CN104099395A - 一种具有抗氧化活性的类球红细菌提取液及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种具有抗氧化活性的类球红细菌提取液及其制备方法，属于类球红细菌提取液技术领域。提取液中包括类胡萝卜素或辅酶Q10或超氧化物歧化酶(SOD)包括以下步骤：菌种活化、类球红细菌发酵、类球红细菌离心分离、类球红细菌提取液制备。本发明制备的类球红细菌提取液具有开创性的意义。

Description

一种具有抗氧化活性的类球红细菌提取液及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种具有抗氧化活性的类球红细菌提取液的制备方法，属于类球红细菌提取液技术领域。
背景技术
类胡萝卜素是维生素A原，具有清除自由基、抗氧化、增强免疫力、防癌等功能，作为着色剂和功能成分广泛应用于食品、医药和化妆品等，然而化学合成类胡萝卜素因毒性其应用受到限制。绝大多数市售类胡萝卜素源于化学合成，不能满足消费者对天然类胡萝卜素的需求，因此研究焦点已从化学合成转移到生物合成。微生物生物合成商业化生物活性色素类胡萝卜素因其高效和易于操控受到广泛关注。
辅酶Q10是一种脂溶性的类维生素物质，广泛存在于生物体细胞的线粒体上，主要结合在线粒体内膜上，构成呼吸链中的重要递氢体。具有清除自由基、维持细胞膜的通透性和提高机体自身免疫力的功能，在临床医药、营养保健品及化妆品等方面具有广阔的应用前景。
超氧化物歧化酶(SOD)是广泛存在于生物体内的一类金属酶，它能催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，从而能有效清除机体内超氧阴离子自由基，是生物体重要的细胞防御系统之一，有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗辐射和消炎作用。SOD已被开发成药品、饮料、保健品、化妆品等的添加剂；细菌SOD的提取常被应用于医学领域、食品领域和化妆品领域中。目前，人们已从猪、牛、马等动物红细胞、肌肉、肝脏组织以及植物和微生物中分离纯化出SOD；其中利用微生物生产SOD具有成本低、周期短、产品纯度高、适用于规模化生产的特点，且所得产品安全性高。因此，近年来从微生物中提取SOD受到国内外许多学者的重视。
当前在国外，光合细菌已在保健食品中应用，在国内光合细菌沼泽红假单胞菌已获准用于饲料添加剂。可见光合细菌在保健食品和药品中的应用已具有一定基础。类球红细菌(Rhodobacter Sphaeroides)是一种光合细菌，属于细菌域中紫色细菌群的α亚群，具有广泛的代谢方式，可以在多种生长条件下生长；大量研究文献表明，类球红细菌已经成为一种非常有工业化开发潜力的微生物。有文献报道类球红细菌发酵生产类胡萝卜素、辅酶Q10和超氧化物歧化酶(SOD)。
纳米技术(nanotechnology)是在80年代末诞生并正在蓬勃发展的一种高新科技，是用单个原子、分子制造物质的科学技术，研究结构尺寸在0.1至100纳米范围内材料的性质和应用。纳米技术具备促进食品传统工业快速发展的巨大潜力，它可以帮助人类在纳米尺度范围内认识和改造自然，即在生产过程中直接操纵原子、分子的排布，从而制造出具有特定功能的新产品。由于其尺寸上的微观性，纳米材料具有与传统材料不同的表面效应、小尺寸效应、量子尺寸效应及宏观量子隧道效应，被广泛应用于原料化工、食品、农业、纺织、电子电器、机械、医学等众多领域。纳米技术已经迅速发展成为21世纪三大支柱科学领域之一[14]，纳米技术必将引发一场新的工业革命。
超声波提取方法是利用超声波的机械破碎和空化作用，使细胞破碎，使细胞更容易释放内容物而增大传质速率；因此超声波浸提具有提取时间短、提取率高、简单高效等特点，而且超声波技术设备成本低廉，操作简单，有利于在工业上推广。超声波作用于含酶溶液时，能产生空化、振荡等作用，并可使酶分子构象及催化部位微环境发生变化，深刻地影响催化活性；人们对超声波影响酶催化过程新的深入认识，将对酶化工领域产生积极的影响，其结果有可能创造一种安全、价廉和靠外力场强化酶催化过程的新方法，给酶法生产工业化带来新的飞跃。Gu等研究表明酸溶法提取类球红细菌类胡萝卜素效果较好。
有关将纳米技术应用于类球红细菌提取液制备方面的文献未见报道。本发明首次报道一种具有抗氧化活性的类球红细菌提取液及其制备方法，为后续将该提取液研究开发为功能(保健)食品奠定坚实的基础。本发明人正从事食品科学与工程学科的教学科研工作，该发明同样可以围绕该学科开展研究开发工作，有利于学科专业建设和人才培养。
发明内容
本发明的目的是提供一种类球红细菌提取液及其制备方法。
一种具有抗氧化活性的类球红细菌提取液，其特征在于，提取液中包括类胡萝卜素或辅酶Q10或超氧化物歧化酶(SOD)。
上述一种具有抗氧化活性的类球红细菌类胡萝卜素提取液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)菌种活化
配制固体培养基(质量百分含量，以下同)：葡萄糖1-5％，胰蛋白胨0.5-5％，酵母粉0.5-5％，氯化钠0.5-2％，琼脂1.5-2％，pH＝7-9；并将其与培养皿置于121℃高压蒸汽灭菌15-30min；然后无菌条件下，倒平板，挑类球红细菌进行平板划线；将平板置于28-37℃培养，2-7d；
配置斜面培养基，斜面培养基与上述固体培养基一样，并于121℃高压蒸汽灭菌15-30min；无菌条件下，挑取上述平板上的类球红细菌单菌落进行斜面接种；然后将斜面置于28-37℃培养，2-7d；
(2)类球红细菌发酵
①种子培养：
种子培养基液体：葡萄糖1-5％，胰蛋白胨0.5-5％，酵母粉0.5-5％，氯化钠0.5-2％，pH＝7-8；并于121℃高压蒸汽灭菌15-30min；
用无菌接种环从步骤(1)活化后的类球红细菌斜面中取菌体一环，接种到盛有(优选250mL三角瓶中含有20mL种子培养基液体)种子培养基液体的三角瓶中，于28-37℃，150-200r/min摇床振荡培养12-36h，得到液体种子；
然后无菌条件下，将得到的液体种子按5-10％的接种量再接种于灭菌的种子培养基中，于28-37℃，150-200r/min摇床振荡培养12-36h，得到活化的液体种子；
②发酵：
液体发酵培养基：苹果酸钠0.4-5％，葡萄糖1-10％，硫酸铵0.5-5％，酵母粉0.5-5％，磷酸氢二钾0.05-0.15％，磷酸二氢钾0.03-0.10％，pH＝7-8，生长因子溶液0.5-2％，并于121℃高压蒸汽灭菌15-30min，其中生长因子溶液配方：维生素B10.05-0.2％，烟酰胺(VPP)0.05-0.2％，生物素0.001-0.002％，生长因子过滤除菌；
按照5-10％的接种量将①摇床活化的液体种子接种到盛有液体发酵培养基的三角瓶中，于28-37℃，150-200r/min摇床振荡培养24-48h，得类球红细菌发酵液；
(3)类球红细菌离心分离
取步骤(2)类球红细菌发酵液于6000-20000rpm离心5-30min，收集菌体，弃上清，再用蒸馏水清洗菌体1-3次，分别于6000-20000rpm离心5-30min，收集菌体，即得类球红细菌湿菌体；
