JP2021505153A - ３ｄ細胞構築物を製造するためのバイオプリンタ - Google Patents

Abstract

三次元（３Ｄ）細胞構築物を作製するためのバイオプリンタであって、流体試料を保持するための１つまたは複数の保持リザーバと；試料容器を保持し、３Ｄ細胞構築物が印刷される基板を支持するためのプリントステージと；１つまたは複数の保持リザーバと流体連通する試料装填システムであって、試料容器から試料を１つまたは複数の保持リザーバに装填するように構成された試料装填システムと；試料装填システムと流体連通するポンプであって、試料を試料容器から引き出し、試料を１つまたは複数の保持リザーバに送るように構成されたポンプと；１つまたは複数のリザーバと流体連通する液滴分注システムであって、１つまたは複数のリザーバからの試料液滴をプリントステージによって支持された基板上に印刷するように構成された液滴分注システムと、を備えるバイオプリンタ。

Description

本技術は、三次元（３Ｄ）細胞構築物を作製するためのバイオプリンタ、３Ｄ細胞構築物をバイオプリントするためのプロセス、およびバイオプリントされた３Ｄ細胞構築物に関する。

関連出願
本出願は２０１７年１２月８日に出願されたオーストラリア仮特許出願第２０１７９０４９４６号に基づき、その優先権を主張し、その内容は、その全体が参照により組み込まれる。

インビトロ細胞生物学の働き手は、初代または不死化細胞をプラスチックまたはガラス表面上に単に平板培養する細胞培養である。細胞増殖、分化および外部刺激に対する応答におけるような多くの細胞特性は、二次元（２Ｄ）およびインビボで見出される３Ｄ環境における細胞に対して基本的に異なっている。特に、薬物開発および精密医療プログラムのために、３Ｄ動物環境をより良く反映し、したがって失敗した動物実験の数を制限する細胞培養条件は、非常に有利である。

例えば、癌細胞生物学において、３Ｄモデルは、２Ｄ細胞培養モデルと比較して、低酸素領域、化学的および生物学的因子の勾配分布および血管新生促進性および多剤耐性蛋白質の発現を含むより多くのインビボ腫瘍様の特徴を示す。

この理由のために、３Ｄ多細胞モデルは一般に、より一般的な２Ｄ細胞培養よりも、インビボ系の優れたモデルとみなされる。

さらに、多細胞生物学におけるほとんどの細胞構造は三次元的に組織化されている。多数の研究が、３Ｄバイオプリンティング技術を用いた細胞のプリンティングを報告している（（Ｍｕｒｐｈｙ ａｎｄ Ａｔａｌａ、２０１４）に概説されている）。

例えば、ＥｎｖｉｓｉｏｎＴＥＣによる３Ｄ−Ｂｉｏｐｌｏｔｔｅｒ（登録商標）、ＧｅＳｉＭによるＢｉｏＳｃａｆｆｏｌｄｅｒ、ＣｅｌｌｉｎｋによるＢｉｏ Ｘ、ＲｅｇｅｎＨＵによるＢｉｏＦａｃｔｏｒｙ（登録商標）、ＢｉｏＢｏｔｓによるＢｉｏＢｏｔ ２など、多くの市販の３Ｄバイオプリンタが存在する。市販の３Ｄバイオプリンタは、マイクロ押出、熱インクジェット又は圧電インクジェット技術に基づくものが最も一般的である。市販の３Ｄバイオプリンタは最も一般的にはプリンタに物質を装填するためにカートリッジ（例えば、Ｎｏｒｄｓｏｎ Ｏｐｔｉｍｕｍ（登録商標）Ｓｙｒｉｎｇｅ Ｂａｒｒｅｌｓ)を利用する。これらのカートリッジの各々は、多くの場合、単一のプリントヘッドに結合される。無菌性の維持はカートリッジの充填、取扱い、取り付けおよび取り外しの間に困難である。

３Ｄバイオプリンティングアプリケーションのための臓器または組織構造の３Ｄモデルの設計は、主に以下に基づいている：
１) データ収集のための非侵襲的な医用画像技術（例えば、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）と磁気共鳴画像（ＭＲＩ））；および
２) コンピュータ支援設計およびコンピュータ支援製造（ＣＡＤ−ＣＡＭ）ツールおよび情報デジタル化、３Ｄレンダリングモデルの生成、および２Ｄ断面画像の生成のための数学的モデリング（Ｍｕｒｐｈｙ ａｎｄ Ａｔａｌａ， ２０１４； Ｈｏｒｎ ａｎｄ Ｈａｒｒｙｓｓｏｎ， ２０１２）。

