CN114404666B

CN114404666B - 一种用于创面修复的原位打印支架及其制备方法

Info

Publication number: CN114404666B
Application number: CN202210107488.2A
Authority: CN
Inventors: 孙利; 王小成; 杨超宇; 李文钊; 赵远锦
Original assignee: Nanjing Deep Breathing Biotechnology Co ltd; Nanjing Drum Tower Hospital
Current assignee: Nanjing Deep Breathing Biotechnology Co ltd; Nanjing Drum Tower Hospital
Priority date: 2022-01-28
Filing date: 2022-01-28
Publication date: 2022-12-27
Anticipated expiration: 2042-01-28
Also published as: CN114404666A

Abstract

本发明提供一种用于创面修复的原位打印支架及其制备方法。该方法基于微流控湿法纺丝技术与3D打印技术的结合，将具有中空通道、尺寸大小可控的水凝胶纤维层层堆砌成3D支架，可实现任意形状和深度的组织缺损的原位填补和即时修复。本发明将具有光合作用活性的小球藻引入到水凝胶支架体系，赋予该支架光控产氧的特性，持续为缺氧性创面提供氧气供应，促进血管再生，进而提高其愈合速度和质量。本发明所采用的微流控芯片和3D打印平台便于实现个性化定制，支架材料内部组成可精确调节，所制得的小球藻复合支架的宏观形状、通道尺寸、光合作用效率和组织再生活性能够有效调控，创面修复效果显著，可广泛适用于多种组织缺损修复的应用。

Description

一种用于创面修复的原位打印支架及其制备方法

技术领域：

本发明属于生物医用材料技术领域，具体涉及一种用于创面修复的原位打印支架及其制备方法。

背景技术：

创面频繁地发生于日常生活和外科手术等，创面修复是全世界医疗卫生领域一个备受关注的问题。创面愈合是一个非常复杂的过程，且伤口本身具有多变性，包括缺损大小、形状、深度、损伤部位、患者是否有糖尿病或缺血性疾病等因素。大面积的皮肤缺损通常需要移植自体或同种异体移植物来填补缺口，但是存在供体不足、免疫排斥及感染风险等缺点。作为一种极具潜力的替代物，组织工程支架已经被用于治疗各种伤口，特别是大面积伤口、深度伤口和慢性创面。然而，目前通常很难制造具有任意形状和尺寸的支架，以匹配实际应用过程中不同深度和形状的伤口。此外，支架内部的营养输送和氧气供应不足，特别是在较大尺寸支架的中心区域，会影响整体治疗效果并导致修复效果不佳。为此，人们通过将无机过氧化物、液体过氧化物或碳氟化合物掺入支架中，实现氧气原位输送的策略，可用于缓解全身缺氧、促进血管生成和胶原蛋白沉积，进而加速伤口愈合。但是，这些系统通常只能提供氧气几天，不能维持整个创面愈合过程所需的氧气供应。因此，开发具有形状可控和持续供氧特性的新型支架有待进一步研究。

微藻作为一种自养型原始微生物，在光照条件下能进行光合作用，将二氧化碳和水转化为氧气和营养物。鉴于其自发产氧特性，以及其丰富的生物活性成分和优异的生物相容性，光合微藻最近已被纳入多种功能型复合材料体系，并成功应用于肿瘤治疗和组织再生等生物医学应用。另一方面，得益于高精密度和设计灵活性，3D生物打印技术已广泛用于组织工程中载活细胞或无细胞仿生支架材料的构建。近年来，一些研究通过在体内组织缺损部位进行原位打印生物活性支架，便于填充不规则形状的缺口，实现与周边的组织更好的桥接和整合。

因此，本发明将微流控湿法纺丝技术与3D打印技术的结合，将具有中空通道、尺寸大小可控的水凝胶纤维层层堆砌成3D支架，可实现任意形状和深度的组织缺损的原位填补和修复。特别地，打印过程中，我们将具有光合作用活性的小球藻引入到水凝胶支架体系，赋予该支架光控产氧的特性，它能够持续为缺氧性创面提供氧气供应，促进血管再生，进而提高其愈合速度和质量。这种基于自供氧气促进创面修复的生物活支架的开发和制备，对于具有微流控辅助打印技术的发展具有重要意义，为开发新型组织工程支架材料用于多种组织缺损修复提供新思路和方法。