(4)制备类球红细菌提取液
研磨法
取菌体加石英砂研磨10-30min，研磨成匀浆，按菌体/丙酮的质量比为1：5-1：30添加丙酮，震荡20-60min，其中菌体：石英砂的质量比为(0.5-2)：(2-5)；
或超声波法
取菌体按菌体/丙酮的质量比为1：5-1：30添加丙酮，震荡混匀后用冰浴超声波粉碎仪进行破壁处理：振幅20-60％、工作/间隔时间0.5-2min/0.5-2min，冰浴超声波总时间10-30min，最后震荡20-60min；
或酸溶辅助超声波法
取菌体按菌体/盐酸溶液的质量比为1：5-1：20添加1-4mol/L盐酸，于20-30℃处理10-30min，然后在6000-20000rpm离心5-30min，收集菌体；菌体再按菌体/丙酮质量比为1：5-1：30添加丙酮，震荡20-40min；然后进行冰浴超声波处理：振幅20-60％、工作/间隔时间0.5-2min/0.5-2min，冰浴超声波总时间10-30min；最后震荡20-60min；
类胡萝卜素提取液收集：采用不同破壁提取方法得到的类球红细菌类胡萝卜素溶液后，于6000-20000rpm离心10-60min，收集上清液即为类球红细菌类胡萝卜素提取液。
上述一种具有抗氧化活性的类球红细菌SOD提取液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)菌种活化
配制固体培养基(质量百分含量，以下同)：葡萄糖1-5％，胰蛋白胨0.5-5％，酵母粉0.5-5％，氯化钠0.5-2％，琼脂1.5-2％，pH＝7-9；并将其与培养皿置于121℃高压蒸汽灭菌15-30min；然后无菌条件下，倒平板，挑类球红细菌进行平板划线；将平板置于28-37℃培养，2-7d；
配置斜面培养基，斜面培养基与上述固体培养基一样，并于121℃高压蒸汽灭菌15-30min；无菌条件下，挑取上述平板上的类球红细菌单菌落进行斜面接种；然后将斜面置于28-37℃培养，2-7d；
(2)类球红细菌发酵
①种子培养：
种子培养基液体：葡萄糖1-5％，胰蛋白胨0.5-5％，酵母粉0.5-5％，氯化钠0.5-2％，pH＝7-8；并于121℃高压蒸汽灭菌15-30min；
用无菌接种环从步骤(1)活化后的类球红细菌斜面中取菌体一环，接种到盛有(优选250mL三角瓶中含有20mL种子培养基液体)种子培养基液体的三角瓶中，于28-37℃，150-200r/min摇床振荡培养12-36h，得到液体种子；
然后无菌条件下，将得到的液体种子按5-10％的接种量再接种于灭菌的种子培养基中，于28-37℃，150-200r/min摇床振荡培养12-36h，得到活化的液体种子；
②发酵：
液体发酵培养基：苹果酸钠0.1-6％，胰蛋白胨0.1-5％，磷酸氢二钾0.05-0.15％，磷酸二氢钾0.03-0.10％，硫酸镁0.1-1％，无水氯化钙0.002-0.02％，硫酸亚铁0.001-0.01％，EDTA0.001-0.01％，pH＝7-8，生长因子溶液0.5-2％，微量元素溶液0.5-2％，微量元素溶液配方：硼酸0.06-0.6％，硫酸锰0.08-0.3％，钼酸钠0.02-0.1％，硫酸锌0.008-0.05％，硫酸铜0.001-0.01％；并于121℃高压蒸汽灭菌15-30min，其中生长因子溶液配方：维生素B10.05-0.2％，烟酰胺(VPP)0.05-0.2％，生物素0.001-0.002％，对氨基苯甲酸0.05-0.2％，生长因子过滤除菌；上述为质量百分含量；
按照3-10％的接种量将①摇床活化的液体种子接种到盛有液体发酵培养基的三角瓶中，于25-37℃，100-200r/min摇床振荡培养16-48h，得类球红细菌发酵液；
(3)类球红细菌离心分离
取步骤(2)类球红细菌发酵液于6000-20000rpm离心5-30min，收集菌体，弃上清，再用蒸馏水清洗菌体1-3次，分别于6000-20000rpm离心5-30min，收集菌体，即得类球红细菌湿菌体；
(4)制备类球红细菌提取液
研磨法
取菌体加石英砂研磨10-30min，研磨成匀浆，按菌体/磷酸缓冲液质量比为1：5-1：30添加pH6-9磷酸缓冲液震荡20-60min，其中菌体：石英砂的质量比为(0.5-2)：(2-5)；
或超声波法
取菌体按菌体/磷酸缓冲液质量比为1：5-1：30添加pH6-9磷酸缓冲液，震荡混匀后用冰浴超声波粉碎仪进行破壁处理：振幅20-60％、工作/间隔时间0.5-2min/0.5-2min，冰浴超声波总时间10-30min，最后震荡20-60min；
或酶法辅助超声波法
采用溶菌酶和磷酸缓冲液对菌体进行酶解，溶菌酶添加量为0.05-1mg溶菌酶/g菌体，菌体/磷酸缓冲液的质量比为1∶5-1∶30，酶解温度25-50℃，酶解pH值5-9，酶解时间30-150min；然后进行冰浴超声波处理：振幅20-60％、工作/间隔时间0.5-2min/0.5-2min，冰浴超声波总时间10-30min；最后震荡20-60min。或纳米研磨法
将类球红细菌湿菌体放入高能纳米冲击磨罐中，于1-8℃下震磨6-10h，然后按菌体/磷酸缓冲液质量比1∶5-1∶30加入pH6-9的磷酸缓冲液，震荡20-60min。
SOD提取液收集
将采用不同破壁提取方法提取菌体中SOD后，于6000-20000rpm离心10-60min，收集上清液即为SOD提取液。
上述一种具有抗氧化活性的类球红细菌辅酶Q10提取液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)菌种活化
配制固体培养基(质量百分含量，以下同)：葡萄糖1-5％，胰蛋白胨0.5-5％，酵母粉0.5-5％，氯化钠0.5-2％，琼脂1.5-2％，pH＝7-9；并将其与培养皿置于121℃高压蒸汽灭菌15-30min；然后无菌条件下，倒平板，挑类球红细菌进行平板划线；将平板置于28-37℃培养，2-7d；
配置斜面培养基，斜面培养基与上述固体培养基一样，并于121℃高压蒸汽灭菌15-30min；无菌条件下，挑取上述平板上的类球红细菌单菌落进行斜面接种；然后将斜面置于28-37℃培养，2-7d；
(2)类球红细菌发酵
①种子培养：
种子培养基液体：葡萄糖1-5％，胰蛋白胨0.5-5％，酵母粉0.5-5％，氯化钠0.5-2％，pH＝7-8；并于121℃高压蒸汽灭菌15-30min；
用无菌接种环从步骤(1)活化后的类球红细菌斜面中取菌体一环，接种到盛有(优选250mL三角瓶中含有20mL种子培养基液体)种子培养基液体的三角瓶中，于28-37℃，150-200r/min摇床振荡培养12-36h，得到液体种子；
然后无菌条件下，将得到的液体种子按5-10％的接种量接种于灭菌的种子培养基中，于28-37℃，150-200r/min摇床振荡培养12-42h，得到活化的液体种子；
②发酵：
液体发酵培养基：葡萄糖0.1-10％，牛肉膏0.05-5％，磷酸氢二钾0.05-0.15％，磷酸二氢钾0.03-0.10％，无水氯化钙0.002-0.02％，EDTA0.001-0.01％，生长因子溶液0.5-2％，微量元素溶液0.5-2％，pH＝7-8；微量元素溶液配方：硫酸锰0.08-0.3％；并于121℃高压蒸汽灭菌15-30min，其中生长因子溶液配方：维生素B10.05-0.2％，烟酰胺(VPP)0.05-0.2％，生物素0.001-0.002％，对氨基苯甲酸0.05-0.2％，生长因子过滤除菌；
