CN109956856B - 从辅酶q10发酵菌粉中提取辅酶q10和磷脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种从辅酶Q10发酵菌粉中提取辅酶Q10和磷脂的方法。该方法的特征在于,以三维Hansen溶解度参数在21‑23(J/cm3)1/2之间、且其氢键项的贡献在10‑12(J/cm3)1/2之间的混合溶剂对辅酶Q10生产菌株的发酵菌粉进行浸提。本发明从辅酶Q10发酵菌粉中可以高效提取辅酶Q10和磷脂两种产品,工艺过程可操作性强,易于工业化生产,产品纯度和收率高,经济效益好。
Description
技术领域
本发明属于生物提取技术领域,特别涉及一种从辅酶Q10发酵菌粉中提取辅酶Q10和磷脂的方法。
背景技术
辅酶Q10广泛应用于生物医药、化妆品和保健品等领域,具有增强人体免疫力、抗肿瘤、抗氧化、保护心脏和大脑、改善微循环、促进学习记忆、提高运动能力等作用,其分子式如下。
制备辅酶Q10的方法主要有动物细胞提取法、烟叶茄尼醇半合成法、完全合成法、微生物发酵法和植物细胞培养法等。其中微生物发酵提取法是主要生产方式。关于辅酶Q10的提取方法,传统的方法为有机溶剂提取法,近年则发展了超声辅助法、超临界二氧化碳提取法、亚临界流体提取法等。
中国专利CN101314782A公开了一种从菌体中提取辅酶Q10的方法,以氯仿、丙酮、四氯化碳、石油醚等为溶剂进行回流萃取5-60分钟,将提取物蒸干溶剂后再用乙醚或石油醚溶解,然后进行硅胶柱层析提纯得辅酶Q10。
中国专利CN102557912A公开了一种辅酶Q10提取液的皂化方法,首先以石油醚、戊烷、正己烷、庚烷、辛烷等为溶剂,在10-50℃下搅拌1-3小时,从辅酶Q10菌体中进行提取,提取次数为2-4次,然后将提取液进行皂化。
中国专利CN104529738A公开了一种从菌体中提取辅酶Q10的方法,将菌体经破壁和皂化处理后,以石油醚为溶剂萃取2次,将溶剂蒸发后再经纯化处理得到辅酶Q10。
中国专利CN104694613A公开了一种从菌体中提取辅酶Q10的方法,先以正己烷为溶剂进行提取,再进行皂化,最后经硅胶柱层析、重结晶等步骤得到辅酶Q10。
中国专利CN106146278A公开了一种从菌渣中提取辅酶Q10的方法,以正己烷、乙酸乙酯、正庚烷、石油醚、丙酮等为溶剂进行渗漉提取,渗漉液浓缩得固态粗产物后用正己烷、正庚烷或石油醚中的任一种溶解,再经多级萃取除杂后得到辅酶Q10。
中国专利CN101381747A公开了一种超声辅助提取辅酶Q10的方法,以水、丙酮、氯仿、正己烷、乙醚、甲醇、乙醇或石油醚为溶剂,于0℃下进行超声,超声频率为0.2-0.8,功率为300-500W,然后分离得到辅酶Q10。
中国专利CN103819326A公开了一种超声辅助提取辅酶Q10的方法,先将菌体在盐酸溶液中进行超声破碎,超声频率为0.3-0.8,功率为200-800W,调整pH值为5-9后以甲醇、乙醇、乙二醇、异丙醇、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚、三氯甲烷中的至少一种为溶剂萃取2次,每次搅拌提取2-3小时,提取温度为20-80℃,然后经层析和结晶得到辅酶Q10。
中国专利CN102391092A公开了一种用超临界二氧化碳从菌体中提取辅酶Q10的方法,萃取条件为:压力24.5MPa,温度35℃,萃取时间45分钟,萃取液经碱处理、硅胶柱层析等得到辅酶Q10。
中国专利CN104591993A公开了一种用亚临界丙烷、丁烷、二甲醚等从菌体中提取辅酶Q10的方法,萃取条件为:压力0.2-1.0MPa,温度10-60℃,萃取时间10-60分钟,再经后续提纯处理得到辅酶Q10。
