CN104805168A

CN104805168A - 利用光合细菌微氧发酵快速生产类胡萝卜素的方法

Info

Publication number: CN104805168A
Application number: CN201510219267.4A
Authority: CN
Inventors: 赵志平; 聂鑫; 张利; 肖长江; 赵阳; 刘兴波
Original assignee: Sichuan University of Science and Engineering
Current assignee: Sichuan University of Science and Engineering
Priority date: 2015-04-30
Filing date: 2015-04-30
Publication date: 2015-07-29
Anticipated expiration: 2035-04-30
Also published as: CN104805168B

Abstract

本发明公开了利用光合细菌微氧发酵快速生产类胡萝卜素的方法，具体步骤如下：将活化的光合细菌(Rhodobacter sphaeroides)接种至MMS培养基中，好氧培养至OD600为0.6-0.8，然后调节培养条件至微氧，诱导类胡萝卜素快速大量合成，然后进行提取、纯化，利用本发明方法发酵生产类胡萝卜素的时间短，仅需要36小时，且菌体产量高达6g/L，类胡萝卜素的产量和产率分别是8.287mg/L和1911μg/g，具有良好的清除DPPH自由基的能力，IC₅₀约为8μg/mL。

Description

利用光合细菌微氧发酵快速生产类胡萝卜素的方法

技术领域

本发明属于发酵领域，具体涉及利用光合细菌微氧发酵快速生产类胡萝卜素的方法。

背景技术

类胡萝卜素是一类脂溶性色素，大多难溶于水，可溶于有机溶剂，是全球生态系统中的一大类色素，是自然界中分布非常广泛和十分重要的色素之一。类胡萝卜素能增加机体免疫功能和细胞之间的缝间联接交流，具有抗氧化功能、抗癌功能、能量传递等重要功能。因其抗氧化性，成为国际药物、膳食补充剂、功能食品等领域广泛关注的新型抗氧化活性物质，被誉为二十一世纪抗氧化剂时代的“新贵”。

化学合成的类胡萝卜素不易被人体吸收，并且有一定的毒副作用，没有被大规模采用。相反，天然类胡萝卜素却受到越来越多的研究与重视。目前，天然类胡萝卜素的来源主要是从天然植物中提取和微生物发酵获取。从植物中提取类胡萝卜素的产量较低，提取成本较高，浪费较大，并且受季节性影响较大。利用光合细菌发酵生产天然类胡萝卜素是目前获取类胡萝卜素的重要来源之一。光合细菌广泛分布在江河、沼泽、海洋以及污泥等，生命力非常强、容易培养、生长繁殖速度快、本身无毒，富含蛋白质、维他命，成为现代生物技术研究的热点。光合细菌富含天然类胡萝卜素，容易分离提取，色彩鲜艳。目前，光合细菌色素广泛应用于油脂类、水果蔬菜类、豆制品和饮料等的着色。类胡萝卜素是光合细菌最重要的光合色素之一，具有吸收光能的作用，其主要作用是抗光氧化破坏，驱散多余的辐射能，保持捕光系统的结构和丰度。虽然光合细菌富含天然类胡萝卜素，但是目前光合细菌还未真正用于工业化规模生产天然类胡萝卜素。其中一个重要原因在于目前采用的光合细菌发酵生产天然类胡萝卜素方法是光照发酵法，该法非常耗时，发酵周期1-2周，甚至更长，严重影响效率。因此，建立一种利用光合细菌微氧发酵快速生产类胡萝卜素的方法是非常必要的。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供利用光合细菌微氧发酵快速生产类胡萝卜素的方法，方法简单，能够使光合细菌Rhodobacter sphaeroides类胡萝卜素合成途径结构基因获得高效表达，菌体量大，类胡萝卜素产量高，具有良好的清除DPPH自由基的能力。

