CN104840272A - 一种具有内置营养通道的三维生物结构的打印方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有内置营养通道的三维生物结构的打印方法。通过控制打印过程中的工艺参数，形成未完全反应的含有细胞的中空凝胶纤维，利用未完全反应的凝胶可以融合的原理来制造具有内置营养通道的三维生物结构。该方法利用含有同轴喷头和辅助z形板的三维打印装置，通过同轴喷头制造未完全反应的中空凝胶纤维作为三维结构的基本单元，驱动X、Y轴实现每层结构的打印，通过z形板的下降，实现层层打印并使下层凝胶结构充分反应以此作为上层结构的支撑。本发明工艺过程简单，可以实现支撑结构和内部流道的同时打印，而且有利于细胞存活。

Description

一种具有内置营养通道的三维生物结构的打印方法

技术领域

本发明属于组织工程技术领域，尤其是涉及一种具有内置营养通道的三维生物结构的打印方法。

背景技术

目前，全球每年等待器官移植的患者数量惊人。美国每年有超过6500人因未能及时得到捐赠的器官而死亡。此外，即便得到了捐赠的器官，患者在接受移植技术后也会出现不同程度的排异反应。目前有两种制作器官的主要方法，一是利用组织工程的思路，打印支架然后在支架内培养细胞，二是利用细胞直接打印构成器官。

目前基于组织工程技术制作器官的思路是先制作多孔支架然后在支架内培养细胞，最后将其移植到生物体内，继续培养。但组织工程方法难以解决细胞的密度问题，且细胞是在支架表面上生长，而真实的细胞生长环境是三维的，更重要的是表面的细胞可以得到更多的营养，内层细胞营养不良。

因而目前器官打印技术又称之为细胞打印技术开始逐渐成为生物器官制造的研究热点。将细胞混合营养液作为生物材料，利用3D打印技术构造出实体器官，然后再进一步进行后续培养便可获得具备生物活性的组织结构。从长远看可以解决人体器官短缺的难题，目前而言也可为高通量药物筛选、生物医学机理研究等提供更为有效的手段。对一个活性组织而言，器官内遍布的各类血管是器官保持活性的根本，各类血管组成的是一个立体的流道网络，只有有效的加工出和试剂生物器官相似的流道网络才有可能实现营养的有效输送，避免外层细胞营养过剩，内层细胞营养不良，确保打印出的细胞能在后续的培养中形成一个真正的活性器官。因而探索在打印同时实现支架/结构内的流道网络构建是活性支架打印的核心。

发明内容

鉴于现有技术无法很好地实现打印过程中凝胶内营养通道的构建，为了提高生物打印中细胞的活性，本发明提供了一种具有内置营养通道的三维生物结构的打印方法，利用三维打印装置，通过控制打印过程中的工艺参数，使形成的中空凝胶纤维未完全反应，没有完全反应的凝胶先驱材料可以融合成一体，最终得到所需要的三维生物结构。

具体方案分别如下：

一种具有内置营养通道的三维生物结构的打印方法，包括：利用三维打印装置打印含有细胞的中空凝胶纤维，通过控制打印过程中的工艺参数，使得打印出的含有细胞的中空凝胶纤维未完全反应，保证相邻两个中空凝胶纤维之间能够融合，打印完成后，使得所有含有细胞的中空凝胶纤维反应完全，得到具有内置营养通道的三维生物结构。

作为优选，所述打印方法的具体步骤为：

(1)制备凝胶先去材料水溶液和凝胶交联水溶液；

制备凝胶先驱材料水溶液时，具体操作步骤为：将灭菌后的凝胶先驱材料和去离子水混合，制备成一定浓度的凝胶材料水溶液。这里所用的凝胶先驱材料一般是离子敏感材料，包括海藻酸钠、壳聚糖等。作为优选，凝胶先驱材料选择为海藻酸钠，其来源广泛，生物兼容性好。

制备凝胶交联剂水溶液时，需要根据不同的凝胶先驱材料提供相应的触发条件，使其发生化学反应形成凝胶，形成具有一定强度的包含细胞的中空凝胶纤维。这里所述的触发条件一般是一种离子溶液，称为凝胶交联剂，例如海藻酸钠对应着氯化钙溶液，壳聚糖对应着氢氧化钠溶液。作为优选，凝胶交联剂选择为氯化钙溶液，其与海藻酸钠反应，产物为海藻酸钙，形成的结构强度较高；