按照3-15％的接种量将①摇床活化的液体种子接种到盛有液体发酵培养基的三角瓶中，于28-37℃，100-270r/min摇床振荡培养24-60h，得类球红细菌发酵液；
(3)类球红细菌离心分离
取步骤(2)类球红细菌发酵液于6000-20000rpm离心5-30min，收集菌体，弃上清，再用蒸馏水清洗菌体1-3次，分别于6000-20000rpm离心5-30min，收集菌体，即得类球红细菌湿菌体；
(4)制备类球红细菌提取液
研磨法：
取菌体加石英砂研磨10-30min，研磨成匀浆，按菌体/甲醇-氯仿溶液质量比为1：5-1：35添加甲醇-氯仿(体积比为1︰2)溶液，震荡20-60min，其中菌体：石英砂的质量比(0.5-2)：(2-5)；
或超声波法：
取菌体按菌体/甲醇-氯仿溶液质量比为1：5-1：35添加甲醇-氯仿(体积比为1︰2)溶液，震荡混匀后用超声波粉碎仪进行破壁处理：振幅20-60％、工作/间隔时间0.5-2min/0.5-2min，冰浴超声波总时间5-30min；最后震荡20-60min；
或酶法辅助超声波法：
采用溶菌酶和磷酸缓冲液对菌体进行酶解，溶菌酶添加量为0.05-1mg溶菌酶/g湿菌体，菌体/磷酸缓冲液的质量比1∶5-1∶35，酶解温度25-50℃，酶解pH值5-9，酶解时间30-180min；酶解后于6000-20000rpm离心5-30min，收集菌体，按菌体/甲醇-氯仿溶液质量比为1∶5-1∶35添加甲醇-氯仿(体积比为1︰2)溶液悬浮菌体；然后进行冰浴超声波处理：振幅20-60％、工作/间隔时间0.5-2min/0.5-2min，冰浴超声波总时间10-30min；最后震荡20-60min；
或纳米研磨法：
将类球红细菌湿菌体放入高能纳米冲击磨罐中，于1-8℃下震磨5-12h，然后按菌体/甲醇-氯仿溶液质量比1∶5-1∶35加入甲醇-氯仿(1︰2)溶液，震荡20-60min；
辅酶Q10提取液收集
采用不同破壁提取方法提取菌体中辅酶Q10后，于6000-20000rpm离心10-60min，取上清液，用旋转蒸发仪于20–55℃进行旋转蒸法，将上清液浓缩干，按菌体/无水乙醇质量比1∶5-1∶35加入无水乙醇溶解样品，得到辅酶Q10提取液。
本专利发明了一种以苹果酸钠和胰蛋白胨为主要原料，或以葡萄糖和牛肉膏为主要原料，生产具有抗氧化活性的类球红细菌SOD或辅酶Q10提取液的方法，采用的菌株是一株具有抗氧化活性的类球红细菌(Rhodobacter Sphaeroides)。本发明首次报道将类球红细菌经高能纳米冲击磨制备为类球红细菌SOD或辅酶Q10提取液，经体外抗氧化实验结果表明该类球红细菌提取液具有抗氧化活性，并介绍其制备方法。由于其尺寸上的微观性，纳米材料具有与传统材料不同的表面效应、小尺寸效应、量子尺寸效应及宏观量子隧道效应，因此类球红细菌经高能纳米冲击磨破壁制备的提取液，其生物活性物质SOD或辅酶Q10便于释放出来，有利于其体外和体内抗氧化作用的发挥。采用高能纳米冲击磨制备类球红细菌SOD或辅酶Q10提取液容易实现扩大生产和产业化，将其开发为功能(保健)食品有利于人体健康。
本专利发明了一种用苹果酸钠、葡萄糖、硫酸铵和酵母浸粉为主要原料，生产具有抗氧化活性的类球红细菌类胡萝卜素提取液的方法，采用的菌株是一株具有抗氧化活性的类球红细菌(RhodobacterSphaeroides)。本发明首次报道具有抗氧化活性的类球红细菌类胡萝卜素提取液的制备方法，将类球红细菌经酸溶辅助超声波法破壁制备类球红细菌类胡萝卜素提取液，经体外抗氧化实验结果表明该类球红细菌类胡萝卜素提取液具有抗氧化活性，并介绍其制备方法。采用酸溶辅助超声波法对类球红细菌进行细胞破壁，具有设备简单、操作易行的特点。类球红细菌经酸溶辅助超声波法破壁制备的提取液，其生物活性物质类胡萝卜素便于释放出来，有利于其体外和体内抗氧化作用的发挥，将其开发为功能(保健)食品有利于人体健康。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1
类胡萝卜素的含量计算
将提取好含类胡萝卜素的丙酮溶液在475nm测吸光度；参照惠伯棣等[惠伯棣,李京.红和黄瓤西瓜中类胡萝卜素含量和组成比较[J].食品科学，2008，29(12):587-591.
]方法计算类胡萝卜素含量。计算公式如下：
A—480nm处的吸光度值；
y—样品溶液的体积(mL)；
—吸光系数，定义为在1cm光程长的比色杯中1％(W/V)浓度溶质的理论吸收值，在此采用值为2500。
类球红细菌中类胡萝卜素清除DPPH自由基能力的测定[刘薇,刘彦霞,赵建,等.DPPH法测定保健食品脂溶性成份抗氧化能力的可行性研究[J].中国酿造，2011,04:86-89.和Hongfei Fu,Bijun Xie,Shaojun Ma,Xinrong Zhu,Gang Fan,Siyi Pan.Evaluation of antioxidant activities of principal carotenoidsavailable in water spinach(Ipomoea aquatica).Journal of Food Composition and Analysis,2011,24:288–297]
1.配制试剂
丙酮环己烷混合液：用量筒量取10mL丙酮和15mL环己烷，于50mlL磨砂口三角瓶中混合均匀，盖盖保存，待用，现用现配。
DPPH溶液(120μmol/L)：称取DPPH0.00118g加10mL丙酮溶解，再用环己烷溶液定容于25mL混合均匀，即为120μmol/L DPPH溶液。
Trolox标准储备液(0.2g/L)：称取Trolox标准物0.0050g，用10mL丙酮溶解，再用环己烷稀释定容于25mL混合均匀，即为0.2g/L Trolox标准储备液。
2测定方法
按照表1所列顺序依次向试管中加入试剂并按表中规定的条件操作。
表1 样品及Trolox的测定方法设计
混匀后室温静置20min，波长514nm处以环己烷调零比色测定其吸光度
计算公式：抗氧化能力值以Trolox当量(μmolTrolox当量/g)表示，1g样品相当于Trolox的微摩尔数。即抗氧化能力值＝[1－[(A样品－A样品空白)/A对照]/[1－(ATrolox/A对照)]×[MTrolox/M样品]。式中：A样品为样品管吸光度值；A样品空白为样品空白管吸光度值；ATrolox为标准Trolox管吸光度值；A对照为对照管吸光度值。MTrolox为标准管所含Trolox的微摩尔数；M样品为标准管所含样品的质量g。
标准曲线的绘制：取0.2g/L Trolox标准储备液1mLl加1mL丙酮环己烷混合液稀释为0.1g/L，照此方法继续将0.1g/L的Trolox稀释为0.05g/L，0.025g/L，0.0125g/L，0.00625g/L的Trolox标准品溶液。
按表1测定。
类球红细菌中类胡萝卜素抗脂质过氧化能力的测定[参见：张智,臧云,王群.酰基化蓝靛果花色苷的抗氧化性研究[J].现代食品科技,2013,29(3):534-538,486.
