CN101843922B

CN101843922B - 富含氨基酸的无细胞真皮基质移植物及其制法和用途

Info

Publication number: CN101843922B
Application number: CN 200910048157
Authority: CN
Inventors: 王西樵; 陆树良
Original assignee: Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd
Current assignee: Ruinjin Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine Co Ltd
Priority date: 2009-03-25
Filing date: 2009-03-25
Publication date: 2013-08-14
Anticipated expiration: 2029-03-25
Also published as: CN101843922A

Abstract

本发明提供了一种富含氨基酸的无细胞真皮基质移植物及其制法和用途。所述的基质含有(a)真皮基质，所述的真皮基质中细胞数量小于5％，按真皮基质的体积计；(b)按真皮基质的重量计，含量为0.5-30重量％的游离氨基酸，所述的游离氨基酸结合或吸附于所述的真皮基质；(c)按真皮基质的重量计，含量为0-30重量％的壳聚糖。本发明的活性无细胞真皮基质可在短时间内与创面基底建立良好的血液循环，提高移植成功率，并改善移植效果。

Description

富含氨基酸的无细胞真皮基质移植物及其制法和用途

技术领域

本发明涉及医学领域，更具体地涉及用于皮肤移植的、富含氨基酸的无细胞真皮基质移植物及其制备方法和用途，所述的无细胞真皮基质可显著促进无细胞真皮基质血管化。

背景技术

皮肤组织创伤后，增生性瘢痕的形成一直是困扰患者的一大难题。如何有效地防治创伤后增生性瘢痕的形成，受到人们广泛的关注和期待。

全层皮肤缺损创面的现代治疗以移植刃厚自体皮(即薄皮)为主。由于刃厚自体皮含有较少的真皮成分，创面愈合后会产生不同程度的疤痕增生。若移植较厚的自体皮，则往往在供皮区造成明显的疤痕增生。

1981年Bell等人利用提取的天然胶原蛋白与成纤维细胞按一定的比例混合，形成一个真皮层。再将表皮细胞悬液接种在这个真皮层上，制成一个类似正常皮肤的复合皮。

Hznsbrough也利用可被生物降解的聚合物作为细胞生长的基质框架，在体外将新生儿成纤维细胞接种于基质框架内。随着细胞在框架上的生长，它们不断地分泌出许多蛋白质和糖蛋白等成分，充填在网状框架中，形成一个天然的细胞外基质。经过实验表明这个具有生命活性的真皮替代物覆盖在深度创面上能够迅速血管化，并且覆盖在其上的自体表皮也随之上皮化。

Heck于1985年报道，以同种异体真皮作为自体表皮的移植载体并应用于大鼠和人体上。他采用经过冷冻处理过的天然同种异体皮肤通过真空吸引法将所得的自体皮覆盖在异体真皮表面。

上述的一些复合移植方法，已部分建立具有类似真皮的结构和功能。植皮区创面变得光滑、平整；减少了疤痕增生，愈后功能也较为完善。

Cuono等人借助体外培养后的单层表皮细胞，覆盖于去除表皮的异体真皮表面。这种方法虽然已初步应用于临床，但效果难以肯定。原因是这种方法虽然脱除了表皮，从而降低了免疫抗原性，不会招致急性排斥反应，但是由于保留了真皮层内含有的表皮细胞成分、成纤维细胞和血管内皮细胞等，它们依然会引发机体产生免疫排斥反应。

1995年美国生命细胞公司的Livesey[Livesey SA，Herndon DN，Hollyoak MA，et al：Transplanted Acellular Allograft Dermal Matrix.Transplantation，1995，60(1)：1～9]等首先报道了无细胞真皮基质的制备方法。同年美国的Wainwright[Wainwright DJ：Use of an Acellular Allograft Dermal Matrix(AlloDerm)in the Management of Full-thickness Burns.Burns，1995，21(4)：243～248]首先报道了无细胞真皮基质的临床应用，引起了国际烧伤学界的广泛重视；国内许多单位也相继开展了临床应用，其应用范围扩大到整形外科，领面外科等，取得了较好的临床效果。

无细胞真皮基质(Acellular Dermal Matrix，ADM)是一种用于全层皮肤缺损创面的真皮替代物，来源于天然皮肤。它是天然皮肤经过一定的理化方法处理后，去除了表皮和真皮中所有细胞成分，但保留了真皮的胶原成分和其三维空间结构，同时也保留了基底膜复合物。由于去除了皮肤中具强抗原性的细胞成分，而仅残留具微弱抗原性的胶原蛋白等细胞外基质成分，同时由于它具有天然真皮结构，可以诱导移植后宿主的细胞成分(如成纤维细胞、内皮细胞等)循其支架结构生长，真皮基质还可支持成纤维细胞的浸润、新生血管形成，使成纤维细胞合成和分泌具有正常结构和功能的细胞外基质如胶原，使肉芽组织快速成熟及真皮深层再生，减少成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，并与其上移植的自体表皮成分融合，形成较为完整的皮肤结构，基本恢复了皮肤原有的功能，从而产生了良好的少疤或无疤的临床效果。无细胞真皮基质与自体表皮复合移植是目前治疗需要植皮的全层皮肤缺损中很有前途的方法。

