CN115245593A - 一种真皮去细胞细胞外基质水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明的真皮去细胞细胞外基质水凝胶具有良好的凝胶化时间以及良好的形状适应性，适合于动态创面以及形状不规则的创面。与现有商品敷料相比，本发明的水凝胶制得的水凝胶敷料极大地缩短了创面愈合时间，加速了皮肤结构和功能的重建；本发明的水凝胶敷料通过调节细胞增殖、迁移和免疫应答对组织再生发挥多重作用，从而促进创面的全层修复；本发明的水凝胶敷料通过降低促炎细胞因子的表达，上调血管内皮生长因子(VEGF)的表达，促进血管生成，促进胶原沉积，显著促进烧伤创面愈合。
Description
技术领域
本发明涉及抗菌水凝胶技术领域，尤其涉及一种真皮去细胞细胞外基质水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
目前创面的治疗方法主要分为皮瓣手术治疗和伤口敷料。现代敷料的理念是创造一个最佳的环境，让上皮细胞不受阻碍地移动，以治疗伤口。传统敷料包括棉絮、天然或合成绷带和纱布。
现代敷料的基本特征是在伤口周围保留或创造一个潮湿的环境，以促进伤口愈合，一般以凝胶、薄膜和泡沫片的形式出现。目前现代敷料的例子包括：水凝胶敷料、银纳米粒子的纳米复合水凝胶等；水胶体敷料目前是广泛应用于牙科领域的弹性材料，由于它们在切除时不会引起疼痛，因此在治疗单纯压迫治疗无效的伤口时具有优势。
明胶水凝胶是一类极亲水的三维网络结构凝胶；天然水凝胶因具备与细胞外基质(ECM)结构相似、物理机械性能可调、保护伤口不受微生物入侵以及可生物降解性等优势而成为促进伤口愈合的理想材料；银离子敷料，由于其在较长时间内释放的银纳米粒子和/或离子具有很强的抗菌活性，常应用于各种生物医学中，例如抗菌伤口敷料、涂层和软组织植入物。
然而，皮瓣的重建和再植往往需要较长时间的固定以及恢复，且不适用于大范围皮肤缺损。传统干性伤口敷料不能提供一个潮湿的伤口环境，且存在成本效益较低，愈合率低，伤口感染率高的问题。水胶体敷料在其完好状态下，水蒸气是不渗透的，对于需要一定量氧气才能快速愈合的感染伤口来说是不利的。水凝胶敷料具有较差的机械性能和对水的敏感性。银离子敷料中的银离子会在生物体中积累，可能对生物体具有潜在的毒害作用。
因此，亟需一种物理机械性能可调、成本低廉、来源广泛、无免疫原性、具有可生物降解性、具有光敏性、可定制任意伤口形状，固化时间短的真皮去细胞细胞外基质水凝胶。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种真皮去细胞细胞外基质水凝胶及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
本发明提供一种真皮去细胞细胞外基质水凝胶的制备方法，包括以下步骤:
S1、制备真皮去细胞支架：通过机械分层去除猪全厚皮肤的皮下脂肪、结缔组织以及表皮，将分离得到的真皮层依次置于不同搅拌溶液中持续搅拌，冻干后即得真皮去细胞支架；
S2、制备真皮去细胞细胞外基质：将步骤S1所得到的真皮去细胞支架剪成极小块或研磨成粉末，并配制成真皮去细胞支架溶液；35～40℃持续搅拌48～96小时后，过滤去除大颗粒，并加入PBS溶液终止消化；
再加入NaOH溶液调节上述溶液的pH至8.0～9.0，并加入甲基丙烯酸；35～40℃持续搅拌24～72小时后，加入PBS溶液终止酰化反应；
再加入NaOH溶液调节上述溶液的pH至7.35～7.45，并透析48～96小时；35～40℃持续搅拌48～96小时后，于-85～-75℃冷冻保存0.5～1.5小时；冻干后即得真皮去细胞细胞外基质；
S3、制备真皮去细胞细胞外基质水凝胶：取步骤S2所得到的真皮去细胞细胞外基质，并配制成真皮去细胞细胞外基质溶液，加入光引发剂后，紫外照射至上述溶液固化成胶状，即得真皮去细胞细胞外基质水凝胶。
优选地，步骤S1中，所述持续搅拌包括：依次置于trypsin溶液中持续搅拌5～7小时；置于去离子水中持续搅拌10～20分钟，重复1～3次；置于乙醇溶液中持续搅拌8～12小时；置于过氧化氢溶液中持续搅拌10～20分钟；置于去离子水中持续搅拌10～20分钟，重复1～3次；置于Triton X-100/EDTA/Tris溶液中持续搅拌5～7小时；置于更换后的Triton X-100/EDTA/Tris溶液中持续搅拌15～20小时；置于去离子水中持续搅拌10～20分钟，重复1～3次；置于过氧乙酸/乙醇溶液中持续搅拌1～3小时；置于PBS溶液中持续搅拌10～20分钟，重复1～3次；置于去离子水中持续搅拌10～20分钟，重复1～3次。
更优选地，步骤S1中，所述持续搅拌的搅拌速度均为200～400rpm。
优选地，步骤S2中，所述真皮去细胞支架溶液的浓度为8～12mg/mL，其中，盐酸的浓度为0.005～0.015mol/L，胃蛋白酶的浓度为0.5～2mg/mL；所述NaOH溶液的浓度为8～12mol/L；所述甲基丙烯酸的滴加比例为每克真皮去细胞支架滴加0.5～1.5mL甲基丙烯酸，所述甲基丙烯酸的滴加速度为0.3～0.8mL/min。
优选地，步骤S2中，终止消化时所加入的PBS溶液为10×PBS溶液，加入的体积为真皮去细胞支架溶液体积的1/10～1/8；终止酰化反应时加入的PBS溶液为1×PBS溶液，加入的体积为滴加甲基丙烯酸后的真皮去细胞支架溶液体积的4～6倍。
优选地，步骤S3中，所述光引发剂为光引发剂I2959，浓度为0.5～1.5mg/mL；所述真皮去细胞细胞外基质溶液的浓度为40～60mg/mL。
优选地，步骤S3中，所述紫外照射中紫外光的波长为365～395nm。
本发明提供一种由上述制备方法制得的真皮去细胞细胞外基质水凝胶。
本发明提供一种上述真皮去细胞细胞外基质水凝胶在制备光敏性生物水凝胶敷料中的应用。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明的真皮去细胞细胞外基质水凝胶具有良好的凝胶化时间以及良好的形状适应性，适合于动态创面以及形状不规则的创面。与现有商品敷料相比，本发明的水凝胶制得的水凝胶敷料极大地缩短了创面愈合时间，加速了皮肤结构和功能的重建；
本发明的水凝胶敷料通过调节细胞增殖、迁移和免疫应答对组织再生发挥多重作用，从而促进创面的全层修复；本发明的水凝胶敷料通过降低促炎细胞因子的表达，上调血管内皮生长因子(VEGF)的表达，促进血管生成，促进胶原沉积，显著促进烧伤创面愈合。
附图说明
图1A为本发明一实施例中真皮去细胞细胞外基质的细胞支架的示意图；图1B为去细胞支架与真皮基因芯片鉴定结果；图1C为去细胞支架与真皮的组织学验证；图1D-E为细胞外基质的主要蛋白成分及组织结构；
图2A为真皮去细胞细胞外基质水凝胶的制备流程示意图；图2B为该反应的化学反应式；
图3A为真皮去细胞细胞外基质(ddECMMA)的核磁共振谱；图3B为储能模量图；图3C为储能模量(G')和损耗模量(G")的变化；图3D为水凝胶与真皮去细胞细胞外基质水凝胶的微观结构对比；图3E为水凝胶的频谱；图3F为蛋白芯片情况；图3G-H为水凝胶在胶原酶I和PBS溶液中的降解情况；
图4A-C为成纤维细胞(L929细胞)与人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞)在水凝胶表面培养结果；
图5A为水凝胶修复大鼠皮肤创面的大体外观图；图5B-C为创面愈合的分析结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
实施例
本实施例提供一种真皮去细胞细胞外基质水凝胶的制备方法，包括以下步骤:
S1、制备真皮去细胞支架：通过机械分层去除猪全厚皮肤的皮下脂肪、结缔组织以及表皮，将分离得到的真皮层依次置于0.25％trypsin溶液中持续搅拌6小时；置于去离子水中持续搅拌15分钟，重复2次；置于70％乙醇溶液中持续搅拌10小时；置于3％过氧化氢溶液中持续搅拌15分钟；置于去离子水中持续搅拌15分钟，重复1次；置于1％Triton X-100/0.26％EDTA/0.69％Tris溶液中持续搅拌6小时；置于更换后的1％Triton X-100/0.26％EDTA/0.69％Tris溶液中持续搅拌16小时；置于去离子水中持续搅拌15分钟，重复2次；置于0.1％过氧乙酸/4％乙醇溶液中持续搅拌2小时；置于PBS溶液中持续搅拌15分钟，重复1次；置于去离子水中持续搅拌15分钟，重复2次；所述持续搅拌的搅拌速度均为300rpm；冷冻干燥仪冻干后即得真皮去细胞支架；后将真皮去细胞支架置于-80℃冰箱保存；
S2、制备真皮去细胞细胞外基质：将步骤S1所得到的真皮去细胞支架剪成极小块或研磨成粉末，并配制成真皮去细胞支架溶液；所述真皮去细胞支架溶液的浓度为10mg/mL，其中，盐酸的浓度为0.01mol/L，胃蛋白酶的浓度为1mg/mL；37℃持续搅拌72小时后，过滤去除大颗粒，并加入PBS溶液终止消化；所述PBS溶液为10×PBS溶液，加入的体积为真皮去细胞支架溶液体积的1/9；
再加入浓度为10mol/L的NaOH溶液调节上述溶液的pH至8.0～9.0，并加入甲基丙烯酸；所述甲基丙烯酸的滴加比例为每克真皮去细胞支架滴加1mL甲基丙烯酸，所述甲基丙烯酸的滴加速度为0.5mL/min；37℃持续搅拌48小时后，加入PBS溶液终止酰化反应；所述PBS溶液为1×PBS溶液，加入的体积为滴加甲基丙烯酸后的真皮去细胞支架溶液体积的5倍；
再加入NaOH溶液调节上述溶液的pH至7.35～7.45，并透析72小时；37℃持续搅拌72小时后，于-80℃冷冻保存1小时；冷冻干燥仪冻干后即得真皮去细胞细胞外基质；后将真皮去细胞细胞外基质置于-80℃冰箱避光保存；
S3、制备真皮去细胞细胞外基质水凝胶：取步骤S2所得到的真皮去细胞细胞外基质，并配制成浓度为50mg/mL的真皮去细胞细胞外基质溶液，加入浓度为1mg/mL光引发剂I2959后，紫外手电照射至上述溶液固化成胶状，所述紫外手电中紫外光的波长为365nm，即得真皮去细胞细胞外基质水凝胶。
检测实施例
真皮去细胞细胞外基质核磁共振具体步骤为：
首先将冻干制备得到的去细胞细胞外基质材料称取50mg干重，溶于氘代水中。选择核磁共振波谱仪(型号：NMRBRUKERAVANCE 400)，将样品放入仪器的磁体，选择一维实验进行检测。
结果如图3A所示，真皮去细胞细胞外基质核磁共振曲线δ在5.0-6.0ppm之间的位置有明显双峰，是H2C＝C(CH3)2质子峰，表明甲基丙烯基团已经成功接到明胶分子链上。
流变学检测实验步骤为：
首先设定旋转流变仪的测定参数，紫外波长为365nm，时间设置为5分钟，变量随频率和固化时间作图。准备好样品，取50mg干重的去细胞细胞外基质材料，溶于1mL的1X PBS溶液内，加入1mg的光引发剂I2959，充分混匀。每次取260uL样品上机并进行分析。
结果如图3B所示，50％真皮去细胞细胞外基质大于其他浓度真皮去细胞细胞外基质和甲基丙烯酸酐化明胶的储能模量，说明50％真皮去细胞细胞外基质水凝胶有更强的抵抗变形能力。
蛋白芯片分析具体操作步骤为：
选取AAH-GF-G1-4试剂盒，将盒内玻片芯片取出，室温平衡20-30min，真空干燥器1-2小时。每个孔中加100μL的样品稀释液，室温摇床上孵育1小时，封闭定量抗体芯片。取真皮组、去细胞支架组、去细胞细胞外基质材料组各50mg(湿重)剪碎，加入RIPA裂解液放入组织研磨仪中研磨，15000rpm离心，吸取上清。抽去每个孔中的缓冲液，添加60μL的样品(上清原液上样)到孔中，在摇床上4℃过夜孵育。次日，抽去每个孔中的标准品或样品，1×洗液I清洗5次，每次5min室温摇床震荡，抽去每个孔中的1×洗液I，加入1×洗液II清洗2次，每次5min室温摇床震荡。离心检测抗体混合物小管，然后加入1.4mL的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μL的检测抗体到每个孔中，室温摇床上孵育2小时。抽去每个孔中的检测抗体，1×洗液I清洗5次，每次5min室温摇床震荡，然后加入1×洗液II清洗2次，每次5min室温摇床震荡。离心Cy3-链霉亲和素小管，然后加入1.4mL的样品稀释液，混合均匀后再次快速离心。添加80μL的Cy3-链霉亲和素到每个孔中，用铝箔纸包住玻片避光孵育，室温摇床上孵育1个小时。抽去每个孔中的Cy3-链霉亲和素，1×洗液I清洗5次，每次5min室温摇床震荡。采用激光扫描仪(型号：InnoScan 300Microarray Scanner)扫描信号，采用Cy3或者绿色通道(激发频率＝532nm)，采用AAH-GF-G1-4的数据分析软件来进行数据分析。
结果如图3F所示，真皮去细胞细胞外基质水凝胶与真皮(Native)和支架(DC)组相比，细胞外基质主要发挥功能生长因子大致保留。
水凝胶降解测试具体实验步骤为：
分别取30％、40％、50％、60％去细胞细胞外基质水凝胶和50％甲基丙烯酸酐化明胶300uL，365nm紫外光下进行光固化，置于-80℃冰箱中冷冻1小时，放入冷冻干燥仪中冻干24小时，称取每个样本的干重，记录为第0天。每孔样本加入500uL的1％浓度的胶原酶Ⅰ消化24h，1×PBS溶液清洗3次，每次5分钟，继续冷冻干燥24小时，称取干重，记录为第1天，依次类推至所有样本全部降解完毕，数据汇总作图。
结果如图3G-H所示，真皮去细胞细胞外基质水凝胶的降解速率明显比纯甲基丙烯酸酐化明胶的降解速率更慢，并且水凝胶的降解速率随时间增加而加快。具体来说在胶原酶I的作用下甲基丙烯酸酐化明胶水凝胶在第3天时已经完全降解，而真皮去细胞细胞外基质水凝胶在第7天的时候才完全降解。
L929与HUVEC细胞在水凝胶表面培养的具体实验步骤为：取24孔板，每孔分别滴加30％、40％、50％、60％去细胞细胞外基质水凝胶和50％甲基丙烯酸酐化明胶300uL，每组3重复，365nm紫外光下进行光固化。在固化后的水凝胶表面每孔铺约1×105个细胞，置于37℃培养箱中培养24小时。次日，弃上清，1×PBS清洗3次，每次5分钟。使用Calcein/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒(品牌：碧云天)，每孔加入500μL CalceinAM/PI检测工作液，37℃避光孵育1小时。孵育结束后，在荧光显微镜下观察染色效果(CalceinAM为绿色荧光，Ex/Em＝494/517nm；PI为红色荧光，Ex/Em＝535/617nm)。
结果如图4A-C所示，在培养1天后，结果显示L929细胞在所有水凝胶组都出现了增殖，活死染色结果说明这些水凝胶都有良好的生物相容性。
水凝胶创面愈合实验具体实验步骤为：共使用25只成年Sprague-Dawley(SD)大鼠(8周龄，体重＝250±15g，每组n＝3)。腹腔注射戊巴比妥钠(2.5％，30mg/kg)，对动物进行麻醉。在大鼠背部对称地切开一个标准化的伤口(圆形，直径＝20毫米)(每组n＝6)，在皮肤上形成一个全厚的伤口。接下来，将30％、40％、50％、60％去细胞细胞外基质水凝胶和50％甲基丙烯酸酐化明胶各300uL铺于创面部位，365nm紫外照射5min光固化使其与伤口完全黏附。最后，用4-0缝合线固定伤口边缘，以尽量避免收缩。
如图5A所示，真皮去细胞细胞外基质水凝胶组创面愈合效果明显高于对照组与甲基丙烯酸酐化明胶组。
如图5B-C所示，在第7天与第14天的时间段，真皮去细胞细胞外基质水凝胶组创面愈合率明显高于对照组与甲基丙烯酸酐化明胶组。
综上所述，本发明的真皮去细胞细胞外基质水凝胶具有良好的凝胶化时间以及良好的形状适应性，适合于动态创面以及形状不规则的创面。与现有商品敷料相比，本发明的水凝胶制得的水凝胶敷料极大地缩短了创面愈合时间，加速了皮肤结构和功能的重建；
本发明的水凝胶敷料通过调节细胞增殖、迁移和免疫应答对组织再生发挥多重作用，从而促进创面的全层修复；本发明的水凝胶敷料通过降低促炎细胞因子的表达，上调血管内皮生长因子(VEGF)的表达，促进血管生成，促进胶原沉积，显著促进烧伤创面愈合。