发明内容：

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种用于创面修复的原位打印支架及其制备方法，通过微流控湿法纺丝技术结合3D打印技术，将具有光合作用活性的小球藻引入到水凝胶支架体系，实现支架在创口部位的原位打印和实时修补，在创面的修复过程中小球藻能持续释放氧气，有效提高缺氧性创面的愈合速度和质量。

本发明采用以下技术方案：

一种用于创面修复的原位打印支架的制备方法，包括以下步骤：

S1、生成一维载活微藻的水凝胶中空纤维基元：设计和构建嵌套式入射通道微流控装置，选择合适浓度交联剂的水相溶液作为内相，选择不同组成配比的载活微藻的预聚物溶液作为外相，直接在空气中挤出初步成型的中空纤维，再经过紫外激光照射进行二重交联固化，制得尺寸均一、连续稳定的载活微藻水凝胶中空纤维材料；

S2、原位打印制备三维载活微藻的水凝胶支架：将S1所制备的中空纤维基元通过3D打印的方式，在清洁平板上通过层层堆积的方式将纤维基元进行交叉排列，原位打印出具有三维连通多孔结构的载活微藻水凝胶纤维支架。

进一步的，可通过调整微流控通道直径，以及内相、外相的流速，对所得的载活微藻水凝胶中空纤维的中空通道尺寸进行调控；通过改变含活微藻预聚物溶液的组成配比，以制备出成分可控的生物活性纤维支架；通过改变三维打印程序得到不同三维连通多孔结构、不同宏观外形或不同尺寸的纤维支架。

进一步的，S1中，所述嵌套式入射通道微流控装置，其微流控芯片由玻璃毛细管、载玻片、盖玻片、点样针头和速干胶组装而成；其中，玻璃毛细管由外相毛细管和内相毛细管同轴嵌套组装而成。

进一步的，所述外相毛细管的管径为300～1500μm，所述内相毛细管管径为20～200μm，通过改变内、外相流速或内、外相毛细管管径，能够调节的水凝胶纤维中空通道的内、外径。

进一步的，S1中，所述外相为添加活微藻的海藻酸钠与甲基丙烯酸酐化明胶GelMA的混合分散液；所述内相为氯化钙与明胶的混合溶液。

进一步的，所述外相中，海藻酸钠和甲基丙烯酸酐化明胶的浓度分别为0.5～2.5％w/v和1～30％w/v；所述活微藻为小球藻，小球藻在外相中的浓度为0～1000万/ml。通过在0.5～2.5％和1～30％范围内改变海藻酸钠和GelMA的含量，能够改变水凝胶纤维基元的成型性能和机械强度；通过在0～1000万/ml范围内改变外相中微藻细胞的含量，能够调节纤维基元的氧气释放性能和皮肤组织再生活性。

进一步的，所述内相中，明胶浓度为1～30％w/v，氯化钙浓度为0.2～2％w/v。通过在1～30％和0.2～2％范围内改变明胶和氯化钙的含量，能够改变水凝胶纤维基元的成型性能和机械强度。

进一步的，S2中，通过3D打印的方式，通过层层堆积的方式将纤维基元在清洁平板上进行交叉排列，原位打印出具有三维连通多孔结构的载活微藻水凝胶纤维支架；所述中空纤维支架的组成中空圆柱状结构的纤维基元，内径为10～500μm，外径为100～1500μm；中空纤维层层堆积形成具有三维连通多孔结构的纤维支架，其孔径尺寸为10～2000μm。

进一步的，S2中，所述具有三维连通多孔结构的纤维支架的基元堆积方式、结构和尺寸能够通过调整三维打印程序而进行调节，基元堆积方式为正交、斜交或平行堆积，支架整体结构可为圆柱体、立方体或复合多面体，以满足不同形状、深度的缺口的实时匹配和完全填补。