然而，无细胞真皮基质应用过程中遇到的突出问题是：无细胞真皮基质移植后，在短时间(3～5天)内，如未能与创面基底建立良好的血液循环，则可引起严重的不良后果，表现为：(1)移植物抗感染能力差，易因发生感染导致移植失败；(2)未能为其上移植的自体表皮提供足够的营养，从而影响后者的存活。

目前市场上已经开发了一些脱细胞真皮的产品，如Integra，Dermagraft-TC，A1loDerm，皮耐克等，但从临床效果来看，仍不尽人意。其最大的缺陷之一是皮片存活率较低。国内作者报道，将厚约0.3-0.5mm的脱细胞真皮与自体刃厚皮片复合移植，存活率只有60.0％左右。[冯祥生，潘银根，谭家驹等.异种(猪)脱细胞真皮与自体表皮复合移植研究.中华整形外科杂志，2000，16(1)：40一42]

国外学者用脱细胞真皮修复先天缺损的牙龈粘膜及鼻中隔穿孔等，但由于脱细胞真皮血管化率低，在临床推广应用受到限制。因此有人推测，无细胞真皮基质的广泛应用仍为时过早。随着近年来对无细胞真皮的研究逐渐深人，如何促进ADM的血管化，逐步成为组织工程皮肤研究的关键，也是临床迫切需要解决的难题。

因此，本领域迫切需要提供新的、有效促进基质血管化的，可用于治疗全层皮肤缺损创面的移植物。

发明内容

本发明的目的就是提供一种新的、有效促进基质血管化的，可用于治疗全层皮肤缺损创面的移植物及其制法。

在本发明的第一方面，提供了一种移植物，它包括：

(a)真皮基质，所述的真皮基质中细胞数量小于5％，按真皮基质的体积计；

(b)按真皮基质的重量计，含量为0.5-30重量％的游离氨基酸，所述的游离氨基酸结合或吸附于所述的真皮基质；和

(c)按真皮基质的重量计，含量为0-30重量％的壳聚糖，

其中所述的游离氨基酸指未形成肽键的、具有游离的氨基和游离的羧基的氨基酸。

在另一类优选例中，所述的氨基酸选自下组：色氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、缬氨酸、赖氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、天冬氨酸、和精氨酸。

在另一类优选例中，所述氨基酸至少包括10、11、12、13、14、15、16、17、18种天然氨基酸。

在另一类优选例中，组分(b)的含量为2-20重量％，更佳地为4-20重量％，按真皮基质的重量计。

在另一类优选例中，组分(b)和组分(c)的干重重量比为1∶5至5∶1，更佳地为2∶1至1∶2。

在另一类优选例中，所述的真皮基质中细胞数量≤4，较佳地≤3％，更佳地≤2％，最佳地≤1％，按真皮基质的体积计。

在另一类优选例中，所述的真皮基质还含有基底膜复合物。

在另一类优选例中，所述的移植物还含有选自下组的一种或多种物质：

(d1)细胞因子，所述的细胞因子包括：成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子-α或其混合物；

(d2)用于防止伤口感染发炎的抗生素；

(d3)防止生长因子降解的保护剂(如肝素)。

更佳地，所述的细胞因子的含量为0.0001-0.1重量％，按真皮基质的重量计。

在另一类优选例中，所述的细胞因子的有效量是100-30000AU/立方厘米真皮基质。

在另一类优选例中，所述的真皮基质的厚度是0.1-5毫米，更佳地为0.2-2毫米。

在另一类优选例中，所述的真皮基质来自下列动物的皮肤：猪、牛、人、鼠。

在另一类优选例中，所述的移植物是用本发明第二方面中所述的方法制备。

在本发明的第二方面中，提供了一种制备移植物的方法，包括步骤：

(i)提供一真皮基质，所述的真皮基质中的细胞数量小于5％，按真皮基质的体积计；

(ii)将真皮基质与游离氨基酸和/或壳聚糖接触，从而使真皮基质含有按真皮基质的重量计，含量为0.5-30重量％的游离氨基酸，所述的游离氨基酸结合或吸附于所述的真皮基质；以及按真皮基质的重量计，含量为0-30重量％的壳聚糖。

在另一类优选例中，在步骤(b)中，用无针高压注射枪将含游离氨基酸的溶液、或者含有游离氨基酸和壳聚糖的溶液注入真皮基质中。

在另一类优选例中，在步骤(ii)中还包括步骤：将(b)将真皮基质与细胞因子接触，从而使真皮基质中含有浓度为100-30000AU/立方厘米真皮基质的所述细胞因子，其中所述的细胞因子包括：成纤维细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、转化生长因子-α或其混合物。

