CN113425891B

CN113425891B - 负载光合细菌的水凝胶及其制备方法和应用

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Publication number: CN113425891B
Application number: CN202110774797.0A
Authority: CN
Inventors: 李振华; 刘会芳; 赵尔曼; 张金超
Original assignee: Hebei University
Current assignee: Hebei University
Priority date: 2021-07-08
Filing date: 2021-07-08
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2041-07-08
Also published as: CN113425891A

Abstract

本发明提供了一种负载光合细菌的水凝胶及其制备方法和应用。所述水凝胶是通过在脱细胞基质中负载光合细菌形成的载菌水凝胶。所述脱细胞基质为脱细胞猪真皮基质，所述光合细菌为紫色非硫光合细菌。本发明提供了上述水凝胶在抗菌和促进伤口愈合的医用敷料中的应用。本发明的载菌水凝胶可以高效杀菌，具有优异的抗菌性能，且吸水率高，可以吸收伤口渗出的组织液。不易发生细胞粘附、组织粘连，避免了换药引起的皮肤伤口二次感染与机械损伤，有利于伤口的愈合。可用于治疗多药耐药细菌感染，实现皮肤切口闭合，改善愈合过程。

Description

负载光合细菌的水凝胶及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医用材料领域，具体地说是一种负载光合细菌的水凝胶及其制备方法和应用。

背景技术

随着耐药菌株的不断出现，传统的抗生素己经越来越不能满足临床上伤口感染治疗的需求。从发现至今，微生物尤其是金黄色葡萄球菌MRSA已在全球肆虐，一旦皮肤伤口感染MRSA，则会出现严重的炎症反应，损伤组织，伤口迁延不易愈合，甚至会导致死亡，严重威胁着人类的健康。临床上的常规治疗手段多是采用抗生素，然而这种全身用药的方式，具有造成二重感染及诱导耐药性产生的副作用。另外，现有的各种金属离子，纳米粒子等抗菌剂，多为外源性物质，存在生物相容性差，毒性大的缺点，不能发挥良好的治疗效果。

应用于细菌感染的传统敷料的作用方式主要是覆盖于伤口表面并吸收渗出液，为伤口提供有限的保护作用。传统敷料包括天然纱布、合成纤维、岛状敷料等，这些敷料比较干燥，通常被用作初级或次级敷料。虽然能够保护创面，有一定吸收性和减少细菌入侵的作用。但是也存在一些缺点：如吸收量少，需频繁换药；浸湿后密闭性差，屏障作用弱，细菌入侵的可能性较高；创面的肉芽组织容易生长进入纱布的网眼中，换药时会损伤新生组织而引起疼痛；对创面愈合无明显促进作用，易干燥，容易与创面粘连，对于破损创面更换时不仅引起疼痛还可能造成二次创伤，引起出血。因而开发一种能够高效杀菌且能够促进伤口愈合的全新敷料是有重要意义的。

发明内容

本发明的目的为提供一种负载光合细菌的水凝胶及其制备方法和应用，以解决传统敷料材料屏障作用较差、无杀菌和促进伤口愈合作用的问题。

本发明的目的是这样实现的：一种负载光合细菌的水凝胶，所述水凝胶是通过在脱细胞基质中负载光合细菌形成的载菌水凝胶。

所述脱细胞基质为脱细胞猪真皮基质，所述光合细菌为紫色非硫光合细菌。

上述的水凝胶的制备方法，包括以下步骤：

（a）制备脱细胞真皮基质：取动物全皮组织，剥落去除皮下脂肪、结缔组织和表皮，将真皮切片，然后用0.25%胰酶和1% Triton X-100对真皮切片进行脱细胞处理；将所得的脱细胞真皮基质剪成小块，置于胃蛋白酶溶液中进行酶解，将酶解后的基质经过滤、清洗、冻干、粉碎后即得脱细胞真皮基质粉末；

（b）光合细菌的培养：将光合细菌接种于灭菌待用的细菌培养基中，用灭菌液体石蜡油对培养基进行液封，然后置于温度为 28-32℃的细菌培养箱中，光照培养5~7天；

（c）EDC/NHS交联液的配制：将EDC/NHS充分溶解于DPBS缓冲液中，配制成EDC/NHS浓度为50-1000mmoL/L的交联液，其中，EDC与NHS的摩尔比为3-5:1；