为实现上述发明目的，本发明的提供如下技术方案：

利用光合细菌微氧发酵快速生产类胡萝卜素的方法，包括如下步骤：将活化的光合细菌(Rhodobacter sphaeroides)单菌落接种到MMS培养基中，好氧过夜培养获得种子；然后按接种量为8％将好氧过夜培养的种子分别接种到含有MMS培养基的培养瓶中，接种后培养液体积相当于培养瓶体积的40％，然后在转速为200～250rpm、温度为30～32℃、黑暗条件下好氧发酵至OD600为0.6-0.8；合并发酵液，使发酵液体积相当于培养瓶体积的80％，再在转速为140～150rpm、温度为30-32℃、黑暗条件下微氧发酵36小时。

优选的，所述好氧发酵的条件是在温度为30℃、转速为250rpm、黑暗条件下培养。

优选的，所述微氧发酵的条件是在温度为30℃、转速为150rpm、黑暗条件下培养。

优选的，所述活化的光合细菌由以下方法制得：先将光合细菌划线培养于MMS固体培养基上至长出红色单菌落，然后挑取红色单菌落接种于MMS体培养基中至光合细菌长至粉红色。

优选的，所述MMS培养基的组分及浓度如下：DL-苹果酸3g/L；MgSO₄×7H₂O 0.2g/L；(NH₄)₂SO₄ 1.2g/L；CaCl₂×2H₂O 0.07g/L；微量元素溶液1.5ml/L，NaOH调节pH至6.9，高压蒸汽灭菌后按20ml/L和8ml/L分别加入50×磷酸溶液和维生素缓冲液；

所述微量元素溶液各组分及浓度如下：Fe(III)-Citrat 500mg/L，MnCl₂×4H₂O 20mg/L，ZnCl₂ 5mg/L，LiCl 5mg/L，KI 2.5mg/L，KBr 2.5mg/L，CuSO₄ 0.15mg/L；

所述50×磷酸溶液各组分及浓度如下：K₂HPO₄ 45g/L，KH₂PO₄ 30g/L；

所述维生素缓冲液各组分及浓度如下：烟酸200mg/L，维生素B1 400mg/L，烟酰胺200mg/L，生物素8mg/L。

更优选的，诱导类胡萝卜素合成后还包括类胡萝卜素的提取步骤，具体为：收集发酵液，离心收集菌体，然后向菌体中加入萃取剂重悬菌体，重悬后进行超声波破碎，再离心收集上清，接着向上清液中按照料液比为1:40补足萃取剂浸提，离心收集上清，沉淀再按料液比为1:40加入萃取剂浸提，再次离心收集上清液，合并上清液，减压蒸馏抽干，残余物用乙醚溶解，然后加入等体积质量分数为10％的KOH甲醇液皂化，再用质量分数为5％的NaCl溶液萃取，收集醚层并用质量分数为5％的NaCl溶液洗涤去除甲醇，最后抽干乙醚，得类胡萝卜素；所述萃取剂为丙酮和甲醇体积比为7:2的溶液。

本发明的有益效果在于：利用微氧发酵法，建立了一种利用光合细菌Rb.sphaeroides快速发酵生产类胡萝卜素的方法，利用微氧黑暗条件快速发酵生产类胡萝卜素，经发酵后离心收集菌体，用超声波破碎细胞，经丙酮甲醇(7:2)混合液分级浸提后减压蒸馏抽干，用适量乙醚溶解后加入等体积的10％的KOH甲醇溶液皂化处理除去细菌叶绿素，再用5％的NaCl溶液分层处理分离甲醇和细菌叶绿素，最后减压蒸馏抽干得到类胡萝卜素粉末，并进行清除DPPH自由基试验，该发明可用于利用微生物快速发酵生产类胡萝卜素，且发酵时间短，仅用36h，较传统光照发酵法大大缩短了发酵周期，对促进光合细菌工业化规模生产类胡萝卜素具有重要的意义。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为本发明的光合细菌微氧发酵大量合成类胡萝卜素后的颜色。