在另一类优选例中，用无针高压注射枪用所述细胞因子的溶液注入真皮基质中。

在另一类优选例中，所述的真皮基质中细胞数量小于1％，按真皮基质的体积计。

在本发明的第三方面，提供了一种试剂盒，它含有本发明第一方面中所述的移植物和使用说明书。

在本发明的第四方面，提供了本发明上述移植物的用途，它用于制备用于治疗皮肤表面创伤的皮肤移植物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图简述

图1显示了浅二度创面情况下，与不补充氨基酸的对照(A区)相比，在补充氨基酸时(B区)坏死组织去除早，创面愈合速度快。

图2显示了深二度创面情况下，与不补充氨基酸的对照(A区)相比，在补充氨基酸时(B区)创面愈合速度快。对照A区坏死组织多，炎症明显。

图3显示了在不含氨基酸成分的对照培养液培养时，对照组内皮细胞生长不良，数量不扩增。

图4显示了在含氨基酸成分的为M199培养液培养时，实验组细胞生长良好，细胞密集。

图5显示了在不添加氨基酸的对照组支架内，细胞数量少(移植5天)。

图6显示了在添加了氨基酸的实验组支架内，细胞血管数量多(移植5天)。

具体实施方式

针对上述本领域存在的问题，本发明人经过深入而广泛的研究，意外地发现，通过加入能游离态的氨基酸和任选的壳聚糖组分，可促使无细胞真皮基质的血管化，从而使得移植物在移植后较短时间内就与创面基底建立良好的血液循环，提高移植成功率，并改善其移植效果。本发明人在此基础上完成了本发明。

术语

术语“纯化的或分离的”指纯化的或分离的物质基本上不含有其他细胞、蛋白质或多肽，例如纯化的细胞因子或分离的细胞因子。

术语“异种移植”指将所需生物材料(如皮肤)从某一物种中取出并再施用于另一物种对象的方法。

术语“自体移植”指将所需生物材料(如皮肤)从某病人中取出并再施用于同一病人的方法。

术语“异体移植”指将所需生物材料(如皮肤)从某病人中取出并再施用于另一不同病人的方法。

术语“同基因移植”指在遗传上相同的人之间发生的细胞移植。

无细胞真皮基质

可用于本发明的无细胞真皮基质没有特别限制，可以是用来源人、猪、牛等哺乳动物的天然皮肤，通过已知方法制备的无细胞真皮基质。

就无细胞真皮基质的主要成分而言，为去除了正常皮肤中的表皮成分和真真皮中所有细胞成分，而保留了真皮中的胶原成分和其三维空间结构，同时较佳地还保留了基底膜复合物。无细胞真皮基质中的胶原为存在于基质中的I和III型胶原，存在于基底膜中的IV型胶原。另外，基质中还有弹力纤维、硫酸软骨素、纤维连接蛋白、氨基聚糖。

在本发明的真皮基质中，细胞数量小于5％，较佳地小于1％，更佳地小于0.5％，最佳地小于0.1％，按真皮基质的体积计。一种简便的检测方法是在光学显微镜高倍视野(×40)下观察时，细胞计数小于3只，较佳地小于2个，更佳地小于1只。

一种优选的真皮基质还含有基底膜复合物，其作用是加强真皮和表皮之间的连接，并改善皮片愈合后的质量。

无细胞真皮基质的厚度没有特别限制，通常约为0.1-5mm，较佳地约为0.2-2mm，更佳地约为0.30-0.50mm。

无细胞真皮基质的大小没有特别限制，可以根据创面不同而制作，也可以制作成例如100mm×100mm的特定规格，然后在使用时裁剪下所需大小的真皮基质。

氨基酸

如本文所用，术语“游离氨基酸”或“游离态氨基酸”指未形成肽键的、具有游离的氨基和游离的羧基的氨基酸。简言之，指未化合的氨基酸。

应理解，在本发明的移植物中，游离态氨基酸可以是处于液态或固态，当然通常游离态氨基酸结合或吸附于所述的真皮基质。

可用于本发明的氨基酸没有特别限制，可以是任何的天然氨基酸，代表性的氨基酸包括(但并不限于)：色氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、缬氨酸、赖氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、天冬氨酸、和精氨酸。

在优选的本发明的移植物中，所述游离氨基酸至少包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18种天然氨基酸。较佳地，本发明的移植物中含有精氨酸、谷氨酸和脯氨酸这三种必需氨基酸；更佳地含有亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、和甲硫氨酸这8种必需氨基酸。