（d）水凝胶的制备：将脱细胞真皮基质粉末加入到三次水中，使其形成浓度为15-25mg/mL的脱细胞基质溶液，然后取等体积的光合细菌培养液，将培养液离心取沉淀，将所得沉淀与脱细胞基质溶液混合均匀，之后加入所述的交联液，充分混合，其中交联液与脱细胞基质溶液的体积比为1:2.5-3.5；将混合后的溶液在-75~-85℃条件下冷冻10-14h，然后在室温下待冰晶溶解，再经漂洗后即得所述水凝胶。

步骤（a）中，脱细胞处理是在室温下，于300转/min的涡旋振捣器上进行孵育，具体条件为：0.25%胰酶孵育6h，1次；去离子水，15min，3次；70%乙醇，10-12h，1次；3%过氧化氢，15min，1 次；去离子水，15min，2次；1% TritonX-100，溶剂为0.26% EDTA/0.69% Tris溶液，6h，1次，然后过夜；去离子水，15min，3次；0.1%过乙酸/4%乙醇，2h，1次；PBS，15min，2次；最后去离子水，15min，2次。

步骤（a）中，胃蛋白酶处理的条件为：用2-4%的胃蛋白酶溶液，室温搅拌酶解处理20-28h。

步骤（b）中，细菌培养基的配制：酵母膏3.0 g，蛋白胨3.0 g，无水 CaCl₂ 0.227g，MgSO₄ 0.244 g，加入 1000 mL 蒸馏水，调pH = 6.8~7.2，灭菌待用。

步骤（d）中，漂洗过程为：将水凝胶置于三次水中，4 ℃条件下，恒温振荡器漂洗 2h，每 30 min 换液一次。

上述的水凝胶在抗菌和促进伤口愈合的医用敷料中的应用。

所述抗菌为抗多重耐药细菌。

本发明通过使用与人皮肤组织具有高度相似性的猪皮为原材料，在其内部负载无毒无害且具有良好光热效果的光合细菌，制备成载菌水凝胶（PSB Gel），该水凝胶具有高度生物相容性，无任何毒性作用。在808 nm NIR的照射下，光合细菌将光能转化为热能，杀灭革兰氏阳性及阴性细菌，ECM 水凝胶则通过调控细胞增殖、迁移等生命活动来促进皮肤组织生长，达到伤口愈合的效果。同时PSB Gel 在制备过程中经过高速离心、低温处理等多种过程，部分PSB细胞膜破裂，各种胡萝卜素等小分子物质释放，具有清除自由基的作用，可以改善伤口愈合过程。该PSB Gel可以高效杀菌，具有优异的抗菌性能，且吸水率高，可以吸收伤口渗出的组织液。不易细胞粘附、组织粘连，避免了换药引起的皮肤伤口二次感染与机械损伤，有利于伤口的愈合。可用于治疗多药耐药细菌感染，实现皮肤切口闭合，改善愈合过程。

本发明提供的PSB Gel与现有技术相比，具有以下优点：

1、本发明创新性的提出了一种载菌水凝胶，所负载的光合细菌无毒无害且富含大量小分子营养物质，具有优异的光热性能，相对于传统的光热剂，具有良好的生物相容性，培养方便，可持续生产利用。

2、PSB Gel可以高效杀菌，具有优异的抗菌性能，并且其吸水率高，可以吸收伤口渗出的组织液。不易细胞粘附、组织粘连，避免了普通敷料换药引起的皮肤伤口二次感染与机械损伤，同时猪皮材料与人皮肤组织具有高度相似性，促进细胞增殖和迁移，有利于伤口的愈合。

