CN102525873B - 含长双歧杆菌菌体裂解液的组合物冻干粉及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于化妆品技术领域，具体为一种含长双歧杆菌菌体裂解液的组合物冻干粉及其制备方法与在化妆品中的应用。将发酵培养的长双歧杆菌菌体与磷酸缓冲液以一定的质量体积比混匀，用超声波破壁，超声后离心得裂解液，向裂解液中加入适量鸡胚精华液和海藻糖冷冻干燥得组合物冻干粉。长双歧杆菌裂解液含有长双歧杆菌的全部胞内物质及部分细胞壁裂解成分，与鸡胚精华液进行组合，用于抗衰老和美白化妆品中，功效优异。本发明还提供含有上述组合物冻干粉的抗衰老和美白化妆品。

Description

含长双歧杆菌菌体裂解液的组合物冻干粉及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于化妆品技术领域，具体涉及一种含长双歧杆菌菌体裂解液的组合物冻干粉及其制备方法与在化妆品中的应用。

背景技术

长双歧发酵物裂解液是含有长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)生产的必需成分和长双岐的代谢产物（活性蛋白质、多肽及细胞因子）、细胞质成分、细胞壁成分及多糖复合物。这些物质可以特异性的激活和支持皮肤自身的保护机制及修复机制，以对抗成熟前的皮肤老化。用于化妆品添加以促进肌肤抗紫外、修复和重建完美构造、抗衰老、保湿防护和解决敏感性和问题皮肤，它们对问题皮肤的作用主要包括：1）激活紫外照射后正常的DNA修复机制，修复皮肤突变 2）保护皮肤并保持皮肤生机和充满活力，保持皮肤水分，去皱，保持肌肤嫩滑3）中和紫外引起的光衰老，抗衰老 4）对抗紫外引起的免疫抑制，回复皮肤平衡5）特异性的激活和支持皮肤自身的保护机制及修复机制，以对抗成熟前的皮肤老化。

中国专利CN 101380288A、专利名称为“用于处理敏感皮肤的长双歧杆菌菌种裂解物的用途”和中国专利 CN 101380289A、专利名称为“长双歧杆菌菌种裂解物用于干燥处理的美容用途”详细阐述了双歧杆菌属种裂解物对于处理和/或预防敏感皮肤特别有效；对干性的表皮或角质物质具有美容治疗作用，在处理鱼鳞癣、银屑病、表皮角化病、局部皮炎和头皮的干燥头皮屑状态中特别有效。此外Guéniche A等人使用长双歧杆菌的提取液证明了在体外和临床这种无细菌繁殖裂解液用于肌肤可以改善易过敏肤质，该裂解液还可以明显抑制神经元辣椒碱诱导降钙素基因相关肽（CGRP）的释放。人体试用结果显示使用含双歧杆菌提取物乳膏的志愿者在试验结束后皮肤敏感度显著降低。此外，试验处理导致了皮肤对物理和化学侵害的抗性增强。

经研究发现，鸡胚精华液含有多种营养成分、抗感染成分和生物活性物质，尤其是含有的类胰岛素生长因子（IGFs）在抗衰老方面表现尤佳。

长双歧杆菌裂解液除了文献已报道的在抗过敏以及预防皮肤干燥方面具有功效外，未见有预防衰老皮肤方面功效的报道，也未见长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合使用，制备抗衰老和美白化妆品的报道。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抗衰老和美白功效的含长双歧杆菌菌体裂解液的组合物冻干粉及其制备方法和应用。

本发明提供的含长双歧杆菌菌体裂解液的组合物冻干粉，由长双歧杆菌菌体裂解液和鸡胚精华液的混合液，由冻干保护剂海藻糖保护后经冻干、粉碎而获得；其中，混合液的体积百分比为：长双歧杆菌裂解液40%～90%，鸡胚精华液10%～60%，两者总量为100%；冻干保护剂海藻糖加量按质量体积比（kg/L）海藻糖：混合液=1:1.0～6.0。优选为长双歧杆菌裂解液50%～70%，鸡胚精华液30%～50%；冻干保护剂海藻糖加量按质量体积比（kg/L）海藻糖：混合液=1:2.0～5.0。更优选为长双歧杆菌裂解液55%～65%，鸡胚精华液35%～45%；冻干保护剂海藻糖加量按质量体积比（kg/L）海藻糖：混合液=1:3.0～4.0。 

本发明提出的长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物冻干粉的制备方法，其步骤如下：

（1）将长双歧杆菌冻干粉和磷酸缓冲液按质量体积比（kg/L）为1:3.0～1:8.0的比例混合溶解，得到长双歧杆菌溶液； 

（2）将步骤（1）中的溶液用超声波处理，破碎长双歧杆菌的细胞壁，超声程序为：超声2～6s，间隔2～6s，超声15～30个循环；按此程序重复超声2～6次；

（3）超声后以5000～8000 rpm的转速离心15～30min；得上清液即长双歧杆菌裂解液；

（4）将长双歧杆菌裂解液与鸡胚精华液混合均匀，按体积比计，长双歧杆菌裂解液40%～90%，鸡胚精华液10%～60%，两者总量为100%；向该混合液中加入冻干保护剂海藻糖，按质量体积比计，海藻糖：混合液=1:1.0～1:6.0；在-45～-85℃下冷冻干燥12～36h，得长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物冻干粉。