(2)选定所需细胞，培养后与凝胶先驱材料配制的溶液混合均匀，制备得到溶液细胞的混合物；本步骤中，细胞的种类需要根据实际需要的生物要求确定，细胞的浓度要根据目标组织器官的要求确定。

(3)将溶液细胞的混合物加入到与外喷头相连的注射器中；将所述凝胶交联剂水溶液加入到与内喷头相连的注射器中；所述外喷头和内喷头同轴设置，所述内喷头的出料端伸入外喷头的喷腔内且继续延伸至于外喷头的出料端平齐；

外喷头和内喷头组成整体的同轴喷头，通过将两个注射器均放置在双通道注射泵上，利用注射泵实现对外喷头和内喷头流量的控制；

(4)设置外喷头和内喷头的出料速度、运行参数，控制外喷头和内喷头按照设定轨迹打印，得到未完全反应的中空凝胶纤维，且相邻中空凝胶纤维线与线之间融合在一起，完成第一层的打印，i＝1；

外喷头和内喷头的出料速度主要利用双通道注射泵控制，以保证得到含有细胞的未完全反应的中空凝胶纤维；

运行参数一般是指同轴喷头的运行速度和轨迹等，这些参数均可通过三维打印装置直接控制；

一般情况下，同轴喷头将物料打印至成形平台上，成形平台在Z轴驱动机构的驱动下科研z轴运动；同轴喷头一般与X轴驱动机构和Y轴驱动机构连接，通过X轴驱动机构和Y轴驱动机构可分别实现同轴喷头沿x轴方向的移动和沿y轴方向的移动；

通过控制中空凝胶纤维线与线之间的距离，保证未完全反应的相邻中空凝胶纤维相互融合；

(5)以相同的方法在第i层上打印第i+1层，第i层和第i+1层层与层接触部位相互融合；第i层和第i+1层均未完全反应，保证层与层之间的融合；

(6)第i层和第i+1层打印完成后，利用控制系统，控制第i层下降，使打印完成的第i层浸泡在凝胶交联剂水溶液中充分反应，并使打印完成的第i+1层暴露在凝胶交联剂水溶液液面外；

该步骤中，通过驱动成形平台下降，即可实现对第i层的下降；使打印完成的第一层浸泡在凝胶交联剂水溶液(例如氯化钙溶液)中充分反应，并使打印完成的第二层依然暴露在凝胶交联剂水溶液液面外；

(7)令i＝i+1，重复步骤(5)和步骤(6)，始终保持最上面两层在融合，下面的层在充分反应，直至打印完成，将整个结构完全浸泡在凝胶交联剂水溶液中，完全反应后得到具有内置营养通道的三维生物结构。

以海藻酸钠和氯化钙的组合为例，步骤(4)中得到含有细胞的未完全反应的中空凝胶纤维的原理为：由同轴喷头外喷头流出的海藻酸钠溶液与同轴喷头内喷头流出的氯化钙溶液接触，表面先发生交联反应，形成一层海藻酸钙凝胶，这层海藻酸钙凝胶使海藻酸钠和氯化钙溶液分离在两侧，由于形成的凝胶层的孔隙很小，只能允许钙离子通过，不允许海藻酸离子通过，所以内层的钙离子穿过凝胶层与外面的海藻酸钠继续反应，直到钙离子完全反应，海藻酸钠没有完全反应，最终形成外部实心部分为包含细胞的海藻酸钙凝胶和未完全反应的包含细胞的海藻酸钠，内部中空部分为水溶液的中空凝胶纤维。根据这个原理，要得到包含细胞的未完全反应的中空凝胶纤维，需要严格控制步骤(1)中海藻酸钠溶液浓度、步骤(1)中氯化钙溶液浓度、步骤(4)-(7)中的海藻酸钠流速和氯化钙溶液流速这四个工艺参数的组合。