Perumal Siddhuraju.The antioxidant activity and free radical-scavenging capacity of phenolics of raw and dryheated moth bean(Vigna aconitifolia)(Jacq.)Marechal seed extracts.Food Chemistry,2006,99:149–157.
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分别于样品管中依次加入0.4％卵磷脂溶液3.6mL，0.4mL不同浓度的样品溶液，0.4mL10mmol/L硫酸亚铁溶液，混匀，避光于37℃水浴60min，加入1mL20％三氯乙酸，1mL0.8％硫代巴比妥酸，沸水浴15min，迅速冷却，以3000rpm转速离心10min，取上清液在535nm测吸光度As。空白管以1mL蒸馏水代替1mLl样品，操作方法同样品管，可测得空白管的吸光度Ac。按以下公式计算抑制率F：F＝(Ac-As)/Ac×100％。
类球红细菌中类胡萝卜素还原力的测定[参见：周波,王晓红,陈丽丽,郭连营,张卓,徐超.玉米紫色植株色素体外抗氧化活性实验研究[J].现代食品科技,2007,23(4):23-25.
Maleeha Manzoor,Farooq Anwar,Zahed Mahmood,Umer Rashid,and Muhammad Ashraf.Variation in Minerals,Phenolics and Antioxidant Activity of Peel and Pulp of Different Varieties of Peach(Prunus persica L.)Fruitfrom Pakistan.Molecules,2012,17:6491-6506.
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分别取2.5mL不同浓度的样品溶液于试管中，依次加入2.5mL，0.2mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝6.6)和2.5mL1％铁氰化钾溶液，于50℃水浴保温20min后快速冷却，再加入2.5mL10％三氯乙酸溶液，以4000r/min的转速离心10min，取上清液2.5mL，依次加入2.5mL重蒸水，0.5mL0.1％氯化铁溶液，充分混匀，静置10min，在700nm处测定吸光度值，以重蒸水作阴性对照。
类球红细菌中类胡萝卜素提取液制备步骤：
(1)菌种活化
配制固体培养基(质量百分含量，以下同)：葡萄糖2％，胰蛋白胨1％，酵母浸粉1％，氯化钠0.5％，琼脂2％，pH＝8.5；并将其与培养皿置于121℃高压蒸汽灭菌20min；然后无菌条件下，倒平板，挑类球红细菌进行平板划线；将平板置于37℃培养，3-5d；
配置斜面培养基，斜面培养基与上述固体培养基一样，并于121℃高压蒸汽灭菌20min；无菌条件下，挑取上述平板上的类球红细菌单菌落进行斜面接种；然后将斜面置于37℃培养，3-5d；
(2)类球红细菌发酵
①种子培养基：
种子培养基：葡萄糖2％，胰蛋白胨1％，酵母浸粉1％，氯化钠0.5％，pH＝7.2，并于121℃高压蒸汽灭菌20min；
用无菌接种环从活化后的类球红细菌斜面中取菌体适量，接种到盛有液体种子培养基的三角瓶中(250mL三角瓶中装20mL种子培养基液体)，于32℃，180r/min摇床振荡培养24h，得到液体种子；
②发酵：
发酵培养基：苹果酸钠0.4％，葡萄糖2％，硫酸铵0.7％，酵母浸粉1％，磷酸氢二钾0.09％，磷酸二氢钾0.06％，生长因子溶液1％，pH＝7.0，121℃灭菌20min；其中生长因子溶液配方：维生素B10.1％，烟酰胺(VPP)0.1％，生物素0.0016％，生长因子过滤除菌；
按照10％的接种量将摇瓶活化的液体种子接种到盛有液体发酵培养基的三角瓶中，于32℃，180r/min摇床振荡培养40h，得类球红细菌发酵液。
(3)类球红细菌离心分离
取步骤②类球红细菌发酵液于12000rpm离心20min，收集菌体，弃上清，再用蒸馏水清洗菌体2次，于12000rpm离心20min，收集菌体，即得类球红细菌湿菌体；
(4)制备类球红细菌提取液
①研磨法
取菌体加石英砂研磨20min，研磨成匀浆，按固液比(菌体/丙酮质量比)为1：10添加丙酮震荡30min，其中菌体：石英砂的质量比为1∶5；
②超声波法
取菌体按固液比(菌体/丙酮质量比)为1：10添加丙酮，震荡混匀后用冰浴超声波粉碎仪进行破壁处理：振幅40％、工作/间隔时间2min/1min，冰浴超声波总时间20min，最后震荡30min；
③酸溶辅助超声波法
取菌体按固液比(菌体/盐酸溶液质量比)为1：10添加3mol/L盐酸，于27℃处理25min，然后在12000rpm离心20min，收集菌体，其中菌体：盐酸为1g：10mL；菌体再按固液比(菌体/丙酮质量比)为1：10添加丙酮，震荡30min；然后进行冰浴超声波处理：振幅40％、工作/间隔时间2min/1min，冰浴超声波总时间20min；最后震荡30min；
类胡萝卜素提取液收集
采用不同破壁提取方法得到的类球红细菌类胡萝卜素溶液后，于12000rpm离心20min，收集上清液即为类球红细菌类胡萝卜素提取液。
实验结果：
1不同细胞破壁方法对提取液中类胡萝卜素含量的影响
表2 不同细胞破壁方法对提取液中类胡萝卜素含量的影响
由表2可知，采用研磨法、超声波法、酸溶辅助超声波法这三种方法分别对类球红细菌进行破壁提取，然后测定提取液中类胡萝卜素含量，结果表明，酸溶辅助超声波法的类胡萝卜素含量最高，破壁效果最好，超声法次之，研磨法最差。
2类球红细菌类胡萝卜素的清除DPPH自由基能力
按照上述方法制备类球红细菌中类胡萝卜素提取液，不同的是步骤(4)采用不同的固液比。
表3 类球红细菌类胡萝卜素的清除DPPH自由基能力(μmolTrolox当量/g)
由表3可知，酸溶辅助超声波法处理的类球红细菌类胡萝卜素提取液的清除DPPH自由基能力优于超声波法，超声波法又优于研磨法。随提取剂用量的增大，细胞浓度降低，类胡萝卜素含量下降，不同破壁方法处理的类球红细菌类胡萝卜素提取液的清除DPPH自由基能力均下降。可见，不同破壁方法提取得到的类球红细菌类胡萝卜素提取液均具有清除DPPH自由基的能力，酸溶辅助超声波法最好。
3类球红细菌类胡萝卜素的抗脂质过氧化能力
按照上述方法制备类球红细菌中类胡萝卜素提取液，不同的是步骤(4)采用不同的固液比。
表4 类球红细菌类胡萝卜素的抗脂质过氧化能力(％)
由表4可知，酸溶辅助超声波法处理的类球红细菌类胡萝卜素提取液的抗脂质过氧化能力优于超声波法，超声波法又优于研磨法。随提取剂用量的增大，不同破壁方法处理的样品其抗脂质过氧化能力均下降。可见，不同破壁方法提取得到的类球红细菌类胡萝卜素提取液均具有抗脂质过氧化能力，酸溶辅助超声波法最好。
4类球红细菌类胡萝卜素的还原力
按照上述方法制备类球红细菌中类胡萝卜素提取液，不同的是步骤(4)采用不同的固液比。
表5 类球红细菌类胡萝卜素的还原力
由表5可知，酸溶辅助超声波法处理的类球红细菌类胡萝卜素提取液的还原力高于超声波法，超声波法又高于研磨法。随提取剂用量的增大，不同破壁方法处理的样品还原力均下降。
综上所述，不同破壁方法提取得到的类球红细菌类胡萝卜素提取液均具有抗氧化能力，其中酸溶辅助超声波法最好。随提取剂用量的增大，不同破壁方法处理的类球红细菌类胡萝卜素提取液的抗氧化能力均呈下降趋势。
实施例2
SOD含量的测定
按照南京建成的总抗氧化能力测试盒的说明书进行测定。
类球红细菌SOD清除ABTS自由基能力的测定[参见Hongfei Fu,Bijun Xie,Shaojun Ma,Xinrong Zhu,GangFan,Siyi Pan.Evaluation of antioxidant activities of principal carotenoids available in water spinach(Ipomoea aquatica).Journal of Food Composition and Analysis,2011,24:288–297.
