CN107557306A - 一种具有抑菌活性的底泥微生物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有抑菌活性的底泥微生物，该微生物从中国浙江省舟山市六横镇美国红鱼养殖池底泥中分离筛选获得，经18sRNA测序提交至NCBI并且对比生物性状相似度，确定微生物为Cordyceps cylindrica SKL‑1，将冻干微生物活化后进行种子液培养，然后经扩大发酵培养，从培养液中提取得到抑菌活性物质。有益效果为：抑菌活性物质的稳定性好、抑菌活性强且具有广谱抗菌性，微生物产抑菌活性物质效率较高，提取时间较短，以双频率复合超声波辅助萃取，可以大大提高抑菌活性物质的萃取分离效率。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其是涉及一种具有抑菌活性的底泥微生物。
技术背景
微生物包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物、显微藻类等在内的一大类生物群体，它个体微小，与人类关系密切。涵盖了有益跟有害的众多种类，广泛涉及食品、医药、工农业、环保等诸多领域。工业微生物涉及食品、制药、冶金、采矿、石油、皮革、轻化工等多种行业。通过微生物发酵途径生产抗生素、丁醇、维生素C以及一些风味食品的制备等；某些特殊微生物酶参与皮革脱毛、冶金、采油采矿等生产过程，甚至直接作为洗衣粉等的添加剂；另外还有一些微生物的代谢产物可以作为天然的微生物杀虫剂广泛应用于农业生产。感染性疾病在临床上具有高致死率的一大疾病，寻找新型抗生素是一项刻不容缓的任务。从天然产物中寻找药物具有悠久的历史和传统，其中微生物来源的抗生素具有巨大的潜力。
关于从微生物中提取抑菌剂的方法有很多，现有技术如授权公众号为
CN 102772447 B的中国发明专利，公开了一种从粉虱座壳孢菌代谢物中提取抑菌剂的方法，该发明方法将粉虱座壳孢菌经液体培养、分离、加有机溶剂萃取、浓缩制得抑菌物，具有来源天然、无毒副作用的优点，但是该发明方法提取抑菌剂需要30-40天，其培养周期太长，增大了时间成本。
发明内容
本方法的目的在于提供一种具有抑菌活性的底泥微生物，抑菌活性物质性质稳定、抑菌效果较强，而且活性物质提取时间短、产率较高。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：一种具有抑菌活性的底泥微生物，从中国浙江省舟山市六横镇美国红鱼养殖池处底泥中分离筛选获得，经18sRNA测序后提交到美国国家生物技术信息中心（NCBI），NCBI系统会自动比对基因序列相似度，选取相似度99%以上的菌种经一一比对生物性状相似度，最终鉴定结果为Cordycepscylindrica SKL-1。
通过上述Cordyceps cylindrica SKL-1分离提取具有抑菌活性物质的方法包括以下步骤：
种子液培养：无菌条件下，取0.5-1.0gCordyceps cylindrica SKL-1冻干菌置于培养皿中，用无菌细管吸取5-10mL培养液，使冻干菌体溶解成悬浮状；活化5-15分钟后将Cordyceps cylindrica KL-1接种入斜面培养基中，在32-35℃条件下恒温培养24-40小时，加入培养基等量的无菌蒸馏水即得种子液；将冻干的Cordyceps cylindrica KL-1经活化后接种入斜面培养基中培养，可以使Cordyceps cylindrica KL-1迅速地恢复到活力旺盛的状态，得到纯而壮的培养物，有利于发酵培养中代谢产物的生成；
扩大发酵培养：在发酵培养液中接种入6-8%的种子液，将发酵培养液放置在气浴恒温振荡器中，在发酵温度为22-25℃，摇床转速为200-210r/min的条件下进行发酵扩大培养，发酵培养24-50小时；发酵培养液可以为Cordyceps cylindrica SKL-1提供足量的碳源、氮源、微量元素、生长因子等物质，促使Cordyceps cylindrica SKL-1进行生长繁殖与新陈代谢，微生物在发酵培养中后期代谢分泌出大量的次级代谢产物，次级代谢产物中的活性物质具有较强的抑菌活性；