图2为类胡萝卜素皂化前后的紫外可见扫描分析。

图3为类胡萝卜素的TLC分析。

图4为类胡萝卜素的稳定性分析。

图5为类胡萝卜素清除DPPH自由基分析。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

本发明所使用的实验材料如下：

(1)MMS培养基(Malate Minimal Salt-Medium)：DL-Malic-Acid 3g/L；MgSO₄×7H₂O0.2g/L；(NH₄)₂SO₄ 1.2g/L；CaCl₂×2H₂O 0.07g/L；微量元素溶液(Trace Metal Solution)1.5ml/L，NaOH调节pH至6.9，高压蒸汽灭菌后分别按20ml/L和8ml/L加入50×磷酸溶液和维生素缓冲液(参考文献见：Drew,G.(1983)Mikrobiologisches Praktikum.Heidelberg:Springge-Verlag)。

(2)微量元素溶液：Fe(III)-Citrat 500mg/L，MnCl₂×4H₂O 20mg/L，ZnCl₂ 5mg/L，LiCl5mg/L，KI 2.5mg/L，KBr 2.5mg/L，CuSO₄ 0.15mg/L，灭菌后4℃保存。

(3)50×磷酸溶液：K₂HPO₄ 45g/L，KH₂PO₄ 30g/L。

(4)维生素缓冲液：烟酸200mg/L，维生素B1 400mg/L，烟酰胺200mg/L，生物素8mg，过滤灭菌，4℃放置。

(5)丙酮甲醇(7:2)混合液：准确量取丙酮350mL丙酮倒入500mL的棕色瓶中，然后加入100mL的甲醇，混匀。

(6)10％KOH甲醇溶液：准确称取100g KOH，溶于适量的甲醇中，搅拌溶解，补充甲醇至1000mL。

(7)TLC展开剂：正己烷：甲醇：丙酮按体积比为70:29:1混合。

(8)0.1mM DPPH：精密称取3.9mg DPPH，用移液管量取10mL甲醇溶解到比色管，再用移液管转移到100mL容量瓶中，甲醇定容至100mL，即配成0.1mM的DPPH。

(9)5％NaCl：准确称取50g NaCl，溶于适量的水中，充分溶解，补充水至1000mL。

实施例1、光合细菌的活化

将-80℃保存的光合细菌(Rb.sphaeroides)划线培养于MMS固体培养基上，在30℃培养大约4d长出红色单菌落；然后，挑取红色单菌落接种于装有10～20mL MMS液体培养基的50mL锥形瓶中，再在30℃、200rpm条件下培养18h，至光合细菌长至粉红色。

实施例2、微氧发酵快速生产类胡萝卜素

以8％接种量，将实施例1活化的光合细菌分别接种到2瓶装有100mL MMS培养基的250mL的锥形瓶中，在温度为30℃、转速为250rpm、黑暗条件下好氧发酵至OD600＝0.8左右，然后将两瓶发酵液合并为一瓶，使得发酵液的体积占到锥形瓶总体积的80％，再在温度为30℃、转速为150rpm、黑暗条件下继续微氧发酵36h，快速诱导发酵大量合成类胡萝卜素，发酵液颜色变为暗红色，如图1所示。

本实施例中，好氧发酵的条件是在转速为200～250rpm、温度为30～32℃均可，好氧发酵终点OD600为0.6-0.8均可；微氧发酵的转速为140～150rpm、温度为30-32℃均可实现发明目的。

实施例3、类胡萝卜素的提取

将实施例2的发酵液于10000rpm、4℃条件下离心10min，弃上清，用蒸馏水漂洗1次，干燥后称重，结果显示菌体产量超过6g/L。本方法较光照发酵法生产类胡萝卜素相比，发酵时间仅用36h，大大缩短了发酵时间，同时可以通过发酵液的颜色快速判断类胡萝卜素的生物合成情况。