上述方法从辅酶Q10发酵菌粉中仅提取出一种有效成分,即辅酶Q10。对于菌粉中的其它有效成分,如磷脂等,则以菌渣的形式废弃,或在皂化过程中被破坏,造成了磷脂的浪费。
磷脂,是含有磷脂根的类脂化合物,是生命基础物质,几种常见磷脂的分子式如下:
磷脂对活化细胞,维持新陈代谢,基础代谢及荷尔蒙的均衡分泌,增强人体的免疫力和再生力,都能发挥重大的作用。另外,磷脂还具有促进脂肪代谢,防止脂肪肝,降低血清胆固醇、改善血液循环、预防心血管疾病的作用。磷脂可以分解过高的血脂和过高的胆固醇,清扫血管,使血管循环顺畅,被公认为“血管清道夫”。在美国,卵磷脂类保健品总销量仅次于复合维生素和维生素E而名列第三。在食品工业中,磷脂常被用作乳化剂,让油类能分散于水中。
在辅酶Q10发酵菌粉中,磷脂含量在10%以上,是辅酶Q10含量的3倍以上。然而辅酶Q10和磷脂分子结构差异很大,想要高效地将辅酶Q10和磷脂两者从辅酶Q10发酵菌粉中提取出来存在巨大的技术难度。而现有技术中也鲜有关于辅酶Q10发酵菌粉中磷脂提取技术的报道。
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的是解决现有技术中从辅酶Q10发酵菌粉中仅提取辅酶Q10,而大量的磷脂成分作为菌渣处理的问题,提供了一种从辅酶Q10发酵菌粉中提取辅酶Q10和磷脂的方法。
用于解决问题的方案
本发明涉及一种从辅酶Q10发酵菌粉中提取辅酶Q10和磷脂的方法,以三维Hansen溶解度参数在21-23(J/cm3)1/2之间、且其氢键项的贡献在10-12(J/cm3)1/2之间的混合溶剂对辅酶Q10生产菌株的发酵菌粉进行浸提。
上述方法中,所述混合溶剂是由溶剂(a)与溶剂(b)形成的混合溶剂,所述溶剂(a)为四氢呋喃、乙酸乙酯、乙醚、丁酮、二氯甲烷、氯仿、正戊烷、正己烷、正庚烷、和环己烷的至少一种,且所述溶剂(b)为甲醇、乙醇、正丙醇、和异丙醇的至少一种。
上述方法中,所述混合溶剂优选为四氢呋喃-甲醇、乙酸乙酯-甲醇、乙酸乙酯-乙醇、氯仿-甲醇、氯仿-乙醇、正己烷-甲醇、正己烷-乙醇、或正己烷-正丙醇。
上述方法中,所述混合溶剂的用量为辅酶Q10发酵菌粉重量的3-10倍;优选所述浸提的温度为10-60℃,和进行2-5次的所述浸提。
上述方法中,所述浸提为浸渍提取、渗漉提取、回流提取、煎煮提取、和超声波辅助提取中的一种;优选地,所述浸提为浸渍提取。
上述方法中,进行所述浸提后得到的浸提液通过下述方法进行分离:
1)将所述浸提液浓缩至干,用低极性溶剂溶解,过滤去除不溶物,再浓缩至辅酶Q10发酵菌粉重量的30%-90%,再将其加入到丙酮中;待其完全混溶后,进行冷却结晶,过滤得滤饼和滤液;滤饼用丙酮进行洗涤,干燥后得到磷脂;和
2)合并步骤1)中得到的滤液和洗涤液,浓缩至干,加入正己烷溶解,然后用低碳醇水溶液进行洗涤;将洗涤后的溶液浓缩至干,加入乙醇溶解,然后降温结晶,得辅酶Q10粗品。
上述方法中,步骤1)中所述低极性溶剂为戊烷、己烷、和石油醚中的一种;优选所述低极性溶剂的用量为辅酶Q10发酵菌粉重量的1-5倍。
上述方法中,步骤1)中所述丙酮的用量为辅酶Q10发酵菌粉重量的2-8倍;步骤2)中所述正己烷的用量为辅酶Q10发酵菌粉重量的0.5-4倍。
上述方法中,步骤2)中所述低碳醇水溶液为甲醇水溶液、乙醇水溶液、和异丙醇水溶液中的一种;优选其中低碳醇的质量百分数为50%-95%;还优选所述低碳醇水溶液的用量为辅酶Q10发酵菌粉重量的1-8倍。