3、该水凝胶在治疗过程中，内部的光合细菌细胞膜被破坏，各种胡萝卜素等小分子物质释放，具有清除自由基的作用，可以进一步改善伤口愈合过程。

附图说明

图1是本发明所制备的水凝胶浓度筛选图示意图。

图2是本发明所制备的水凝胶示意图。

图3是空白水凝胶及载菌水凝胶紫外图。

图4是载菌水凝胶SEM图。

图5是空白水凝胶及载菌水凝胶溶胀率图。

图6是空白水凝胶及载菌水凝胶力学性能和流变性能图。

图7是载菌水凝胶光热性质图。

图8是光合细菌及载菌水凝胶的抗氧化性质。

图9是载菌水凝胶的体外抑菌作用。

图10是载菌水凝胶治疗MRSA感染小鼠后的组织再培养结果图。

图11是治疗后细菌感染组织的病理分析。

图12是载菌水凝胶治疗小鼠伤口愈合图片。

图13是治疗后小鼠体重变化。

图14是治疗后伤口组织的病理分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。本发明实施例中未提到的试验条件和操作均按本领域常规方法或制造商建议的条件进行。本发明选用的光合细菌为市购的Rhodobacter johrii。

实施例1：

本发明制备了负载光合细菌的生物水凝胶敷料，包括如下步骤：

（1）脱细胞猪真皮基质粉末的制备

a、制备脱细胞真皮基质

从市场取体重约120kg猪的背外侧全层皮，将样本在蒸馏水中浸泡2h。所有样本均剥落去除皮下脂肪、结缔组织和表皮，然后将真皮切片进行脱细胞处理。脱细胞方案具体步骤：用0.25%胰酶/1% Triton X-100脱细胞方案处理真皮切片，在室温下，300转/min的涡旋振捣器上孵育，条件为：0.25%胰酶孵育6h，1次；去离子水，15min，3次；70%乙醇，11h，1次；3%过氧化氢15min，1 次；去离子水，15min，2次；1% TritonX-100在0.26% EDTA/0.69% Tris中，6h，1次，然后过夜，1次；去离子水，15min，3次；0.1%过乙酸/4%乙醇，2h，1次；PBS，15min，2次；最后去离子水，15min，2次。

b、胃蛋白酶酶解

将所得到的脱细胞真皮基质，剪成1×1cm的小块，将其全部置于3%的胃蛋白酶溶液中进行酶解，室温下，300转/min搅拌24h。

c、清洗

将酶解后的脱细胞真皮基质过滤取沉淀，用三次水清洗3次。

d、冻干

清洗后的沉淀置于冻干机冷冻干燥24h。

e、粉碎

将冻干后的ECM海绵用粉碎机粉碎约半分钟，得到ECM粉末。50mL离心管密封，4℃保存待用。

（2）光合细菌的培养

培养基的配制：酵母膏3.0 g，蛋白胨3.0 g，无水 CaCl₂ 0.227 g，MgSO₄ 0.244 g，加入 1000 mL的蒸馏水，调pH 至7.0，灭菌待用。

首先用锥形瓶配置好 200 mL 的细菌培养基，灭菌待用。细菌接种在超净台中进行，取适量的光合细菌接种于灭菌待用的 200 mL 细菌培养基中，并加入适量的灭菌液体石蜡油对培养基进行液封，标明接种日期，然后置于温度为 30℃的细菌培养箱中，白炽灯光照培养6天。

（3）负载光合细菌水凝胶的制备

a、交联液配制

交联液为将EDC/NHS（摩尔比EDC/NHS=4:1），充分溶解于DPBS缓冲液中，EDC/NHS浓度为400mmol/L。

b、载菌水凝胶制备

将获得的脱细胞真皮基质粉末加入三次水中，使其形成浓度为20mg/mL的溶液，随后取体积1：1的光合细菌菌液，将菌液离心得沉淀，加入同体积浓度为20mg/mL脱细胞真皮粉末溶液，混匀，再加入1/3溶液体积的交联液，充分混合；将混合后的溶液在-80℃条件下冷冻12h，室温下待冰晶溶解即得到负载光合细菌水凝胶。将水凝胶转移至玻璃大烧杯中，加入三次水，4℃下，100 转/分恒温振荡器漂洗2h，每 30min 换液一次，以去除水溶性交联剂。将最终所得凝胶置于4℃冰箱保存待用。