进一步的，S2中，3D打印成型后的纤维支架，利用紫外激光照射进行二重交联固化以加强固化成型，从而获得具有较好机械强度以及稳定三维多孔结构的水凝胶立体支架。

本发明还提供了采用上述方法制备得到的用于创面修复的原位打印支架，可针对活体组织缺口部位进行支架的打印，支架内部的小球藻在创面的修复过程中能持续释放氧气，有效提高缺氧性创面的愈合速度和质量。

本发明的有益效果：

1)本发明依托微流控技术，采用嵌套式微流控芯片进行载活微藻水凝胶纤维制备，构造简单、搭建步骤少，不需要复杂的机械加工过程，工艺简单，操作方便；通过调整微流控芯片中毛细管管径以及各相流体流速，可以实现对所得纤维的中空通道结构的调控；微藻可以长期在水凝胶内部增殖，并保持其光合作用产生氧气的活性，改变其含量可以有效调控产氧速率和释放量。

2)本发明通过结合3D打印技术，制备出3D打印载活微藻水凝胶支架，支架的尺寸、整体形状以及孔道的大小、形状、连通性可以实现精确设计和控制，可实现高效、快速、可重复性制备，避免人为误差，并满足实际不同创面的个性化需求。支架的三维孔道结构能提供一个有利于细胞黏附、增殖、分化以及生长的三维支架式外环境，有利于氧气、营养物质的输运，进而促进新生组织长。

3)本发明提出将具有光合作用活性的小球藻引入到水凝胶支架体系，赋予该支架光控产氧的特性，持续为缺氧性创面提供氧气供应，促进血管再生，进而提高其愈合速度和质量。这种基于自供氧气促进创面修复的生物活支架的开发和制备，对于具有微流控辅助打印技术的发展具有重要意义，为开发新型组织工程支架材料用于多种组织缺损修复提供新思路和方法。

附图说明：

图1为本发明用于创面修复的原位打印支架通过光合作用产生氧气促进创面愈合的示意图；

图2为本发明的载活微藻中空水凝胶纤维支架的表面(a，b)和截面(c，d)扫描电镜形貌照片；

图3为打印结束后，载活微藻水凝胶支架在光照下连续培养7天的变化情况，(a，b)分别为数码照片和光学显微照片；

图4为细胞增殖效果图，表明在载活微藻水凝胶支架处理下，正常皮肤细胞增殖效果更明显：(a)为培养细胞5天后的活细胞染色照片，(b)为细胞在5天内的增殖活性定量评估结果；

图5为本发明的载活微藻水凝胶支架在活体小鼠背部创口部位的原位打印过程照片(a)及其15天内对小鼠体内创面愈合修复过程观察(b)。

具体实施方式：

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1

本发明实施例通过微流控3D打印方式制备三维连通多孔结构的载活微藻水凝胶纤维支架，如图1所示，具体制备流程如下：

(1)配制内、外相溶液：

1.1)内相溶液：由氯化钙和明胶溶液组成，称取一定量氯化钙和明胶粉体，溶于超纯水，形成浓度为0.8％(w/v)的氯化钙和5％(w/v)明胶的混合溶液，作为内相溶液。

1.2)外相溶液：将小球藻分散在浓度分别为2.5％(w/v)和5％(w/v)的海藻酸钠和GelMA混合预聚物溶液中。具体为：首先将活微藻细胞液从4℃冰箱中取出，放室温中复温2小时，离心去除旧培养液，将细胞分散在新培养液里并对细胞浓度进行计数。取一定浓度的小球藻细胞液，称取一定质量的海藻酸钠和GelMA固体，溶于小球藻细胞液，获得浓度分别为2.5％(w/v)和5％(w/v)的海藻酸钠和GelMA混合预聚物溶液；在37℃中搅拌，待溶液完全溶解后，加入一定质量的光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰亚膦酸锂(LAP)，其最终浓度为0.1％(w/v)。