提取活性物质：在发酵液中加入等体积的乙酸乙酯灭活，将发酵液在800-900r/min转速下搅拌5-15分钟，抽滤2-3次滤除菌体后取滤液；在滤液中加入1.8-2.0倍体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取3-4次分离水相和有机相，每次萃取以双频率复合超声波辅助，每次萃取保留上层类黄色澄清液体即有机相，将有机相合并后冷冻干燥即得活性物质；通过中高速搅拌使菌体与次级代谢产物分离，然后抽滤滤除掉破碎的菌体，通过冷冻干燥萃取时的上层类黄色澄清液体即得到抑菌活性物质，双频率复合超声波有助于提高提取效率，提取方法简单容易操作，低温干燥可以保持抑菌活性物质的活性。
作为优选，培养基的组成及其浓度为：马铃薯粉120-140g/L，葡萄糖30-45g/L，琼脂10-12g/L，氯化钠32.0-35.0g/L、硫酸镁3.5-3.8g/L、氯化钙2.5-3.5g/L、碘化钾1.7-2.0g/L、硼酸锌0.040-0.045g/L、硅酸钠0.0022-0.0025g/L、磷酸亚铁0.072-0.080g/L、3-硝基-2,6-二氯吡啶0.0022-0.0025g/L、氨水0.002-0.0022g/L、硝酸锂0.0031-0.0033g/L、余量为无菌蒸馏水；调节pH为7.2-7.4，在121-123℃温度下高压灭菌15-25分钟；微量的3-硝基-2,6-二氯吡啶可以提高Cordyceps cylindrica SKL-1真菌产天门冬氨酸转氨甲酰酶和蛋白酶的产速，从而可以加快Cordyceps cylindrica SKL-1的繁殖生长，加速其活化，使真菌迅速恢复生命力，提高效率与产能；培养基的拟生长环境不仅为Cordycepscylindrica SKL-1提供足够的碳源、氮源、微量元素、生长因子等物质，还可以使真菌恢复到生长繁殖旺盛的状态，促使其次级代谢产物的分泌，提高抑菌活性物质的含量。
作为优选，发酵培养液的组成及其浓度为：可溶性淀粉13-15g/L，蛋白胨2.0-3.5g/L，抑制剂0.02-0.025g/L，海水素33-35g/L，余量为无菌蒸馏水，调节pH为7.2-7.4，在121-123℃温度下高压灭菌20-30分钟；抑制剂是重量比为0.32-0.34:1的L-（-）-甘油醛与D-（+）-甘油醛；发酵环境下，Cordyceps cylindrica SKL-1可以通过高强度的繁殖代谢分泌出次级代谢产物，次级代谢产物中的有效成分具有较强、广谱的抑菌活性；抑制剂可以抑制Cordyceps cylindrica SKL-1促初级代谢产物分泌的酶的活性，从而抑制其初级代谢反应的进行，降低初级代谢反应对分叉中间体的利用，从而使Cordyceps cylindrica SKL-1将分叉中间体更多的用于次级代谢反应，进而提高次级代谢产物的产率与产量。
作为优选，双频率复合超声波的频率分别为30-45kHz与60-90kHz，功率密度分别为0.40-0.45W/cm2与0.50-0.60W/cm2；双频率复合超声波各自的空化效应可以发生协同作用，所产生的空化效应较之单频甚至双频交替要强的多，其所产生的空化崩溃次数也较多，分离水溶性物质与油溶性物质的效率得到较大的提高，辅助萃取完成抑菌活性物质的提取，提高提取效率。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明方法中的抑菌活性物质的稳定性与活性很高，提取效率较高，提取时间较短，以双频率复合超声波辅助萃取分离抑菌活性物质，可以大大提高抑菌活性物质的纯度，提高产能；2）种子液培养基可以通过提高真菌产天门冬氨酸转氨甲酰酶和蛋白酶的产速，可以加快Cordyceps cylindrica SKL-1的繁殖生长，加速其活化，使真菌迅速恢复生命力，提高效率与产能；3）发酵培养液中的抑制剂可以抑制利于促进初级代谢产物分泌的酶的活性，从而抑制其初级代谢反应的进行，降低初级代谢反应对分叉中间体的利用，从而使Cordyceps cylindrica SKL-1将分叉中间体更多的用于次级代谢反应，进而提高次级代谢产物的产率与产量。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