然后向菌体中加入适量的丙酮甲醇体积比为7:2的萃取剂重悬菌体，超声波破碎；超声波破碎条件为：功率300W，击3s，间隔5s，冰浴，持续30min。破碎后再在10000rpm、4℃条件下离心10min，收集上清，按照料液比为1:40的比率补足丙酮甲醇体积比为7:2的萃取剂，置于摇床中，黑暗条件下，150rpm，浸提1h，离心，收集上清；沉淀再按料液比为1:40加入丙酮甲醇体积比为7:2的萃取剂，再次浸提沉淀中的类胡萝卜素，再次离心收集上清。在480nm处测定两次上清的吸光度值，利用公式：产量(mg/l)＝ADV₁/0.16V₂，提取产率(μg/g)＝ADV₁/0.16W。其中A表示480nm处的吸光值，D表示稀释倍数，0.16表示类胡萝卜素的消光系数，V₁表示提取剂的体积；V₂表示用于提取色素的发酵液体积，W表示细菌干重。计算结果显示，类胡萝卜素的产量和产率分别是8.287mg/L和1911μg/g。

将抽提液在55℃左右减压蒸馏抽干后，将残余物溶于少量乙醚中，加入等体积10％的KOH的甲醇液，置于摇床中，50rpm，黑暗条件下振荡1～2h。待充分皂化后，用5％NaCl水溶液洗涤，萃取分离，静置30min，上层为红色的醚层，含有类胡萝卜素；下层为绿色的水相，表明里面含有大量的菌绿素，反复萃取2次。皂化处理去除溶液中的细菌叶绿素，提高了类胡萝卜素的纯度。抽提出的醚层再用5％的NaCl溶液洗涤3次以除去甲醇，进一步提高类胡萝卜素的纯度和安全度，再在50℃抽干乙醚即得到红色类胡萝卜素粉末。将得到的类胡萝卜素进行紫外可见扫描分析和TLC薄层层析，结果分别如图2和图3所示。从图2可以看出，皂化后的类胡萝卜素在480nm附近有最大光谱吸收，符合类胡萝卜素的光谱吸收特征。从图3可以看出，皂化后的类胡萝卜素样品出现多条不同颜色的条带，并计算出了各个成分的比移值，符合类胡萝卜素。

分析提取类胡萝卜素对温度、酸和光照强度稳定性：将类胡萝卜素在温度分别为30℃、50℃、70℃和90℃条件下放置3h，结果如图4中A所示。从图4中A可以看出，类胡萝卜素的稳定性随着温度的增加而降低，但90℃时类胡萝卜素的损失率仅为13.61％，所以总体上温度对类胡萝卜素的影响较小。然后测定类胡萝卜素在酸碱中稳定性，取适量的纯化类胡萝卜素粉末，溶于甲醇中，各取5ml于10ml比色管中，分别加入0.1％、0.5％、1％、2％和4％的盐酸和KOH溶液定容至10ml在室内暗处放置2h，结果如图4中B所示。由图4中B可以看出，类胡萝卜素在碱中较稳定，这种稳定性并不随碱浓度增大而减弱；在酸中不稳定，且酸浓度越大，类胡萝卜素越易分解。将再将类胡萝卜素分别在黑暗、室内自然光和2000Lux的光照处理，并分别于0h、8h、16h和24h取样测定类胡萝卜素的损失率，结果如图4中C所示。从图4中C可以看出，类胡萝卜素在黑暗和室内自然光下比较稳定，但在2000Lux的光照下损失率达到76.29％。

实施例4、类胡萝卜素清除DPPH自由基

DPPH(1,1-二苯基-2-苦肼基自由基)是一种稳定自由基，具有一个未配对电子，接受1个e^-或H⁺才能到稳定，甲醇溶液呈深紫色。当有自由基清除剂存在时，DPPH溶液的颜色会变浅，吸光值将会下降，由于其吸光值下降是呈线性，所以可以用来评价试验样品的抗氧化能力。用清除率来表示此抗氧化能力，清除率越大则抗氧化性越强。