实施例2

对水凝胶的性能进行表征，具体如下：

（1）将实施例1步骤（1）制备的脱细胞基质粉末加入到三次水中，得到不同浓度的未载菌水凝胶（浓度见图1所示），将凝胶置于-80℃条件下进行冷冻，取出后室温放置（a为倒置，b为斜置）一段时间，并观察凝胶形态，结果如图1所示，水凝胶的浓度过大过小都会对凝胶形态产生影响。最终只有15mg/ml与20mg/ml浓度的水凝胶具有较好的形态，选择出最佳浓度为后续的实验材料。对20mg/ml浓度水凝胶进行拍照，结果如图2所示，20mg/ml具有更优异的形态，从而定为后续的实验浓度。

（2）通过紫外分光光度计对未载菌水凝胶（Gel）和载菌水凝胶（PSB Gel）进行紫外测定，结果如图3所示。负载光合细菌的水凝胶在808nm具有紫外吸收。

（3）冷场发射扫描电子显微镜（SEM）：将未载菌水凝胶（Gel）和载菌水凝胶（PSBGel）样品浸入液氮10 min，冷冻干燥24h，然后喷金到冻干样品的表面，观察水凝胶的微观结构。结果如图4所示，SEM表征结果显示，Gel（A）具有三维网状结构，而PSB Gel(B)则具有更加紧密的三维结构。同时在PSB Gel内部看到了光合细菌，说明成功合成了所需材料。

（4）溶胀率：将PSB Gel置于PBS中，室温下100rpm/min在振荡器上振动。当达到预设时间时，使用滤纸除去表面水分，称重湿水凝胶。溶胀比公式：溶胀比=（W_s-W_d）/ W_d，其中W_d代表水凝胶初始干重，W_s是溶胀平衡后的湿重。

如图5所示。在达到溶胀平衡状态后，水凝胶均具有较高的保水率，是其干重的四倍。此外，各组水凝胶的保水率相似，说明所负载的PSB浓度并不会影响水凝胶的溶胀性能，PSB Gel具有良好的溶胀性主要是其内部的网状结构可以吸收水分。

（5）流变性质：

将水凝胶放在流变仪的圆形检测托盘中心，设置相应变量，最后可通过水凝胶的储能模量（G′）和损耗模量（G′′）进行对水凝胶进行评估。如图6所示，a是在37℃下用1%恒定应变和频率进行从1~100rad/s变化的振荡频率试验，b是以1%恒应变和10 rad/s恒频率进行25~70℃的温度扫描实验。

由图6可知，1~120rad/s的频率下（a），各组水凝胶（制备时菌浓度不同）G′＞ G″。这是典型的水凝胶所具有的行为。表面各组水凝胶均具有动态的水凝胶网络结构。在20~70℃条件下进行进一步的测试（b），在整个温度范围内，各组水凝胶依然是G′＞ G″，一直保持水凝胶状态，随着温度的升高，G′与G″值并没有呈下降趋势，说明所合成的水凝胶具有良好的稳定性和刚性。

（6）PSB Gel光热性质：

a：取负载不同浓度光合细菌(0，10⁶，10⁷，10⁸，10⁹CFU/mL)）的水凝胶，用808nmNIR辐射（1W/cm²）8min。用热成像仪记录温度。

b：取4份PSB Gel（10⁸CFU/ml），分别用不同功率808nmNIR辐射（0.5，1，1.5，2W/cm²）8min。用热成像仪记录温度。结果如图7所示。在近红外光的照射下，所负载的细菌浓度和功率作为变量对PSB Gel进行光热性质实验，（a）可以看出，当808nm近红外激光器的功率一定时，PSB Gel随着所负载PSB浓度的增加，温度逐渐升高。当使用同一浓度的PSB时，光热效果随着808nm近红外激光器的功率增加而增加（b）。由此可以证明，在808nm近红外光的照射下，PSB Gel可以将吸收的光转化为热，而单独的Gel却没有相应的温度变化。