以海藻酸钠和氯化钙的组合为例，步骤(5)中含有细胞的中空凝胶纤维融合在一起的原理为：中空凝胶纤维实心部分的外层为未完全反应的海藻酸钠，成溶胶态，这样相邻的线与线或层与层之间未反应的海藻酸钠便可以融合为一体。根据这个原理，要使相邻的中空凝胶纤维线与线或层与层融合在一起，需要根据中空凝胶纤维径向尺寸严格控制线与线和层与层之间的距离，这就要求控制系统在生成代码信息时，根据不同的工艺参数设置好合适的线距和层高。

作为优选，所述凝胶先驱材料为海藻酸钠或壳聚糖；所述凝胶交联剂为氯化钙或氢氧化钠。打印过程中材料的浓度及流速的优选方案：所述凝胶先驱材料水溶液的质量百分比浓度为2％-4％，流速为0.5-1.5ml/min；所述凝胶交联剂水溶液的质量百分比浓度为2％-4％，流速为1-4ml/min。选择该技术方案是时，打印得到的三维生物结构的强度较好。

作为进一步的优选，所述凝胶先驱材料为海藻酸钠；所述凝胶交联剂为氯化钙。此时打印过程中材料的浓度及流速的优选方案：所述海藻酸钠水溶液的质量百分比浓度为4％，流速为1ml/min；所述氯化钙水溶液的质量百分比浓度为2％，流速为1ml/min。选择该技术方案时，打印得到的三维生物结构强度最好。

作为优选，步骤(4)中平台的运动速度为800-1200mm/min。选择该技术方案，保证运动平台的速度与溶液的流速匹配，以形成均匀的直线。

步骤(6)中利用成形平台下降一层距离使打印完成的第i层浸泡在氯化钙溶液中充分反应的目的是下层充分反应后的凝胶具有较高的强度，以此支撑上层的凝胶结构，大大减小形成的流道的变形程度。

作为优选，步骤(1)和步骤(7)中，凝胶交联剂水溶液的浓度相同，这样完全反应后的结构均一。

作为优选，每层中空凝胶纤维中，相邻两个中空凝胶纤维中心之间的距离小于单个中空凝胶纤维的外径，大于单个中空凝胶纤维的内径。保证中空凝胶纤维线与线之间的重合。

本发明的一种具有内置营养通道的三维生物结构的打印装置及方法，与现有技术相比较，具有以下优点：

(1)本发明利用溶胶-凝胶交联反应的程度来实现中空凝胶纤维线与线和层与层之间的融合。结合中空凝胶纤维的尺寸，通过控制线与线和层与层之间的距离便可以得到融合成一个整体的三维生物结构。

(2)本发明利用未完全反应的中空凝胶纤维融合原理，在打印三维生物结构的过程中可以实现支撑结构和内部流道的同时制造。

(3)本发明形成内部流道的工艺简单，不需要后处理工艺，有利于细胞存活。

(4)本发明利用成形平台的下降，使下层的凝胶结构充分反应，作为上层凝胶结构的支撑，可以制造具有一定强度的组织结构。

附图说明

图1为本发明的一种具有内置营养通道的三维生物结构的打印方法的流程图。

图2为本发明中为了得到未完全反应的中空凝胶纤维以实现相邻的中空凝胶纤维的融合，材料的浓度及流速的优选方案图。

图3为本发明中打印的结构强度与海藻酸钠浓度和中空凝胶间距间的关系图。

其中：图3(a)是打印出的不同浓度的凝胶结构的应力—应变曲线；图3(b)是打印出的不同间距的凝胶结构的应力—应变曲线；图3(c)是打印出的凝胶结构的抗拉强度和最大应变与海藻酸钠浓度的关系图；图3(d)是打印出的凝胶结构的抗拉强度和最大应变与相邻中空凝胶纤维间距的关系图。