Perumal Siddhuraju.The antioxidant activity and free radical-scavenging capacity of phenolics of raw and dryheated moth bean(Vigna aconitifolia)(Jacq.)Marechal seed extracts.Food Chemistry,2006,99:149–157.
刘薇，邱乐，杨婧，刘彦霞，赵建,文镜,等.ABTS与邻二氮菲-Fe3+法测定保健食品抗氧化能力比较分析[J].食品工业，2013,34(3),120-123.
Andrzej L.Dawidowicz,Malgorzata Olszowy.The importance of solvent type in estimating antioxidantproperties of phenolic compounds by ABTS assay.Eur Food Res Technol,2013,236:1099–1105.]
将0.3μmol/mL Trolox溶液用10％乙醇溶液分别配成浓度为0.20，0.15，0.10，0.05，0.01μmol/mL的标准应用液。按下列表6步骤进行测定。以Trolox浓度为横坐标，清除率(吸光值变化量)为纵坐标，制备Trolox标准曲线。
表6 ABTS法检测样品及Trolox的步骤/mL
清除率＝1-[(A样品管-A样品空白管)/A对照管]×100％
类球红细菌SOD清除羟自由基能力的测定
按照南京建成的羟自由基测定试剂盒的说明书进行。
类球红细菌SOD清除超氧阴离子能力的测定
按照南京建成的抑制超氧阴离子自由基测试盒的说明进行。
类球红细菌SOD还原力的测定
分别取2.5mL不同浓度的样品溶液于试管中，依次加入2.5mL，0.2mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝6.6)和2.5mL1％铁氰化钾溶液，于50℃水浴保温20min后快速冷却，再加入2.5mL10％三氯乙酸溶液，以4000r/min的转速离心10min，取上清液2.5mL，依次加入2.5mL重蒸水，0.5mL0.1％氯化铁溶液，充分混匀，静置10min，在700nm处测定吸光度值，以重蒸水作阴性对照。
类球红细菌SOD提取液的制备步骤：
(1)菌种活化
配制固体培养基(质量百分含量，以下同)：葡萄糖2％，胰蛋白胨1％，酵母浸粉1％，氯化钠0.5％，琼脂2％，pH＝8.5；并将其与培养皿置于121℃高压蒸汽灭菌20min；然后无菌条件下，倒平板，挑类球红细菌进行平板划线；将平板置于37℃培养，3-5d；
配置斜面培养基，斜面培养基与上述固体培养基一样，并于121℃高压蒸汽灭菌20min；无菌条件下，挑取上述平板上的类球红细菌单菌落进行斜面接种；然后将斜面置于37℃培养，3-5d；
(2)类球红细菌发酵
①种子培养基：
种子培养基：葡萄糖2％，胰蛋白胨1％，酵母浸粉1％，氯化钠0.5％，pH＝7.2，并于121℃高压蒸汽灭菌20min；
用无菌接种环从活化后的类球红细菌斜面中取菌体适量，接种到盛有液体种子培养基的三角瓶中(250mL三角瓶中装20mL种子培养基液体)，于32℃，180r/min摇床振荡培养24h，得到液体种子；
②发酵：
液体发酵培养基：苹果酸0.3％，胰蛋白胨0.4％，磷酸氢二钾0.09％，磷酸二氢钾0.06％，硫酸镁0.02％，无水氯化钙0.0075％，硫酸亚铁0.0012％，EDTA0.002％，pH＝7.5，生长因子溶液1％，微量元素溶液1％，微量元素溶液配方：硼酸0.28％，硫酸锰0.16％，钼酸钠0.076％，硫酸锌0.024％，硫酸铜0.004％；并于121℃高压蒸汽灭菌20min，其中生长因子溶液配方：维生素B1 0.1％，烟酰胺(VPP)0.1％，生物素0.0016％，对氨基苯甲酸0.1％，生长因子过滤除菌；
按照5％的接种量将①摇床活化的液体种子接种到盛有液体发酵培养基的三角瓶中，于32℃，150r/min摇床振荡培养24h，得类球红细菌发酵液；
(3)类球红细菌离心分离
取步骤(2)类球红细菌发酵液于10000rpm离心20min，收集菌体，弃上清，再用蒸馏水清洗菌体1-3次，分别于10000rpm离心20min，收集菌体，即得类球红细菌湿菌体；
(4)制备类球红细菌提取液
①研磨法
取菌体加石英砂研磨15min，研磨成匀浆，按固液比(菌体/磷酸缓冲液质量比)为1：15添加pH7.8磷酸缓冲液震荡30min，其中菌体：石英砂的质量比为1∶5；
②超声波法
取菌体按固液比(菌体/磷酸缓冲液质量比)为1：15添加pH7.8磷酸缓冲液，震荡混匀后用冰浴超声波粉碎仪进行破壁处理：振幅30％、工作/间隔时间1min/1min，冰浴超声波总时间15min，最后震荡30min；
③酶法辅助超声波法
溶菌酶添加量为0.1mg溶菌酶/g菌体，固液比(菌体/磷酸缓冲液的质量比)为1∶15，酶解温度40℃，酶解pH值7，酶解时间60min；然后进行冰浴超声波处理：振幅30％、工作/间隔时间1min/1min，冰浴超声波总时间15min；最后震荡30min。
④纳米研磨法
将类球红细菌湿菌体放入高能纳米冲击磨罐中，于6℃下震磨8h，然后按固液比(菌体/磷酸缓冲液的质量比)1∶15加入pH7.8的磷酸缓冲液，震荡30min。
SOD提取液收集
将采用不同破壁提取方法提取菌体中SOD后，于10000rpm离心20min，收集上清液即为SOD提取液。
实验结果
1不同破壁方法和料液比对提取液中SOD含量的影响
按照上述方法制备类球红细菌中SOD提取液，不同的是步骤(4)采用不同的固液比。
表7 不同破壁方法和料液比对提取液中SOD含量的影响(U/mL)
由表7可知，分别采用研磨法、超声波法、酶法辅助超声波法和纳米磨法这四种方法分别对类球红细菌进行破壁提取，然后测定提取液中SOD含量，结果表明，在相同料液比下，纳米磨法的SOD含量最高，酸溶辅助超声波法次之，超声波法更小，研磨法最小。随提取剂用量的增大，细胞浓度降低，SOD含量下降，不同破壁方法处理的提取液的SOD含量均下降。
2类球红细菌SOD清除ABTS自由基能力
表8 类球红细菌类SOD的清除ABTS自由基能力(％)
由表8可知，当料液比为1:15时，纳米磨法处理的类球红细菌SOD提取液的清除ABTS自由基能力最强，其次是酶法辅助超声波法，再次为超声波法，最后是研磨法。可见，不同破壁方法提取得到的类球红细菌SOD提取液均具有清除ABTS自由基的能力，纳米磨法最好。
3类球红细菌SOD清除羟自由基能力
按照上述方法制备类球红细菌中SOD提取液，不同的是步骤(4)采用不同的固液比。