(2)组装同轴嵌套式微流控芯片：利用微电极拉制仪或乙炔喷灯拉制两种不同尺寸的玻璃毛细管，外相毛细管管径为500μm，内相毛细管管径为100μm；微流控芯片由玻璃毛细管、载玻片、盖玻片、点样针头和速干胶组装而成，其中，玻璃毛细管由外相锥形毛细管和内相纺锤形出口毛细管同轴嵌套组装而成。

(3)制备一维载活微藻中空纤维：

将内相及外相溶液抽取到相应规格的医用一次性针筒注射器中，并将其分别安放在两台蠕动泵上，注射器和微流控芯片通过聚乙烯管连接，设定各相流速，启动蠕动泵工作；在微流控通道内，当内相离子交联液和外相聚合物溶液相遇时，由于钙离子和海藻酸迅速交联固化，具有中空结构的载小球藻纤维由外相玻璃毛细管挤出，在空气中初具雏形。

(4)制备三维载活微藻水凝胶支架：

将微流控芯片整合到3D打印平台，利用计算机程序操控微流控喷头的移动位置，调整喷头的移动速度为6mm/s，匹配纤维的挤出速度，在洁净平板容器表面，逐层堆积连续挤出的微流控纤维材料，可制备出三维连通多孔结构的载活微藻纤维支架；待打印结束后，将支架暴露在紫外激光照射下5min，进行二重交联固化，可得到具有较好机械强度和稳定三维多孔结构的载活微藻水凝胶支架。

(5)三维载活微藻水凝胶支架的表征：

支架打印结束后，在光学显微镜下观察水凝胶内部活微藻的分布情况；将活微藻进行固定脱水干燥后采用扫描电镜进行观察，如图2所示，可以明显看到一些微藻随机分布在支架中空基元的表面和内部。

实施例2

将实施例1所制备的载活微藻水凝胶支架进行氧气释放实验：

(1)载活微藻水凝胶支架的体外培养：

将原位打印的载活微藻水凝胶支架浸泡在专用的无菌微藻培养液中，保持孵育环境温度为25℃，采用光强度为6000lux的LED灯泡进行持续照射一周，肉眼可见原本接近无色的支架颜色逐渐变成绿色，光学显微镜下可观察到活微藻细胞的数量在支架内部逐渐增加(图3)。

(2)载活微藻水凝胶支架的溶解氧释放实验：

为探究活微藻支架的光合产氧能力，将支架置于LED灯光下，两者距离保持10厘米，控制温度环境为25℃或37℃，使用溶解氧微型传感电极实时监控支架培养液中的溶解氧含量。为检测可控的氧气生产和消耗过程，先将支架暴露在LED灯照射60分钟，然后在黑暗条件下再孵育60分钟，重复该过程5次，记录溶解氧的变化情况。

实施例3

载活微藻水凝胶支架的体外和体内创面修复性能评估实验：

(1)体外活性评估实验包括缺氧条件下细胞增殖和迁移实验：

1.1)细胞增殖：采用皮肤成纤维细胞和血管内皮细胞作为模式细胞，为模拟体内创面缺氧情况，将细胞置于1％O₂的缺氧环境中培养。在24孔板中以每孔1万个细胞的密度接种细胞，12小时后将装载有微藻支架的Transwell小室转移到孔板内与细胞进行共培养。光照组采用光强度为6000lux的LED灯泡每天照射6小时。缺氧培养1、3、5天后，利用CCK8法，通过测450nm处的吸光度，评估皮肤成纤维细胞的增殖情况。并对细胞进行活死染色处理，采用激光共聚焦显微镜进行观察拍照。实验结果如图4所示，由于小球藻支架可通过光合作用产生氧气，从而缓解细胞缺氧情况，对细胞的增殖具有显著性促进效果。

1.2)细胞迁移：将10万个皮肤成纤维细胞或血管内皮细胞接种到24孔板中，缺氧条件下培养。12小时后用200微升枪头制造一个划痕，随后将装载有微藻支架的Transwell小室转移到孔板内与细胞进行共培养。继续缺氧培养，光照组采用光强度为6000lux的LED灯泡进行持续照射。在特定的时间点进行拍照记录划痕变化情况，定量分析划痕面积缩小率，证明光合作用活性支架具有促进细胞迁移的效果。