分别配制成2.438μg/mL、3.078μg/mL、3.45μg/mL、5.119μg/mL、6.0μg/mL、7.706μg/mL、7.769μg/mL、8.175μg/mL和9.956μg/mL的类胡萝卜素溶液。然后，分别取1mL各浓度的类胡萝卜素和2mL的0.1mM的DPPH于具塞比色管，混匀，黑暗、室温反应30min，测定OD₅₁₇的吸光值，计算DPPH自由基清除率。

A₁为纯DPPH的OD，A₂为加了自由基清除剂的DPPH的OD，A₃自由基清除剂的OD。

实验结果表明，清除DPPH自由基的能力分别为13.51％、17.55％、19.05％、29.33％、31.64％、43.53％、44.0％、50.85％和56.47％。清除DPPH自由基的能力随着浓度的升高而增强，如图5所示。从图中可以看出类胡萝卜素对DPPH自由基清楚的IC₅₀约为8μg/mL，说明提取的类胡萝卜素具有良好的清除DPPH自由基的能力。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims

1.利用光合细菌微氧发酵快速生产类胡萝卜素的方法，其特征在于，包括如下步骤：将活化的光合细菌(Rhodobacter sphaeroides)单菌落接种到MMS培养基中，好氧过夜培养获得种子；然后按接种量为8％将好氧过夜培养的种子分别接种到含有MMS培养基的培养瓶中，接种后培养液体积相当于培养瓶体积的40％，然后在转速为200～250rpm、温度为30～32℃、黑暗条件下好氧发酵至OD600为0.6-0.8；合并发酵液，使发酵液体积相当于培养瓶体积的80％，再在转速为140～150rpm、温度为30-32℃、黑暗条件下微氧发酵36小时。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述好氧发酵的条件是在温度为30℃、转速为250rpm、黑暗条件下培养。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述微氧发酵的条件是在温度为30℃、转速为150rpm、黑暗条件下培养。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化的光合细菌由以下方法制得：先将光合细菌划线培养于MMS固体培养基上至长出红色单菌落，然后挑取红色单菌落接种于MMS液体培养基中至光合细菌长至粉红色。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述MMS培养基的组分及浓度如下：DL-苹果酸3g/L；MgSO₄×7H₂O 0.2g/L；(NH₄)₂SO₄1.2g/L；CaCl₂×2H₂O 0.07g/L；微量元素溶液1.5ml/L，NaOH调节pH至6.9，高压蒸汽灭菌后按20ml/L和8ml/L分别加入50×磷酸溶液和维生素缓冲液；

所述微量元素溶液各组分及浓度如下：Fe(III)-Citrat 500mg/L，MnCl₂×4H₂O 20mg/L，ZnCl₂5mg/L，LiCl 5mg/L，KI 2.5mg/L，KBr 2.5mg/L，CuSO₄0.15mg/L；

所述50×磷酸溶液各组分及浓度如下：K₂HPO₄45g/L，KH₂PO₄30g/L；

所述维生素缓冲液各组分及浓度如下：烟酸200mg/L，维生素B1400mg/L，烟酰胺200mg/L，生物素8mg。

6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于：诱导类胡萝卜素合成后还包括类胡萝卜素的提取步骤，具体为：收集发酵液，离心收集菌体，然后向菌体中加入萃取剂重悬菌体，重悬后进行超声波破碎，再离心收集上清，接着向上清液中按照料液比为1:40补足萃取剂浸提，离心收集上清，沉淀再按料液比为1:40加入萃取剂浸提，再次离心收集上清液，合并上清液，减压蒸馏抽干，残余物用乙醚溶解，然后加入等体积质量分数为10％的KOH甲醇液皂化，再用质量分数为5％的NaCl溶液萃取，收集醚层并用质量分数为5％的NaCl溶液洗涤去除甲醇，最后抽干乙醚，得类胡萝卜素；所述萃取剂为丙酮和甲醇体积比为7:2的溶液。