上述方法中,步骤2)所述结晶的温度为0-20℃,优选所述乙醇的用量为辅酶Q10发酵菌粉重量的0.2-0.8倍。
上述方法中,步骤2)中在结晶前,加入脱色剂,进行脱色处理;优选所述脱色剂为活性炭、白土、和吸附性树脂中的一种。
上述方法中,步骤2)得到的辅酶Q10粗品经硅胶柱层析,得到高纯辅酶Q10。
发明的效果
本发明从辅酶Q10发酵菌粉中可以高效提取辅酶Q10和磷脂两种产品,工艺过程可操作性强,易于工业化生产,产品纯度和收率高,经济效益好。
附图说明
图1是本发明实施例1得到的磷脂31P核磁谱图。
图2是本发明实施例1得到的辅酶Q10成品HPLC谱图。
具体实施方式
研究发现,虽然辅酶Q10和磷脂的分子结构差异很大,但均具备长碳链结构和可形成氢键的官能团。当对辅酶Q10发酵菌粉浸提所用溶剂的三维Hansen溶解度参数在21-23(J/cm3)1/2之间、且其氢键项的贡献在10-12(J/cm3)1/2之间时,可以高效地将辅酶Q10和磷脂两者从辅酶Q10发酵菌粉中提取出来。
常见溶剂的三维Hansen溶解度参数可以方便地在文献(如工具书:《HansenSolubility Parameters A User's Handbook》)中获取,然而,几乎所有单一溶剂的三维Hansen溶解度参数及其氢键项的贡献并不在上述范围之内,为此,需使用混合溶剂。混合溶剂的溶解度参数具有线性加和性,按如下公式I计算:
公式I
混合溶剂溶解度参数氢键项的贡献按如下公式II计算:
公式II
本发明从辅酶Q10发酵菌粉中提取辅酶Q10和磷脂的方法是:以三维Hansen溶解度参数在21-23(J/cm3)1/2之间、且其氢键项的贡献在10-12(J/cm3)1/2之间的混合溶剂对辅酶Q10发酵菌粉进行浸提,然后再对浸提液进行分离,得到磷脂和辅酶Q10。
所述三维Hansen溶解度参数在21-23(J/cm3)1/2之间、且其氢键项的贡献在10-12(J/cm3)1/2之间的混合溶剂是由溶剂(a)与溶剂(b)形成的混合溶剂,所述溶剂(a)为四氢呋喃、乙酸乙酯、乙醚、丁酮、二氯甲烷、氯仿、正戊烷、正己烷、正庚烷、和环己烷的至少一种,且所述溶剂(b)为甲醇、乙醇、正丙醇、和异丙醇的至少一种。
作为优选的,所述三维Hansen溶解度参数在21-23(J/cm3)1/2之间、且其氢键项的贡献在10-12(J/cm3)1/2之间的混合溶剂的组合为四氢呋喃-甲醇、乙酸乙酯-甲醇、乙酸乙酯-乙醇、氯仿-甲醇、氯仿-乙醇、正己烷-甲醇、正己烷-乙醇、正己烷-正丙醇中的一种。
所述混合溶剂的用量为辅酶Q10发酵菌粉重量的3-10倍。
所述浸提方式没有特别的要求。作为优选的,所述浸提可以为浸渍提取、渗漉提取、回流提取、煎煮提取或超声波辅助提取中的一种。更为优选的,所述浸提为浸渍提取。
所述浸提的操作可以采用本领域通用的操作方式,只要能够有效提取辅酶Q10和磷脂即可。其中,优选浸提温度为10-60℃,优选浸提2-5次。
在本发明中以三维Hansen溶解度参数在21-23(J/cm3)1/2之间、且其氢键项的贡献在10-12(J/cm3)1/2之间的混合溶剂对辅酶Q10发酵菌粉中的有效成分进行提取,能够兼顾辅酶Q10和磷脂的提取效率,实现了辅酶Q10和磷脂两种有效成分的高效提取。
上述的从辅酶Q10发酵菌粉中提取辅酶Q10和磷脂的方法所得到的浸提液用如下方法进行分离:
1)将浸提液浓缩至干,用低极性溶剂溶解,过滤去除不溶物,再浓缩至辅酶Q10发酵菌粉重量的30%-90%,再将其加入到丙酮中。待其完全混溶后,进行冷却结晶,过滤得滤饼和滤液。滤饼用丙酮进行洗涤,干燥后得到磷脂。
