CN105228698B - 利用自组装的金纳米壳层包覆细菌并借助激光产生光热分解与冷光来杀死与追踪细菌的方法 - Google Patents

利用自组装的金纳米壳层包覆细菌并借助激光产生光热分解与冷光来杀死与追踪细菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种利用自组装的金纳米壳层包覆细菌并借助激光产生光热分解与冷光来杀死与追踪细菌的方法，可以杀死革兰式阳性、阴性与抗药性细菌。本发明不用加任何还原剂即可在细菌表面自行组装产生一层金纳米壳层，由于金有非常好的光热转换效率，故可利用线性连续式与非线性飞秒式激光照射此细菌金纳米材料来产生热并有效率的杀死细菌，亦即光热分解效应；并利用非线性飞秒式激光照射时，此细菌金纳米材料不仅会产生热能，同时具有产生冷光的光学特质，杀死的细菌越多，产生的冷光越强，且可持续放光不会产生光漂白；借助此冷光可当作一指示剂，来追踪与确认细菌的存活，动向与座落的位置。

Description

利用自组装的金纳米壳层包覆细菌并借助激光产生光热分解 与冷光来杀死与追踪细菌的方法
技术领域
本发明关于一种非常简易且有效率的方式来杀死，特别涉及一种利用自组装的金纳米壳层包覆细菌的纳米材料借助激光产生光热分解与冷光来杀死与追踪细菌的方法，可应用于抗药性细菌的杀死与追踪。
背景技术
1.传统杀菌方式
1.1抗生素 (antibiotic)
抗生素是由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其它活性的一类次级代谢产物，能干扰其它生活细胞发育功能的化学物质。现临床常用的抗生素有微生物培养液液中提取物以及用化学方法合成或半合成的化合物。目前已知天然抗生素不下万种。抗生素事实上它不仅能杀灭细菌而且对霉菌、支原体、衣原体等其它致病微生物也有良好的抑制和杀灭作用。用于治病的抗生素除由此直接提取外；还有完全用人工合成或部分人工合成的。然而，重复使用一种抗生素可能会使致病菌产生抗药性。的所以现在提出杜绝滥用抗生素此乃是原因的一，且科学地使用抗生素是有必要的。通常建议做细菌培养并作药敏试验，根据药敏试验的结果选用极度敏感药物，这样就避免了盲目性，而且也能收到良好的治疗效果。
抗生素等抗菌剂的抑菌或杀菌作用，有几种作用机制：a.阻碍细菌细胞壁的合成，导致细菌在低渗透压环境下膨胀破裂死亡，以这种方式作用的抗生素主要是beta-内酰胺类抗生素。哺乳动物的细胞没有细胞壁，不受这类药物的影响。b.与细菌细胞膜相互作用，增强细菌细胞膜的通透性、打开膜上的离子通道，让细菌内部的有用物质漏出菌体或电解质平衡失调而死。以这种方式作用的抗生素有多粘菌素和短杆菌肽等。c.与细菌核糖体或其反应底物（如转移核糖核酸、信息核糖核酸）相互所用，抑制蛋白质的合成，这意味着细胞存活所必需的结构蛋白和酶不能被合成。以这种方式作用的抗生素包括四环素类抗生素、大环内酯类抗生素、氨基糖苷类抗生素、氯霉素等。d.阻碍细菌脱氧核糖核酸的复制和转录，阻碍脱氧核糖核酸复制将导致细菌细胞分裂繁殖受阻，阻碍脱氧核糖核酸转录成信息核糖核酸则导致后续的信息核糖核酸翻译合成蛋白的过程受阻。以这种方式作用的主要是人工合成的抗菌剂喹诺酮类（如氧氟沙星）。e.影响叶酸代谢，抑制细菌叶酸代谢过程中的二氢叶酸合成酶和二氢叶酸还原酶，妨碍叶酸代谢。因为叶酸是合成核酸的前体物质，叶酸缺乏导致核酸合成受阻，从而抑制细菌生长繁殖，主要是磺胺类和甲氧芐啶。
1.2高温高压灭菌釜(autoclave)
高温高压灭菌釜是用水蒸气的高温高压对物品进行灭菌处理的装备。通常的处理条件是在高压1.2-1.5 千克/平方厘米饱和蒸汽摄氏121℃下处理25到40分钟，导致细菌体蛋白质与酵素凝固变性而达到灭菌的目的。具体处理条件由待处理物品的体积和数量决定。高温高压灭菌釜被广泛应用于微生物学、医药领域、刺青、身体穿孔、兽医学、牙医学、足病医疗和修复整形制备。灭菌釜的大小和功能因其处理的对象而异。典型的处理对象包括实验室玻璃制品、手术用具、医疗废物、病患护理用品、动物笼填充垫，以及培养基。目前，灭菌釜在医疗废物（诸如带有致病菌的医院废物）抛弃前的灭菌处理方面应用正在显着增长。作此种功用的灭菌釜，通常都是使用原始原理的普通灭菌釜，通过利用加压蒸汽和过热水来消毒有潜在致病能力的物品。新一代的废物处理高压釜可以在不使用任何加压容器的情况下对培养基、橡胶制品、实验服、手套等达到相同的杀菌效果。
2.生物性模版(template)与金纳米粒子作用的简介
虽然目前有很多自组装方式来制备得到纳米材料，即便有这些方式来制得材料，但也很难利用这些如化学或物理方法来达到完全控制自组装的合成。其自组装过程中的很高的准确度与灵活性也是我们想到发展的，然而生物性模版在此提供了我们另一种可达到这些性质的自组装方式，其中细菌是一极有潜力的生物性模版，但目前只有极少数发现对此探讨。
2-1.病毒模板
病毒大致上是由一蛋白壳层(proteinaceous shell)，衣壳(capsid)所构成，并将遗传物质包覆在内部，然而以病毒作为模版，它可展现以下的特性：有固定的结构与成分、分散性好、表面有特异性的结合作用位置、有完全的分散但不同结构的形态(如球状、棒状与管状病毒)与表面具有孔洞或通道可使物质进入内部等。故非常适合当作一纳米构筑模板，来进行自组装的化学反应。Radloff et. al.在2005年提出以直径约为140纳米 的虹彩病毒(Chilo iridescent virus，CIV)当作核心，先与直径2-5纳米的金纳米粒子混合，使这些小尺寸的金纳米与其表面作用后形成一成核点(nucleation site)，再加入金离子溶液与的混合形成一纳米壳层(nanoshell)，得到一金属介电纳米结构(metallodielectricnanostructures)的材料。且发现通过加入不同量的电解质来控制并减少病毒表面所带的电荷，以得到不同厚度的金纳米壳层且其表面电浆共振也会随其纳米壳层的厚度而有所变化。由此结果对于虹彩病毒表面与金纳米粒子的特殊作用位置有更深一层的了解。
2-2.真菌范本
真菌的外观宽达数微米与长达数毫米的菌丝构成; 借助此特性将纳米粒子连接或包覆在菌丝上，依照不同需求可将的应用在高表面积感应器(sensors)、具有光学活性(optically active)的结构等领域上。利用简单的碳与氮为养分即能生长的微生物如真菌当范本，再利用小分子与纳米粒子间的作用，即可于模版上长出粒子或聚集物最后生成一纳米壳层，Sugunan et. al.在2007年提出利用麸胺酸(glutamate)钠还原氯金酸，生成以麸胺酸离子为保护剂的高度生物兼容性的15纳米的金纳米粒子。其中麸胺酸的碳与氮经由氧化作用生成二氧化碳与氨，可当作真菌的养分来源，再与小巢状曲菌(Aspergillusnidulans)真菌于金离子溶液环境中混合形成覆盖一层金纳米粒子的微米线。利用此制备方式在未来的研究：可在任何的微生物上自组装出任何形状与成分的材料。
2-3.细菌范本
细菌一般是单细胞，其结构简单，缺乏细胞核、细胞骨架以及膜状胞器，例如粒线体和叶绿体，但是有细胞壁。根据细胞壁的组成成分，细菌分为革兰氏阳性菌和阴性菌。革兰氏阳性菌的细胞壁较厚(15-80纳米)并由肽聚糖(peptidoglycan)所构成，脂质含量较少(1-4 %)，革兰氏阴性菌的细胞壁较薄(10-15纳米)由糖蛋白、外膜和脂多糖体(lipopolysaccharide，LPS)所组成且脂质含量较多(11-22 %)。细菌与金属离子之间的相互作用、生物体在其中所扮演的角色一直为科学家所研究，但关于金离子(Au3+)的微生物吸附和还原的特性及其应用并未有深入了解。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用自组装的金纳米壳层包覆细菌的纳米材料借助激光产生光热分解与冷光来杀死与追踪细菌的方法。
为达到上述目的，本发明提供一种利用自组装的金纳米壳层包覆细菌的纳米材料借助激光产生光热分解与冷光来杀死与追踪细菌的方法，选取细菌作为生物模板，并使用含金离子的溶液分别与细菌混合培养，由于细菌表面有一层由糖蛋白组成的S层，且S层上糖蛋白的羧基和肽链上胺基酸残基的离子化羧基与金离子作用，利用糖蛋白部分的水解产物如还原糖的半缩醛羟基或游离态的醛基当作电子供应者，进行氧化还原反应后，将金离子还原成金纳米粒子沉积在细菌的表面，形成一细菌包覆金纳米壳层的纳米材料，再利用线性与非线性激光照射包覆金纳米壳层的细菌以产生热从而有效率的杀死细菌。
优选地，其中该含金离子的溶液包含：四氯金酸溶液、含碳酸金的错离子溶液、吡啶三氯化金溶液或四氯化金钾溶液。
优选地，其中该照射包覆金纳米壳层该细菌其金纳米材料在利用非线性激光照射后，能对包覆以金纳米材料的细菌产生光热分解效果。
优选地，其中该金纳米壳层包覆细菌的纳米材料在借助非线性激光照射后具有产生冷光的光学特质，得以持续放光而不会产生光漂白，随着照射时间加长，产热效果更为明显，使得细菌死亡越多，所产生的冷光越强，借助此来判断细菌的存活。
优选地，其中该利用线性激光照射时，该细菌金纳米材料于近红外光区波长范围为700纳米至1400纳米内达到良好的吸收，对该材料利用激发光波长为808纳米的连续性线性激光照射时，使得该材料具有极高效率的升温效果，以光分解效应，来杀死细菌。
优选地，其中该利用非线性激光照射时，该细菌金纳米材料于近红外光区波长范围为700纳米至1400纳米内达到良好的吸收，对该材料利用激发光波长为720至820纳米的脉冲式非线性飞秒激光照射时，使得该材料具有极高效率的升温效果，以光分解效应，来杀死细菌。
优选地，其中被包覆金纳米材料的细菌在被产生的热能杀死所产生的冷光，作为追踪与确认伤口上细菌的存活、动向与座落的位置。
优选地，其中该适用的细菌为大肠杆菌BL21菌株、枯草杆菌、非抗药性金黄色葡萄球菌或抗药性金黄色葡萄球菌。
优选地，其中该含金离子的溶液与细菌混合培养，能用在动物体内经一段时间的培养，以产生包覆金纳米壳层的细菌，并以非线性激光照射，在体内亦能产生光热分解与冷光以杀死细菌及作为细菌存活的追踪。
本发明具有以下有益效果：
以生物模板自组装得到有功能的纳米材料虽然是很具有潜力，但至目前为止依旧是一个未知的领域。目前，也没有许多发现同时以大肠杆菌(Escherichia coli，E. coli)BL21菌株、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、非抗药性金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)与抗药性金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)做为生物范本，以不加任何还原剂、自组装的简易方式于细菌表面的S层(S-layer)自组装成一金纳米壳层。
在此本发明已成功的在细菌表面经由氧化还原方式制得一细菌包覆金纳米壳层的纳米材料，将具有传染性的病原菌变换成一新型的光热材料。并发现包覆了金纳米壳层的细菌经几周后，依旧俱有生命力。利用线性与非线性激光照射时，此细菌金纳米材料于近红外光区皆具有不错的吸收。且由于金有非常好的光热转换效率，故可利用线性与非线性激光照射此细菌金纳米材料来产生光热分解效应，并有效率的杀死细菌。
另一大优点为利用非线性激光照射时，此细菌金纳米材料不仅会产生光热分解效应，同时此材料本身具有产生冷光的光学特质，当被杀死的细菌越多，产生的冷光越强，且可持续放光不会产生光漂白。我们另以高压灭菌釜与抗生素处理完此材料让细菌死亡后，并照射非线性激光，发现是无冷光产生的。由此可知，此材料冷光的生成，需要利用非线性激光照射才会产生。
除了体外实验成功的外，在动物实验上也发现于伤口上亦具有相同的冷光放光效应且具非常好的杀菌效果，故可借助此冷光的发现，此细菌金纳米材料可当作一指示剂，来追踪与确认伤口上细菌的存活，动向与座落的位置。
现今，由于随着人类大量滥用抗生素，使得越来越多细菌产生抗药性，然而抗生素的使用也有耗尽的一天，故非常需要即刻寻找一方便且有效的杀菌方式。借助此发现，可提供另一选择方式，预期在未来可应用于临床上：可针对抗生素过敏的病患，于其具有细菌的外部伤口进行金纳米于细菌表面的产生，并照射非线性激光，经显微镜观察，可依照此材料所放出的冷光的强弱与位置得知细菌的存活与否，和所在的位置。
附图说明
图1：本发明自组装细菌金纳米壳层的示意图。
图2：本发明自组装细菌金纳米壳层的简单示意图。
图3-a：为未包覆任何金纳米壳层的大肠杆菌BL21菌株。
图3-b：为经由含金离子的溶液与大肠杆菌BL21菌株混合后，已包覆金纳米壳层的大肠杆菌BL21金纳米材料。
图3-c：为利用高角度环形暗场扫描穿透电子显微镜对大肠杆菌BL21金纳米材料的金元素做影像分析图。
图3-d：为未包覆任何金纳米壳层的枯草杆菌。
图3-e：为经由含金离子的溶液与枯草杆菌混合后，已包覆金纳米壳层的枯草杆菌金纳米材料。
图3-f：为利用高角度环形暗场扫描穿透电子显微镜对枯草杆菌金纳米材料的金元素做影像分析图。
图3-g：为未包覆任何金纳米壳层的抗药性金黄色葡萄球菌。
图3-h：为经由含金离子的溶液与抗药性金黄色葡萄球菌混合后，已包覆金纳米壳层的抗药性金黄色葡萄球菌金纳米材料。
图3-i：为利用高角度环形暗场扫描穿透电子显微镜对抗药性金黄色葡萄球菌金纳米材料金元素做影像分析图。
图4-a：傅立叶转换-红外线光谱仪鉴定图；大肠杆菌BL21原本表面的官能基信号为氢氧(O-H)结合碳氧(C-O)、碳碳氧(O-C=C)不对称伸展和胺基酸的羧根(C(=O)2)对称伸展；而金纳米壳层于大肠杆菌BL21表面生成后，因S层表层的羧基与金离子(Au3+)经配位作用，使得这些官能基信号都移动至较小的波数。
图4-b：傅立叶转换-红外线光谱仪鉴定图；枯草杆菌的信号为:碳碳氧(O-C=C)不对称伸展、胺基酸的羧根(C(=O)2)对称伸展；而金纳米壳层于枯草杆菌表面生成后，因S层表层的羧基与金离子(Au3+)经配位作用，使得这些官能基信号都移动至较小的波数。
图4-c：傅立叶转换-红外线光谱仪鉴定图；抗药性金黄色葡萄球菌的信号: 碳碳氧(O-C=C)不对称伸展、胺基酸的羧根(C(=O)2)对称伸展；而金纳米壳层于抗药性金黄色葡萄球菌表面生成后，因S层表层的羧基与金离子(Au3+)经配位作用，使得这些官能基信号都移动至较小的波数。
图5-a1：X光绕射图谱使用来做已包覆金纳米壳层的大肠杆菌BL21金纳米材料的鉴定图。
图5-a2：元素分析使用来做已包覆金纳米壳层的大肠杆菌BL21金纳米材料的鉴定图。
图5-b1：X光绕射图谱使用来做已包覆金纳米壳层的枯草杆菌金纳米材料的鉴定图。
图5-b2：元素分析使用来做已包覆金纳米壳层的枯草杆菌金纳米材料的鉴定图。
图5-c1：X光绕射图谱使用来做已包覆金纳米壳层的抗药性金黄色葡萄球菌金纳米材料的鉴定图。
图5-c2：元素分析使用来做已包覆金纳米壳层的抗药性金黄色葡萄球菌金纳米材料的鉴定图。
图6-a：金纳米结合于细菌表面的百分比与效率测定图。
图6-b：细菌金纳米壳层的三倍频信号，以大肠杆菌BL21金纳米壳层形成数周之后来做侦测，细菌依然随着时间的增加，细菌依旧具有活动力(箭头所指)。
图6-c：利用LIVE (西托9，SYTO 9)/DEAD (碘化丙啶，propidium iodide)套组工具，通过荧光显微镜侦测大肠杆菌BL21金纳米壳层形成数周后的存活概况图。
图6-d1：穿透式电子显微镜观测大肠杆菌BL21金纳米壳层形成数周之后，细菌依旧俱有分裂能力的图。
图6-d2：穿透式电子显微镜观测枯草杆菌金纳米壳层形成数周之后，细菌依旧俱有分裂能力的图。
图6-d3：穿透式电子显微镜观测抗药性金黄色葡萄球菌金纳米壳层形成数周之后，细菌依旧俱有分裂能力的图。
图7-a：随着含金离子的溶液与大肠杆菌BL21金纳米壳层混合培养时间增加，其紫外光/可见光光谱仪的信号图。
图7-b：随着含金离子的溶液与枯草杆菌金纳米壳层混合培养时间增加，其紫外光/可见光光谱仪的信号图。
图7-c：随着含金离子的溶液与抗药性金黄色葡萄球菌金纳米壳层混合培养时间增加，其紫外光/可见光光谱仪的信号图。
图8-a：经由连续式线性激光(红外光激光)照射纯水与大肠杆菌BL21金纳米材料，温度上升的情形图。
图8-b：经由连续式线性激光(红外光激光)照射纯水与枯草杆菌金纳米材料，温度上升的情形图。
图8-c：经由连续式线性激光(红外光激光)照射纯水与抗药性金黄色葡萄球菌金纳米材料，温度上升的情形图。
图9：利用非线性飞秒激光侦测的细菌金纳米材料的双光子吸收光谱。
图10-a1：尚未照射激光的大肠杆菌BL21金纳米壳层材料后，利用LIVE (西托9)/DEAD (碘化丙啶)套组工具染色后的影像。
图10-a2：尚未照射激光的枯草杆菌金纳米壳层材料后，利用LIVE (西托9)/DEAD(碘化丙啶)套组工具染色后的影像。
图10-b1：已照射线性激光的大肠杆菌BL21金纳米壳层材料后，利用LIVE (西托9)/DEAD (碘化丙啶)套组工具染色后的影像。
图10-b2：已照射线性激光的枯草杆菌金纳米壳层材料后，利用LIVE (西托9)/DEAD (碘化丙啶)套组工具染色后的影像。
图10-c1：利用LIVE (西托9)/DEAD (碘化丙啶)套组工具将大肠杆菌BL21金纳米壳层材料的细菌存活率数值化。
图10-c2：利用LIVE (西托9)/DEAD (碘化丙啶)套组工具将枯草杆菌金纳米壳层材料的细菌存活率数值化。
图10-d1：使用细菌菌落计数法(colony forming unit，CFU)来计算线性激光照射后，大肠杆菌BL21金纳米壳层材料的细菌的存活率。
图10-d2：使用细菌菌落计数法(colony forming unit，CFU)来计算线性激光照射后，枯草杆菌金纳米壳层材料的细菌的存活率。
图10-e1：照射非线性飞秒激光后的大肠杆菌BL21金纳米壳层材料的影像。
图10-e2：照射非线性飞秒激光后的枯草杆菌金纳米壳层材料的影像。
图10-f1：照射非线性飞秒激光后的大肠杆菌BL21金纳米壳层材料后，利用LIVE(西托9)/DEAD (碘化丙啶)套组工具染色后的影像。
图10-f2：照射非线性飞秒激光后的枯草杆菌金纳米壳层材料后，利用LIVE (西托9)/DEAD (碘化丙啶)套组工具染色后的影像。
图10-g1：利用LIVE (西托9)/DEAD (碘化丙啶)套组工具将大肠杆菌BL21金纳米壳层材料的细菌存活率数值化。
图10-g2：利用LIVE (西托9)/DEAD (碘化丙啶)套组工具将枯草杆菌金纳米壳层材料的细菌存活率数值化。
图10-h1：使用高压灭菌釜杀死大肠杆菌BL21金纳米壳层材料的细菌后，并使用非线性激光侦测是否有冷光产生的影像。
图10-h2：使用高压灭菌釜杀死枯草杆菌金纳米壳层材料的细菌后，并使用非线性激光侦测是否有冷光产生的影像。
图10-i1：使用氨苄西林(ampicillin)杀死大肠杆菌BL21金纳米壳层材料的细菌后，并使用非线性激光侦测是否有冷光产生的影像。
图10-i2：使用氨苄西林(ampicillin)杀死枯草杆菌金纳米壳层材料的细菌后，并使用非线性激光侦测是否有冷光产生的影像。
图10-j1：使用细菌菌落计数法来计算非线性激光照射、高压灭菌釜与氨苄西林处理后，大肠杆菌BL21金纳米壳层材料的细菌的存活率。
图10-j2：使用细菌菌落计数法来计算非线性激光照射、高压灭菌釜与氨苄西林处理后，枯草杆菌金纳米壳层材料的细菌的存活率。
图11-a1：单独的大肠杆菌BL21菌株照射非线性飞秒激光后的影像图。
图11-a2：单独的枯草杆菌菌株照射非线性飞秒激光后的影像图。
图11-b1：照射非线性飞秒激光后，大肠杆菌BL21金纳米材料的影像图。
图11-b2：照射非线性飞秒激光后，枯草杆菌金纳米材料的影像图。
图12-a1：单独的大肠杆菌BL21菌株照射线性激光后的影像图。
图12-a2：单独的枯草杆菌菌株照射线性激光后的影像图。
图12-b1：大肠杆菌BL21金纳米材料照射线性激光后的影像图。
图12-b2：枯草杆菌金纳米材料照射线性激光后的影像图。
图13-a1：尚未照射激光的无抗药性金黄色葡萄球菌金纳米壳层材料后，利用LIVE(西托9)/DEAD (碘化丙啶)套组工具染色后的影像。
图13-a2：尚未照射激光的抗药性金黄色葡萄球菌金纳米壳层材料后，利用LIVE(西托9)/DEAD (碘化丙啶)套组工具染色后的影像。
图13-b1：万古霉素(vancomycin)作用之后，LIVE (西托)/DEAD (碘化丙啶)套组工具染色并观察无抗药性金黄色葡萄球菌金纳米壳层材料的影像。
图13-b2：万古霉素(vancomycin)作用之后，LIVE (西托)/DEAD (碘化丙啶)套组工具染色并观察抗药性金黄色葡萄球菌金纳米壳层材料的影像。
图13-c1：已照射线性激光的无抗药性金黄色葡萄球菌金纳米壳层材料后，利用LIVE (西托9)/DEAD (碘化丙啶)套组工具染色后的影像。
图13-c2：已照射线性激光的抗药性金黄色葡萄球菌金纳米壳层材料后，利用LIVE(西托9)/DEAD (碘化丙啶)套组工具染色后的影像。
图13-d1：利用LIVE (西托)/DEAD (碘化丙啶)套组工具将无抗药性金黄色葡萄球菌金纳米壳层材料的细菌存活率数值化。
图13-d2：利用LIVE (西托)/DEAD (碘化丙啶)套组工具将抗药性金黄色葡萄球菌金纳米壳层材料的细菌存活率数值化。
图13-e1：使用细菌菌落计数法(colony forming unit，CFU)来计算线性激光照射后，无抗药性金黄色葡萄球菌金纳米壳层材料的细菌的存活率。
图13-e2：使用细菌菌落计数法(colony forming unit，CFU)来计算线性激光照射后，抗药性金黄色葡萄球菌金纳米壳层材料的细菌的存活率。
图13-f1：照射非线性飞秒激光后，无抗药性金黄色葡萄球菌金纳米壳层材料的影像。
图13-f2：照射非线性飞秒激光后，抗药性金黄色葡萄球菌金纳米壳层材料的影像。
图13-g1：照射非线性飞秒激光后的无抗药性金黄色葡萄球菌金纳米壳层材料后，利用LIVE (西托9)/DEAD (碘化丙啶)套组工具染色后的影像。
图13-g2：照射非线性飞秒激光后的抗药性金黄色葡萄球菌金纳米壳层材料后，利用LIVE (西托9)/DEAD (碘化丙啶)套组工具染色后的影像。
图13-h1：利用LIVE (西托9)/DEAD (碘化丙啶)套组工具将无抗药性金黄色葡萄球菌金纳米壳层材料的细菌存活率数值化。
图13-h2：利用LIVE (西托9)/DEAD (碘化丙啶)套组工具将抗药性金黄色葡萄球菌金纳米壳层材料的细菌存活率数值化。
图13-i1：使用高压灭菌釜杀死无抗药性金黄色葡萄球菌金纳米壳层材料的细菌后，并使用非线性激光侦测是否有冷光产生的影像。
图13-i2：使用高压灭菌釜杀死抗药性金黄色葡萄球菌金纳米壳层材料的细菌后，并使用非线性激光侦测是否有冷光产生的影像。
图13-j1：万古霉素杀死无抗药性金黄色葡萄球菌金纳米壳层材料的细菌后，并使用非线性激光侦测是否有冷光产生的影像。
图13-j2：万古霉素杀死抗药性金黄色葡萄球菌金纳米壳层材料的细菌后，并使用非线性激光侦测是否有冷光产生的影像。
图13-k1：使用细菌菌落计数法来计算非线性激光照射、高压灭菌釜与万古霉素处理后，无抗药性金黄色葡萄球菌金纳米壳层材料的细菌的存活率。
图13-k2：使用细菌菌落计数法来计算非线性激光照射、高压灭菌釜与万古霉素处理后，抗药性金黄色葡萄球菌金纳米壳层材料的细菌的存活率。
图14-a1：单独的无抗药性的金黄色葡萄球菌菌株照射线性激光70毫瓦后的影像图。
图14-a2：单独的无抗药性的金黄色葡萄球菌菌株照射线性激光80毫瓦后的影像图。
图14-a3：单独的无抗药性的金黄色葡萄球菌菌株照射线性激光90毫瓦后的影像图。
图14-b1：照线非线性飞秒激光70毫瓦后，无抗药性的金黄色葡萄球菌金纳米材料的影像图。
图14-b2：照射非线性飞秒激光80毫瓦后，无抗药性的金黄色葡萄球菌金纳米材料的影像图。
图14-b3：照射非线性飞秒激光90毫瓦后，无抗药性的金黄色葡萄球菌金纳米材料的影像图。
图15-a1：单独的抗药性的金黄色葡萄球菌菌株照射线性激光70毫瓦后的影像图。
图15-a2：单独的抗药性的金黄色葡萄球菌菌株照射线性激光80毫瓦后的影像图。
图15-a3：单独的抗药性的金黄色葡萄球菌菌株照射线性激光90毫瓦后的影像图。
图15-b1：照线性非线性飞秒激光70毫瓦后，抗药性的金黄色葡萄球菌金纳米材料的影像图。
图15-b2：照线性非线性飞秒激光80毫瓦后，抗药性的金黄色葡萄球菌金纳米材料的影像图。
图15-b3：照线性非线性飞秒激光90毫瓦后，抗药性的金黄色葡萄球菌金纳米材料的影像图。
图16-a：大肠杆菌BL21金纳米壳层材料照射非线性飞秒激光后的双光子冷光光谱图。
图16-b：枯草杆菌金纳米壳层材料照射非线性飞秒激光后的双光子冷光光谱图。
图16-c：抗药性的金黄色葡萄球菌金纳米壳层材料照射非线性飞秒激光后的双光子冷光光谱图。
具体实施方式
有关本发明所采用的技术、手段及其功效，以下列举较佳实施例并配合附图详细说明于后，相信本发明上述的目的、构造及特征，当可由的得一深入而具体的了解。
本发明设计的利用细菌包覆金纳米壳层的纳米材料借助激光产生光热分解与冷光来杀死与追踪细菌的方法，在此，本发明是选用了大肠杆菌BL21菌株、枯草杆菌与抗药性金黄色葡萄球菌作为生物模板。本发明使用含金离子的溶液分别与这三种细菌混合培养，由于细菌表面有一层由糖蛋白(glycoproteins)组成的S层，且S层上糖蛋白的羧基和肽链上胺基酸残基的离子化羧基当作与金离子作用处，利用糖蛋白部分的水解产物如还原糖的半缩醛羟基或游离态的醛基当作电子供应者，进行氧化还原反应后，将四氯化金离子还原成金纳米粒子沉积在细菌的表面，形成一细菌包覆金纳米壳层的纳米材料(bacteriacoated with Au nanoshells) (如图1、图2)。本发明使用了许多的鉴定方式来观察此材料=> (1) 由穿透式电子显微镜鉴定可知：图3-a、图3-b与图3-g为未包覆任何金纳米壳层的细菌形态(依序为大肠杆菌BL21菌株、枯草杆菌与抗药性金黄色葡萄球菌)；图3-d、图3-e与图3-h为已包覆了金纳米壳层的细菌形态(所产生的金纳米粒子直径小于7纳米);(2) 我们同时也使用了傅立叶转换-红外线光谱仪来鉴定:如大肠杆菌BL21原本表面的官能基信号为氢氧(O-H)结合碳氧(C-O)、碳碳氧(O-C=C)不对称伸展和胺基酸的羧根(C(=O)2)对称伸展。但金纳米壳层于细菌表面生成后，因S层表层的羧基与金离子经配位作用，使得这些官能基信号都移动至较小的波数(即较长的波长，为红位移)，相同的结果也在枯草杆菌与抗药性金黄色葡萄球菌发现(如图4-a、4-b、4-c)；(3) X光绕射与元素分析被使用来做此材料的鉴定(如图5-a1、5-a2、5-b1、5-b2、5-c1、5-c2)；(4) 利用高角度环形暗场扫描穿透电子显微镜对金元素做影像分析：图3-c、图3-f与图3-i依序为大肠杆菌BL21菌株、枯草杆菌与抗药性金黄色葡萄球菌的暗场金元素影像图；以上数种方式鉴定可知金纳米壳层已成功的自组装形成于细菌表面的S层。
图6-a为随着含金离子的溶液分别与这三种细菌混合培养时间增加，而金纳米结合于细菌表面的百分比与效率测定图，经混合后，部分金纳米粒子已经结合于细菌表面；随着时间增加，结合比率增加更多；同时，随着细菌与金成长液混合时间的增加，会产生不同状态或金壳层厚度的细菌金纳米材料，再分别测其紫外光/可见光光谱，发现其特性吸收峰的强度会因金纳米粒子的尺寸、形状和聚集程度而有所不同，在此，观察其表面电浆共振的波长范围由可见光至近红外光区，最主要是来自于金纳米产生后形成聚集、最后变成聚集状态的金壳层的贡献，且随着培养时间的增长，吸收强度也随的增强，随着培养时间增加，于细菌表面由金纳米粒子形成致密的金纳米壳层，故于近红外光区同时也有扁长且宽的吸收产生，随着混合的时间增加吸收值也会跟着增加(如图7-a、7-b、7-c)。图6-b为使用反射式的光学倍频(harmonic generation)显微镜撷取倍频影像，此为一非侵入式的非线性影像技术，在此，利用所得的金壳层的细菌继续于金成长液中混合数周后，利用三倍频信号来观察细菌的形态。可发现随着观察时间增加，细菌依旧具有活动力，能在无机环境下继续存活(如图6-b)。图6-c为利用LIVE (西托9)/DEAD (碘化丙啶)套组工具，通过荧光显微镜侦测大肠杆菌BL21金纳米壳层形成数周后，大部分已包覆了金纳米壳层的细菌依旧保有生命力。再借助穿透式电子显微镜观测大肠杆菌BL21金纳米壳层形成数周之后，细菌依旧具有分裂的能力(如图6-d1、6-d2、6-d3)。这些结果显示，在不加入任何还原剂的环境下，确实能够通过自然氧化还原力于细菌表面S层产生金纳米壳层，并且于长时间下，细菌依然保有应有的生命力与生理功能。
由于金有非常好的光热转换效率，在此先利用连续性线性的激光(红外光激光)来做此实验，通过升温效率的实验来测试(如图8-a、8-b、8-c)：经由激光照射细菌金纳米材料，温度上升的情形。结果发现合成的细菌金纳米材料有极好的升温效果，故在初步实验可知此材料经激光照射后确实具有升温效果，且适合当一光热治疗剂。另一方面，也想了解利用非线性激光照射此细菌金纳米材料是否也会有相同的加热杀菌效果。首先，先测定双光子照射后此材料的吸收状况(如图9)。
经由上述实验确认后，准备开始做线性与非线性激光照射此材料的实验。首先，先使用连续性线性的激光(红外光激光)照射此细菌金纳米材料，再使用LIVE (西托9 )/DEAD(碘化丙啶)套组工具，通过荧光显微镜侦测细菌的存活率(如图10-a1、10- a2、10-b1、10-b2)；为了方便了解光热杀菌效率，利用软件将存活率数值化，结果发现BL21与枯草杆菌金纳米材料存活率皆降到非常低(如图10-c1、10-c2)，为了重复确认存活率，另使用CFU细菌菌落计数实验确认，也得到相同的结果，即细菌的存活率也皆降到非常低(如图10-d1、10-d2)。另一方面，开始使用非线性飞秒激光照射，此细菌金纳米材料来了解细菌的存活率，惊讶地发现随着照射时间的增加，产生的冷光也随的增强(如图10-e1、10-e2与图11-a1、11-a2、11-b1、11-b2)。相反的，即便使用线性激光对此菌纳米材料照射，却是无法产生冷光(如图12-a1、12-a2、12-b1、12-b2)。然而，也再次使用LIVE (西托9)/DEAD (碘化丙啶)套组工具将照射完非线性激光的细菌存活率数值化(图10-f1、10-f2与图10-g1、10-g2)，结果显示存活率也降到非常低。由此，可知此令人振奋的结果，随着非线性激光照射细菌金纳米材料时间越长，产生的冷光也越强，而死掉的细菌量也越多。
为了做比较，也使用了高压灭菌釜与氨苄西林等两种不同的作用方式使细菌死亡，再利用相同参数的非线性激光来观测，皆无法观测到产生的冷光(如图10-h1、10-h2与图10-i1、10-i2)。由目前结果可知，可使用短时间照射的非线性飞秒激光即可杀死几乎所有的细菌(如图10-g1、10-g2与图图10-j1、10-j2)，相较于高压灭菌釜与氨苄西林等两种杀菌方式，无论是革兰氏阴性菌(大肠杆菌BL21)与格兰氏阳性菌(枯草杆菌)，或线性与非线性激光照射，本发明的方法提供了一非常有效率的杀菌方式；除此的外，随着非线性激光照射细菌金纳米材料时间越长，产生的冷光也越强，而死掉的细菌量也越多，为令人意外与惊喜的另一发现。
抗生素是目前最广泛用来杀死细菌的药物，不同抗生素可对不同的细菌有杀菌作用，盘尼西林是人类最早用来对抗细菌感染的抗生素，但使用不久后就发现有些金黄色葡萄球菌可制造一种盘尼西林酵素(penicillinase)来破坏盘尼西林，因而对盘尼西林产生抗药性。之后，科学家合成出一种不会被盘尼西林酵素(penicllinase)破坏的抗生素二甲氧基苯青霉素(methicillin)，可用来杀死金黄色葡萄球菌(不论它是否会制造盘尼西林酵素penicillinase)；金黄色葡萄球菌是一种革兰式阳性球菌，普遍存在于自然环境中与人体上的某些部位他是造成人类感染的一种常见且重要的细菌，可引起人体许多部位的感染，包括皮肤伤口的感染、骨关节的感染、甚至深部组织的感染。之后，这一类药物就成为治疗金黄色葡萄球菌感染最重要的抗生素。
然而，近20年来却也有愈来愈多的内酰胺也杀不死的抗二甲氧基苯青霉素的金黄素葡萄球菌，称抗药性金黄色葡萄球菌。依据国内临床报告，由金黄色葡萄球菌所分离出的抗药性金黄色葡萄球菌的比例高达50%至80%，因此临床上在处理金黄色葡萄球菌感染的病人时，大部分就是在处理抗药性金黄色葡萄球菌感染的问题。此外，相关研究指出，抗药性金黄色葡萄球菌细菌不只对盘尼西林与内酰胺等抗生素具有抗药性，它同时也对许多其它类的抗生素具有抗药性，也就是所谓的多重抗药性细菌(multidrug-resistantbacteria)。也因如此，在治疗此类受感染病人时能使用的抗生素种类非常有限，甚至只有万古霉素可使用。抗药性金黄色葡萄球菌的传播一般是经由接触传播，特别是人类的彼此接触，其中以手的接触是传播中最重要的途径；如医院内，经由医院工作人员的双手接触病人，很容易将抗药性金黄色葡萄球菌由此途径传染给其它病人。因此如何防止抗药性金黄色葡萄球菌传播，或甚至杀死抗药性金黄色葡萄球菌是目前最重要且最迫切被解决的议题。
在此，欲利用此细菌纳米材料的方法来杀死抗药性的金黄色葡萄球菌。因此选用了无抗药性的金黄色葡萄球菌与抗药性的金黄色葡萄球菌来研究。先使用连续性线性的激光(红外光激光)照射此细菌金纳米材料，再使用LIVE (西托9)/DEAD (碘化丙啶)套组工具，通过荧光显微镜侦测细菌的存活率，尚未照射激光的材料，细菌皆处于活着状态(如图13-a1、13-a2)，为了确认抗药性的金黄色葡萄球菌具抗药性，我们使用了的万古霉素添加于此两种细菌金纳米材料，发现大部分的无抗药性的金黄色葡萄球菌呈现死亡状态，而抗药性的金黄色葡萄球菌只有部分死亡(如图13-b1、13-b2)；再照射激光后并利用软件将存活率数值化(如图13-c1、13-c2)，结果发现无抗药性的金黄色葡萄球菌与抗药性的金黄色葡萄球菌金纳米材料存活率皆降到非常低(如图13-d1、13-d2)；另使用细菌菌落计数实验确认，也得到相同的结果(如图13-e1、13-e2)。
另一方面，开始使用非线性飞秒激光照射，此细菌金纳米材料来了解细菌的存活率，此两株细菌金纳米材料也呈现随着照射时间的增加，产生的冷光也随的增强(如图13-f1、13-f2、图14-a1、14-a2、14-a3、14-b1、14-b2、14-b3与图15-a1、15-a2、15-a3、15-b1、15-b2、15-b3)。而再使用LIVE (西托9)/DEAD (碘化丙啶)套组工具将照射完非线性激光的细菌存活率数值化(如图图13-g1、13-g2与图13-h1、13-h2)，结果显示存活率也降至非常低。另外，相同的结果显示，随着非线性激光照射细菌金纳米材料时间越长，产生的冷光也越强，而死掉的细菌量也越多。而高压灭菌釜与万古霉素等两种不同的作用方式使细菌死亡，再利用相同参数的非线性激光来观测，皆无法观测到产生的冷光(如图13-i1、13-i2与图13-j1、13-j2)。
由目前结果可知，可使用短时间照射的非线性飞秒激光即可杀死几乎所有的细菌(如图13-h1、13-h2与图13-k1、13-k2)，相较于高压灭菌釜与抗生素等两种杀菌方式，无论是是否为抗药性金黄色葡萄球菌，或线性与非线性激光照射，本发明的方法提供了一非常有效率的杀菌方式；除此的外，随着非线性激光照射细菌金纳米材料时间越长，产生的冷光也越强，而死掉的细菌量也越多，在金黄色葡萄球菌上也是行的通的。由于发现冷光的产生，也针对此细菌金纳米材料来侦测此冷光的双光子光谱，蓝色曲线表示照射完非线性激光后细菌金纳米材料的光谱；红色曲线表示未包覆金纳米壳层的细菌照射完非线性激光后的光谱(如图16-a、16-b、16-c)。结果显示，只需给予足量的非线性激光能量，即会产生冷光，可了解此材料本身具有产生冷光的光学特质。结合之前的实验结果可知，再继续给予能量即可产生更强的冷光并使杀死更多的细菌。
由于未来欲借助此细菌金纳米材料应用于临床上，故在此也做了动物实验。在小鼠耳朵内皮上造成一个小伤口，并于伤口上分别接种无抗药性的金黄色葡萄球菌与抗药性的金黄色葡萄球菌后，在于伤口上持续加入含金离子的溶液培养，借助此方式可在伤口上自组装产生细菌金纳米壳层材料，接着并照射非线性激光，可发现随着照射时间的增加，冷光产生的强度越来越强，由此可证明无论无抗药性的金黄色葡萄球菌与抗药性的金黄色葡萄球菌，确实可使用此法于伤口上产生细菌金纳米壳层材料，并经由激光的照射产生冷光，且使细菌死亡。随着细菌逐渐对抗生素产生多重抗药性的情形下(如超级细菌)，在未来抗生素必定不是唯一临床的杀菌方式，故本发明另一有效率且新颖的杀菌方法是非常急迫与必要的，期望在未来可将此发现应用于临床医学上。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非用以对本发明作任何形式上的限制，故举凡运用本发明专利精神所作的任何修饰或变更等，皆仍应同理包括于本发明的专利保护范围内。

Claims (8)

1.一种利用自组装的金纳米壳层包覆细菌的纳米材料借助激光产生光热分解与冷光来杀死与追踪细菌的方法，其特征在于：选取细菌作为生物模板，并使用含金离子的溶液分别与细菌混合培养，由于细菌表面有一层由糖蛋白组成的S层，且S层上糖蛋白的羧基和肽链上胺基酸残基的离子化羧基与金离子作用，利用糖蛋白部分的水解产物当作电子供应者，进行氧化还原反应后，将金离子还原成金纳米粒子沉积在细菌的表面，形成一细菌包覆金纳米壳层的纳米材料，再利用线性与非线性激光照射包覆金纳米壳层的细菌以产生热从而有效率的杀死细菌；
其中，该含金离子的溶液包含：含金的错离子溶液、吡啶三氯化金溶液或四氯化金钾溶液；
该细菌为大肠杆菌BL21菌株、非抗药性金黄色葡萄球菌或抗药性金黄色葡萄球菌。
2.如权利要求1所述利用自组装的金纳米壳层包覆细菌的纳米材料借助激光产生光热分解与冷光来杀死与追踪细菌的方法，其特征在于：该照射包覆金纳米壳层该细菌其金纳米材料在利用激光照射后，能对包覆以金纳米材料的细菌产生光热分解效果。
3.如权利要求1所述利用自组装的金纳米壳层包覆细菌的纳米材料借助激光产生光热分解与冷光来杀死与追踪细菌的方法，其特征在于：该金纳米壳层包覆细菌的纳米材料在借助激光照射后具有产生冷光的光学特质，得以持续放光而不会产生光漂白，随着照射时间加长，产热效果更为明显，使得细菌死亡越多，所产生的冷光越强，借助此来判断细菌的存活。
4.如权利要求1所述利用自组装的金纳米壳层包覆细菌的纳米材料借助激光产生光热分解与冷光来杀死与追踪细菌的方法，其特征在于：该利用线性激光照射时，该细菌金纳米材料于近红外光区波长范围为700纳米至1400纳米内达到良好的吸收，对该材料利用激发光波长为808纳米的连续线性激光进行照射，使得该材料具有极高效率的升温效果，以光分解效应，来杀死细菌。
5.如权利要求1所述利用自组装的金纳米壳层包覆细菌的纳米材料借助激光产生光热分解与冷光来杀死与追踪细菌的方法，其特征在于：该利用非线性激光照射时，该细菌金纳米材料于近红外光区波长范围为700纳米至1400纳米内达到良好的吸收，对该材料利用激发光波长为720至820纳米的脉冲式非线性飞秒激光照射时，使得该材料具有极高效率的升温效果，以光分解效应，来杀死细菌。
6.如权利要求1所述利用自组装的金纳米壳层包覆细菌的纳米材料借助激光产生光热分解与冷光来杀死与追踪细菌的方法，其特征在于：被包覆金纳米材料的细菌在被产生的热能杀死所产生的冷光，作为追踪与确认伤口上细菌的存活、动向与座落的位置。
7.如权利要求1所述利用自组装的金纳米壳层包覆细菌的纳米材料借助激光产生光热分解与冷光来杀死与追踪细菌的方法，所述糖蛋白部分的水解产物为还原糖的半缩醛羟基或游离态的醛基。
8.如权利要求1所述利用自组装的金纳米壳层包覆细菌的纳米材料借助激光产生光热分解与冷光来杀死与追踪细菌的方法，其特征在于：该含金离子的溶液与细菌混合，能用在动物体内，以产生包覆金纳米壳层的细菌，并以非线性激光照射，在体内产生光热以分解杀死细菌并产生冷光作为细菌存活的追踪。
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