創薬、個別化医療および一般細胞生物学へのスケーラブルで再現性があり、費用対効果の高い方法で３Ｄ細胞培養モデルの適用を容易にするツールおよび技術が必要とされている。

本発明者らは、インビトロ３Ｄ細胞培養アッセイおよびそのアレイを作製するためのデバイス、システムおよび方法を開発した。

概要
第１の態様では、本発明は三次元（３Ｄ）細胞構築物を製造するためのバイオプリンタを提供するものであり、前記バイオプリンタは、以下：
流体試料を保持するための１つまたは複数の保持リザーバ；
試料容器を保持し、３Ｄ細胞構築物が印刷される基板を支持するためのプリントステージ；
前記１つまたは複数の保持リザーバと流体連通する試料装填システムであって、試料を試料容器から前記１つまたは複数の保持リザーバに装填するように構成された試料装填システム；
試料装填システムと流体連通するポンプであって、試料を試料容器から引き出し、前記試料を前記１つまたは複数の保持リザーバ内に送り込むように構成されたポンプ；および、
前記１つまたは複数のリザーバと流体連通する液滴分注システムであって、前記１つまたは複数のリザーバからの試料液滴を前記プリントステージによって支持された基板上に印刷するように構成された液滴分注システム、を含む。

一実施形態では、バイオプリンタが１つまたは複数の保持リザーバ、プリントステージ、ホルダ、試料装填システム、ポンプ、および液滴分注システムを包含するハウジングをさらに備える。

一実施形態ではバイオプリンタがハウジング内に配置された空気流システムをさらに備え、空気流システムはハウジング内に層流空気流を誘導するように構成される。

一実施形態によると、空気流システムは、ハウジング内に層流空気流を誘導するファンを備える

一実施形態では、空気流システムが少なくとも１つの空気フィルタを含む。

一実施形態では試料装填システムが試料容器内に挿入するための針を備え、ポンプは針が試料容器内に挿入されると、針を通して流体を引き込むように構成される。

一実施形態では、バイオプリンタが針に連結された第１の位置決めユニットをさらに備え、第１の位置決めユニットは針を試料容器内に挿入し、針を試料容器から引き抜くように構成される。

一実施形態では、バイオプリンタがトラックを有する第２の位置決めユニットをさらに備え、第２の位置決めユニットは針および液滴分注システムに結合され、第２の位置決めユニットのトラックに沿って針および液滴分注システムを移動させるように構成される。

一実施形態によると、バイオプリンタはトラックを有する第３位置決めユニットをさらに含み、第３位置決めユニットは、プリントステージに結合され、プリントステージを第３位置決めユニットのトラックに沿って移動させるように構成されている。

一実施形態によると、第２位置決めユニットのトラックは、第３位置決めユニットのトラックに対して略垂直に延びる。

一実施形態では、バイオプリンタが複数の保持リザーバをさらに備え、試料装填システムは試料容器から複数のリザーバのうちの任意の１つに試料を装填するように構成される。

一実施形態では、試料容器が複数の試料ウェルを有するトレイであり、試料ウェルは試料を収容するように構成され、試料装填システムは試料ウェルのいずれか１つから保持リザーバのいずれか１つに試料をロードするように構成される。

一実施形態では、バイオプリンタが試料装填システムから廃棄材料を受け取るように構成された廃棄物容器をさらに備える。

一実施形態では、廃棄物容器はトレイ上に提供される。

一実施形態では、ポンプが保持リザーバのうちの１つから試料を引き出し、試料装填システムから試料を送り出すように構成される。

一実施形態では、バイオプリンタが各保持リザーバ内の圧力を調整するために、各保持リザーバに流体連通して結合された圧力レギュレータをさらに備える。

一実施形態では、バイオプリンタがポンプ、試料装填システム、各保持リザーバ、および圧力レギュレータと流体連通するセレクタバルブをさらに備え、セレクタバルブは試料装填システムおよび各保持リザーバに流体連通するポンプを選択的に連結するように構成される。

一実施形態によると、圧力レギュレータは、圧縮空気供給源に流体連通して取り外し可能に連結される。

第２の態様では、本発明が第１の態様のバイオプリンタを使用して１つまたは複数の試料の液滴を堆積させることを含む、三次元細胞構築物を作製する方法を提供する。

第３の態様において、本発明は、三次元細胞構築物を製造する方法を提供するものであって、該方法は、以下：
第１の態様のバイオプリンタを提供すること；
プリントステージへの基板を提供すること；
試料容器をプリントステージに提供することであって、試料容器は、試料を含み；
試料を試料装填システムによって保持リザーバの１つに装填すること；および、
液滴分注システムを使用して保持リザーバから基板上に試料を印刷して、三次元細胞構築物を形成すること、を含む。

また、三次元細胞構築物を作製するためのバイオプリンタも開示されており、該バイオプリンタは、以下：
試料を試料容器から保持リザーバに装填するための試料装填システム；
試料を保持リザーバに導くための保持リザーバと流体連通するセレクタバルブ；
保持リザーバと流体連通する液滴分注システムであって、保持リザーバから基板上に試料液滴を印刷するように適合された液滴分注システム；
試料装填システム、選択バルブ、および液滴分注システムの動作を制御するための制御システム；
層流空気流システム；および、試料装填システム、セレクタバルブ、液滴分注システムおよび層流空気流システムを包含するハウジング、を含む。

一実施形態では、試料装填システムが複数の試料容器と、各容器からの試料を保持するための複数の保持リザーバとを備える。

一実施形態では、複数の試料容器が取り外し可能な試料トレイに収容される。

一実施形態では、取り外し可能な試料トレイが試料容器をアレイ状に保持するための１０個の位置を含む。

一実施形態では、試料容器がキャップおよび隔壁を有するバイアルである。

一実施形態では、取り外し可能な試料トレイが試料装填システムをフラッシングすることからの廃棄物を受け取るための廃棄物容器をさらに含む。

一実施形態では、取り外し可能な試料トレイが試料装填システム、セレクタバルブ、および液滴分注システムを洗浄するための洗浄容器をさらに含む。

一実施形態では、試料装填システムが試料容器内に挿入するための針と、試料容器内の試料を保持リザーバに移送するために針に動作可能に結合されたポンプとを備える。

一実施形態によると、ポンプは容積型ポンプである。

一実施形態では、ポンプが蠕動ポンプ、ダイアフラムポンプ、またはシリンジポンプである。

一実施形態では、ポンプが容器内の試料の再懸濁のために動作可能に可逆的である。

一実施形態では、試料装填システムが針に動作可能に結合された第１の位置決めユニットをさらに含み、第１の位置決めユニットは針を試料容器と穿刺係合し、および試料容器と穿刺係合しないように位置決めする。

一実施形態では、試料容器中の試料が細胞懸濁液、水、エタノール、バイオインク、活性化剤、洗浄溶液、フラッシング流体、細胞培養培地、または溶液中に分散された薬物であり得る。

一実施形態では、試料容器内の試料は無菌である。

一実施形態によると、試料装填システムは針に動作可能に結合された第２の位置決めユニットをさらに備え、第２の位置決めユニットは針を２次元空間に位置決めする。

一実施形態では、保持リザーバが細長いチューブである。

一実施形態では、細長いチューブがコイル状に巻かれ、チャンバ内に収容される。

一実施形態では、保持リザーバが可撓性チューブのスプールで形成される。

一実施形態では、可撓性チューブがポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）チューブからなる。

一実施形態では、液滴分注システムが複数の保持リザーバに動作可能に結合され、各保持リザーバから基板上に試料液滴を分配するように適合された少なくとも１つのプリントヘッドを備える。

一実施形態では、少なくとも１つのプリントヘッドがバルブのアレイである。

一実施形態によると、各バルブはマイクロソレノイドバルブである。

一実施形態では、試料がマイクロソレノイドバルブの上流の保持リザーバに保存される。

一実施形態では、各保持リザーバがそれぞれのプリントヘッドを有する。

一実施形態では、各保持リザーバが圧力レギュレータに結合される。

一実施形態によると、圧縮空気供給がレギュレータマニホールドに連結される。

一実施形態によると、各マイクロソレノイドバルブは、各圧力レギュレータに連結される。

一実施形態によると、液滴分注システムはレギュレータマニホールド内に複数の圧力レギュレータ、少なくとも１つのチェックバルブを含み、圧縮された空気供給は、レギュレータマニホールド内の各圧力レギュレータに動作可能に連結される。

一実施形態によると、圧力レギュレータは、セレクタバルブに連結されている。

一実施形態では、試料が試料装填システムを使用して試料容器から保持リザーバ内に取り込まれ、液滴分注システムの圧力レギュレータおよび試料装填システムのセレクタバルブが保持リザーバからプリントヘッドに試料を移動させるように動作する状態で、液滴分注システムの動作を介して保持リザーバからプリントヘッド内に取り込まれる。