图4为本发明的中空凝胶纤维融合过程的示意图。

其中：图4(a)是同轴喷头的喷嘴处产生中空纤维的过程图；图4(b)是形成的未完全反应的中空凝胶纤维；图4(c)是相邻的未完全反应的中空凝胶纤维的融合过程。

图5为本发明的利用z形板进行层层打印的示意图。

其中：图5(a)是打印第一层的状态；图5(b)是打印第二层的状态；图5(c)是打印第三层的状态；图5(d)是整个结构浸泡在氯化钙溶液中的状态。

图6为利用本发明的方法打印出的含有内置营养流道的三维生物结构。

图7为利用本发明的方法打印出的含有内置营养流道的三维生物结构的细胞活性和不含流道的细胞活性的对比图。

图8为本发明的工艺所需要的装置结构示意图。

图9a为本发明工艺所需装置中的同轴喷头结构示意图。

图9b为图9a所示同轴喷头的剖视图。

图中：1为同轴喷头，2为z形板，3为储液槽，4为双通道注射泵，5为盛放海藻酸钠与细胞混合液的注射器，6为盛放氯化钙溶液的注射器，7为第一供液管，8为第二供液管，9为密封盖，10为安装管，11为外喷头，12为内喷头，13为定位盘。

具体实施方式

图8为本发明的工艺所需要的装置结构示意图。整个装置包括：同轴喷头1，z形板2，储液槽3，双通道注射泵4，盛放海藻酸钠与细胞混合液的注射器5，盛放氯化钙溶液的注射器6。同轴喷头1固定在水平驱动机构上，水平驱动机构一般包括X轴驱动机构和Y轴驱动机构，在水平驱动机构的驱动下，同轴喷头1能够实现在x、y轴方向上的往复运动，以实现每层结构的打印。z形板2作为打印的成形平台，固定在Z轴驱动机构上，在Z轴驱动机构的驱动下，z形板2能够实现在z轴方向上的往复运动，以实现三维层层结构的打印。储液槽3中盛放氯化钙溶液用来实现未完全反应的凝胶结构充分反应，双通道注射泵4通过设置相应的流速以实现海藻酸钠和氯化钙溶液的供液。

上述的X轴驱动机构、Y轴驱动机构和Z轴驱动机构均可采用现有的驱动机构，一般包括电机、电机丝杠、与电机丝杠螺纹配合的滑块以及对滑块进行导向、将电机丝杠转化为滑块的屏东的导向部件或者导向结构。X轴驱动机构一般固定在Y轴驱动机构的滑块上，实现对同轴喷头x轴和y轴移动方向的控制。在X轴驱动机构、Y轴驱动机构驱动下，同轴喷头完成每层中多个中空纤维线的打印，在Z轴驱动机构的配合下，完成多层之间的打印。

同轴喷头1的结构如图9a和图9b所示，同轴喷头1由第一供液管7、第二供液管8、带有保证第二供液管8能够插入的避让孔的密封盖9、安装管10、外喷头11、内喷头12、多孔的定位盘13组成。安装管10内设有内腔，内腔靠近顶部内壁设有倒置的圆锥台，顶部的圆锥台用于实现内喷头12的固定。外喷头11顶面设有定位台阶，用于实现定位盘13的定位。工作时，第一供液管7、密封盖9、外喷头11通过螺纹连接固定在安装管10上，内喷头12顶面与密封盖9底面抵接，内喷头12低端为类似外锥台结构，与安装管10内壁设置的锥形太抵接，通过密封盖9下压力实现自身的固定，第二供液管8下端为圆锥面，通过圆锥面与内喷头12连接，内喷头12通过多孔的定位盘13中间的孔深入到外喷头11的端部，内外喷头端面平齐。整个同轴喷头装配后密封性很好。定位盘13、内喷头12和外喷头11同轴设置，多孔的定位盘13中间设有避让内喷头12端部的避让通孔，以及用于与第一供液管7导通的打印通道，打印通道沿圆柱形多孔的定位盘13的中心轴周向均匀设置。

结合具体的材料及相应的参数对本发明做详细描述。凝胶先驱材料选用海藻酸钠，凝胶交联剂材料选用氯化钙，细胞选用小鼠成纤维细胞L929。

首先为了得到未完全反应的中空凝胶纤维以实现相邻的中空凝胶纤维的融合，按照图2提供的材料的浓度及流速的优选方案，本实例选择海藻酸钠的浓度为4％，流速为1ml/min；氯化钙的浓度为2％，流速为1ml/min，从图3可以看出，这种组合下所打印的凝胶结构的强度最好。此外，小鼠成纤维细胞L929的浓度为1×10⁶个/ml。在此条件下形成的中空凝胶纤维的平均外径为1113μm，内径为817μm，壁厚为148μm。

图4为本发明的中空凝胶纤维融合过程的示意图。如图4(a)，海藻酸钠溶液流入同轴喷头的外喷头，氯化钙溶液流入同轴喷头的内喷头。根据离子交联顺序，钙离子向海藻酸钠溶液中扩散，反应形成一层海藻酸钙凝胶s，这层海藻酸钙凝胶s使海藻酸钠和氯化钙溶液分离在两侧，由于形成的凝胶层的孔隙很小，只能允许钙离子通过，不允许海藻酸离子通过，所以内层的钙离子穿过凝胶层与外面的海藻酸钠继续反应，直到钙离子完全反应，海藻酸钠没有完全反应，最终形成外部实心部分为包含细胞的海藻酸钙凝胶和未完全反应的包含细胞的海藻酸钠，内部中空部分为水溶液的中空凝胶纤维，如图4(b)所示，其中黑色部分为反应完全的凝胶，阴影部分为未完全反应的凝胶。通过驱动X、Y轴驱动机构，设置凝胶纤维线距为1mm，这样相邻的线与线之间未反应的凝胶便可以融合为一体，如图4(c)所示。

图6为本实例所打印出的含有内置营养流道的三维生物结构。该结构为六层长方体形状，如图6(a)所示。其截面效果如图6(b)所示。在打印开始前，需要利用三维软件构建需要打印的三维生物结构的三维模型，然后利用分层软件分层得到各层的代码信息。然后利用控制系统，根据成形条件，设置运动平台的速度，根据融合条件设置线距和层高。为打印上述这种结构，结合本发明的成形工艺流程示意图1和利用z形板进行层层打印的示意图5对本发明做详细描述。具体实施步骤如下：

(1)制备质量浓度为8％的海藻酸钠溶液：称取一定量的生化级海藻酸钠粉末，放在紫外灯下照射灭菌半小时，按比例将海藻酸钠粉末和去离子水混合，磁力搅拌机搅拌24小时，温度设置为60℃，转速为120rpm。待混合均匀后得到质量浓度为8％的海藻酸钠溶液；

(2)将培养在培养瓶中的小鼠成纤维细胞L929先用PBS冲洗，再用胰酶消化下来，得到的细胞悬浮液在离心机上离心，离心后去掉上清液。按比例加入MEM培养基混合均匀后得到细胞浓度为2×10⁶个/ml；

(3)将步骤(1)中的8％海藻酸钠溶液和步骤(2)中的2×10⁶个/ml的细胞溶液按体积比1:1混合均匀，最终海藻酸钠溶液的浓度为4％，细胞的浓度为1×10⁶个/ml；

(4)制备质量浓度为2％的氯化钙溶液：称取一定量的生化级氯化钙粉末，放在紫外灯下照射灭菌半小时，按比例将氯化钙粉末和去离子水混合，磁力搅拌机搅拌1小时，温度设置为25℃，转速为120rpm。待混合均匀后得到质量浓度为2％的氯化钙溶液；

(5)将步骤(3)中配置好的含有小鼠成纤维细胞的4％的海藻酸钠溶液倒入与同轴喷头1外喷头相连的注射器5中；将步骤(4)中配置好的4％的氯化钙溶液倒入与同轴喷头1相连的注射器6中。并将两个注射器均放置在双通道注射泵4上；

(6)利用双通道注射泵4控制同轴喷头1外喷头和内喷头的液体的流动速度，均设置为1ml/min，得到含有小鼠成纤维细胞的未完全反应的中空凝胶纤维；

(7)第一层的轨迹路线为平行于X轴的直线，根据轨迹生成相应的G代码信息，在X轴驱动机构驱动下，同轴喷头1运动速度设置为1000mm/min，线距设置为1mm。运行程序后得到融合在一起的第一层凝胶结构，如图5(a)；

(8)第二层的轨迹路线为平行于Y轴的直线，类似于步骤(7)，运行程序后得到融合在一起的第二层凝胶结构，如图5(b)；

(9)前两层打印完成后，利用控制系统，启动Z轴驱动机构运行，速度设置为600mm/min，下降距离为1mm，使打印完成的第一层浸泡在氯化钙溶液中充分反应，并使打印完成的第二层依然暴露在氯化钙溶液液面外；