2)合并步骤1)中得到的滤液和洗涤液,浓缩至干,加入正己烷溶解,然后用低碳醇水溶液进行洗涤。将洗涤后的溶液浓缩至干,加入乙醇溶解,进行结晶,得辅酶Q10粗品。
在步骤1)中将浸提物进行浓缩,浓缩物用低极性溶剂溶解,过滤,将大部分高极性杂质以不溶物的形式去除,提高了浸提液中辅酶Q10和磷脂的纯度。所述低极性溶剂为戊烷(正戊烷、异戊烷、新戊烷及其混合物)、己烷(正己烷、2-甲基戊烷、3-甲基戊烷、2,3-二甲基丁烷、2,2-二甲基丁烷及其混合物)或石油醚中的一种,所述低极性溶剂的用量为辅酶Q10发酵菌粉重量的1-5倍。
在步骤1)中将低极性溶剂进行浓缩后,利用了磷脂在丙酮中溶解度低,而辅酶Q10在丙酮中溶解度高的特点,十分简单的就可以将磷脂以不溶物的形式从丙酮溶液中分离出来,以高收率得到了高纯度的磷脂产品。所述丙酮的用量为辅酶Q10发酵菌粉重量的2-8倍;步骤2)中正己烷用量为辅酶Q10发酵菌粉重量的0.5-4倍。
在步骤2)中将合并的滤液和洗涤液中丙酮浓缩后,加入正己烷进行溶解,用低碳醇水溶液进行洗涤,将高极性杂质去除,进一步提高了溶液中辅酶Q10的纯度,为后续结晶过程的顺利进行提供了保证。所述低碳醇水溶液为甲醇水溶液、乙醇水溶液、和异丙醇水溶液中的一种,其中低碳醇的质量百分数为50%-95%,所述低碳醇水溶液的用量为辅酶Q10发酵菌粉重量的1-8倍。
步骤2)所述的结晶温度为0-20℃,所述乙醇的用量为辅酶Q10发酵菌粉重量的0.2-0.8倍。
步骤2)中进行结晶前,可加入脱色剂,进行脱色处理。所述脱色剂可以为活性炭、白土或吸附树脂中的一种。
上述步骤2)得到的辅酶Q10粗品可再进行纯化处理,如进行硅胶柱层析,即可得到高纯度的辅酶Q10。
在本发明中,所述辅酶Q10发酵菌粉是指辅酶Q10生产菌株在发酵后的经烘干后得到的干菌体。
所述产辅酶Q10细菌可以为土壤杆菌属、曲霉属、醋酸杆菌属、氨基杆菌属、土壤单胞菌属、嗜酸菌属、布勒担孢酵母属(Bulleromyces)、布勒掷胞酵母属、短波单胞菌属、隐球菌属、雪球酵母属(Chionosphaera)、念珠菌属、片花耳属(Cerinosterus)、网柄菌属(Exisophiala)、外担子菌属、费落酵母属(Fellomyces)、线状黑粉菌属、费落担子属(Filobasidium)、地霉属、粉座菌属、葡糖杆菌属、考克娃酵母属(Kockovaella)、克氏担孢酵母属(Kurtzmanomyces)、拉拉利亚属(Lalaria)、白冬孢酵母属(Leucosporidium)、军团菌属、甲基杆菌属、枝动菌属、卵胞酵母属、假单胞菌属、普西多酵母属(Psedozyma)、副球菌属、石座菌属(Petromyces)、红酵母属、红冬胞属、根单胞菌属、红菌属、红游动菌属、红假单胞菌属、红细菌属、掷胞酵母属、锁掷酵母属、齐藤酵母属(Saitoella)、裂殖糖酵母属、鞘氨醇单胞菌属、孢子丝菌属、子囊分生孢霉属(Sympodiomycopsis)、小梗担孢子属(Sterigmatosporidium)、外囊菌属、银耳属、丝胞酵母属、替拉替利属(Tilletiaria)、腥黑粉菌属、褶胞黑粉菌属、腥掷孢菌属(Tilletiopsis)、黑粉菌属、优地诺酵母属(Udeniomyces)、嗜黄酵母属(Xanthophilomyces)、黄色杆菌属、拟青霉属、顶胞霉属、生丝单胞菌属或根瘤菌属的微生物。
作为优选的,所述产辅酶Q10微生物为类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides);更优选地,类球红细菌为菌种保藏编号CGMCC No.5997的类球红细菌、菌种保藏编号CGMCCNo.5998的类球红细菌;和/或菌种保藏编号CGMCC No.5999的类球红细菌。