一种具有抑菌活性的底泥微生物，该微生物筛选分离自中国浙江省舟山市六横镇美国红鱼养殖池处底泥中，经18sRNA测序后提交到美国国家生物技术信息中心（NCBI），NCBI系统会自动比对基因序列相似度，选取相似度99%以上的菌种经一一比对生物性状相似度，最终鉴定结果为Cordyceps cylindrica SKL-1。
通过上述Cordyceps cylindrica SKL-1分离提取具有抑菌活性物质的方法包括以下步骤：
1）种子液培养：培养基的组成及其浓度为：马铃薯粉120g/L，葡萄糖30g/L，琼脂10g/L，氯化钠32.0g/L、硫酸镁3.5g/L、氯化钙2.5g/L、碘化钾1.7g/L、硼酸锌0.040g/L、硅酸钠0.0022g/L、磷酸亚铁0.072g/L、3-硝基-2,6-二氯吡啶0.0022g/L、氨水0.002g/L、硝酸锂0.0031g/L、余量为无菌蒸馏水；调节pH为7.2，在121℃温度下高压灭菌15分钟；培养液中琼脂含量为0；无菌条件下，取0.8gCordyceps cylindrica SKL-1冻干菌置于培养皿中，用无菌细管吸取8mL培养液，使冻干菌体溶解成悬浮状；活化10分钟后将Cordyceps cylindricaKL-1接种入斜面培养基中，在34℃条件下恒温培养36小时，加入培养基等量的无菌蒸馏水即得种子液；
2）扩大发酵培养：发酵培养液的组成及其浓度为：可溶性淀粉13g/L，蛋白胨2.0g/L，抑制剂0.02g/L，海水素33g/L，余量为无菌蒸馏水，调节pH为7.2，在121℃温度下高压灭菌20分钟；抑制剂是重量比为0.32:1的L-（-）-甘油醛与D-（+）-甘油醛的混合物；在发酵培养液中接种入8%的种子液，将发酵培养液放置在气浴恒温振荡器中，在发酵温度为24℃，摇床转速为200r/min的条件下进行发酵扩大培养，发酵培养36小时；
3）提取活性物质：在发酵液中加入等体积的乙酸乙酯灭活，将发酵液在800r/min转速下搅拌5分钟，抽滤2次滤除菌体后取滤液；在滤液中加入1.8倍体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取3次分离水相和有机相，每次萃取以双频率复合超声波辅助，频率分别为30kHz与60kHz，功率密度分别为0.40W/cm2与0.50 W/cm2，每次萃取保留上层类黄色澄清液体即有机相，将有机相合并后冷冻干燥即得活性物质。
实施2：
通过Cordyceps cylindrica SKL-1分离提取具有抑菌活性物质的最优方法，包括以下步骤：
种子液培养：无菌条件下，取1.0gCordyceps cylindrica SKL-1冻干菌置于培养皿中，用无菌细管吸取10mL培养液，使冻干菌体溶解成悬浮状；活化15分钟后将Cordycepscylindrica KL-1接种入斜面培养基中，在35℃条件下恒温培养40小时，加入培养基等量的无菌蒸馏水即得种子液；将冻干的Cordyceps cylindrica KL-1经活化后接种入斜面培养基中培养，可以使Cordyceps cylindrica KL-1迅速地恢复到生机旺盛的状态，有利于发酵培养中代谢产物的生成；
扩大发酵培养：在发酵培养液中接种入8%的种子液，将发酵培养液放置在气浴恒温振荡器中，在发酵温度为24℃，摇床转速为200r/min的条件下进行发酵扩大培养，发酵培养48小时；发酵培养液可以为Cordyceps cylindrica SKL-1提供足量的碳源、氮源、微量元素、生长因子等物质，促使Cordyceps cylindrica SKL-1代谢分泌出大量的次级代谢产物，为次级代谢产物中活性物质的提取做准备；