表9 类球红细菌SOD清除羟自由基能力(％)
由表9可知，纳米磨法处理的类球红细菌SOD提取液的清除羟自由基能力最强，其次是酶法辅助超声波法，再次为超声波法，最后是研磨法。随提取剂用量的增大，不同破壁方法处理的类球红细菌SOD提取液的清除羟自由基能力均下降。可见，不同破壁方法和料液比条件下提取得到的类球红细菌SOD提取液均具有清除羟自由基的能力，纳米磨法最好。
4类球红细菌SOD清除超氧阴离子能力
按照上述方法制备类球红细菌中SOD提取液，不同的是步骤(4)采用不同的固液比。
表10 类球红细菌SOD清除超氧阴离子能力(％)
由表10可知，纳米磨法处理的类球红细菌SOD提取液的清除超氧阴离子能力最强，其次是酶法辅助超声波法，再次为超声波法，最后是研磨法。随提取剂用量的增大，不同破壁方法处理的类球红细菌SOD提取液的清除超氧阴离子能力均下降。可见，不同破壁方法和料液比条件下提取得到的类球红细菌SOD提取液均具有清除超氧阴离子的能力，纳米磨法最好。
5类球红细菌SOD的还原力
按照上述方法制备类球红细菌中SOD提取液，不同的是步骤(4)采用不同的固液比。
表11 类球红细菌SOD的还原力
由表11可知，纳米磨法处理的类球红细菌SOD提取液的还原力最大，其次是酶法辅助超声波法，再次为超声波法，最后是研磨法。随提取剂用量的增大，不同破壁方法处理的类球红细菌SOD提取液的还原力均下降。
综上所述，不同破壁方法提取得到的类球红细菌SOD提取液均具有抗氧化能力，其中纳米磨法最好。随提取剂用量的增大，不同破壁方法处理的类球红细菌SOD提取液的抗氧化能力均呈下降趋势。
实施例3
辅酶Q10测定
采用高效液相色谱法，按《保健食品中辅酶Q10的测定》(GB/T22252-2008)测定辅酶Q10提取液中的辅酶Q10含量。
类球红细菌辅酶Q10清除DPPH自由基能力的测定
具体操作同实施例1。
类球红细菌辅酶Q10抗脂质过氧化能力的测定
具体操作同实施例1。
类球红细菌辅酶Q10还原力的测定
具体操作同实施例1。
类球红细菌辅酶Q10提取液的制备步骤：
(1)菌种活化
配制固体培养基(质量百分含量，以下同)：葡萄糖2％，胰蛋白胨1％，酵母浸粉1％，氯化钠0.5％，琼脂2％，pH＝8.5；并将其与培养皿置于121℃高压蒸汽灭菌20min；然后无菌条件下，倒平板，挑类球红细菌进行平板划线；将平板置于37℃培养，3-5d；
配置斜面培养基，斜面培养基与上述固体培养基一样，并于121℃高压蒸汽灭菌20min；无菌条件下，挑取上述平板上的类球红细菌单菌落进行斜面接种；然后将斜面置于37℃培养，3-5d；
(2)类球红细菌发酵
①种子培养基：
种子培养基：葡萄糖2％，胰蛋白胨1％，酵母浸粉1％，氯化钠0.5％，pH＝7.2，并于121℃高压蒸汽灭菌20min；
用无菌接种环从活化后的类球红细菌斜面中取菌体适量，接种到盛有液体种子培养基的三角瓶中(250mL三角瓶中装20mL种子培养基液体)，于32℃，180r/min摇床振荡培养24h，得到液体种子；
②发酵：
液体发酵培养基：葡萄糖0.4％，牛肉膏0.1％，磷酸氢二钾0.09％，磷酸二氢钾0.06％，无水氯化钙0.0075％，EDTA0.002％，生长因子溶液1％，微量元素溶液1％，pH＝7.0；微量元素溶液配方：硫酸锰0.16％；并于121℃高压蒸汽灭菌20min，其中生长因子溶液配方：维生素B1 0.1％，烟酰胺(VPP)0.1％，生物素0.0016％，对氨基苯甲酸0.1％，生长因子过滤除菌；
按照10％的接种量将①摇床活化的液体种子接种到盛有液体发酵培养基的三角瓶中，于32℃，180r/min摇床振荡培养24h，得类球红细菌发酵液；
(3)类球红细菌离心分离
取步骤(2)类球红细菌发酵液于10000rpm离心20min，收集菌体，弃上清，再用蒸馏水清洗菌体1-3次，分别于10000rpm离心20min，收集菌体，即得类球红细菌湿菌体；
(4)制备类球红细菌提取液
①研磨法：
取菌体加石英砂研磨14min，研磨成匀浆，按固液比(菌体/甲醇-氯仿溶液质量比)为1：15添加甲醇-氯仿(体积比为1︰2)溶液，震荡30min，其中菌体：石英砂的质量比1∶5；
②超声波法：
取菌体按固液比(菌体/甲醇-氯仿溶液质量比)为1：15添加甲醇-氯仿(体积比为1︰2)溶液，震荡混匀后用超声波粉碎仪进行破壁处理：振幅30％、工作/间隔时间1min/1min，冰浴超声波总时间14min；最后震荡30min；
③酶法辅助超声波法：
溶菌酶添加量为0.1mg溶菌酶/g菌体，固液比(菌体/提取液的质量比)为1∶15，酶解温度37℃，酶解pH值7.2，酶解时间90min；酶解后于10000rpm离心20min，收集菌体；按菌体/甲醇-氯仿溶液质量比为1∶15添加甲醇-氯仿溶液悬浮菌体，其中甲醇-氯仿体积比为1︰2；然后进行冰浴超声波处理：振幅30％、工作/间隔时间1min/1min，冰浴超声波总时间14min；最后震荡30min。
④纳米研磨法：
将类球红细菌湿菌体放入高能纳米冲击磨罐中，于6℃下震磨8h，然后按固液比(菌体/提取剂的质量比)1∶15加入甲醇-氯仿溶液(体积比1︰2)，震荡30min。
辅酶Q10提取液收集
采用不同破壁提取方法提取菌体中辅酶Q10后，于10000rpm离心20min，取上清液，用旋转蒸发仪于35℃进行旋转蒸法，将上清液浓缩干，按固液比(质量比)1∶15加入无水乙醇溶解样品，得到辅酶Q10提取液。
实验结果
1不同破壁方法对提取液中辅酶Q10含量的影响
表12 不同破壁方法对提取液中辅酶Q10含量的影响
由表12可知，采用研磨法、超声波法、酶法辅助超声波法和纳米磨法这四种方法分别对类球红细菌进行破壁提取，然后测定提取液中辅酶Q10含量，结果表明，纳米磨法的辅酶Q10含量最高，破壁效果最好，酶法辅助超声波法次之，超声法其次，研磨法最差。
2类球红细菌辅酶Q10清除DPPH自由基能力
按照上述方法制备类球红细菌Q10提取液，不同的是步骤(4)采用不同的固液比。
表13 类球红细菌辅酶Q10清除DPPH自由基能力(μmolTrolox当量/g)
由表13可知，纳米磨法处理的类球红细菌辅酶Q10提取液的清除DPPH自由基能力好于酶法辅助超声波法的，酶法辅助超声波法好于超声波法，超声波法又优于研磨法。随提取剂用量的增大，细胞浓度降低，辅酶Q10含量下降，不同破壁方法处理的类球红细菌辅酶Q10提取液的清除DPPH自由基能力均下降。可见，不同破壁方法提取得到的类球红细菌辅酶Q10提取液均具有清除DPPH自由基的能力，纳米磨法最好。
3类球红细菌辅酶Q10抗脂质过氧化能力
按照上述方法制备类球红细菌Q10提取液，不同的是步骤(4)采用不同的固液比。
表14 类球红细菌辅酶Q10抗脂质过氧化能力(％)
由图14可知，纳米磨法处理的类球红细菌辅酶Q10提取液的抗脂质过氧化能力优于酶法辅助超声波法的，酶法辅助超声波法优于超声波法，超声波法又优于研磨法。随提取剂用量的增大，不同破壁方法处理的样品其抗脂质过氧化能力均下降。可见，不同破壁方法提取得到的类球红细菌辅酶Q10提取液均具有抗脂质过氧化能力，纳米磨法最好。
4类球红细菌辅酶Q10的还原力
按照上述方法制备类球红细菌Q10提取液，不同的是步骤(4)采用不同的固液比。
表15 类球红细菌辅酶Q10的还原力(％)
由表15可知，纳米磨法处理的类球红细菌辅酶Q10提取液的抗还原力大于酶法辅助超声波法的，酶法辅助超声波法大于超声波法，超声波法又大于研磨法。随提取剂用量的增大，不同破壁方法处理的样品还原力均下降。
综上所述，不同破壁方法提取得到的类球红细菌辅酶Q10提取液均具有抗氧化能力，其中纳米磨法最好。随提取剂用量的增大，不同破壁方法处理的类球红细菌辅酶Q10提取液的抗氧化能力均呈下降趋势。

Claims (4)

1.一种具有抗氧化活性的类球红细菌提取液，其特征在于，提取液中包括类胡萝卜素或辅酶Q10或超氧化物歧化酶(SOD)。
2.一种具有抗氧化活性的类球红细菌类胡萝卜素提取液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)菌种活化
配制固体培养基(质量百分含量，以下同)：葡萄糖1-5％，胰蛋白胨0.5-5％，酵母粉0.5-5％，氯化钠0.5-2％，琼脂1.5-2％，pH＝7-9；并将其与培养皿置于121℃高压蒸汽灭菌15-30min；然后无菌条件下，倒平板，挑类球红细菌进行平板划线；将平板置于28-37℃培养，2-7d；
配置斜面培养基，斜面培养基与上述固体培养基一样，并于121℃高压蒸汽灭菌15-30min；无菌条件下，挑取上述平板上的类球红细菌单菌落进行斜面接种；然后将斜面置于28-37℃培养，2-7d；
(2)类球红细菌发酵
①种子培养：
种子培养基液体：葡萄糖1-5％，胰蛋白胨0.5-5％，酵母粉0.5-5％，氯化钠0.5-2％，pH＝7-8；并于121℃高压蒸汽灭菌15-30min；
用无菌接种环从步骤(1)活化后的类球红细菌斜面中取菌体一环，接种到盛有(优选250mL三角瓶中含有20mL种子培养基液体)种子培养基液体的三角瓶中，于28-37℃，150-200r/min摇床振荡培养12-36h，得到液体种子；
然后无菌条件下，将得到的液体种子按5-10％的接种量再接种于灭菌的种子培养基中，于28-37℃，150-200r/min摇床振荡培养12-36h，得到活化的液体种子；
②发酵：
液体发酵培养基：苹果酸钠0.4-5％，葡萄糖1-10％，硫酸铵0.5-5％，酵母粉0.5-5％，磷酸氢二钾0.05-0.15％，磷酸二氢钾0.03-0.10％，pH＝7-8，生长因子溶液0.5-2％，并于121℃高压蒸汽灭菌15-30min，其中生长因子溶液配方：维生素B10.05-0.2％，烟酰胺(VPP)0.05-0.2％，生物素0.001-0.002％，生长因子过滤除菌；
按照5-10％的接种量将①摇床活化的液体种子接种到盛有液体发酵培养基的三角瓶中，于28-37℃，150-200r/min摇床振荡培养24-48h，得类球红细菌发酵液；
(3)类球红细菌离心分离
取步骤(2)类球红细菌发酵液于6000-20000rpm离心5-30min，收集菌体，弃上清，再用蒸馏水清洗菌体1-3次，分别于6000-20000rpm离心5-30min，收集菌体，即得类球红细菌湿菌体；
(4)制备类球红细菌提取液
研磨法
取菌体加石英砂研磨10-30min，研磨成匀浆，按菌体/丙酮的质量比为1：5-1：30添加丙酮，震荡20-60min，其中菌体：石英砂的质量比为(0.5-2)：(2-5)；
或超声波法
取菌体按菌体/丙酮的质量比为1：5-1：30添加丙酮，震荡混匀后用冰浴超声波粉碎仪进行破壁处理：振幅20-60％、工作/间隔时间0.5-2min/0.5-2min，冰浴超声波总时间10-30min，最后震荡20-60min；或酸溶辅助超声波法
取菌体按菌体/盐酸溶液质量比为1：5-1：20添加1-4mol/L盐酸，于20-30℃处理10-30min，然后在6000-20000rpm离心5-30min，收集菌体；菌体再按菌体/丙酮质量比为1：5-1：30添加丙酮，震荡20-40min；然后进行冰浴超声波处理：振幅20-60％、工作/间隔时间0.5-2min/0.5-2min，冰浴超声波总时间10-30min；最后震荡20-60min；
类胡萝卜素提取液收集：采用不同破壁提取方法得到的类球红细菌类胡萝卜素溶液后，于6000-20000rpm离心10-60min，收集上清液即为类球红细菌类胡萝卜素提取液。
3.一种具有抗氧化活性的类球红细菌SOD提取液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)菌种活化
配制固体培养基(质量百分含量，以下同)：葡萄糖1-5％，胰蛋白胨0.5-5％，酵母粉0.5-5％，氯化钠0.5-2％，琼脂1.5-2％，pH＝7-9；并将其与培养皿置于121℃高压蒸汽灭菌15-30min；然后无菌条件下，倒平板，挑类球红细菌进行平板划线；将平板置于28-37℃培养，2-7d；
配置斜面培养基，斜面培养基与上述固体培养基一样，并于121℃高压蒸汽灭菌15-30min；无菌条件下，挑取上述平板上的类球红细菌单菌落进行斜面接种；然后将斜面置于28-37℃培养，2-7d；
(2)类球红细菌发酵
①种子培养：
种子培养基液体：葡萄糖1-5％，胰蛋白胨0.5-5％，酵母粉0.5-5％，氯化钠0.5-2％，pH＝7-8；并于121℃高压蒸汽灭菌15-30min；
用无菌接种环从步骤(1)活化后的类球红细菌斜面中取菌体一环，接种到盛有种子培养基液体的三角瓶中，于28-37℃，150-200r/min摇床振荡培养12-36h，得到液体种子；
然后无菌条件下，将得到的液体种子按5-10％的接种量再接种于灭菌的种子培养基中，于28-37℃，150-200r/min摇床振荡培养12-36h，得到活化的液体种子；
②发酵：
液体发酵培养基：苹果酸钠0.1-6％，胰蛋白胨0.1-5％，磷酸氢二钾0.05-0.15％，磷酸二氢钾0.03-0.10％，硫酸镁0.1-1％，无水氯化钙0.002-0.02％，硫酸亚铁0.001-0.01％，EDTA0.001-0.01％，pH＝7-8，生长因子溶液0.5-2％，微量元素溶液0.5-2％，微量元素溶液配方：硼酸0.06-0.6％，硫酸锰0.08-0.3％，钼酸钠0.02-0.1％，硫酸锌0.008-0.05％，硫酸铜0.001-0.01％；并于121℃高压蒸汽灭菌15-30min，其中生长因子溶液配方：维生素B10.05-0.2％，烟酰胺(VPP)0.05-0.2％，生物素0.001-0.002％，对氨基苯甲酸0.05-0.2％，生长因子过滤除菌；
按照3-10％的接种量将①摇床活化的液体种子接种到盛有液体发酵培养基的三角瓶中，于25-37℃，100-200r/min摇床振荡培养16-48h，得类球红细菌发酵液；
(3)类球红细菌离心分离
取步骤(2)类球红细菌发酵液于6000-20000rpm离心5-30min，收集菌体，弃上清，再用蒸馏水清洗菌体1-3次，分别于6000-20000rpm离心5-30min，收集菌体，即得类球红细菌湿菌体；
(4)制备类球红细菌提取液
研磨法
取菌体加石英砂研磨10-30min，研磨成匀浆，再按菌体/磷酸缓冲液质量比为1∶5-1∶30添加pH6-9磷酸缓冲液震荡20-60min，其中菌体：石英砂的质量比为(0.5-2)：(2-5)；
或超声波法
取菌体按菌体/磷酸缓冲液质量比为1∶5-1∶30添加pH6-9磷酸缓冲液，震荡混匀后用冰浴超声波粉碎仪进行破壁处理：振幅20-60％、工作/间隔时间0.5-2min/0.5-2min，冰浴超声波总时间10-30min，最后震荡20-60min；
或酶法辅助超声波法
采用溶菌酶和磷酸缓冲液对菌体进行酶解，溶菌酶添加量为0.05-1mg溶菌酶/g菌体，菌体/磷酸缓冲液质量比为1∶5-1∶30，酶解温度25-50℃，酶解pH值5-9，酶解时间30-150min；然后进行冰浴超声波处理：振幅20-60％、工作/间隔时间0.5-2min/0.5-2min，冰浴超声波总时间10-30min；最后震荡20-60min；
或纳米研磨法
将类球红细菌湿菌体放入高能纳米冲击磨罐中，于1-8℃下震磨6-10h，然后按菌体/磷酸缓冲液质量比1∶5-1∶30加入pH6-9的磷酸缓冲液，震荡20-60min；
SOD提取液收集
将采用不同破壁提取方法提取菌体中SOD后，于6000-20000rpm离心10-60min，收集上清液即为SOD提取液。
4.一种具有抗氧化活性的类球红细菌辅酶Q10提取液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)菌种活化
配制固体培养基(质量百分含量，以下同)：葡萄糖1-5％，胰蛋白胨0.5-5％，酵母粉0.5-5％，氯化钠0.5-2％，琼脂1.5-2％，pH＝7-9；并将其与培养皿置于121℃高压蒸汽灭菌15-30min；然后无菌条件下，倒平板，挑类球红细菌进行平板划线；将平板置于28-37℃培养，2-7d；
配置斜面培养基，斜面培养基与上述固体培养基一样，并于121℃高压蒸汽灭菌15-30min；无菌条件下，挑取上述平板上的类球红细菌单菌落进行斜面接种；然后将斜面置于28-37℃培养，2-7d；
(2)类球红细菌发酵
①种子培养：
种子培养基液体：葡萄糖1-5％，胰蛋白胨0.5-5％，酵母粉0.5-5％，氯化钠0.5-2％，pH＝7-8；并于121℃高压蒸汽灭菌15-30min；
用无菌接种环从步骤(1)活化后的类球红细菌斜面中取菌体一环，接种到盛有(优选250mL三角瓶中含有20mL种子培养基液体)种子培养基液体的三角瓶中，于28-37℃，150-200r/min摇床振荡培养12-36h，得到液体种子；
然后无菌条件下，将得到的液体种子按5-10％的接种量接种于灭菌的种子培养基中，于28-37℃，150-200r/min摇床振荡培养12-42h，得到活化的液体种子；
②发酵：
液体发酵培养基：葡萄糖0.1-10％，牛肉膏0.05-5％，磷酸氢二钾0.05-0.15％，磷酸二氢钾0.03-0.10％，无水氯化钙0.002-0.02％，EDTA0.001-0.01％，生长因子溶液0.5-2％，微量元素溶液0.5-2％，pH＝7-8；微量元素溶液配方：硫酸锰0.08-0.3％；并于121℃高压蒸汽灭菌15-30min，其中生长因子溶液配方：维生素B10.05-0.2％，烟酰胺(VPP)0.05-0.2％，生物素0.001-0.002％，对氨基苯甲酸0.05-0.2％，生长因子过滤除菌；
按照3-15％的接种量将①摇床活化的液体种子接种到盛有液体发酵培养基的三角瓶中，于28-37℃，100-270r/min摇床振荡培养24-60h，得类球红细菌发酵液；
(3)类球红细菌离心分离
取步骤(2)类球红细菌发酵液于6000-20000rpm离心5-30min，收集菌体，弃上清，再用蒸馏水清洗菌体1-3次，分别于6000-20000rpm离心5-30min，收集菌体，即得类球红细菌湿菌体；
(4)制备类球红细菌提取液
研磨法：
取菌体加石英砂研磨10-30min，研磨成匀浆，按菌体/甲醇-氯仿溶液质量比为1：5-1：35添加甲醇-氯仿(体积比为1︰2)溶液震荡20-60min，其中菌体：石英砂的质量比(0.5-2)：(2-5)；
或超声波法：
取菌体按菌体/甲醇-氯仿溶液质量比为1：5-1：35添加甲醇-氯仿溶液，其中甲醇-氯仿体积比为1︰2，震荡混匀后用超声波粉碎仪进行破壁处理：振幅20-60％、工作/间隔时间0.5-2min/0.5-2min，冰浴超声波总时间5-30min；最后震荡20-60min；
或酶法辅助超声波法：
采用溶菌酶和磷酸缓冲液对菌体进行酶解，溶菌酶添加量为0.05-1mg溶菌酶/g菌体，按菌体/磷酸缓冲液的质量比1∶5-1∶35，酶解温度25-50℃，酶解pH值5-9，酶解时间30-180min；酶解后于6000-20000rpm离心5-30min，收集菌体；按菌体/甲醇-氯仿溶液质量比为1∶5-1∶35添加甲醇-氯仿溶液悬浮菌体，其中甲醇-氯仿体积比为1︰2；然后进行冰浴超声波处理：振幅20-60％、工作/间隔时间0.5-2min/0.5-2min，冰浴超声波总时间10-30min；最后震荡20-60min；
或纳米研磨法：
将类球红细菌湿菌体放入高能纳米冲击磨罐中，于1-8℃下震磨5-12h，然后按菌体/甲醇-氯仿溶液质量比1∶5-1∶35加入甲醇-氯仿溶液，其中甲醇-氯仿体积比为1︰2，震荡20-60min；
辅酶Q10提取液收集
采用不同破壁提取方法提取菌体中辅酶Q10后，于6000-20000rpm离心10-60min，取上清液，用旋转蒸发仪于20–55℃进行旋转蒸法，将上清液浓缩干，按菌体/无水乙醇质量比为1∶5-1∶35添加1∶5-1∶35加入无水乙醇溶解样品，得到辅酶Q10提取液。
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