CN113440640B - 一种藻-菌凝胶敷料及其制备方法 - Google Patents

一种藻-菌凝胶敷料及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种同时藻‑菌凝胶敷料，包括不透气且透明的背衬层和设置于所述背衬层以内的凝胶，所述凝胶为含有微藻和活的需氧菌的凝胶颗粒。该敷料以凝胶为载体，利用需氧菌耗氧加速体系乏氧，通过光合作用，微藻激活的氢化酶可释放氢气，以改善慢性创面炎症促进愈合。敷料的填充物含有可同时为组织递送高浓度溶解氧的活性微藻和或的需氧菌，敷料背衬层为透明、不透气的膜，敷料贴合于创面之后，微藻产生的氢气可以高效的渗透组织，改善创面氧化损伤和慢性炎症，从而起到促进各类伤口，尤其是慢性伤口，更尤其是糖尿病慢性伤口修复的作用。该敷料是一种局部供氢技术，便于携带。

Description

一种藻-菌凝胶敷料及其制备方法
技术领域
本发明属于医用敷料领域，具体涉及一种藻-菌凝胶医用敷料。
背景技术
现有技术中，针对伤口部位，尤其是各种慢性创面处于氧化损伤、长期的慢性炎症愈合困难。同时，现有的伤口敷料无法长时间递送治疗物质，使用过后就需要全部进行更换，造成了浪费。
发明内容
针对上述现有技术的问题，本发明的提出一种伤口修复用的藻-菌敷料及其制备方法。藻-菌共生凝胶敷料贴附于创面后，通过隔绝创面和外环境，避免伤口接触外环境中的病原体；制得的凝胶载体可缓慢释放氢气，使得产品维持时间延长，减少更换频率，节约成本。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种藻-菌凝胶敷料，包括不透气且透明的背衬层和设置于所述背衬层以内的凝胶，所述凝胶为含有微藻和活的需氧菌的凝胶颗粒。
凝胶中的活需氧菌通过呼吸作用，消耗氧气造成不透气的背衬层内乏氧，微藻的氢化酶在该乏氧条件下被激活，通过光合作用进行生物产氢，氢气进而缓解创面的氧化损伤和慢性炎症，直接促进创面愈合。对于各类伤口，尤其是慢性伤口，更尤其是糖尿病慢性伤口的修复具有优良的促进作用。
优选的，所述凝胶为海藻酸钠凝胶、透明质酸钠凝胶、波洛沙姆或明胶-甲基丙烯酰胺中的一种或几种。
优选的，所述微藻为聚球藻、小球藻、斜生栅藻、莱茵衣藻、鱼腥藻、三角褐指藻、杜氏盐藻或微拟球藻中的一种或几种。
优选的，所述活需氧菌为地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、深红红螺菌或沙门氏菌的一种或几种。
优选的，所述微藻和所述活需氧菌的数量比为1:6~15。
优选的，所述微藻和所述需氧菌在所述凝胶中的总浓度为1.4×108~7.5×108个/mL。即，每毫升所述凝胶中含有微藻和活需氧菌共1.4×108~7.5×108个。
优选的，所述凝胶中还含有培养基。培养基可以有效地提高微藻与活菌的活性，增强光合作用、呼吸作用的效率及产生氢气总量。
优选的，所述培养基含有胰蛋白胨、酵母提取物和氯化钠。
优选的，所述背衬层粘贴在凝胶的上端。
优选的，所述背衬层为聚氨酯。
优选的，所述敷料还包括亲水透气的内衬层。
优选的，所述内衬层为亲水型聚四氟乙烯（PTFE）。
优选的，所述内衬层具有孔径为0.1-0.22μm的微孔。
本发明还提供上述藻-菌凝胶敷料的制备方法，包括如下步骤：
（1）将微藻和活需氧菌与凝胶前驱液混合，之后采用凝胶前驱液制备得到凝胶；
（2）将所述凝胶置于背衬层以内，形成敷料。
形成敷料的方法可采用现有技术的方法成型，例如粘贴等。
进一步的，对于有内衬层的敷料，可采用热压、粘贴等现有技术接合内衬层和背衬层使得所述敷料成型。
进一步的，所述凝胶前驱液为海藻酸钠溶液时，所述步骤（1）为将微藻和活需氧菌与海藻酸钠溶液混合之后注射入氯化钙水溶液中，制备得到凝胶球；
所述凝胶前驱液为透明质酸钠溶液时，所述步骤（1）为将微藻和活需氧菌与透明质酸钠溶液混合之后，搅拌过夜得到凝胶；
所述凝胶前驱液为波洛沙姆溶液时，所述步骤（1）为将微藻和活需氧菌与波洛沙姆溶液混合之后，静置成得到凝胶；
所述凝胶前驱液为明胶-甲基丙烯酰胺前驱液时，所述步骤（1）为将微藻和活需氧菌与0.5%-1%光引发剂、2-甲基丙苯酮、明胶-甲基丙烯酰胺溶液混匀，之后以405nm光辐照10-30s使混合液凝胶化，静置得到水凝胶；所述明胶-甲基丙烯酰胺在混合液中的质量浓度为10%~30%之间。
本发明具有以下有益效果：
1. 本发明所述藻-菌凝胶敷料贴附于创面后，通过不透气的背衬层隔绝创面和外环境，避免伤口接触外环境中的病原体。
2. 本发明所述藻-菌凝胶敷料中的活菌通过呼吸作用，消耗氧气造成体系乏氧，微藻的氢化酶被激活，通过光合作用进行生物产氢，氢气进而缓解创面的氧化损伤和慢性炎症，直接促进创面愈合。
3. 本发明所述藻-菌凝胶敷料，其微藻和菌混合在凝胶中，接触面大，产氢时间长，产氢量大，可以长效递送氢气用于治疗，避免重复更换，降低了成本。
4. 本发明所述藻-菌凝胶敷料，相比现有技术，其采用的均为对生物体友好的材料，不使用风险物质。
5. 本发明所述藻-菌凝胶敷料，其中的活需氧菌通过呼吸作用产生的CO2，可以作为微藻光合作用的碳源使用，有利于提高微藻与活菌的活性，促进微藻高效产氢。
附图说明
图1为本发明所述藻-菌凝胶敷料的结构和治疗原理图。其中，1是内衬层，2是背衬层。
图2为实施例1中不同浓度配比的藻-菌溶液的产氢效果图。
图3为实施例1中凝胶球和藻-菌溶液产氢效果图。
图4为实施例1中藻凝胶球产氢缓解巨噬细胞氧化损伤效果图。
图5为实施例1中对人成纤维细胞增殖和人脐静脉内皮细胞分化实验结果图。
图6为实施例1中糖尿病小鼠伤口愈合情况照片。
图7为实施例1中糖尿病小鼠伤口愈合率结果图。
图8为实施例1中对糖尿病小鼠伤口愈合50%时所需时间图。
图9为实施例1中缓解糖尿病小鼠伤口组织的氧化损伤实验结果图。
图10为实施例1中促进糖尿病小鼠伤口组织血管再生结果图。
图11为实施例1中对糖尿病小鼠伤口愈合组织在第12天的H&E和Masson实验结果图。
具体实施方式
实施例1
（1）制备藻-菌凝胶敷料：
将小球藻、活的地衣芽孢杆菌与海藻酸钠水溶液（质量浓度为1%~4%）混合，其中小球藻、地衣芽孢杆菌的混合液与海藻酸钠溶液的体积用量为1:1~1:2之间。之后将该混合液注射入3%（w/v）的氯化钙溶液中，制备得到凝胶。得到的凝胶中，微生物总数量浓度（藻和菌的总数的浓度）为1.4×108~8×108个/mL。
将得到的凝胶转移至孔径0.1-0.22um 的亲水型PTFE聚四氟乙烯薄膜上，并在凝胶上方粘贴透明不透气的防水聚氨酯可粘贴薄膜，得到成型的敷料。
采用的内衬层在允许气体和水分单向高效渗透组织的同时，隔绝了微藻和活菌的跨膜扩散，维持创面无菌。
（2）为了验证藻-菌凝胶的产氢性能，首先将不同浓度配比的小球藻和地衣芽孢杆菌溶液均匀混合，在持续光照下振荡培养，通过气相色谱测量不同浓度配比的藻-菌溶液的产氢差异。得到的结果如图2所示，可以看出1:10数量配比的藻菌体系产氢最高。
进一步，按照步骤（1）的方法，将1:8-1:15浓度配比的小球藻、地衣芽孢杆菌的混合溶液与海藻酸钠溶液均匀混合，其中所述小球藻的浓度为1×108个/mL，使用注射器将混合溶液滴入氯化钙中，制成大小相同的藻凝胶球。在持续光照条件下振荡培养，通过气相色谱测量凝胶球溶液上层空气中的氢气浓度，比较等量的藻-菌凝胶球与藻-菌溶液产氢差异。如图3所示，可以看出固定化的藻-菌凝胶球在相同时间光照下产氢量与藻-菌溶液相近。
（3）为了验证藻-菌凝胶产生的氢气通过缓解细胞氧化损伤来促进糖尿病伤口环境细胞的增殖分化功能，首先将小鼠单核巨噬细胞分为3组：正常组细胞直接加入基础培养基，其余2组细胞置于过氧化氢中培养诱导氧化损伤，其中藻-菌凝胶组细胞在Transwell上室中加入步骤（1）新鲜制得的小球藻-地衣芽孢杆菌凝胶球，光照培养后，通过染色鉴别巨噬细胞的氧化损伤情况。如图4所示，相比之下藻-菌凝胶球能够更好地缓解过氧化氢诱导的氧化损伤，尤其是特异性清楚毒性最强的羟基自由基。
进一步，将人脐静脉内皮细胞和人成纤维细胞置于高葡萄糖浓度培养基中，将两种细胞分为3组：正常组细胞直接加入基础培养基，其余2组细胞用高糖培养并暴露于乏氧环境中，其中藻-菌凝胶组细胞在Transwell上室中加入步骤（1）新鲜制得的小球藻-地衣芽孢杆菌凝胶球，光照培养后，通过染色鉴别人成纤维细胞的生长数目以及人脐静脉内皮细胞的管腔生成长度。如图5所示，相比之下藻-菌凝胶球能够更好地促进细胞增殖及分化。
（4）为了证明藻-菌共生凝胶敷料对于糖尿病慢性伤口的治疗效果，将患有糖尿病的Balb/C小鼠随机分为四组：对照组、活菌组、微藻组、藻-菌凝胶组。去除背部中央的真皮表皮及浅表部分，去掉全层创面。对照组伤口暴露在空气中，其余组小鼠伤口分别将步骤（1）新鲜制备的活菌凝胶敷料/微藻凝胶敷料/藻-菌凝胶敷料局部覆盖在伤口上（所用的藻为小球藻，所用的菌为地衣芽孢杆菌），平均每3天更换一次敷料，并同一时间测量伤口面积，直到伤口完全愈合。如图6，7，8所示，使用藻-菌凝胶敷料可以显著促进伤口愈合，尤其是在第3天左右伤口愈合面积接近50%，加速糖尿病慢性创面急性化愈合。
进一步，分别取各组的糖尿病伤口组织在第6天、12天进行免疫组化以及免疫荧光分析。如图9，10，11所示，使用藻-菌凝胶敷料可以清除缓解糖尿病伤口的毒性自由基，缓解氧化损伤，促进伤口组织的血管再生。且藻-菌凝胶敷料治疗的伤口组织具备良好的上皮结构，肉芽组织丰富，胶原纤维大量整齐致密排列。
实施例2
将斜生栅藻、三角褐指藻、活的枯草芽孢杆菌与波洛沙姆溶液（质量浓度为20%~30%）混合，其中斜生栅藻和三角褐指藻与枯草芽孢杆菌的数量比为1:6，斜生栅藻、三角褐指藻、活的枯草芽孢杆菌的混合液（微生物总浓度为3.5×108~8×108个/mL）与波洛沙姆溶液的体积用量为1:1~1:2之间。之后将该混合液静置得到凝胶。
将得到的凝胶转移至孔径0.1-0.22um 的亲水型PTFE聚四氟乙烯薄膜上，并在凝胶上方粘贴透明不透气的防水聚氨酯可粘贴薄膜，得到成型的敷料。
采用实施例1中步骤（2）的方法测试得到的凝胶，其产氢浓度为4.2μmol。
实施例3
将聚球藻、鱼腥藻、活的深红红螺菌与0.5%-1%光引发剂、2-甲基丙苯酮、明胶-甲基丙烯酰胺溶液（质量浓度为10%~30%）混匀，其中聚球藻和鱼腥藻与深红红螺菌的数量比为1:8，聚球藻、鱼腥藻、深红红螺菌与光引发剂、2-甲基丙苯酮的混合液（其中微生物总浓度为3.5×108~8×108个/mL）与明胶-甲基丙烯酰胺溶液的体积用量为1:1。之后将该混合液以405nm光辐照10-30s使混合液凝胶化，静置即得凝胶。
将得到的凝胶转移至孔径0.1-0.22um 的亲水型PTFE聚四氟乙烯薄膜上，并在凝胶上方粘贴透明不透气的防水聚氨酯可粘贴薄膜，得到成型的敷料。
采用实施例1中步骤（2）的方法测试得到的凝胶，其产氢浓度为5μmol。
实施例4
将莱茵衣藻、杜氏盐藻、微拟球藻、活的沙门氏菌、枯草芽孢杆菌和含有胰蛋白胨的培养基混匀，其中莱茵衣藻、杜氏盐藻和微拟球藻与沙门氏菌、枯草芽孢杆菌的数量比为1:10，莱茵衣藻、杜氏盐藻、微拟球藻、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌和培养基的混合液（其中微生物总浓度为3.5×108~8×108个/mL）与透明质酸钠溶液（质量浓度为1%~4%）体积用量为1:1。之后将该混合液室温搅拌过夜即得凝胶。
将得到的凝胶转移至孔径0.1-0.22um 的亲水型PTFE聚四氟乙烯薄膜上，并在凝胶上方粘贴透明不透气的防水聚氨酯可粘贴薄膜，得到成型的敷料。
采用实施例1中步骤（2）的方法测试得到的凝胶，其产氢浓度为4.5μmol。

Claims (11)

1.一种藻-菌凝胶敷料，其特征在于，包括不透气且透明的背衬层和设置于所述背衬层以内的凝胶，所述凝胶为含有微藻和活的需氧菌的凝胶颗粒；
所述需氧菌为地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、深红红螺菌或沙门氏菌的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的藻-菌凝胶敷料，其特征在于，所述凝胶为海藻酸钠凝胶、透明质酸钠凝胶、波洛沙姆或明胶-甲基丙烯酰胺中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的藻-菌凝胶敷料，其特征在于，所述微藻为聚球藻、小球藻、斜生栅藻、莱茵衣藻、鱼腥藻、三角褐指藻、杜氏盐藻或微拟球藻中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的藻-菌凝胶敷料，其特征在于，所述微藻和所述活需氧菌的数量比为1:6~15。
5.根据权利要求1所述的藻-菌凝胶敷料，其特征在于，所述微藻和所述需氧菌在所述凝胶中的总浓度为1.4×108~7.5×108个/mL。
6.根据权利要求1所述的藻-菌凝胶敷料，其特征在于，所述凝胶中还含有培养基。
7.根据权利要求6所述的藻-菌凝胶敷料，其特征在于，所述培养基含有胰蛋白胨、酵母提取物和氯化钠。
8.根据权利要求1所述的藻-菌凝胶敷料，其特征在于，所述敷料还包括亲水透气的内衬层。
9.根据权利要求8所述的藻-菌凝胶敷料，其特征在于，所述内衬层为亲水型聚四氟乙烯。
10.根据权利要求8所述的藻-菌凝胶敷料，其特征在于，所述内衬层具有孔径为0.1-0.22μm的微孔。
11.权利要求1-10任一项所述藻-菌凝胶敷料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将微藻和活的需氧菌与凝胶前驱液混合，之后采用凝胶前驱液制备得到凝胶；
（2）将所述凝胶置于背衬层以内，形成敷料。
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