提取活性物质：在发酵液中加入等体积的乙酸乙酯灭活，将发酵液在900r/min转速下搅拌10分钟，抽滤3次滤除菌体后取滤液；在滤液中加入2.0倍体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取4次分离水相和有机相，每次萃取以双频率复合超声波辅助，频率分别为40kHz与60kHz，功率密度分别为0.45W/cm2与0.55W/cm2，每次萃取保留上层类黄色澄清液体即有机相，将有机相合并后冷冻干燥即得活性物质；通过中高速搅拌使菌体与次级代谢产物分离，然后抽滤滤除掉破碎的菌体，通过冷冻干燥萃取时的上层类黄色澄清液体即得到抑菌活性物质，提取方法简单，双频率超声波辅助可以有效提高萃取效率，缩短萃取时间，降低成本，将活性物质在低温下干燥保存可以保持抑菌活性物质的活性。
培养基的组成及其浓度为：马铃薯粉140g/L，葡萄糖40g/L，琼脂10g/L，氯化钠33.0g/L、硫酸镁3.5g/L、氯化钙3.0g/L、碘化钾2.0g/L、硼酸锌0.040g/L、硅酸钠0.0025g/L、磷酸亚铁0.075g/L、3-硝基-2,6-二氯吡啶0.0024g/L、氨水0.002g/L、硝酸锂0.0032g/L、余量为无菌蒸馏水；调节pH为7.2，在121℃温度下高压灭菌20分钟；微量的3-硝基-2,6-二氯吡啶可以提高Cordyceps cylindrica SKL-1真菌产天门冬氨酸转氨甲酰酶和蛋白酶的产速，从而可以加快Cordyceps cylindrica SKL-1的繁殖生长，加速其活化，使真菌迅速恢复生命力，提高效率与产能；培养基的拟生长环境不仅为Cordyceps cylindrica SKL-1提供足够的碳源、氮源、微量元素、生长因子等物质，还可以使真菌恢复到生长繁殖旺盛的状态，促使其次级代谢产物的分泌，提高抑菌活性物质的含量。
发酵培养液的组成及其浓度为：可溶性淀粉14g/L，蛋白胨2.5g/L，抑制剂0.024g/L，海水素34g/L，余量为无菌蒸馏水，调节pH为7.3，在121℃温度下高压灭菌20分钟；抑制剂是重量比为0.34:1的L-（-）-甘油醛与D-（+）-甘油醛；抑制剂可以抑制Cordycepscylindrica SKL-1促初级代谢产物分泌的酶的活性，从而抑制其初级代谢反应的进行，降低初级代谢反应对分叉中间体的利用，从而使Cordyceps cylindrica SKL-1将分叉中间体更多的用于次级代谢反应，进而提高次级代谢产物的产率与产量。
实施例3：
底泥微生物抑菌活性物质的抑菌活性实验，包括以下步骤：
1）配制培养基与溶液：制备LB液体培养基，在LB液体培养基的基础上加入20g琼脂粉配制成固体培养基；样品溶液为活性物质的甲醇溶液，浓度为10mg/mL；阳性对照液为环丙沙星甲醇溶液，浓度为10mg/mL；阴性对照液为甲醇。
2）致病菌的培养：将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌接种于LB液体培养基中，放入摇床中发酵扩大培养。
3）致病菌的涂布：待致病菌发酵液浑浊时，用无菌移液枪吸取适量液体滴入LB固体培养基内，用无菌涂布棒进行涂布操作。
4）抑菌活性筛选：运用滤纸片法在无菌培养皿内放置四片灭菌处理过的圆形滤纸片，分别用移液枪吸取约10μL活性物质的甲醇溶液、环丙沙星甲醇溶液，两组有机相甲醇溶液滴于滤纸片上，待其挥发后，用镊子夹取至上步用致病菌涂布过的培养基内，正放片刻后倒置放入培养箱内，24小时后观察实验结果。依据抑菌圈直径，可以计算出活性物质对大肠杆菌的抑菌率为环丙沙星的1.69倍，活性物质对金黄色葡萄球菌的抑菌率为环丙沙星的2.02倍，可知抑菌活性物质对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌均由较强的杀灭效果，活性物质中的效用成分可以作用于微生物细胞膜，增加细胞膜通透性，破坏细胞结构，从而导致菌体内成分泄露，并最终致其死亡，具有广谱抗菌性能，Cordyceps cylindrica SKL-1是一种具有较强抑菌活性的微生物。