一种优选的游离态氨基酸的原料是常规的、医用的复方氨基酸注射液。

在本发明的移植物中，游离态氨基酸的一般大于0.1重量％，通常为0.5-30重量％，较佳地为1-20重量％，更佳地为1.5-20重量％，按真皮基质的重量计。

壳聚糖

在本发明的移植物中，壳聚糖是一种任选的组分。然而，为了使得移植物携带更多的游离态氨基酸，宜同时使用壳聚糖。

壳聚糖是由甲壳类动物提取的氨基葡萄糖和乙酰氨基葡萄糖组成的多聚糖，具有来源广泛，成本低廉，其黏度高、黏结力大，流动性和溶解性好，且具有良好的生物黏附性、生物相容性、安全性，可以稳定地携带药物黏附于组织材料上，同时延长药物在患处的滞留时间。

另外，壳聚糖是一种线性长链高聚物分子，含有大量可以与其他细胞分子形成氢键的-OH和-NH₂基团，当环境pH小于其离子解离常数(6.5)时，-NH₂质子化形成-NH³⁺使分子带正电。上述分子特性使壳聚糖成为优良的生物黏附材料，既可以有效携带氨基酸成分，又可以促进细胞的黏附和迁移。

再者，无细胞真皮基质经脱细胞物质和戊二醛交联处理后，支架内的胶原的天然性质难以重现，影响了对正常细胞的黏附，是无细胞真皮基质难以血管化的重要原因之一。

本发明人的研究表明，当壳聚糖结合后，无细胞真皮支架表面获得改性，可以促进细胞向支架的黏附、迁移和浸润，同时释放氨基酸成分营养细胞，加速细胞增殖和血管化。因此壳聚糖是一种较为理想的促进游离态氨基酸吸附或粘附的载体材料。

在本发明中，壳聚糖的含量没有特别限制，按真皮基质的重量计，其含量通常为0-30重量％，较佳地为0.5-25重量％，更佳地为1-20重量％。

当本发明的移植物同时含有游离态氨基酸和壳聚糖时，两者的重量比没有特别限制。为了获得较佳的效果，游离态氨基酸和壳聚糖的干重重量比为通常为1∶10至10∶1；较佳地为1∶5至5∶1，更佳地为2∶1至1∶2。

其他添加剂

在本发明的活性无细胞真皮基质中，除了含有上述的游离态氨基酸和壳聚糖之外，还可以含有其他一些添加剂，例如促进血管生成的细胞因子、防止伤口感染发炎的抗生素、防止生长因子降解的保护剂(如肝素)。

一种优选的其他添加剂是促进血管生成的细胞因子。

如本文所用，术语“促进血管生成的因子或细胞因子”指对血管生成有促进或激活作用的物质，主要包括：成纤维细胞生长因子(fibroblast growthfactor，FGF)、血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血小板衍生生长因子(Platelet-derived growth factor，PDGF)、转化生长因子-α(transforming growth factor-α，TGF-α)等。优选的细胞因子是FGF(包括碱性成纤维细胞生长因子bFGF)和VEGF。

VEGF血管内皮细胞生长因子被认为是作用最强、特异性最高的促内皮细胞增殖、迁移的调控因于。在创面愈合过程中，VEGF促进创面血管化；迄今只发现血管内皮细胞对VEGF有高特异性的增殖反应，还未见其它细胞对VEGF反应的报道。因此，创面组织中VEGF的多少与血管形成密切相关。此外，VEGF参与调节血管内皮细胞(endothelial cell，EC)迁移、增殖和管样结构的形成。VEGF不足会导致血管腔闭合、血管退化。

碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是哺乳动物和人体内存在的一种非常微量的多肽类物质，能刺激中胚胎层和外胚胎层来源的细胞如成纤维细胞、血管内皮细胞等的分裂和增殖，生理功能非常广泛。bFGF对创伤修复过程的三个阶段，即局部炎症反应阶段、细胞增殖分化及肉芽组织形成阶段、组织重建阶段均有显著的促进作用。在细胞增殖和修复期，最关键的步骤之一是肉芽组织的形成，肉芽组织的本质是大量的毛细血管和丰富的成纤维细胞，bFGF正是成纤维细胞、血管内皮细胞及血管平滑肌细胞的高效促生长剂，能够强烈刺激新生毛细血管的形成，显著增加肉芽组织毛细血管数量和血液流量，改善创面微循环，为组织修复提供所必须的氧及丰富的营养物质。所以，创面bFGF的含量与创面愈合中新生血管的形成密切相关。

利用bFGF和VEGF等生长因子的这种生物作用，可以进一步提高无细胞真皮基质移植后的存活率，进而改善其移植效果。

可用于本发明的各细胞因子的来源没有特别限制，可以使用天然的、分离的、重组的或合成的细胞因子，而分离、重组表达和/或人工合成各种细胞因子的技术是本领域中已知的。此外，还可从市场上购得各细胞因子，例如bFGF可购自珠海东大集团东大生物工程公司。

其他药物载体

除了使用壳聚糖作为优选的氨基酸载体之外，在本发明的移植物中还可使用其他作为药物载体的黏附材料，只要这些材料对于伤口的愈合无副作用。代表性的其他药物载体包括(但并不限于)：胶原凝胶、明胶、西黄芪胶、黄原胶、植物凝集素、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、羟乙基纤维素、羟丙甲纤维素和羟丙基纤维素、卡波姆、或其组合。

制备方法

在获得了无细胞真皮基质后，将真皮基质与游离态的氨基酸和任选的壳聚糖接触，从而制得富含游离态氨基酸的无细胞真皮基质移植物。

在本发明中，制备方法没有特别限制，只要该方法能使游离态氨基酸均匀地分布在真皮基质之中和或之上即可。

一种方法是将无细胞真皮基质在含游离态氨基酸的溶液中放置(孵育)一段时间，然后进行干燥(例如冷冻干燥)。其中，在溶液中放置然后进行干燥的步骤可进行一次或多次。

如果需要使得无细胞真皮基质含有携带氨基酸的药物载体(如壳聚糖)，可以将无细胞真皮基质在含壳聚糖和氨基酸的混合溶液中浸润，或者依次在壳聚糖溶液和氨基酸溶液中浸润。

另一种方法是用无针高压注射枪(例如可购自MadaJet XL，USA的无针高压注射枪)将游离态的氨基酸注入无细胞真皮基质中。这种方法的优点是利用压力使游离态氨基酸均匀地渗透到真皮基质之中。

这两种方法都能促使无细胞真皮基质的血管化，从而提高无细胞真皮基质移植成功率从而改善其移植效果。

创面愈合过程中血管化的检测，可通过常规方法进行，例如，通过检测以下指标进行。

1)HE染色，利用光镜可直接观察组织中血管的大致形态和数量分布，方法相对简单，但不够准确。

2)CD31血小板内皮细胞粘附分子(Platelet endothelial cell adhesionmolecule)。CD31是一种130Kda整合粘膜蛋白，属于免疫球蛋白超基因家族，介导细胞与细胞粘附。CD31在内皮细胞中持续表达，因此可以作为血管化标志。

3)CD34，在内皮细胞粘附过程中，扮有重要角色，是血管形成的重要标志。实验研究显示，在创面新生生成的血管，其CD34表达普遍增加，抗CD34抗体能很好标记内皮细胞，并能区分新生血管和正常组织血管。

上述这些指标可应用免疫学和组织化学原理进行检测，并对创面组织切片中血管内皮细胞带有的抗原进行显色，利用光学显微镜对创面组织中的微血管计数，从而得出创面组织中的微血管密度，反映创面的血管化程度。

本发明的实验已表明，使用本发明的活性无细胞真皮基质后，能促使无细胞真皮基质移植后在短时间内就形成优良的血管化，从而建立良好的血液循环，提高移植成功率，从而改善其移植效果。

本发明的主要优点包括：

(a)材料价格低廉，制作方法相对简单，对机体细胞无毒无害。

(b)本发明移植物可显著促进无细胞真皮支架血管化。

(c)本发明移植物的制备方法适合产业化批量生产。

(d)使用壳聚糖作为药物载体时，有助于提高氨基酸的携带量并且控制氨基酸的释放。

(e)本发明壳聚糖作为药物载体时，还可添加如细胞因子，抗生素等成分达到组织修复目的。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

补充氨基酸成分有利于创伤组织的修复

将复合氨基酸与壳聚糖混合制成凝胶，分别应用于志愿者的烧伤浅II度和深II度创面，标记为B区。对照组使用磺胺嘧啶银，标记为A区。每日一次，隔日应用。

结果如图1和2所示。实验组创面(B区)炎症明显减轻，坏死组织去除早，愈合速度大大快于对照组(A区)。这表明局部氨基酸应用能极大促进创面愈合，同时减轻局部炎症反应。

实施例2

氨基酸成分有利于细胞的生长

选择常规的脐静脉内皮细胞进行培养，其中实验组为M199培养液培养(富含多种氨基酸成分)，而对照组为不含氨基酸成分的同等培养液。

结果如图3和4所示，对照组细胞生长不良，增殖率明显下降。

实施例1和2的结果提示，局部氨基酸的应用能促进内皮细胞增殖，促进组织生长。

实施例3

无细胞真皮基质的制备

在该实施例中，通过以下步骤制备无细胞真皮基质，以下步骤均要求无菌操作。

步骤一：清洁级SD大鼠，背部脱毛后24小时，切取背部全厚皮肤(大小约15×20平方厘米)；在取皮鼓上反取中厚皮；①去表皮处理：加入2.5单位/ml分散酶II(Dispase II，Roche公司)，4℃条件下作用24小时，在作用结束后以弯头皮镊揭除表皮，并吸去去表皮液。②脱细胞处理：加入0.5％十二烷基硫酸钠(SDS，简称去污剂)160ml，20～26℃作用24小时；吸除去污剂，用Hanks液冲洗两遍，最后，吸除Hanks液，即可得到无细胞真皮基质。然后将其置于含青霉素(100u/ml)、氯霉素(100μg/ml)和卡那霉素(100μg/ml)的Hanks液中，4℃保存备用。

合格的无细胞真皮基质符合以下要求：去除了表皮和真皮中所有细胞成分，包括完整的细胞和细胞碎屑(细胞碎屑≤1/10个高倍视野)，但保留了真皮的三维空间结构。

实施例4

制备富含游离态氨基酸的移植物

在本实施例中，采用具有生物黏附性能的壳聚糖作为支架材料与氨基酸的媒介。将壳聚糖与氨基酸成分有效混合后，通过无细胞真皮基质的反复浸提与晾干(或冻干)，然后将无细胞真皮基质冷冻干燥，从而制得富含游离态氨基酸的移植物。

材料：

复方氨基酸注射液(18AA)为复方制剂，是由18种氨基酸配制而成的灭菌水溶液，总氨基酸含量为8.5％。

各氨基酸浓度(毫克/1000毫升)：

L-丙氨酸1220

L-异亮氨酸420

L-精氨酸840

L-亮氨酸590

L-天门冬氨酸250

醋酸L-赖氨酸950

L-胱氨酸20

L-谷氨酸420

L-甘氨酸590

L-蛋氨酸420

L-组氨酸500

L-苯丙氨酸340

L-脯氨酸420

L-苏氨酸420

L-丝氨酸340

L-色氨酸140

L-酪氨酸20

L-缬氨酸550

方法如下：

将市售的18种氨基酸含量为8.5％的复方氨基酸溶液与壳聚糖进行混合，制得壳聚糖和氨基酸的混合液。所述混合液中，总氨基酸的浓度为8.5％，壳聚糖的浓度为3％。

将实施例1中制备的无细胞真皮，依照无细胞真皮质量与浸提介质体积之比0.2g/ml，浸入制备的壳聚糖和氨基酸的混合液中，经过三次浸提与晾干，进行冷冻干燥，制得富含游离态氨基酸的移植物。

经过测定，在制备的移植物中，每克无细胞真皮含复方氨基酸成分约0.1g(约为10％氨基酸含量)。

实施例5

活性无细胞真皮基质的动物试验

在该实施例中，利用动物实验进行测试。测试方法如下：选择一定数量的清洁级SD大鼠，背部脱毛后24小时，用手术刀在人鼠背部切取一定大小的全层皮肤，在鼓式取皮刀上反取刃厚皮，作为自体皮。创面随机分为三组：

组1创面作为实验创面，止血后，先移植在实施例4中制备的活性无细胞真皮基质，然后在其上移植自体皮，加压包扎；

组2创面作为对照创面，止血后，同样先后移植实施例3中制备的无细胞真皮基质和自体皮，加压包扎。

7天，14天和21天后，上述每组动物分别取材后处死。标本固定，石蜡切片后HE染色与免疫组织化学检测CD31和CD34，利用光学显微镜对上述切片创面组织中所标记的微血管计数，可以得出创面组织中的微血管密度。

根据创面组织中所标记的微血管计数值，比较添加与不加游离氨基酸所产生的创面不同血管化程度。结果如下：

(1)加入游离氨基酸后的活性无细胞真皮基质，能促使无细胞真皮基质移植后在短时间内与创面基底建立良好的血液循环，提高了移植成功率、改善移植效果。

(2)组1的效果优于组2的效果。

这表明，添加了氨基酸的实验组细胞迁入多和血管化早，而对照组细胞和血管数目少(图5和图6)。

实施例6

活性无细胞真皮基质的制备

基本上按实施例3的步骤制备活性无细胞真皮基质，不同点仅在于选用的皮肤是脱毛后的猪皮。

实施例7

活性无细胞真皮基质的制备

基本上按实施例3和4的步骤制备活性无细胞真皮基质，不同点仅在于，额外添加了浓度为2500AU的bFGF(每克无细胞真皮基质)。

实施例8

活性无细胞真皮基质的制备

基本上按实施例3和4的步骤制备活性无细胞真皮基质，不同点仅在于，分别将无细胞真皮基质依次浸在3％壳聚糖溶液和8.5％复合氨基酸溶液中，而不是浸在壳聚糖和氨基酸的混合溶液中。

经过测定，在制备的移植物中，每克无细胞真皮含复方氨基酸成分约0.07g(约为7％氨基酸含量)。

实施例9

市售的氨基酸含量为8.5％的复合氨基酸溶液，取2ml、4ml、6ml以无针高压注射枪(购自MadaJet XL，USA)分别注入重量为10g的无细胞真皮基质，冷冻干燥后，得到富含氨基酸的无细胞真皮基质。其中，获得的活性无细胞真皮基质中氨基酸浓度分别约为0.02g/克真皮基质，0.04g/克真皮基质和0.06g/克真皮基质。

或者将无细胞真皮基质直接使用氨基酸溶液浸提，晾干后无细胞真皮的氨基酸含量约为0.03g/克真皮基质。

实施例10

配制氨基酸含量为精氨酸含量2％(w/v)、谷氨酸含量2％(w/v)和脯氨酸1％(w/v)的三元氨基酸复合溶液。取5ml以无针高压注射枪(购自MadaJet XL，USA)注入重量为10g的无细胞真皮基质，冷冻干燥后。取5ml氨基酸溶液，再次以无针高压注射枪注入，冷冻干燥后，得到富含氨基酸的无细胞真皮基质。其中，获得的活性无细胞真皮基质中氨基酸浓度约为0.05g/克真皮基质。

实施例11

将氨基酸含量为8.5％且壳聚糖为3％的混合溶液，取5ml以无针高压注射枪(购自MadaJet XL，USA)分别注入重量为10g的无细胞真皮基质，冷冻干燥后，得到富含氨基酸的无细胞真皮基质。其中，获得的活性无细胞真皮基质中氨基酸浓度约为0.05g/克真皮基质，壳聚糖浓度为约0.03g/克真皮基质。

实施例12

将氨基酸含量为8.5％且壳聚糖为5％的混合溶液，取5ml以无针高压注射枪(购自MadaJet XL，USA)分别注入重量为10g的无细胞真皮基质，冷冻干燥后，得到富含氨基酸的无细胞真皮基质。其中，获得的活性无细胞真皮基质中氨基酸浓度约为0.05g/克真皮基质，壳聚糖浓度为约0.04g/克真皮基质。

实施例13

将氨基酸含量为3％且壳聚糖为5％的混合溶液，取5ml以无针高压注射枪(购自MadaJet XL，USA)分别注入重量为10g的无细胞真皮基质，冷冻干燥后，得到富含氨基酸的无细胞真皮基质。其中，获得的活性无细胞真皮基质中氨基酸浓度分别约为0.02g/克真皮基质，壳聚糖浓度为约0.08g/克真皮基质。

实施例14

将氨基酸含量为3％且壳聚糖为5％并含2400AU bFGF/ml(1ng/ml)的混合溶液，取5ml以无针高压注射枪(购自MadaJet XL，USA)分别注入重量为10g的无细胞真皮基质，冷冻干燥后，得到富含氨基酸的无细胞真皮基质。其中，获得的活性无细胞真皮基质中氨基酸浓度分别约为0.02g/克真皮基质，壳聚糖浓度为约0.08g/克真皮基质，bFGF的浓度分别约为15000AU/立方厘米。

实施例15

将氨基酸含量为3％且壳聚糖为5％并含24000AU bFGF/ml(10ng/ml)的混合溶液，取5ml以无针高压注射枪(购自MadaJet XL，USA)分别注入重量为10g的无细胞真皮基质，冷冻干燥后，得到富含氨基酸的无细胞真皮基质。其中，获得的活性无细胞真皮基质中氨基酸浓度分别约为0.02g/克真皮基质，壳聚糖浓度为约0.08g/克真皮基质，bFGF的浓度分别约为15000AU/立方厘米。

实施例16

活性无细胞真皮基质的动物试验

基本上按实施例5的方法，对实施例6-15中制备的活性无细胞真皮基质进行动物实验。

结果表明，这些富含氨基酸的活性无细胞真皮基质可在短时间内与创面基底建立良好的血液循环，提高移植成功率，并改善移植效果。

移植物	试验结果	备注
			实施例6	细胞迁入多和血管化早
实施例7	细胞迁入多和血管化早
			实施例8	细胞迁入多和血管化早
实施例9	细胞迁入较多和血管化较早	氨基酸含量越高，效果越好。移植至大鼠背部创面，亦能促进无细胞真皮血管化，与不添加氨基酸组比较有明显优势。但效果不及壳聚糖载体组
			实施例10	细胞迁入较多和血管化较早	仅含三种关键氨基酸的移植物也能够促进血管化，但效果稍逊于18种复合氨基酸的效果。
实施例11	细胞迁入多和血管化早
			实施例12	细胞迁入多和血管化早
实施例13	细胞迁入多和血管化早
			实施例14	细胞迁入多和血管化更早
实施例15	细胞迁入多和血管化更早

讨论

为了便于理解，本发明人提供以下讨论和机理。然而应理解，本发明的保护范围并不受这些讨论和机理的限制。

临床研究发现：浅度烧伤愈合后不遗留或仅遗留轻微的瘢痕，而深度烧伤愈合后则易形成明显的瘢痕增生。皮肤缺损后植皮越厚，瘢痕形成越少，植全厚皮则不遗留瘢痕。本发明人通过研究脱细胞真皮支架对成纤维细胞生物学功能影响，发现脱细胞真皮具有“模板样”作用，能够调控成纤维细胞生物学行为向着减少瘢痕的方向发展，减少TGF-β1和胶原等的产生，从而减少瘢痕的形成。由此提出了瘢痕形成的“真皮模板缺损学说”。

创伤修复是一个组织再生的过程，生物合成是组织细胞最主要的活动。其中氨基酸元素是细胞生物合成需求的基本原料。所有细胞都需要8种必须氨基酸作为原料参与组织修复，包括亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、甲硫氨酸。此外还需要谷氨酰胺，其中所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶合成的原料，也是合成ATP，ADP，AMP所需要的基本物质。

对创伤大鼠血浆游离氨基酸谱的检测发现，血浆游离氨基酸在创伤后三天不论必需氨基酸或非必需氨基酸，其总和均显著降低。原因主要有三个方面：一是创面渗出液中丢失大量游离氨基酸；二是因为创伤后氨基酸的分解代谢增加；三是局部组织修复使机体需求量大大增加。从个体氨基酸的改变看，大致可分为以下几类。第一类：创伤后含量下降。包括异亮、亮、缬、丙、谷、精、丝氨酸。第二类：创伤后含量一度升高，但以后均恢复，有苯丙氨酸和组氨酸。第三类：创伤后含量基本无改变，有蛋氨酸等。

发明人认为，有关氨基酸促进创面愈合的机制可能与以下因素有关。

首先，氨基酸对细胞内蛋白质合成和降解过程中有重要的调节功能。当把支链氨基酸(亮氨酸，异亮氨酸和缬氨酸)注入老鼠正常浓度的原生质中，可以加速蛋白质合成的磷酸化过程，促进蛋白质的合成，同时抑制蛋白质的分解，为细胞蛋白质和酶的合成提供充分的底物。

其次还与精氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸等等具有抗氧化功能和促进免疫细胞功能的作用有关，保护细胞免受氧自由基的攻击，促进中性粒细胞和巨噬细胞活化。

再者，氨基酸的组合添加物可以提高内皮细胞NOS和NO的表达，促进线粒体功能和内皮细胞的增殖和血管化，同时促进局部血流灌注。

一方面，壳聚糖可有效地携带氨基酸吸附于无细胞真皮基质。另一方面，当壳聚糖结合于无细胞真皮基质后，无细胞真皮支架表面获得改性，可以促进细胞向支架的黏附、迁移和浸润，同时释放氨基酸成分营养细胞，加速细胞增殖和血管化。因此壳聚糖是一种较为理想的促进游离态氨基酸吸附或粘附的载体材料，有助于提高氨基酸的携带量并且控制氨基酸的释放。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种移植物，其特征在于，它包括：

(a) 真皮基质，所述的真皮基质中细胞数量小于5%，按真皮基质的体积计；

(b) 按真皮基质的重量计，含量为0.5-30重量%的游离氨基酸，所述的游离氨基酸结合或吸附于所述的真皮基质；和

(c) 按真皮基质的重量计，含量为0-30重量%的壳聚糖，

2.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的氨基酸选自下组：色氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、缬氨酸、赖氨酸、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、天冬氨酸、和精氨酸。

3. 如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述氨基酸包括10、11、12、13、14、15、16、17或18种天然氨基酸。

4.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，组分(b)和组分(c)的干重重量比为1:5至5:1。

5.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的移植物还含有选自下组的一种或多种物质：

(d2)用于防止伤口感染发炎的抗生素；

(d3)防止生长因子降解的保护剂。

6.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的真皮基质的厚度是0.1-5毫米。

7. 如权利要求6所述的移植物，其特征在于，所述的真皮基质的厚度是0.2-2毫米。

8.如权利要求1所述的移植物，其特征在于，所述的真皮基质来自下列动物的皮肤：猪、牛、人、鼠。

9.一种制备权利要求1所述的移植物的方法，其特征在于，包括步骤：

(i) 提供一真皮基质，所述的真皮基质中的细胞数量小于5%，按真皮基质的体积计；

(ii) 将真皮基质与游离氨基酸和/或壳聚糖接触，从而使真皮基质含有按真皮基质的重量计，含量为0.5-30重量%的游离氨基酸，所述的游离氨基酸结合或吸附于所述的真皮基质；以及按真皮基质的重量计，含量为0-30重量%的壳聚糖。

10.一种试剂盒，其特征在于，它含有权利要求1所述的移植物和使用说明书。

11. 一种权利要求1所述的移植物的用途，其特征在于，用于制备用于治疗皮肤表面创伤的皮肤移植物。