步骤（1）中，所述的长双歧杆菌冻干粉和磷酸缓冲液质量体积比（kg/L）优选为 1:4.0～1:6.0。

步骤（2）中，所述的超声程序优选为：超声3～5s，间隔3～5s，超声15～25个循环。按照此程序重复超声3～5次。

步骤（3）中，所述的离心转速优选为5500～6500rpm，离心时间优选为15～20min。

步骤（4）中，优选为长双歧杆菌裂解液50%～70%，鸡胚精华液30%～50%；冻干保护剂海藻糖加量按质量体积比（kg/L）海藻糖：混合液=1:2.0～5.0，在-55～-80℃下冷冻干燥15～30h。更优选为长双歧杆菌裂解液55%～65%，鸡胚精华液35%～45%；冻干保护剂海藻糖加量按质量体积比（kg/L）海藻糖：混合液=1:3.0～4.0，在-65～-80℃下冷冻干燥18～24h。

本发明涉及长双歧杆菌菌种中的一种或多种微生物的裂解液，特别地涉及长双歧杆菌菌体裂解液。由发酵生物技术结合低温粉碎裂解技术制造的长双歧发酵物裂解液，含有长双歧杆菌生产的必需成分和长双岐杆菌的代谢产物（活性蛋白质、多肽及细胞因子）、细胞质成分、细胞壁成分及多糖复合物。 将这些活性成分用于皮肤可提供抗过敏、抗皱、保湿等功效。

本发明中，鸡胚精华液提取自健康孵化8～16天的鸡胚，这个阶段的鸡胚尤其是孵化12～14天的鸡胚，含有丰富的维持新生命萌发的各种营养物质，具有显著的促进生长和提高机体免疫能力的活性成分。鸡胚中所含的生物活性物质大体上可分为3 类，即营养成分、抗感染成分和生物活性物质。营养成分有蛋白质、氨基酸、碳水化合物(葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖等) 、脂类、脂肪酸、多种维生素（A、E、C等）、矿物质（Fe、Zn、Cu等）等；抗感染成分有免疫球蛋白、干扰素、胎儿蛋白、溶菌酶和磷酸二酯酶(抗锥虫)等； 生物活性物质有唾液酸、儿茶酚胺、类胰岛素生长因子（IGF-I）、胰岛素、激肽酶、组胺酶、红细胞生成素、脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶等。这些成分对皮肤的作用主要有（1）营养滋养皮肤（2）保水润肤抗皱（3）抗感染。

发明人经过不断的试验，发现将鸡胚精华液与长双歧杆菌裂解液混合制备成组合物，用于处理和/或预防皮肤的老化具有协同增效的作用。即本发明所述的长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物冻干粉可用于制备对皮肤具有抗衰老和美白功效的化妆品。

本发明还提供一种抗衰老和美白化妆品组合物，该化妆品组合物中含有本发明的长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物冻干粉，其含量为化妆品组合物总重量的0.1%～5%，优选为1%～3%。

本发明涉及抗衰老和美白化妆品，其产品形式可以是乳膏、面霜、精华露、精华液、精华素、凝胶、洗剂或洗脱型产品等。

本发明中，术语“皮肤问题”包括有皱纹的、有线纹的，粗糙的、干燥的、易起屑的、敏感的、暗黄的、衰老的和/或UV损伤的皮肤。

这些不期望的问题特别地涉及皮肤具有衰老迹象的人，这些人的皮肤由于受到年龄、疾病、压力、饮食习惯、使用的化妆品、紫外线等因素的影响，皮肤出现很多问题。

如前所述，本发明的长双歧杆菌菌种的裂解液与鸡胚精华液组合物冻干粉作为化妆产品中的活性成分是特别有效的。特别地，化妆产品优选适合用于有上述问题的皮肤，从而改善皮肤的外观和触感，以及用于健康的皮肤，从而用于预防或延缓皮肤的老化。

本发明中，术语“改善”意为消除、最小化不期望的问题，可以视觉上或通过触觉检测到，例如皮肤皱纹、弹性、水分、黑素。

本发明中，术语“预防”意为减少问题出现的风险。 

本发明中，所述含有长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物冻干粉，其中裂解液通常是指采用一定的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，使胞内产物释放到液相中获得的细胞浆液。

本发明中，使用术语“裂解液”，不优先指通过所涉及的微生物裂解而获得的全部裂解液，或者仅仅是其部分。故裂解液包括细胞内生物组份和细胞壁和细胞膜组份的全部或部分。

更具体地，所述的裂解液包括细胞胞质部分，该胞质部分包括乳酸脱氢酶、磷酸酶、磷酸酮酶、转醛酶和代谢物等酶类。细胞壁的组份特别地是肽聚糖、胞壁糖或粘肽和磷壁酸，细胞膜的组份由甘油磷脂组成。

细胞裂解可以用多种方法实现，例如超声波振荡法、酶解法、渗透压冲击法、冻结-融化法等。

本发明中，所述的鸡胚精华液提取自健康孵化8～16天的鸡胚，具体提取步骤为：

（1）取孵化8～16天的健康鸡胚蛋（优选孵化12～14天的健康鸡胚蛋），敲壳取鸡胚；

（2）用食品粉碎机将鸡胚打成匀浆，加入pH6.8～7.2的磷酸缓冲液（30～50 mM），按质量比，鸡胚：磷酸缓冲液=1:1～3，4～10℃条件下，将鸡胚和磷酸缓冲液充分搅拌浸取过夜；

（3）用多层（例如4-6层）医用纱布过滤步骤（2）中的鸡胚浸取液，将滤液以4000～6000 rpm的转速离心15～30min；

（4）将离心后的上清液，用截留分子量为10000～20000 Da的中空纤维膜超滤进行过滤，得滤出液，即鸡胚精华液。

本发明所述的长双歧杆菌菌种的裂解液和鸡胚精华液组合物，是以粉状形态呈现，此外还可以以液体形式被利用。

本发明的含长双歧杆菌菌种的裂解液和鸡胚精华液组合物冻干粉用在抗衰老美白化妆品中，该化妆品还可以加入化妆品用油性原料。对于所述油性原料并没有特别的限制，可以包括合成酯类，具体为包括硬脂酸酯类，例如三硬脂酸甘油酯、硬脂酸鲨肝酯、氢化大豆油脂肪酸甘油酯；油酸酯类，亚油酸酯类，例如油酸异癸酯、丙二醇单油酸酯、亚油酸异丙酯；棕榈酸酯类，例如棕榈酸异硬脂基酯、棕榈酸异十六烷基酯；异硬脂酸酯类，例如异硬脂酸异丙酯、异硬脂酸失水山梨醇酯、异硬脂酸丙二醇酯；羟基硬脂酸酯类，例如羟基硬脂酸甘油单酯、单羟基硬脂酸甘油酯；肉豆蔻酸酯类，例如肉豆蔻酸异硬脂基酯、肉豆蔻酸丁酯；异棕榈酸酯类，例如异棕榈酸辛酯、异棕榈酸双甘油基酯；月桂酸酯类，例如月桂酸甘油酯、月桂酸丙二醇酯、月桂酸异硬脂基酯；辛酸、壬酸、癸酸酯类，例如异硬脂基辛酸酯、异壬酸异癸酯；聚甘油酯类，例如单硬脂酸聚甘油酯、二硬脂酸聚甘油酯；羊毛脂衍生物类，例如羟化羊毛脂、羊毛甾醇；季戊四醇酯类，例如季戊四醇四肉豆蔻酸酯；蓖麻油酸酯类，例如蓖麻油酸甘油酯、氢化蓖麻油；柠檬酸，琥珀酸酯类，例如柠檬酸乙酰三乙酯、琥珀酸二乙氧基乙酯；磷酸酯类，例如聚氧乙烯烷基（12～16）醚磷酸酯（6EO）、磷酸三油基酯；其它酯类，例如山嵛酸甘油基酯、没食子酸辛酯；还有脂肪酸类，例如椰子油脂肪酸、棕榈仁油脂肪酸、亚油酸；脂肪醇类，芳香醇类，例如椰子油醇、花生醇、橄榄油醇；蜡类，例如合成烃蜡、合成角鲨烷。

在添加上述油性原料时，其添加量优选为化妆品总重量的0.01%～45%，更优选为0.05%～25%。

本发明的含长双歧杆菌菌种的裂解液和鸡胚精华液组合物冻干粉用在抗衰老美白化妆品中，该化妆品还可以加入化妆品用营养性添加剂，所述的营养性添加剂包括（1）维生素类，例如烟酸、尿囊素DL-泛醇、天然维生素E、d-δ-生育酚；（2）氨基酸，例如L-羟基脯氨酸、L-酪氨酸、L-组氨酸；（3）腺苷盐，例如核黄素腺苷二核苷酸二钠二水盐、腺苷一磷酸；（4）甾醇类，例如谷甾醇、胆甾醇油酸酯、植物甾醇油酸酯、壬酸胆甾醇酯；（5）水解蛋白类，例如油酰水解胶原蛋白、水解胶原乙酯液、椰子油脂肪酸水解胶原蛋白、异硬脂酰水解胶原蛋白；（6）其它营养性物质，例如脐带提取液、油溶性胎盘提取液、葡萄糖酸钠。

在添加上述营养性添加剂时，其添加量优选为化妆品总重量的0.01～45%，优选的添加量为0.05%～25%，更优选为0.1%～20%。

本发明的含长双歧杆菌菌种的裂解液和鸡胚精华液组合物冻干粉用在抗衰老美白化妆品中，该化妆品也可以加入表面活性剂。所述表面活性剂的例子包括失水山梨醇脂肪酸酯 (Span-20、Span-40、Span-60、Span-80)和其环氧乙烷加成物(Tween-20、Tween-40、Tween-60、Tween-80)、月桂醇聚氧乙烯醚、椰子油脂肪酸二乙醇酰胺、油酸单甘油酯、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯羊毛脂、烷基磷酸酯、烷基磷酸聚氧化乙烯酯、脂肪酸碱金属盐、烷基甘油基醚。可以加入上述表面活性剂中的一种或若干种。

在添加上述表面活性剂时，其添加量优选为化妆品总重量的0.01%～45%，更优选为0.05%～25%。

本发明的含长双歧杆菌菌种的裂解液和鸡胚精华液组合物冻干粉用在抗衰老美白化妆品中，该化妆品也可以加入水溶性多元醇。所述水溶性多元醇的例子包括分子内含有两个或两个以上羟基的醇，例如乙二醇、聚乙二醇、丙二醇、丙三醇、甘油-环氧乙烷加成物、山梨醇、POE（20）山梨醇、1,3-丁二醇、葡萄糖、麦芽糖、麦芽糖醇、蔗糖、果糖、木糖醇、麦芽三糖、苏糖醇、赤藓醇以及通过还原淀粉分解得到的醇。可采用上述醇中的一种或数种。

在添加上述水溶性多元醇时，可根据实际需要来选择合适的添加比例。通常，它们的添加量优选为化妆品总重量的0.01%～60%，更优选为0.1%25%。

本发明的含长双歧杆菌菌种的裂解液和鸡胚精华液组合物冻干粉用在抗衰老美白化妆品中，该化妆品还可以进一步加入化妆品用粉类原料。所述粉类原料包括：（1)硅酸盐类，例如蒙脱土、浮石粉、硅酸钙、玻璃粉；（2）铝盐，例如肉豆蔻酸铝、异硬脂酸铝、乳酸铝；（3）云母类，例如金云母、绢云母、合成金云母；（4）层压粉，例如聚乙烯对苯二甲酸酯-铝-环氧树脂层压粉、聚乙烯-聚酯层压粉；（5）表面处理物粉末，例如纤维素粉、松香酸钠处理碳酸钙；（6）其它粉末，例如水杨酸钛、氧化铝钴、羟基磷酸钙。这些粉类原料在使用前可以用以下物质来预处理：用甲基氢甲基聚硅氧烷、三甲基甲硅烷氧基硅酸、甲基环聚硅氧烷或类似物质的聚硅氧烷处理；用磷酸全氟烷基酯、全氟醇或类似物的氟处理；用N-酰基谷氨酸或类似物得氨基酸处理；卵磷脂处理；金属皂处理；脂肪酸处理；磷酸烷基酯处理或类似处理。

在添加上述化妆品用粉类原料时，可根据化妆品的制剂形式选择合适的添加比例。通常，它们的添加量优选为化妆品总重量的0.01%～50%，更优选为0.05～30%。

本发明的含长双歧杆菌菌种的裂解液和鸡胚精华液组合物冻干粉的抗衰老美白化妆品还可以包含多种其它在化妆品领域使用的添加剂。这类成分类型的实例包括：保湿剂、成膜剂、增稠剂、抗菌防腐剂、颜料、香料、防晒剂、螯合剂、天然原料。

本发明的含长双歧杆菌菌种的裂解液和鸡胚精华液组合物冻干粉的抗衰老美白化妆品的pH值优选3～10。更优选的pH值为4～9，这样接近皮肤正常的酸碱度，有利于保持皮肤的正常生理功能。

一般采用本领域已知的制备化妆品的常规方法来制备本发明的含长双歧杆菌菌种的裂解液和鸡胚精华液组合物冻干粉的抗衰老美白化妆品。此类方法一般通过一个或多个步骤混合各种成分，使其成为相对均一的状态，其中涉及到有无加热、冷却、均质、使用真空等。抗衰老美白化妆品可以制备成任何所需的常规形态，例如洗面乳、沐浴露、面霜、精华露、精华液、精华素、乳膏、凝胶、洗剂或洗脱型产品。

在任何化妆品的配方中，本发明的含长双歧杆菌菌种的裂解液和鸡胚精华液组合物冻干粉的添加量范围都是基于化妆品想要达到的效果，配方中的其它组分、组合物类型、成本和实用性。通常，本发明的含长双歧杆菌菌种的裂解液和鸡胚精华液组合物冻干粉的添加量优选为0.1%～5%，更优选为1%～3%。

本发明所述的长双歧杆菌菌种的微生物可以以活的、半活的或灭活的或死的形式包含在本发明的抗衰老美白化妆品中。

当这些微生物以活的形式用在抗衰老美白化妆品时，每克产品中活微生物的量范围可以为10²～10¹¹cfu/g、优选为10⁴～10¹¹ cfu/g、更优选为10⁶～10⁹cfu/g的微生物。

所述的微生物也可以包含在细胞成份的部分形式中。稀释或未稀释，或可替代地浓缩或未浓缩的微生物或部分也可以通过粉末、液体、或其部分的形式加入。

本发明的抗衰老美白化妆品还可以包含其它的多种化妆品用添加剂。

本发明的含长双歧杆菌菌种的裂解液和鸡胚精华液组合物冻干粉在化妆品中使用，所述化妆品局部应用，在皮肤上产生抗衰老和美白效果，例如弹性蛋白酶、酪氨酸酶的抑制和刺激胶原生成。此外，含长双歧杆菌菌种的裂解液和鸡胚精华液组合物冻干粉可用于提供抗氧化效果。本发明的含长双歧杆菌菌种的裂解液和鸡胚精华液组合物冻干粉可用于任何形式的化妆品，不论是否存在于化妆品中。冻干粉的量对于想要达到的效果以及组合物的制剂形式（例如洗面乳、面霜、乳膏或凝胶），应该是安全和有效的，而含长双歧杆菌菌种的裂解液和鸡胚精华液组合物冻干粉的添加量优选为0.1%～5%。

本发明中所述的抗衰老美白化妆品作为用于改善具有衰老迹象的皮肤的美容方法的一部分是特别有效的，其中，向需要此类改善的皮肤施用此类化妆品，进行改善此类皮肤状况所需的持续时间。虽然此类持续时间根据此类化妆品的效果而变化，优选的每天向皮肤至少应用一次该化妆品。