（7）抗氧化活性：

将150 uL不同浓度细菌液或者水凝胶研磨液加入到150 uLDPPH(0.1 mmol/L)自由基甲醇溶液中。剧烈振摇，在室温下避光孵育30 min，使用酶标仪在517 nm波长处测定吸光度，平行3次。使用公式[1-(A-A2)/Ao]×100%计算DPPH自由基的清除率，式中Ao是不加待测液的吸光度值，A是待测液吸光度值，Az是不加自由基的吸光度值。抗氧化活性表示为EC₅₀(ug/mL)，即在517 nm波长处引起吸光度降低50%所需的样品剂量，较低的EC₅₀值对应较强的抗氧化活性。结果如图8所示，抗氧化伤口敷料可以通过调节活性氧的过量产生来改善伤口愈合过程。以提供具有优异抗氧化活性的水凝胶。PSB Gel与灭活后的PSB具有几乎相同的抗氧化效率，然而经过NIR照射后的水凝胶，具有相对更高的清除自由基的效率，经过NIR的照射，加速了PSB细胞膜的破裂，产生更多类胡萝卜素等物质来发挥抗氧化的作用。

（8）抗菌效果：

用耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和大肠杆菌来评估水凝胶的抗菌效果，将灭菌水凝胶置于48孔板中，取细菌液（10⁶ CFU / mL）用PBS清洗3遍，取500μL细菌也添加到水凝胶表面。用808nmNIR辐射(1.5W / cm2)不同时间，时间间隔分别为0、1、3、5和10min。没有水凝胶的组同样加入200μL细菌，用808nmNIR辐射(1.5W / cm2)不同时间，作为对照组。将1 mL无菌DPBS引入每个孔中以重新悬浮细菌幸存者。在37℃下培养24h后，计算琼脂平板上的菌落形成单位。每组重复测试五次，通过公式：Log Reduction=Log cell count of control-Log survivor count on hydrogel来计算抗菌效率。结果如图9所示，PBS为对照，808nm红外激发光对PSB Gel照射不同时间。在近红外光照射1min以后，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细菌对数减少80%以上。进一步将辐射时间延长至5min和10min，PSB Gel对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均显示出100%的杀灭率。但是PBS对照组则没有细菌减少，说明单纯的近红外光照射是没有抗菌能力的。

（9）活体抗菌效果：

将BALB / c (5weeks, 20±2g, female)小鼠分成五组(n=6)，使小鼠皮肤感染，将水凝胶敷于小鼠皮肤的感染部位，每组处理三天，然后，在无菌条件下，每组取一只小鼠感染部位的皮肤，用1mL无菌 PBS 冲洗，将冲洗后的PBS 稀释 1000 倍后均匀涂布在固体LB 培养基表面，37 ℃下培养 24 h，比较每组形成的菌落数量。如图10所示，各组在处理三天后，取感染组织处的细菌进行再培养。观察相应的菌落生长情况， PSB Gel在近红外光的照射下，可以有效地将光能转化为热能，从而达到100%的杀菌率。

取感染部位的皮肤，将其置于在10%甲醛溶液中固定，脱水，制作成5µm厚的石蜡切片，随后进行HE染色。结果如图11所示，采用HE观察感染创面周围组织的病理变化。第3天，各组仍然处于一种感染大量炎症细胞，经NIR照射的PSB Gel组与炎症细胞的浸润程度基本较低，组织正在接近恢复，结果表明在NIR的照射下，PSB Gel产生的热，将MRSA杀死，从而降低了MRSA感染部位的炎症作用。

（10）伤口愈合效果：

将BALB / c (5weeks, 20±2g, female)小鼠分成四组(n=6)：对照组，PBS组，Gel组和PSB Gel组，在小鼠背部产生直径约1cm的圆形全层皮肤伤口。将水凝胶及PSB覆盖在伤口上，而生理盐水处理的伤口用作阴性对照。在预设时间间隔对伤口拍照。结果如图12所示。

我们建立了全层皮肤伤口模型来评估水凝胶伤口修复功效。通过拍照监测伤口愈合的过程。第4天，各组创面面积均缩小，Gel与PSB Gel组伤口闭合率均在50%左右，显著高于对照组。在第8天和第12天Gel和PSB Gel组都可以显著的加速伤口的闭合，表皮组织变得光滑,与对照组相比出现了显着性的差异。图中所显示的伤口面积大小和伤口闭合时间变化，都进一步证明Gel和PSB Gel具有最佳的伤口愈合功效。