(10)与步骤(7)相同，驱动X、Y轴驱动机构运动完成第三层的打印。暴露在氯化钙溶液液面外的第二层由于没有完全反应，与第三层融合在一起，如图5(c)；

(11)重复步骤(9)(10)，层层打印，始终保持最上面两层在融合，下面的层在充分反应；

(12)当整个三维结构打印完成后，驱动Z轴驱动机构，使z形板下降5mm，使整个结构完全浸泡在氯化钙溶液中，完全反应后得到具有一定强度且内部具有通道的三维生物结构，如图5(d)。

打印结束后，发明人对本实例所打印的图6所示的含有细胞的凝结结构做了细胞活性分析，并与直接浇注成不含营养通道的凝胶结构进行对比，结果如图7所示。可以看出，相比于不含营养通道的凝胶结构，细胞的活性大大提高。经过一个星期培养后含有营养通道的凝胶结构的细胞活性为：一天后92.9±2.36％，四天后84.7±3.18％，七天后67.1±3.89％。这表明本发明的具有内置营养通道的三维生物结构的打印方法有利于细胞的存活。

Claims (7)

1.一种具有内置营养通道的三维生物结构的打印方法，其特征在于，包括：利用三维打印装置打印含有细胞的中空凝胶纤维，通过控制打印过程中的工艺参数，使得打印出的含有细胞的中空凝胶纤维未完全反应，保证相邻两个中空凝胶纤维之间能够融合，打印完成后，使得所有含有细胞的中空凝胶纤维反应完全，得到具有内置营养通道的三维生物结构。

2.根据权利要求1所述的具有内置营养通道的三维生物结构的打印方法，其特征在于，包括：

(1)制备凝胶先驱材料水溶液和凝胶交联剂水溶液；

(2)选定所需细胞，培养后与所述凝胶先驱材料水溶液混合均匀，制备得到溶液细胞的混合物；

(3)将溶液细胞的混合物加入到与外喷头相连的注射器中；将所述凝胶交联剂水溶液加入到与内喷头相连的注射器中；所述外喷头和内喷头同轴设置，所述内喷头的出料端伸入外喷头的喷腔内且继续延伸至于外喷头的出料端平齐；

(4)设置外喷头和内喷头的出料速度、运行参数，控制外喷头和内喷头按照设定轨迹打印，得到未完全反应的中空凝胶纤维，且相邻中空凝胶纤维线与线之间融合在一起，完成第一层的打印，i＝1；

(5)以相同的方法在第i层上打印第i+1层，第i层和第i+1层层与层接触部位相互融合；

(6)第i层和第i+1层打印完成后，利用控制系统，控制第i层下降，使打印完成的第i层浸泡在凝胶交联剂水溶液中充分反应，并使打印完成的第i+1层暴露在凝胶交联剂水溶液液面外；

(7)令i＝i+1，重复步骤(5)和步骤(6)，直至打印完成，将整个结构完全浸泡在凝胶交联剂水溶液中，完全反应后得到具有内置营养通道的三维生物结构。

3.根据权利要求2所述的具有内置营养通道的三维生物结构的打印方法，其特征在于，所述凝胶先驱材料水溶液的质量百分比浓度为2％-4％，流速为0.5-1.5ml/min；所述凝胶交联剂水溶液的质量百分比浓度为2-4％，流速为1-4ml/min。

4.根据权利要求2所述的具有内置营养通道的三维生物结构的打印方法，其特征在于，步骤(4)中，第i层平台运动的速度为800-1200mm/min。

5.根据权利要求2或3所述的具有内置营养通道的三维生物结构的打印方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(7)中，凝胶交联剂水溶液的浓度相同。

6.根据权利要求2所述的具有内置营养通道的三维生物结构的打印方法，其特征在于，所述凝胶先驱材料为海藻酸钠或壳聚糖；所述凝胶交联剂为氯化钙或氢氧化钠。

7.根据权利要求6所述的具有内置营养通道的三维生物结构的打印方法，其特征在于，所述凝胶先驱材料为海藻酸钠；所述凝胶交联剂为氯化钙。