在本说明书及下面的实施例中，除非另外特别说明，百分比是重量百分比，写成“…～…”之间的数值范围包含所述范围的上限和下限。配制之前将各组份按本领域内技术人员易于决定的顺序和条件混合在一起。

附图说明

图1为消费者皮肤功效测试。

图2为实施例8皮肤水分测试中，与初始时间记录的数值相比水合值的变化。

图3为实施例11皮肤皱纹测试中，与处理开始时的数值相比最大粗糙度的变化。 

具体实施方式

为更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。

实施例1  长双歧杆菌裂解液冻干粉的制备

将长双歧杆菌冻干粉和磷酸缓冲液按质量体积比（kg/L）1:5.0混合溶解，然后用超声波来破碎长双歧杆菌的细胞壁，超声程序为：超声3s，间隔3s，超声20个循环。再按照此程序超声3次。超声后以6000rpm的转速离心20min。将离心后的上清液按质量体积比（kg/L）海藻糖：溶液=1:3.0向该溶液中加入海藻糖，在-80℃下冷冻干燥18h得长双歧杆菌冻干粉。

实施例2  长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物冻干粉的制备

将长双歧杆菌冻干粉和磷酸缓冲液按质量体积比（kg/L）1:5.0混合溶解，然后用超声波来破碎长双歧杆菌的细胞壁，超声程序为：超声3s，间隔3s，超声20个循环。再按照此程序超声3次。超声后以6000rpm的转速离心20min。将离心后的上清液与鸡胚精华液按体积比1.5:1 混合均匀，按质量体积比（kg/L）海藻糖：混合液=1:3.0向该混合液中加入海藻糖，在-80℃下冷冻干燥18h得组合物冻干粉。

以下为体外试验

实施例3  长双歧杆菌裂解液及其和鸡胚精华液组合物的抗氧化（清除自由基）作用

自由基是导致皮肤衰老的主要因素之一，抗氧化作用的物质可与自由基结合或发生替代，使得[DPPH·]自由基的数量减少，溶液颜色变浅，表现为515 nm处的光吸收值不断减少，只至达到稳定。因此可以通过测定515 nm下抗氧化物质对自由基的捕获[清除]能力来计算（判断）其抗氧化或清除自由基的能力。用于对功能性化妆品原料的抗氧化、抗衰老、美白作用。[DPPH·]（二苯基苦味肼基自由基）是一类较为稳定的以N为中心的自由基。[DPPH·]甲醇溶液呈紫色，在515 nm波长处有最大光吸收，颜色的深浅与浓度呈线性关系。[DPPH·]自由基被有较强还原能力的抗氧化剂直接捕获，根据DPPH被抗氧剂捕获后特征吸收的变化，可推知抗氧化剂对芳香自由基的清除能力，籍此对化妆品的抗衰老功效进行表征。检测对自由基的清楚能力，是防止皮肤老化的重要考察指标，特别是针对光老化。

建立标准的DPPH实验方法，本发明的长双歧杆菌裂解液冻干粉以及含长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物冻干粉用10 mM pH7.0的磷酸缓冲液复溶。实验以维生素C为正对照，取样0.1 mL，加入3.9 mL质量浓度为25 ug/mL的标准DPPH甲醇溶液，以甲醇为调零对照，515 nm波长下测定不同时间的吸光值，根据标准曲线换算为DPPH的质量浓度，计算出DPPH的残留率。根据DPPH残留率所对应的抗氧化物质的浓度判定长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物的清除自由基能力—抗氧化能力，结果显示，与维生素C相比，建议使用量的长双歧杆菌裂解液冻干粉以及长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物冻干粉分别具有10~30%和35~65%的清除自由基的能力，可见组合物对自由基的清除能力比单独使用长双歧杆菌裂解液更显著。

实施例4  长双歧杆菌裂解液及其和鸡胚精华液组合物对酪氨酸酶活性的抑制

酪氨酸酶是一种含铜的金属酶，普遍存在于哺乳动物、植物和微生物中，主要参与生物体内黑色素和其他多酚类物质的形成。体外酪氨酸酶活性抑制的生物活性物质有一定的酪氨酸酶活性抑制能力，可以用于评判具有美白活性物质的生物学功效。

本发明的长双歧杆菌裂解液冻干粉以及长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物冻干粉用10 mM pH7.0的磷酸缓冲液复溶，以多巴为底物，蘑菇酪氨酸酶为正对照，磷酸缓冲为负对照，建立酪氨酸酶活性检测体系，用于检测长双歧杆菌裂解液以及长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物对酪氨酸酶的抑制作用。取1.0 mL蘑菇酪氨酸酶溶液，加3 mL pH 6.0的磷酸缓冲液，加入2.0 mL多巴溶液，摇匀。反应5 min后，480 nm波长下测定OD值（使用l cm比色杯），以单位时间的OD值增加表示5分钟反应内酶的活力。长双歧杆菌裂解液以及长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物对酪氨酸酶活性抑制活性的测定，在酶反应体系中分别加入使用量的长双歧杆菌裂解液以及长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物，5分钟后分别测定OD480，计算单位时间OD的负增加表示抑制后的酶活性，与不加抑制剂比较计算抑制效率。结果显示长双歧杆菌裂解液以及长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物对酪氨酸酶活性的抑制作用分别为20~35%和30~50%，组合物显示了比单独使用长双歧杆菌裂解液更好的抑制效果。

实施例5  长双歧杆菌裂解液及其和鸡胚精华液组合物对黑色素合成的作用

美白活性物质具有抑制黑色素形成或促进黑色素降解的生物学作用，利用小鼠黑色素瘤B16体系，检测长双歧杆菌裂解液以及长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物对B16细胞黑色素合成的抑制作用，评价美白化妆品活性活性成分的活性作用。

黑色素细胞培养，培养基中分别添加长双歧杆菌裂解液以及长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物为处理组，不加长双歧杆菌裂解液以及长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物为对照组培养细胞，收集细胞、破碎、离心，测定420 nm光吸收值，以OD420的大小表示黑色素的深浅。结果显示，与对照相比，长双歧杆菌裂解液以及长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物分别可以减少B16细胞黑色素合成的15~35%和25~50%，且组合物对细胞黑色素合成的减少要好于长双歧杆菌裂解液。

实施例6 长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物对皮肤细胞胶原蛋白合成的作用

皮肤基质指标成分—胶原蛋白；细胞基底膜指标成分—IV型胶原蛋白，皮肤重建等价物及皮肤组织功能成分指标—纤维连接蛋白和透明质酸等的测定，以评判这些功能性物质对皮肤结构和功能重建的作用。

以HDF（人皮肤成纤维细胞）和HEK（人表皮角质细胞）为体系，培养细胞分别添加长双歧杆菌裂解液以及长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物为处理组，培养细胞48小时，收集细胞，以ELISA试剂盒测定总胶原蛋白和IV型胶原蛋白。实验结果显示两种添加物都可以提高HDF和HEK细胞合成胶原蛋白，但使用组合物的提高幅度较大。

表1  提高胶原蛋白合成的百分率（%）

。

以下为人体试验

实施例7  消费者皮肤功效测试

由60名对象组成的消费者（平均年龄53岁）试验组采用含长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物冻干粉的精华露、含2%长双歧杆菌裂解液冻干粉的精华露以及不含前两种功能性添加剂的安慰剂精华露进行皮肤功效研究。试验对象测试了上述三种配方。

试验周期包括三天的调理阶段、三天和三十天的产品使用阶段。这是一项盲测，配方随机选取。三天试用期间，试验对象每天记录使用情况并填写问卷，回答关于每种精华露的感官和使用特点的4个问题；三十天试用期间，试验对象每天记录使用情况并填写问卷，回答关于每种精华露的使用感觉和效果的6个问题，按照从1到3的等级做出评价。从结果可以看出消费者对含有长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物的精华露和含有长双歧杆菌裂解液的精华露的几乎所有性质都做出了高于安慰剂精华露的评价，且对含有长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物的精华露的评价好于含有长双歧杆菌裂解液的精华露（图1）。认为使用含有长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物的产品后皮肤的水润度、亮度、粗糙度等均有了不同程度的改善。

实施例8  皮肤水分测试

将各组实验样品与受试部位随机编号，决定试验样品和受试部位的对照顺序。由8名志愿者组成试验组。试验前，受试者需要统一用温热清水清洗双手前臂内侧。洗净后在受试者双手前臂内侧做好测量标记。本实验中左右手前臂各标记两个试验区域。每个区域涂抹一种受试物，区域间隔1cm。每处试验区域为4cm×4cm，试验样品量为0.2g。受试者在恒定环境中静坐30min后，使用Corneometer CM825 PC进行受试部位空白值的测量，每个区域依照一定顺序固定测量5个点，得出其平均值。然后由专人负责涂抹样品，并开始计时。按实验的设计分别于各时段测量MMV的变化。将每次检测的平均值减去空白值即为该时段MMV的变化值，再除去空白值即得出MMV的增长率，结果见图2。

皮肤水分含量增长率计算公式如下：

皮肤水分含量增长率=（MMV_t-MMV₀）/MMV₀×100%

式中，MMV₀表示涂抹前皮肤MMV；MMV_t表示涂抹后t时段皮肤MMV。

实验结果显示使用含有2%长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物冻干粉的精华露的受试者皮肤水合平均值增加的幅度均大于含2%长双歧杆菌裂解液冻干粉的精华露，说明与在产品中单独使用长双歧杆菌裂解液相比，使用组合物的保湿效果更佳。

实施例9  皮肤黑素含量变化测试

使用Mexameter MX18测定特定波长的光照在人体皮肤上后的反射量，确定皮肤中黑素的含量，藉此可以对化妆品的美白功效进行评价。

由20名女性志愿者（平均年龄41.3岁）组成试验组。试验前受试者需要统一的温和清洁剂清洗试验部位（左右面颊部位），首先用Corneometer CM 825PC测试仪检测每个试验部位（左右面颊试验部位尽量对称），分别重复5次，得出其平均值，此为基础值C₀。然后让每位受试者在右侧面颊使用0.3g含2%长双歧杆菌裂解液冻干粉的精华露，在左侧使用数量相同，含2%长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物冻干粉的精华露，每天2次，共持续20天。20天后，在面颊上进行仪器测量，每个受试部位各检测5次，得出平均值，并分别记为C_T和C_CK。计算皮肤黑素含量的变化。结果显示使用两种精华露后75%以上的试用者的皮肤黑素含量都有不同程度的降低，但使用含2%长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物冻干粉的精华露后，皮肤的黑素降幅更佳显著，均在20%以上，最高达55%，而使用含2%长双歧杆菌裂解液冻干粉的精华露部位的皮肤黑素含量降幅在10~35%之间，实验结果说明长双歧杆菌裂解液以及长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物均可以作为有效的活性成分，应用于化妆品中，能有效和显著地提亮与增白肤色，但组合物的使用效果更佳。 