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种具有抑菌活性的底泥微生物，其特征在于：所述底泥微生物为Cordycepscylindrica SKL-1，从所述底泥微生物中提取抑菌活性物质的方法包括以下步骤：种子液培养、扩大发酵培养、提取活性物质，所述提取活性物质的步骤为：在发酵液中加入等体积的乙酸乙酯灭活，将发酵液搅拌后进行抽滤，抽滤2-3次滤除菌体后取滤液；在滤液中加入1.8-2.0倍体积的乙酸乙酯进行萃取，萃取3-4次分离水相和有机相，每次萃取以双频率复合超声波辅助，每次萃取保留上层类黄色澄清液体即有机相，将有机相合并后冷冻干燥即得抑菌活性物质。
2.根据权利要求1所述的一种具有抑菌活性的底泥微生物，其特征在于：所述的双频率复合超声波的频率分别为30-45kHz与60-90kHz，功率密度分别为0.40-0.45W/cm2与0.50-0.60W/cm2。
3.根据权利要求1所述的一种具有抑菌活性的底泥微生物，其特征在于：所述搅拌操作的转速为800-900r/min，搅拌时间为5-15分钟。
4. 根据权利要求1所述的一种具有抑菌活性的底泥微生物，其特征在于：所述的种子液培养步骤为：无菌条件下，取0.5-1.0gCordyceps cylindrica SKL-1冻干菌置于培养皿中，用无菌细管吸取5-10mL培养液置于培养皿，使冻干菌体溶解成悬浮状；活化5-15分钟后将Cordyceps cylindrica KL-1接种入斜面培养基中，在32-35℃条件下恒温培养24-40小时，加入培养基等量的无菌蒸馏水即得种子液。
5.根据权利要求4所述的一种具有抑菌活性的底泥微生物，其特征在于：所述种子液培养步骤中的培养基的组成及其浓度为：马铃薯粉120-140g/L，葡萄糖30-45g/L，琼脂10-12g/L，氯化钠32.0-35.0g/L、硫酸镁3.5-3.8g/L、氯化钙2.5-3.5g/L、碘化钾1.7-2.0g/L、硼酸锌0.040-0.045g/L、硅酸钠0.0022-0.0025g/L、磷酸亚铁0.072-0.080g/L、3-硝基-2,6-二氯吡啶0.0022-0.0025g/L、氨水0.002-0.0022g/L、硝酸锂0.0031-0.0033g/L、余量为无菌蒸馏水；调节pH为7.2-7.4，在121-123℃温度下高压灭菌15-25分钟。
6.根据权利要求1所述的一种具有抑菌活性的底泥微生物，其特征在于：所述扩大发酵培养的步骤为：在发酵培养液中接种入发酵液重量6-8%的种子液，将发酵培养液放置在气浴恒温振荡器中，在发酵温度为22-25℃，摇床转速为200-210r/min的条件下进行发酵扩大培养，发酵培养24-50小时。
7.根据权利要求6所述的一种具有抑菌活性的底泥微生物，其特征在于：所述扩大发酵培养步骤中的发酵培养液的组成及其浓度为：可溶性淀粉13-15g/L，蛋白胨2.0-3.5g/L，抑制剂0.02-0.025g/L，海水素33-35g/L，余量为无菌蒸馏水，调节pH为7.2-7.4，在121-123℃温度下高压灭菌20-30分钟。
8.根据权利要求7所述的一种具有抑菌活性的底泥微生物，其特征在于：所述扩大发酵培养步骤中的抑制剂是重量比为0.32-0.34:1的L-（-）-甘油醛与D-（+）-甘油醛。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180109 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |