CN106085851A - 基于3d打印的细胞共培养模型及制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于3D打印的非接触式细胞共培养模型，包括用于培养不同细胞的两个培养体系，两个培养体系均由3D打印的中空纤维卷绕而成，中空纤维作为营养物质输送的通道；两个培养体系的至少一部分内外嵌套的卷绕在一起。本发明同时还公开了一种基于3D打印的细胞共培养模型的制造方法，该方法能够制造出实用且可控的细胞共培养模型，生产效率高，经济便捷。本发明可以建立两种细胞非接触式三维共培养体系；将细胞培养液循环灌入共培养体系的通道内，实现细胞动态共培养；本发明共培养模型利用3D打印技术，可以实现细胞和营养输送通道的同时成形，工艺简单，生产效率高。

Description

基于3D打印的细胞共培养模型及制造方法

技术领域

本发明属于生物制造技术领域，尤其是涉及一种基于3D打印的细胞共培养模型及制造方法。

背景技术

体外细胞共培养是将两种或两种以上的细胞共同培养于同一环境中的技术。细胞共培养技术能模拟体内细胞正常活动的微环境，有利于观察细胞与培养环境之间、细胞与细胞之间的相互作用，由于其具有更好地反映体内环境的优点，所以这种方法被广泛应用于现代细胞研究中。

目前细胞共培养的方法主要有直接接触式共培养和非直接接触式共培养。直接接触式共培养是将不同类型的细胞在同一个培养体系中混合在一起进行共同培养，使两种细胞直接接触，并通过旁分泌、自分泌作用产生细胞生产因子等进行相互作用。其缺点是不同类型的细胞发生直接接触，不能彻底分开，不利于后续分析观察。非直接接触式共培养是将两种或两种以上的细胞分别接种在不同的载体上，然后将这些载体置于同一个培养环境中，共培养体系中一者对另者的影响是通过旁分泌的细胞因子相互作用，但两者不接触。由于两种细胞容易分离，便于观察和不影响后续的检测。

另外，细胞在体内是以三维状态生长的，传统的体外二维培养条件下的细胞不能真实反映体内细胞的形态、功能等特点。因而急需开发出一种细胞三维非接触式共培养模型。

发明内容

为了克服现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一种基于3D打印的细胞共培养模型，利用该细胞共培养模型，能够保证不同细胞不直接接触，同时可以实现细胞三维动态培养。

本发明同时还提供了一种基于3D打印的细胞共培养模型的制造方法，该方法能够制造出实用且可控的细胞共培养模型，生产效率高，经济便捷。

一种基于3D打印的非接触式细胞共培养模型，包括用于培养不同细胞的两个培养体系，两个培养体系均由3D打印的中空纤维卷绕而成，中空纤维作为营养物质输送的通道；两个培养体系的至少一部分内外嵌套的卷绕在一起。

本发明的细胞共培养模型采用由生物兼容性凝胶材料制造成的中空纤维体作为细胞的载体，将细胞和凝胶材料混合后一起打印出来，利用打印出的中空纤维自身的微流道实现营养物质的输送。由于水凝胶具有通透性，分子可以透过凝胶间壁进行交换，不需要单独开设交换孔道。本发明凝胶材质为海藻酸钠和氯化钙的交联产物，具有通透性的中空纤维培养体实心部分即为海藻酸钙，形成的结构强度较高。

为了加工方便，在同一回转体的外围打印中空纤维，作为优选，所述非接触式细胞共培养模型具有空间上的轴线，各培养体系的中空纤维在围绕轴线螺旋卷绕的同时还沿轴向延伸，整体上为筒形结构。

所述空间上的轴线即为回转体的旋转轴线。

为了便于相互对照，作为优选，每个培养体系包括依次连通的对照部分、过度部分和共培养部分，其中对照部分带有营养物质输送的进口，共培养部分带有用于营养物质输送的出口；两个培养体系的对照部分相互远离，两个培养体系的共培养部分内外嵌套的卷绕在一起。

每个培养体系中，对照部分和共培养部分的螺旋紧密排列(多圈的螺旋结构中，相邻圈彼此贴靠)，过度部分的螺旋稀疏排列。稀疏排列是相对于紧密排列而言，即并不要求相邻圈彼此贴靠，仅仅是过渡连通而已。