实施例10  皮肤弹性测试

皮肤弹性随皮肤衰老而降低，因此皮肤弹性是判断皮肤衰老的重要标志之一，是皮肤衰老检测必不可少的项目。由20名女性志愿者（平均年龄41.3岁）组成试验组。试验前受试者需要统一的温和清洁剂清洗试验部位（左右面颊部位），首先用Corneometer CM 825PC测试仪检测每个试验部位（左右面颊试验部位尽量对称），分别重复5次，得出其平均值，此为基础值Ue₀。然后让每位受试者在右侧面颊使用0.3g含2%长双歧杆菌裂解液冻干粉的精华露，在左侧使用数量相同，含2%长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物冻干粉的精华露，每天2次，共持续20天。20天后，在面颊上进行仪器测量，每个受试部位各检测5次，得出平均值，并分别记为Ue_T和Ue_CK。结果显示使用两种精华露后80%以上的试用者皮肤弹性均有所增加，但使用含2%长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物冻干粉的精华露的皮肤弹性变化效果更为显著，增幅在10%~35%之间，而使用含2%长双歧杆菌裂解液冻干粉的精华露的皮肤弹性增幅在6%~20%之间。实验结果说明长双歧杆菌裂解液以及长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物均可以作为有效的活性成分，应用于化妆品中，能有效和显著地改善皮肤的弹性，但组合物的使用效果更佳。 

实施例11  皮肤皱纹测试

本测试旨在评价单次和数次分别使用含2%长双歧杆菌裂解液冻干粉的精华露和含有2%长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物冻干粉的精华露后皮肤粗糙度的变化。由20名女性志愿者（平均年龄41.3岁）组成试验组。试验前受试者需要统一的温和清洁剂清洗试验部位。然后在受试者的右侧面部使用0.3g含2%长双歧杆菌裂解液冻干粉的精华露，在左侧使用数量相同、含长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物冻干粉的精华露，每天2次，共持续20天。在试验开始时，首次使用精华露2h后，4h后以及试验结束时提取皮肤印模，然后通过专用的软件进行分析，即可得到不同皮肤皱纹的相应参数。在面颊上进行仪器测量，作为基础对照水平。

通过方差重复测量分析和Bonferroni检验，对各个时间控制点的记录数值进行对比。当概率p≤0.05时，可认为差异具有统计显著性，结果见图3。

实验结果显示使用含2%长双歧杆菌裂解液冻干粉的精华露和含2%长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物冻干粉的精华露的受试者使用部位的最大粗糙度都明显下降，但后者下降的幅度均比前者要大。说明在相同的添加浓度下，长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物要比单独使用长双歧杆菌裂解液效果好，组合物能够更快更有效地产生祛皱作用，非常适用于熟龄护肤和抗衰老等化妆品中。    

应该理解，本文中例举和描述的发明的特定实施方案仅意在示范，可以修饰和以不同但等价的方式实践本发明。因此很明显，上文公开的特定实施方案是可以改变或修饰的，所有此类变体都认为在本发明的范围和精神内。

Claims (14)

1.一种含有长双歧杆菌菌体裂解液和鸡胚精华液的组合物冻干粉，其特征在于由长双歧杆菌菌体裂解液和鸡胚精华液的混合液，由冻干保护剂海藻糖保护后经冻干、粉碎而获得；其中，混合液的体积百分比为：长双歧杆菌裂解液40%～90%，鸡胚精华液10%～60%，两者总量为100%；冻干保护剂海藻糖加量按质量体积比kg/L为海藻糖：混合液=1:1.0～6.0；

其制备方法具体步骤如下：

（1）将长双歧杆菌冻干粉和磷酸缓冲液按质量体积比kg/L为1:3.0～1:8.0的比例混合溶解，得到长双歧杆菌溶液； 

（2）将步骤（1）中的溶液用超声波处理，破碎长双歧杆菌的细胞壁，超声程序为：超声2～6s，间隔2～6s，超声15～30个循环；按此程序重复超声2～6次；

（3）超声后以5000～8000 rpm的转速离心15～30min；得上清液即长双歧杆菌裂解液；

（4）将长双歧杆菌裂解液与鸡胚精华液混合均匀，按体积比计，长双歧杆菌裂解液40%～90%，鸡胚精华液10%～60%，两者总量为100%；向该混合液中加入冻干保护剂海藻糖，按质量体积比计，海藻糖：混合液=1:1.0～1:6.0；在-45～-85℃下冷冻干燥12～36h，得长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物冻干粉；

其中，所述鸡胚精华液提取自健康孵化8～16天的鸡胚，具体提取步骤为：

（1）取孵化8～16天的健康鸡胚蛋，敲壳取鸡胚；

（2）用食品粉碎机将鸡胚打成匀浆，加入pH为6.8～7.2，浓度为30～50 mM的磷酸缓冲液，按质量比，鸡胚：磷酸缓冲液=1:1～3，4～10℃条件下，将鸡胚和磷酸缓冲液充分搅拌浸取过夜；