所述产辅酶Q10微生物的发酵方法可参考现有技术,如JP2008253271(A)、CN105420417A等专利文献中的发酵技术。优选的,参照CN105420417A,利用在线控制氧消耗速率和电导率结合本发明技术方案进行。具体的,在类红球细菌发酵生长阶段控制氧消耗速率在30-150mmol/(L·h)之间,同时电导率稳定在5-30ms/cm之间;在底物合成积累阶段控制氧消耗速率在60-120mmol/(L·h)之间,同时电导率稳定在8-15ms/cm之间。在发酵阶段,使用的培养基为本领域常规的含有碳源、氮源、磷源和微量营养素的培养基。例如,每升培养基中酵母粉8g,氯化铵3g,氯化钠2.8g,柠檬酸铁0.005g,磷酸二氢钾0.6g,磷酸氢二钾0.9g,硫酸镁12.55g,氯化钙0.1g,pH值7.0。所述电导率通过补料培养基控制,用于本发明的补料培养基没有特别限制,可以是各种常规的含有碳源、氮源、磷源和微量营养素的培养基。例如所述补料培养基为如下配方—每升补料液中含酵母粉8~12g,硫酸铵5~10g,硫酸镁1~2g,氯化钠3~6g,磷酸二氢钾2~4g,磷酸氢二钾2~4g,氯化钙1~2g,生物素0.013~0.025g,pH值7.0。
实施例
参考专利CN105420417A中的发酵技术制备得到发酵菌粉,具体如下:
种子培养:用无菌水洗涤培养好的斜面,制成108~109个细胞每毫升的菌悬液,移取10ml到装量500ml/1000ml的种子瓶中,在30℃、180-250rpm的条件下培养22-26小时。
发酵培养:将上述步骤所得种子液接种到装有发酵培养基的5升发酵罐,接种量10%,培养温度29-33℃,罐内压力0.03~0.05Mpa,接种后初始搅拌转速500rpm,空气流量9L/min。24小时后调节转速至600rpm,控制补料培养基的加入速率使发酵液电导率维持在10-20ms/cm范围内,全程罐内残留葡萄糖控制在0.5-2.0%之间,发酵培养110小时左右。
采用的菌种为菌种保藏编号CGMCC No.5999的类红球细菌。
发酵培养基为每升培养基中含:酵母粉8g、氯化铵3g、氯化钠2.8g、柠檬酸铁0.005g、磷酸二氢钾0.6g、磷酸氢二钾0.9g、硫酸镁12.55g、氯化钙0.1g,pH值调节为7.0。
补料培养基配方为每升补料液中含:酵母粉12g、硫酸铵10g、硫酸镁2g、氯化钠6g、磷酸二氢钾4g、磷酸氢二钾4g、氯化钙2g、生物素0.025g,pH值调整为7.0,补料培养基电导率为23.0ms/cm。
发酵结束后,过滤发酵液,得到湿菌体。在60℃下进行烘干,得到干燥的发酵菌粉。
液相色谱外标法检测菌粉中磷脂含量为11.99%,辅酶Q10含量为2.83%。
实施例1
取100g上述辅酶Q10发酵菌粉,加入300g四氢呋喃-甲醇混合溶剂(四氢呋喃所占体积分数为72%,混合溶剂的三维Hansen溶解度参数为22.2(J/cm3)1/2,其氢键项的贡献为12.0(J/cm3)1/2)进行浸渍提取,浸提温度为10℃,浸提3次,得浸提液。将浸提液浓缩至干,回收混合溶剂,浓缩物用200g正己烷溶解,过滤去除不溶物,再浓缩至60g,将其加入到300g丙酮中,于50℃搅拌2小时,而后降温至0℃,保温结晶2小时,过滤,得滤饼和滤液。将所得滤饼用少量丙酮洗涤,干燥后得磷脂12.1g,纯度为95.2%,收率为96.1%,主要成分为磷脂酰甘油、双磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和卵磷脂,其31P核磁谱图见图1。