在上述试验过程中，在预设时间间隔称量小鼠体重。结果如图13所示。我们记录了小鼠在治疗过程中的体重变化，Gel与PSB Gel组小鼠体重没有任何下降趋势，反而在治疗的过程中体重增长了，说明本申请的材料对小鼠的身体状况并不会产生不良反应及影响。

为了评估伤口区域的表皮再生和炎症，将收集的皮肤标本在10%甲醛溶液中固定，脱水，制作成5µm厚的石蜡切片，随后进行HE染色。结果如图14所示，在第4天、第8天和第12天对创面组织进行组织学分析，以评估愈合过程。伤口周围组织的H&E染色可以看出炎症细胞的浸润情况。第4天，各组均形成一层上皮，但对照组和PSB，Gel组创面周围炎症细胞较多。而PSB Gel组相对来说炎症细胞较少，说明PSB Gel可以减轻创面周围炎症。第8天，经PSB Gel组治疗后，皮肤出现肉芽组织，毛囊和上皮组织。而其他组仍然有炎症细胞。表明其创面愈合能力在四组中是最佳的。第12天，各组仍表现出轻度急性炎症反应，而Gel与PSBGel出现大量毛囊和血管、完整的表皮。

光合细菌（PSB），作为世界上最古老的细菌，无毒无害。光合细菌内富含类胡萝卜素和B族维生素及活性物质，具有抗氧化、调脂等多种生理活性。本发明的光合细菌在808nm近红外光(NIR)的照射下，可以将光能转化为热能，具有优异的光热性质，即使在高温条件下，灭活的光合细菌也同样具有良好的光热性质。相比较市面上的光热剂，其不存在细胞毒性大、不可降解性、价格昂贵、制作工艺复杂等问题，同时光合细菌可以大量培养增殖，以供持续使用。细胞外基质（ECM）水凝胶属于天然的生物凝胶，天然ECM支架不仅保留了组织的微环境，而且表现出优异的生物学活性，为细胞生长提供了必要的生存场所，并调控细胞的增殖、分化、迁移等生命活动。

将PSB负载到水凝胶内部制备成载菌水凝胶，应用在伤口处，水凝胶中的光合细菌在近红外光的照射下，能够将光能转化为热能，通过产生的热来达到杀菌的目的，同时ECM水凝胶支架可以通过调控细胞增殖、迁移来促进皮肤组织生长，达到伤口愈合的效果。

Claims

1.一种负载光合细菌的水凝胶，其特征是，所述水凝胶通过以下方法制备得到：

（b）光合细菌的培养：将光合细菌接种于灭菌待用的细菌培养基中，用灭菌液体石蜡油对培养基进行液封，然后置于温度为 28-32℃的细菌培养箱中，光照培养5~7天；所述光合细菌为Rhodobacter johrii；

2.一种负载光合细菌的水凝胶的制备方法，其特征是，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，步骤（a）中，脱细胞处理是在室温下，于300转/min的涡旋振捣器上进行孵育，具体条件为：0.25%胰酶孵育6h，1次；去离子水，15min，3次；70%乙醇，10-12h，1次；3%过氧化氢，15min，1 次；去离子水，15min，2次；1%TritonX-100，溶剂为0.26% EDTA/0.69% Tris溶液，6h，1次，然后过夜；去离子水，15min，3次；0.1%过乙酸/4%乙醇，2h，1次；PBS，15min，2次；最后去离子水，15min，2次。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，步骤（a）中，胃蛋白酶处理的条件为：用2-4%的胃蛋白酶溶液，室温搅拌酶解处理20-28h。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，步骤（b）中，细菌培养基的配制：酵母膏3.0 g，蛋白胨3.0 g，无水 CaCl₂ 0.227 g，MgSO₄ 0.244 g，加入 1000 mL 蒸馏水，调pH =6.8~7.2，灭菌待用。

6. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征是，步骤（d）中，漂洗过程为：将水凝胶置于三次水中，4℃条件下，恒温振荡器漂洗 2h，每 30min 换液一次。

7.权利要求1所述的水凝胶在制备抗菌和促进伤口愈合的医用敷料中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征是，所述抗菌为抗多重耐药细菌。