(2)载活微藻水凝胶支架的活体原位打印和创面修复实验：

首先通过腹腔注射链脲佐菌素(STZ)的方式诱导出糖尿病小鼠模型。STZ注射4周后，测量小鼠血糖，选择血糖水平超过20毫摩尔每升的糖尿病小鼠进行后续实验。随机分为四组：(1)对照组，(2)纯支架组，(3)小球藻支架组和(4)小球藻支架+光组。在每只小鼠的背部上制造直径为10毫米的全皮层创口，采用原位打印的方式在创口部位原位填充支架(图5a)，随后用不透明的敷料贴盖住。小球藻支架+光组中的支架每三天在LED灯下照射2小时。使用数码相机记录皮肤伤口愈合进程(图5b)。在第15天处死所有小鼠并取样进行组织学分析，包括苏木精-伊红(H&E)和马森三色染色及CD31和HIF-1α的免疫组化染色等，评估新生皮肤组织的微观形态及其内部血管分布和组织缺氧情况。结果显示，相对于对照组和纯支架组，小球藻支架组和小球藻支架+光组可明显提高小鼠创面的愈合速度，并且以小球藻支架+光组效果最佳。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种用于创面修复的原位打印支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S2、原位打印制备三维载活微藻的水凝胶支架：将S1所制备的中空纤维基元通过3D打印的方式，在清洁平板上通过层层堆积的方式将纤维基元进行交叉排列，原位打印出具有三维连通多孔结构的载活微藻水凝胶纤维支架；

S1中，所述外相为添加活微藻的海藻酸钠与甲基丙烯酸酐化明胶GelMA的混合分散液；所述内相为氯化钙与明胶的混合溶液；所述外相中，海藻酸钠和甲基丙烯酸酐化明胶的浓度分别为0.5~2.5% w/v和1~30% w/v；所述活微藻为小球藻，小球藻在外相中的浓度为0 ~1000 万/ml。

2.根据权利要求1所述的用于创面修复的原位打印支架的制备方法，其特征在于，通过调整微流控通道直径，以及内相、外相的流速，对所得的载活微藻水凝胶中空纤维的中空通道尺寸进行调控；通过改变含活微藻预聚物溶液的组成配比，以制备出成分可控的生物活性纤维支架；通过改变三维打印程序得到不同三维连通多孔结构、不同宏观外形或不同尺寸的纤维支架。

3.根据权利要求1所述的用于创面修复的原位打印支架的制备方法，其特征在于，S1中，所述嵌套式入射通道微流控装置，其微流控芯片由玻璃毛细管、载玻片、盖玻片、点样针头和速干胶组装而成；其中，玻璃毛细管由外相毛细管和内相毛细管同轴嵌套组装而成。

4.根据权利要求1所述的用于创面修复的原位打印支架的制备方法，其特征在于，所述内相中，明胶浓度为1~30% w/v，氯化钙浓度为0.2~2% w/v。

5.根据权利要求1所述的用于创面修复的原位打印支架的制备方法，其特征在于，S2中，所述中空纤维内径为10~500 μm，外径为100~1500 μm；中空纤维层层堆积形成具有三维连通多孔结构的纤维支架，其孔径尺寸为10~2000 μm。

6.根据权利要求1所述的用于创面修复的原位打印支架的制备方法，其特征在于，S2中，所述具有三维连通多孔结构的纤维支架的基元堆积方式、结构和尺寸通过调整三维打印程序而进行调节，基元堆积方式为正交、斜交或平行堆积，支架整体结构为圆柱体、立方体或复合多面体，以满足不同形状、深度的缺口的匹配和完全填补。

7.根据权利要求1所述的用于创面修复的原位打印支架的制备方法，其特征在于，S2中，3D打印成型后的纤维支架，利用紫外激光照射进行二重交联固化以加强固化成型，从而获得具有较好机械强度以及稳定三维多孔结构的水凝胶立体支架。

8.一种用于创面修复的原位打印支架，其特征在于，采用权利要求1~7任一项所述的制备方法制备得到。