（3）用医用纱布过滤步骤（2）中的鸡胚浸取液，将滤液以4000～6000 rpm的转速离心15～30min；

（4）将离心后的上清液，用截留分子量为10000～20000 Da的中空纤维膜超滤进行过滤，得滤出液，即鸡胚精华液。

2.一种如权利要求1所述的含有长双歧杆菌菌体裂解液和鸡胚精华液的组合物冻干粉的制备方法，其特征在于步骤如下：

（1）将长双歧杆菌冻干粉和磷酸缓冲液按质量体积比kg/L为1:3.0～1:8.0的比例混合溶解，得到长双歧杆菌溶液； 

（2）将步骤（1）中的溶液用超声波处理，破碎长双歧杆菌的细胞壁，超声程序为：超声2～6s，间隔2～6s，超声15～30个循环；按此程序重复超声2～6次；

（3）超声后以5000～8000 rpm的转速离心15～30min；得上清液即长双歧杆菌裂解液；

（4）将长双歧杆菌裂解液与鸡胚精华液混合均匀，按体积比计，长双歧杆菌裂解液40%～90%，鸡胚精华液10%～60%，两者总量为100%；向该混合液中加入冻干保护剂海藻糖，按质量体积比计，海藻糖：混合液=1:1.0～1:6.0；在-45～-85℃下冷冻干燥12～36h，得长双歧杆菌裂解液和鸡胚精华液组合物冻干粉。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤（1）中，所述的长双歧杆菌冻干粉和磷酸缓冲液质量体积比kg/L为 1:4.0～1:6.0。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤（2）中，所述的超声程序为：超声3～5s，间隔3～5s，超声15～25个循环；按照此程序重复超声3～5次。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤（3）中，所述的离心转速为5500～6500rpm，离心时间为15～20min。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤（4）中，按体积比计，长双歧杆菌裂解液为50%～70%，鸡胚精华液为30%～50%；冻干保护剂海藻糖加量按质量体积比kg/L为海藻糖：混合液=1:2.0～5.0。

7.如权利要求1所述的长双歧杆菌菌体裂解液和鸡胚精华液的组合物冻干粉在制备对皮肤具有抗衰老和美白功效的化妆品中的应用。

8.一种化妆品组合物，其特征在于含有权利要求1所述的长双歧杆菌菌体裂解液和鸡胚精华液的组合物冻干粉，其中，所述组合物冻干粉含量为化妆品组合物总重量0.1%～5%。

9.根据权利要求8所述的化妆品组合物，其特征在于所述化妆品组合物是膏、霜、露、水、凝胶或洗剂。

10.根据权利要求8所述的化妆品组合物，其特征在于所述化妆品组合物还加入化妆品用油性原料，所述油性原料为硬脂酸酯类，油酸酯类，亚油酸酯类，棕榈酸酯类，异硬脂酸酯类，羟基硬脂酸酯类，肉豆蔻酸酯类，异棕榈酸酯类，月桂酸酯类，聚甘油酯类，羊毛脂衍生物类，季戊四醇酯类，蓖麻油酸酯类，琥珀酸酯类，磷酸酯类，山嵛酸甘油基酯，脂肪酸类，脂肪醇类，或蜡类中的一种或几种；油性原料的添加量为组合物总重量的0.01%～45%。

11.根据权利要求8所述的化妆品组合物，其特征在于所述化妆品组合物还加入有化妆品用营养性添加剂，所述的营养性添加剂为：维生素类，氨基酸，腺苷盐，甾醇类，水解蛋白类，以及其它营养性物质：脐带提取液、油溶性胎盘提取液、葡萄糖酸钠中的一种或几种，营养性添加剂的添加量为组合物总重量的0.01%～45%。

12.根据权利要求8所述的化妆品组合物，其特征在于所述化妆品组合物还加入有表面活性剂，所述表面活性剂为：失水山梨醇脂肪酸酯和其环氧乙烷加成物、月桂醇聚氧乙烯醚、椰子油脂肪酸二乙醇酰胺、油酸单甘油酯、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯羊毛脂、烷基磷酸酯、烷基磷酸聚氧化乙烯酯、脂肪酸碱金属盐、烷基甘油基醚中的一种或若干种；表面活性剂的添加量为组合物总重量的0.01%～45%。

13.根据权利要求8所述的化妆品组合物，其特征在于该化妆品组合物还加入有下述物质：乙二醇、聚乙二醇、丙二醇、丙三醇、山梨醇、POE（20）山梨醇、1,3-丁二醇、葡萄糖、麦芽糖、麦芽糖醇、蔗糖、果糖、木糖醇、麦芽三糖、苏糖醇以及赤藓醇中的一种或数种；上述物质的添加量为组合物总重量的0.01%～60%。

14.根据权利要求8-13之一所述的化妆品组合物，其特征在于所述化妆品组合物还加入有化妆品用粉类原料，所述粉类原料为硅酸盐类，铝盐，云母类，聚乙烯对苯二甲酸酯-铝-环氧树脂层压粉，聚乙烯-聚酯层压粉，纤维素粉，松香酸钠处理碳酸钙，水杨酸钛，氧化铝钴或羟基磷酸钙中的一种或几种；化妆品用粉类原料的添加量为组合物总重量的0.01%～50%。

Images