合并上述滤液和丙酮洗涤液,浓缩至干,加入100g正己烷溶解,然后用800g甲醇水溶液(甲醇所占的质量百分比为80%)进行洗涤。将洗涤后的溶液浓缩至干,加入40g乙醇于60℃搅拌溶解,加入活性炭脱色2小时,过滤,滤液降温至0℃,保温结晶5小时,过滤,得辅酶Q10粗品。将辅酶Q10粗品进行硅胶柱层析分离,得辅酶Q10成品2.72g,纯度为99.2%,收率为95.3%,HPLC谱图见图2。
实施例2
取100g上述辅酶Q10发酵菌粉,加入300g四氢呋喃-甲醇混合溶剂(四氢呋喃所占体积分数为78%,混合溶剂的三维Hansen溶解度参数为21.6(J/cm3)1/2,其氢键项的贡献为11.1(J/cm3)1/2)进行浸渍提取,浸提温度为10℃,浸提5次,得浸提液。将浸提液浓缩至干,回收混合溶剂,浓缩物用100g 2-甲基戊烷溶解,过滤去除不溶物,再浓缩至30g,将其加入到200g丙酮中,于50℃搅拌0.5小时,而后降温至0℃,保温结晶2小时,过滤,得滤饼和滤液。将得到的滤饼用少量丙酮洗涤,干燥后得磷脂11.9g,纯度为96.5%,收率为95.8%,主要成分为磷脂酰甘油、双磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和卵磷脂。
合并上述滤液和丙酮洗涤液,浓缩至干,加入50g正己烷溶解,然后用400g甲醇水溶液(甲醇所占的质量百分比为95%)进行洗涤。将洗涤后的溶液浓缩至干,加入30g乙醇于50℃搅拌溶解,加入活性炭脱色1小时,过滤,滤液降温至0℃,保温结晶1小时,过滤,得辅酶Q10粗品。将辅酶Q10粗品进行硅胶柱层析分离,得辅酶Q10成品2.76g,纯度为99.1%,收率为96.6%。
实施例3
取100g上述辅酶Q10发酵菌粉,加入800g四氢呋喃-甲醇混合溶剂(四氢呋喃所占体积分数为84%,混合溶剂的三维Hansen溶解度参数为21.0(J/cm3)1/2,其氢键项的贡献为10.3(J/cm3)1/2)进行浸渍提取,浸提温度为30℃,浸提2次,得浸提液。将浸提液浓缩至干,回收混合溶剂,浓缩物用300g正戊烷溶解,过滤去除不溶物,再浓缩至40g,将其加入到300g丙酮中,于40℃搅拌1小时,而后降温至-10℃,保温结晶0.5小时,过滤,得滤饼和滤液。将得到的滤饼用少量丙酮洗涤,干燥后得磷脂12.3g,纯度为95.1%,收率为97.6%,主要成分为磷脂酰甘油、双磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和卵磷脂。
合并上述滤液和丙酮洗涤液,浓缩至干,加入200g正己烷溶解,然后用400g乙醇水溶液(乙醇所占的质量百分比为60%)进行洗涤。将洗涤后的溶液浓缩至干,加入20g乙醇于40℃搅拌溶解,加入吸附树脂脱色2小时,过滤,滤液降温至10℃,保温结晶4小时,过滤,得辅酶Q10粗品。将辅酶Q10粗品进行硅胶柱层析分离,得辅酶Q10成品2.72g,纯度为99.5%,收率为95.6%。
实施例4
取100g上述辅酶Q10发酵菌粉,加入500g氯仿-乙醇混合溶剂(氯仿所占体积分数为54%,混合溶剂的三维Hansen溶解度参数为22.5(J/cm3)1/2,其氢键项的贡献为12.0(J/cm3)1/2)进行回流浸提,浸提温度为60℃,浸提2次,得浸提液。将浸提液浓缩至干,回收混合溶剂,浓缩物用200g异戊烷溶解,过滤去除不溶物,再浓缩至40g,将其加入到400g丙酮中,于30℃搅拌2小时,而后降温至-10℃,保温结晶2小时,过滤,得滤饼和滤液。将得到的滤饼用少量丙酮洗涤,干燥后得磷脂12.0g,纯度为95.8%,收率为95.9%,主要成分为磷脂酰甘油、双磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和卵磷脂。
合并上述滤液和丙酮洗涤液,浓缩至干,加入100g正己烷溶解,然后用100g乙醇水溶液(乙醇所占的质量百分比为85%)进行洗涤。将洗涤后的溶液浓缩至干,加入50g乙醇于60℃搅拌溶解,加入活性炭脱色2小时,而后降温至10℃,保温结晶6小时,过滤,得辅酶Q10粗品。将辅酶Q10粗品进行硅胶柱层析分离,得辅酶Q10成品2.75g,纯度为99.1%,收率为96.3%。
实施例5
取100g上述辅酶Q10发酵菌粉,在渗漉筒中使用1000g正己烷-正丙醇混合溶剂(正己烷所占体积分数为35%,混合溶剂的三维Hansen溶解度参数为21.1(J/cm3)1/2,其氢键项的贡献为11.3(J/cm3)1/2)进行渗漉法提取,提取温度为20℃,反复渗漉3次,得浸提液。将浸提液浓缩至干,回收混合溶剂,浓缩物用500g石油醚溶解,过滤去除不溶物,再浓缩至80g,将其加入到600g丙酮中,于30℃搅拌2小时,而后降温至10℃,保温结晶3小时,过滤,得滤饼和滤液。将得到的滤饼用少量丙酮洗涤,干燥后得磷脂11.8g,纯度为97.1%,收率为95.6%,主要成分为磷脂酰甘油、双磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和卵磷脂。
合并上述滤液和丙酮洗涤液,浓缩至干,加入300g正己烷溶解,然后用200g异丙醇水溶液(异丙醇所占的质量百分比为50%)进行洗涤。将洗涤后的溶液浓缩至干,加入60g乙醇于50℃搅拌溶解3小时,加入活性炭脱色3小时,过滤,滤液降温至20℃,保温结晶5小时,过滤,得辅酶Q10粗品。将辅酶Q10粗品进行硅胶柱层析分离,得辅酶Q10成品2.77g,纯度为99.4%,收率为97.3%。
实施例6
取100g上述辅酶Q10发酵菌粉,加入400g乙酸乙酯-乙醇混合溶剂(乙酸乙酯所占体积分数为61%,混合溶剂的三维Hansen溶解度参数为21.4(J/cm3)1/2,其氢键项的贡献为12.0(J/cm3)1/2)进行浸渍提取,浸提温度为60℃,浸提2次,得浸提液。将浸提液浓缩至干,回收混合溶剂,浓缩物用200g石油醚溶解,过滤去除不溶物,再浓缩至90g,将其加入到800g丙酮中,于20℃搅拌3小时,而后降温至10℃,保温结晶5小时,过滤,得滤饼和滤液。将得到的滤饼用少量丙酮洗涤,干燥后得磷脂12.0g,纯度为96.4%,收率为96.5%,主要成分为磷脂酰甘油、双磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和卵磷脂。
合并上述滤液和丙酮洗涤液,浓缩至干,加入400g正己烷溶解,然后用200g异丙醇水溶液(异丙醇所占的质量百分比为70%)进行洗涤。将洗涤后的溶液浓缩至干,加入80g乙醇于70℃搅拌溶解,加入白土脱色0.5小时,过滤,滤液降温至20℃,保温结晶10小时,过滤,将滤饼加入40g乙醇再进行一次重结晶,得辅酶Q10粗品。将辅酶Q10粗品进行硅胶柱层析分离,得辅酶Q10成品2.70g,纯度为99.6%,收率为95.0%。
Claims (16)
1.一种从辅酶Q10发酵菌粉中提取辅酶Q10和磷脂的方法,其特征在于,以三维Hansen溶解度参数在21-23(J/cm3)1/2之间、且其氢键项的贡献在10-12(J/cm3)1/2之间的混合溶剂对辅酶Q10生产菌株的发酵菌粉进行浸提,所述浸提的温度为10-60℃,
其中,进行所述浸提后得到的浸提液通过下述方法进行分离:
1)将所述浸提液浓缩至干,用低极性溶剂溶解,过滤去除不溶物,再浓缩至辅酶Q10发酵菌粉重量的30%-90%,再将其加入到丙酮中;待其完全混溶后,进行冷却结晶,过滤得滤饼和滤液;滤饼用丙酮进行洗涤,干燥后得到磷脂;和
2)合并步骤1)中得到的滤液和洗涤液,浓缩至干,加入正己烷溶解,然后用低碳醇水溶液进行洗涤;将洗涤后的溶液浓缩至干,加入乙醇溶解,然后降温结晶,得辅酶Q10粗品,
步骤1)中所述低极性溶剂为戊烷、己烷、和石油醚中的一种,
步骤2)中所述低碳醇水溶液为甲醇水溶液、乙醇水溶液、和异丙醇水溶液中的一种。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述混合溶剂是由溶剂(a)与溶剂(b)形成的混合溶剂,所述溶剂(a)为四氢呋喃、乙酸乙酯、乙醚、丁酮、二氯甲烷、氯仿、正戊烷、正己烷、正庚烷、和环己烷的至少一种,且所述溶剂(b)为甲醇、乙醇、正丙醇、和异丙醇的至少一种。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述混合溶剂为四氢呋喃-甲醇、乙酸乙酯-甲醇、乙酸乙酯-乙醇、氯仿-甲醇、氯仿-乙醇、正己烷-甲醇、正己烷-乙醇、或正己烷-正丙醇。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法,其特征在于,所述混合溶剂的用量为辅酶Q10发酵菌粉重量的3-10倍。
5.根据权利要求1-3任一项所述的方法,其特征在于,进行2-5次的所述浸提。
6.根据权利要求1-3任一项所述的方法,其特征在于,所述浸提为浸渍提取、渗漉提取、回流提取、煎煮提取、和超声波辅助提取中的一种。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述浸提为浸渍提取。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述低极性溶剂的用量为辅酶Q10发酵菌粉重量的1-5倍。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1)中所述丙酮的用量为辅酶Q10发酵菌粉重量的2-8倍;步骤2)中所述正己烷的用量为辅酶Q10发酵菌粉重量的0.5-4倍。
10.根据权利要求1项所述的方法,其特征在于,其中低碳醇的质量百分数为50%-95%。
11.根据权利要求1项所述的方法,其特征在于,所述低碳醇水溶液的用量为辅酶Q10发酵菌粉重量的1-8倍。
12.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤2)所述结晶的温度为0-20℃。
13.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述乙醇的用量为辅酶Q10发酵菌粉重量的0.2-0.8倍。
14.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤2)中在结晶前,加入脱色剂,进行脱色处理。
15.根据权利要求14项所述的方法,其特征在于,所述脱色剂为活性炭、白土、和吸附性树脂中的一种。
16.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤2)得到的辅酶Q10粗品经硅胶柱层析,得到高纯辅酶Q10。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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