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。
Claims (9)
1.一种真皮去细胞细胞外基质水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备真皮去细胞支架：通过机械分层去除猪全厚皮肤的皮下脂肪、结缔组织以及表皮，将分离得到的真皮层依次置于不同搅拌溶液中持续搅拌，冻干后即得真皮去细胞支架；
S2、制备真皮去细胞细胞外基质：将步骤S1所得到的真皮去细胞支架剪成极小块或研磨成粉末，并配制成真皮去细胞支架溶液；35～40℃持续搅拌48～96小时后，过滤去除大颗粒，并加入PBS溶液终止消化；
再加入NaOH溶液调节上述溶液的pH至8.0～9.0，并加入甲基丙烯酸；35～40℃持续搅拌24～72小时后，加入PBS溶液终止酰化反应；
再加入NaOH溶液调节上述溶液的pH至7.35～7.45，并透析48～96小时；35～40℃持续搅拌48～96小时后，于-85～-75℃冷冻保存0.5～1.5小时；冻干后即得真皮去细胞细胞外基质；
S3、制备真皮去细胞细胞外基质水凝胶：取步骤S2所得到的真皮去细胞细胞外基质，并配制成真皮去细胞细胞外基质溶液，加入光引发剂后，紫外照射至上述溶液固化成胶状，即得真皮去细胞细胞外基质水凝胶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述持续搅拌包括：依次置于trypsin溶液中持续搅拌5～7小时；置于去离子水中持续搅拌10～20分钟，重复1～3次；置于乙醇溶液中持续搅拌8～12小时；置于过氧化氢溶液中持续搅拌10～20分钟；置于去离子水中持续搅拌10～20分钟，重复1～3次；置于Triton X-100/EDTA/Tris溶液中持续搅拌5～7小时；置于更换后的Triton X-100/EDTA/Tris溶液中持续搅拌15～20小时；置于去离子水中持续搅拌10～20分钟，重复1～3次；置于过氧乙酸/乙醇溶液中持续搅拌1～3小时；置于PBS溶液中持续搅拌10～20分钟，重复1～3次；置于去离子水中持续搅拌10～20分钟，重复1～3次。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述持续搅拌的搅拌速度均为200～400rpm。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述真皮去细胞支架溶液的浓度为8～12mg/mL，其中，盐酸的浓度为0.005～0.015mol/L，胃蛋白酶的浓度为0.5～2mg/mL；所述NaOH溶液的浓度为8～12mol/L；所述甲基丙烯酸的滴加比例为每克真皮去细胞支架滴加0.5～1.5mL甲基丙烯酸，所述甲基丙烯酸的滴加速度为0.3～0.8mL/min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，终止消化时所加入的PBS溶液为10×PBS溶液，加入的体积为真皮去细胞支架溶液体积的1/10～1/8；终止酰化反应时加入的PBS溶液为1×PBS溶液，加入的体积为滴加甲基丙烯酸后的真皮去细胞支架溶液体积的4～6倍。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述光引发剂为光引发剂I2959，浓度为0.5～1.5mg/mL；所述真皮去细胞细胞外基质溶液的浓度为40～60mg/mL。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述紫外照射中紫外光的波长为365～395nm。
8.一种如权利要求1-7任一项所述制备方法制得的真皮去细胞细胞外基质水凝胶。
9.一种如权利要求8所述真皮去细胞细胞外基质水凝胶在制备光敏性生物水凝胶敷料中的应用。
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