作为优选，同一培养体系中，对照部分、过度部分和共培养部分的轴向长度相同。作为进一步的优选，两个培养体系中的共培养部分在轴向上完全重叠。

本发明还提供了一种基于3D打印的非接触式细胞共培养模型的制造方法，该方法利用同轴喷头辅助的3D打印工艺来制造含有通道的培养模型，可以实现细胞和通道的同时打印，以实现非接触式三维细胞共培养。

一种基于3D打印的非接触式细胞共培养模型的制造方法，包括：利用可轴向移动的第一同轴喷头在旋转的回转体外围以中空纤维的形式打印出一个培养体系；利用可轴向移动的第二同轴喷头在旋转的回转体外围以中空纤维的形式打印出另一个培养体系，且后一培养体系的共培养部分包络在前一培养体系的共培养部分的外周；完成打印后去除回转体，并对两个培养体系进行固化处理。

所述第一同轴喷头和第二同轴喷头均包括同轴嵌套的内喷头和外喷头，其中内喷头用于输出形成中空纤维的带有培养细胞的海藻酸钠水溶液；外喷头用于输出支撑中空纤维的氯化钙水溶液。

内喷头和外喷头均可依照现有技术连接相应的注射器和注射泵。

本发明制造方法具体步骤为：

(1)制备海藻酸钠水溶液和氯化钙水溶液：将灭菌后的生化级海藻酸钠粉末和去离子水混合，制备成一定浓度的海藻酸钠水溶液；将灭菌后的生化级氯化钙粉末和去离子水混合，制备成一定浓度的氯化钙水溶液；

(2)选定所需要共培养的细胞(包括细胞Ⅰ和细胞Ⅱ)，在培养瓶里培养后分别与海藻酸钠溶液混合均匀，制备得到海藻酸钠水溶液细胞Ⅰ的混合物，以及海藻酸钠水溶液细胞Ⅱ的混合物；

作为优选，步骤(1)(2)中所述海藻酸钠水溶液细胞Ⅰ的混合物中海藻酸钠水溶液的质量百分比浓度为2％-4％，流速为0.5-1.5ml/min；所述氯化钙水溶液的质量百分比浓度为2％-4％，流速为1-4ml/min。选择该技术方案时，材料粘度适合打印，打印得到的细胞共培养模型强度较好，生物兼容性较好。

(3)将所述海藻酸钠细胞Ⅰ的混合物加入到与第一同轴喷头的外喷头相连的注射器中；将所述海藻酸钠细胞Ⅱ的混合物加入到与第二同轴喷头的外喷头相连的注射器中；将所述氯化钙溶液分别加入到与两个同轴喷头的内喷头相连的注射器中；

其中，外喷头和内喷头组成整体的同轴喷头，所述外喷头和内喷头同轴设置，所述内喷头的出料端伸入到外喷头的喷腔内且继续延伸至外喷头的出料端平齐；通过将四个注射器放置在四通道注射泵上，利用注射泵实现对外喷头和内喷头流量的控制；

(4)3D打印共培养体系

设置同轴喷头的出料速度、运行参数，控制外喷头和内喷头按照设定参数打印，得到未完全反应的中空纤维，且控制相邻中空纤维的间距使相邻中空纤维线与线融合或者分离，完成共培养体系中参照部分、过度部分、共培养部分的打印；

其中，外喷头和内喷头的出料速度主要利用四通道注射泵控制，以保证得到含有细胞的未完全反应的中空纤维；

运行参数一般是指同轴喷头的移动速度和回转体的转动速度，这些参数均可以通过3D打印装置直接控制；

一般情况下，同轴喷头将物料打印至回转体上，中空纤维均匀缠绕在回转体上；同轴喷头一般与X轴驱动机构和Y轴驱动机构连接，通过X轴驱动机构和Y轴驱动机构可分别实现同轴喷头沿x轴方向的移动和沿y轴方向的移动；回转体一般与A回转轴驱动机构连接，通过A回转轴驱动机构实现回转体旋转运动；

回转体的材料选用玻璃或者不锈钢，便于脱模；

通过控制中空纤维线与线之间的距离，保证未完全反应的相邻中空纤维相互融合或者分离；

打印过程中，凝胶的出料速度，回转体的转速和同轴喷头的移动速度必须匹配才能形成均匀一致的共培养模型。具体的工艺参数可按照以下公式得到：

$n=\frac{v_0}{\mathrm{\π}\·d}---\left(1\right)$

$v=\frac{S\·v_0}{\mathrm{\π}\·d}---\left(2\right)$

其中，v₀是凝胶出料速度，d是回转体直径，S是相邻凝胶纤维的间距，n是回转体的转速，v是同轴喷头移动速度；

按照上述原则设置好参数后，具体打印过程如下：

(ⅰ)利用第一同轴喷头打印一个培养体系的对照部分；

其中，为保证相邻中空纤维融合，相邻中空纤维的间距小于单个中空纤维的外径，大于单个中空纤维的内径；

(ⅱ)利用第一同轴喷头打印过度部分；

其中，为保证相邻中空纤维分离，相邻中空纤维的间距大于于单个中空纤维的外径；

(ⅲ)利用第一同轴喷头打印共培养部分；

其中，为保证相邻中空纤维融合，相邻中空纤维的间距小于单个中空纤维的外径，大于单个中空纤维的内径；

(ⅳ)利用第二同轴喷头打印另一个培养体系的共培养部分；

其中，为保证相邻中空纤维融合，相邻中空纤维的间距小于单个中空纤维的外径，大于单个中空纤维的内径；打印该共培养部分的起始端要和前一培养体系的共培养部分的起始端相同；

(ⅴ)利用第二同轴喷头打印过度部分；

其中，为保证相邻中空纤维分离，相邻中空纤维的间距大于单个中空纤维的外径；

(ⅵ)利用第二同轴喷头打印对照部分；

其中，为保证相邻中空纤维融合，相邻中空纤维的间距小于单个中空纤维的外径，大于单个中空纤维的内径；

(5)去除回转体模板，将打印的细胞共培养模型的凝胶结构浸泡在氯化钙溶液中，完全反应得到具有一定强度的结构。

本发明的细胞共培养模型实际使用时，两个细胞培养体系分别与蠕动泵和盛放细胞培养液的储液罐相连，构成另个独立又相互影响的动态循环细胞培养系统，从而实现调控共培养体系中目标细胞的多种行为。

本发明的基于3D打印的细胞共培养模型，与现有技术相比较，具有以下优点：

(1)本发明可以建立两种细胞非接触式三维共培养体系；

(2)本发明可以将细胞培养液循环灌入共培养体系的通道内，实现细胞动态共培养；

(3)本发明共培养模型利用3D打印技术，可以实现细胞和营养输送通道的同时成形，工艺简单，生产效率高；

(4)本发明利用生物兼容性凝胶材料作为细胞打印和培养的载体，材料获取容易，避免使用昂贵的材料和工艺。

附图说明

图1为本发明的基于3D打印的细胞共培养模型的结构示意图。

图2为图1所示细胞共培养模型的剖面俯视图。

图3为本发明的细胞共培养模型的3D打印过程示意图。

图4为本发明的3D打印工艺所需要的装置结构示意图。

图5为本发明细胞共培养模型使用状态的结构示意图。

上述图中：1-培养体系，1a-对照部分，1b-过度部分，1c-共培养部分,2-培养体系，2a-对照部分，2b-过度部分，2c-共培养部分，3-回转体，4-第二同轴喷头，5-第一同轴喷头，6-注射器，7-注射器，8-注射器，9-注射器，10-四通道注射泵，11-计算机，12蠕动泵，13-储液罐，14-储液罐，15-蠕动泵，16-组织培养箱。

具体实施方式

如图1、图2所示，本发明的基于3D打印的细胞共培养模型具体的技术方案如下：

基于3D打印的细胞共培养模型，包括用于培养细胞Ⅰ的培养体系1和用以培养细胞Ⅱ的培养体系2；培养体系1包括对照部分1a、过度部分1b、共培养部分1c；培养体系2包括对照部分2a、过度部分2b、共培养部分2c。

参见图中箭头方向，对照部分1a含有用于营养物质输送的进口；共培养部分1c含有用于营养物质输送的出口。对照部分2a含有用于营养物质输送的进口；共培养部分2c含有用于营养物质输送的出口。

图4为本发明的3D打印工艺所需要的装置结构示意图。整个装置包括：打印细胞Ⅰ凝胶层的同轴喷头5，打印细胞Ⅱ凝胶层的同轴喷头4，与同轴喷头4连接的盛放氯化钙溶液的注射器6，与同轴喷头4连接的盛放海藻酸钠细胞Ⅱ混合物的注射器7，与同轴喷头5连接的盛放氯化钙溶液的注射器8，与同轴喷头5连接的盛放海藻酸钠细胞Ⅰ混合物的注射器9，四通道注射泵10，回转体3，计算机11。

同轴喷头4、同轴喷头5固定在水平驱动机构上，水平驱动机构一般包括X轴驱动机构和Y轴驱动机构，在水平驱动机构的驱动下，同轴喷头4、同轴喷头5能够实现在x、y轴方向上的往复运动，以实现每层机构的打印。

图中x轴水平布置，y轴竖直布置。

回转体3作为共培养模型结构成形的模板，固定在回转轴驱动机构上，在回转轴驱动机构的驱动下，回转体3能够实现在沿箭头A方向的旋转运动，以实现整个结构的打印。

四通道注射泵10通过设置相应的流速以实现海藻酸钠细胞混合物和氯化钙溶液的供液。计算机11通过相应的控制程序控制注射泵的运动和X轴平移、Y轴平行、以及A方向旋转运动。

上述的X轴驱动机构、Y轴驱动机构均可采用现有的驱动机构，一般包括电机、联轴器、电机丝杠、与电机丝杠螺纹配合的滑块以及对滑块进行导向、将电机丝杠转化为滑块的平动的导向部件或者导向结构。X轴驱动机构一般固定在Y轴驱动机构的滑块上，实现对同轴喷头x轴和y轴移动方向的控制。回转轴驱动机构也可采用现有的驱动机构，一般包括电机、联轴器、电机座、轴承，实现回转体的旋转运动。在X轴驱动机构、Y轴驱动机构驱动下，同轴喷头完成中空纤维线的打印，在回转轴驱动机构的配合下，完成管状结构的打印。

结合具体的材料及相应的参数对本发明做详细描述。本实施例中细胞Ⅰ为成骨细胞，细胞Ⅱ为破骨细胞，探究成骨细胞和破骨细胞间的相互作用。

本实例条件下形成的中空纤维的平均外径为1113μm，内径为817μm，壁厚为148μm。回转体的直径为6mm。

结合本发明的打印过程示意图3对本发明做详细描述，具体实施步骤如下：

(1)制备质量浓度为8％的海藻酸钠溶液：称取一定量的生化级海藻酸钠粉末，放在紫外灯下照射灭菌半小时，按比例将海藻酸钠粉末和去离子水混合，磁力搅拌机搅拌24小时，温度设置为60℃，转速为120rpm。待混合均匀后得到质量浓度为8％的海藻酸钠溶液；

(2)制备质量浓度为2％的氯化钙溶液：称取一定量的生化级氯化钙粉末，放在紫外灯下照射灭菌半小时，按比例将氯化钙粉末和去离子水混合，磁力搅拌机搅拌1小时，温度设置为25℃，转速为120rpm。待混合均匀后得到质量浓度为2％的氯化钙溶液；

(3)将培养在培养瓶中的成骨细胞和破骨细胞先用PBS冲洗，再用胰酶消化下来，得到的细胞悬浮液在离心机上离心，离心后去掉上清液，按比例加入DMEM培养基混合均匀后得到细胞浓度为2×10⁶个/ml；

(4)将步骤(1)中的8％海藻酸钠溶液分别与步骤(3)中的2×10⁶个/ml的成骨细胞溶液和2×10⁶个/ml的破骨细胞溶液按体积比1:1混合均匀，最终分别得到海藻酸钠成骨细胞混合物和海藻酸钠破骨细胞混合物，其中海藻酸钠溶液的浓度为4％，细胞的浓度为1×10⁶个/ml；

(以下步骤亦结合图1，图4的标记叙述)。(5)将步骤(4)中配置好的含有成骨细胞的4％的海藻酸钠溶液倒入与同轴喷头5外喷头相连的注射器9中；将步骤(2)中配置好的2％的氯化钙溶液倒入与同轴喷头5内喷头相连的注射器8中；将步骤(4)中配置好的含有破骨细胞的4％的海藻酸钠溶液倒入与同轴喷头4外喷头相连的注射器7中；将步骤(2)中配置好的2％的氯化钙溶液倒入与同轴喷头4内喷头相连的注射器6中。并将四个注射器均放置在双通道注射泵10上；

(6)利用四通道注射泵10控制同轴喷头4和5外喷头和内喷头的液体的流动速度，均设置为1ml/min，得到含有细胞的未完全反应的中空纤维；

(7)利用同轴喷头5打印用于培养成骨细胞的培养体系1的对照部分1a(L₁段)：同轴喷头5平行于X轴直线运动，线距设置为1mm，回转体3转动速度设置为42r/min,X轴驱动运动速度设置为46mm/min。运行程序后得到融合的成骨细胞凝胶结构；

(8)利用同轴喷头5打印用于培养成骨细胞的培养体系1的过度部分1b(L₂段)：同轴喷头5平行于X轴直线运动，线距设置为4mm，回转体3转动速度设置为42r/min,X轴驱动运动速度设置为184mm/min，。运行程序后得到分离的成骨细胞凝胶结构；

(9)利用同轴喷头5打印用于培养成骨细胞的培养体系1的共培养部分1c(L₃段)：同轴喷头5平行于X轴直线运动，线距设置为1mm，回转体3转动速度设置为42r/min,X轴驱动运动速度设置为46mm/min，。运行程序后得到融合的成骨细胞凝胶结构；

(10)利用同轴喷头4打印用于培养破骨细胞的培养体系2的共培养部分2c(L₃段)：同轴喷头4平行于X轴直线运动，线距设置为1mm，回转体3转动速度设置为42r/min,X轴驱动运动速度设置为46mm/min，。运行程序后得到融合的破骨细胞凝胶结构；

(11)利用同轴喷头4打印用于培养破骨细胞的培养体系2的过度部分2b(L₄段)：同轴喷头4平行于X轴直线运动，线距设置为4mm，回转体3转动速度设置为42r/min,X轴驱动运动速度设置为184mm/min，。运行程序后得到分离的破骨细胞凝胶结构；

(12)利用同轴喷头4打印用于培养成骨细胞的培养体系2的对照部分2a(L₅段)：同轴喷头4平行于X轴直线运动，线距设置为1mm，回转体3转动速度设置为42r/min,X轴驱动运动速度设置为46mm/min。运行程序后得到融合的破骨细胞凝胶结构；

(13)去除回转体3，将打印的凝胶结构浸泡在氯化钙溶液中，完全反应得到具有一定强度的细胞共培养模型；

如图5所示，将细胞共培养模型放到组织培养箱16里，成骨细胞培养体系与蠕动泵12和盛放成骨细胞培养液的储液罐13相连，培养液从成骨细胞培养体系的进口进入，从其出口流出，构成动态循环供液系统；破骨细胞培养体系与蠕动泵15和盛放成骨细胞培养液的储液罐14相连，培养液从破骨细胞培养体系的进口进入，从其出口流出，构成动态循环供液系统。

Claims (7)

1.一种基于3D打印的非接触式细胞共培养模型，包括用于培养不同细胞的两个培养体系，其特征在于，两个培养体系均由3D打印的中空纤维卷绕而成，中空纤维作为营养物质输送的通道；两个培养体系的至少一部分内外嵌套的卷绕在一起。

2.如权利要求1所述的基于3D打印的非接触式细胞共培养模型，其特征在于，所述非接触式细胞共培养模型具有空间上的轴线，各培养体系的中空纤维在围绕轴线螺旋卷绕的同时还沿轴向延伸，整体上为筒形结构。

3.如权利要求2所述的基于3D打印的非接触式细胞共培养模型，其特征在于，每个培养体系包括依次连通的对照部分、过度部分和共培养部分，其中对照部分带有营养物质输送的进口，共培养部分带有用于营养物质输送的出口；两个培养体系的对照部分相互远离，两个培养体系的共培养部分内外嵌套的卷绕在一起。

4.如权利要求3所述的基于3D打印的非接触式细胞共培养模型，其特征在于，同一培养体系中，对照部分、过度部分和共培养部分的轴向长度相同。

5.如权利要求4所述的基于3D打印的非接触式细胞共培养模型，其特征在于，两个培养体系中的共培养部分在轴向上完全重叠。

6.一种基于3D打印的非接触式细胞共培养模型的制造方法，其特征在于，包括：利用可轴向移动的第一同轴喷头在旋转的回转体外围以中空纤维的形式打印出一个培养体系；利用可轴向移动的第二同轴喷头在旋转的回转体外围以中空纤维的形式打印出另一个培养体系，且后一培养体系的共培养部分包络在前一培养体系的共培养部分的外周；完成打印后去除回转体，并对两个培养体系进行固化处理。

7.如权利要求6所述的基于3D打印的非接触式细胞共培养模型的制造方法，其特征在于，所述第一同轴喷头和第二同轴喷头均包括同轴嵌套的内喷头和外喷头，其中内喷头用于输出形成中空纤维的带有培养细胞的海藻酸钠水溶液；外喷头用于输出支撑中空纤维的氯化钙水溶液。