一実施形態では、液滴分注システムが基板を支持するためのプリントステージをさらに備える。

一実施形態では、基板はマルチウェルプレートである。

一実施形態によると、液滴分注システムはプリントステージに動作可能に連結された第３位置決めユニットをさらに含み、第３位置決めユニットは、プリントステージを二次元空間内に位置決めする。

一実施形態では、制御システムがユーザ入力から試料容器内の試料の識別情報を記録する。

一実施形態では、制御システムがバイオプリンタを動作させるためのプログラムされた命令を含む非一時的なコンピュータ可読媒体を備える。

一実施形態では、非一時的コンピュータ可読媒体がバイオプリンタとは別個に配置され、バイオプリンタに動作可能に接続可能である。

一実施形態によると、層流システムは、ハウジング内に空気を吸い込むためのファンと、空気を流入させるための空気入口と、フィルタと、空気出口とを備える。

一実施形態では、ファンは遠心ファンである。

一実施形態では、ファンがプリントステージの下からハウジングの前へ、試料装填システムの周りで、１つまたは複数のフィルタを通って、ハウジングの外に空気を引き込む。

一実施形態によると、ファンは、バイオプリンタハウジングのフロント・アクセス・ドアを通して空気を吸引する。

一実施形態では、層流システムが２つのフィルタを備え、１つは排気用であり、１つはプリントステージに向かって空気を受け取るためのものである。

一実施形態によると、各フィルタは高効率微粒子空気（ＨＥＰＡ）フィルタである。

一実施形態では、各フィルタが空気流の約５０％を受け取る。

一実施形態では、ハウジングがユーザによるバイオプリンタの内部へのアクセスを可能にするためのヒンジドアを含む。

一実施形態では、取り外し可能な試料トレイがドアを介してバイオプリンタに装填可能である。

一実施形態では、取り外し可能な試料トレイは蓋を有する。

一実施形態では、ハウジングが試料トレイの蓋を受け入れるための凹部と、マルチウェルプレートのための蓋とを有する。

一実施形態では、試料容器がバイオプリンタ内部の取り外し可能な試料トレイに装填可能である。

第２の態様では、第１の態様によるバイオプリンタを使用して試料の複数の液滴を堆積させることによって、少なくとも１つの三次元細胞構築物を作製する方法が提供される。

本明細書を通じて、文脈が別途必要としない限り、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」という用語または「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」または「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」といった変形は、明示された要素、整数または工程、あるいは要素、整数または工程の群を包含することを意味するものとして理解されるが、他の要素、整数または工程、あるいは要素、整数または工程の群の排除を意味するものではない。

本明細書に含まれている文書、行為、材料、装置、物品等のいかなる議論も、単に本発明の文脈を提供する目的のためである。これらの事項のいずれかまたは全てが、先行技術の基礎の一部を形成するか、または本明細書の各請求項の優先日前に存在したように、本発明に関連する分野における共通の一般知識であったことを容認するものと解釈されるべきではない。

本発明をより明確に理解するために、以下の図面および実施例を参照して好ましい実施形態を説明する。

図１は３Ｄ細胞構築物を作製するためのバイオプリンタの背面斜視図であり、試料装填システムを図示する；

図２は、図１の試料装填システムの正面斜視図である；

図３は試料装填システムの正面斜視図であり、各々が試料を収容する複数の試料容器を示す；

図４は、図３の試料装填システムの背面斜視図である；

図５は、試料装填システムで使用される取り外し可能な試料トレイの斜視図である；

図６は、層流空気流システムが取り付けられたバイオプリンタの正面斜視図である；

図７は、層流空気流システムのみを示すバイオプリンタの背面斜視図である；

図８は、図７の層流空気流システムのみを示すバイオプリンタの背面斜視図である；

図９および図１０は、層流空気流システムの空気流路を示す透明パネルを備えたバイオプリンタを示す； 図９および図１０は、層流空気流システムの空気流路を示す透明パネルを備えたバイオプリンタを示す；

図１１は、液滴分注システムおよび試料装填システムのための位置決めユニットが図示されたバイオプリンタの上面斜視図である；

図１２は、複数の保持リザーバ及び圧縮空気供給システムを備えたバイオプリンタの側面斜視図である；

層流空気流システムが設置された図１１のバイオプリンタの正面斜視図である；

図１４は、図１３のバイオプリンタの背面斜視図である；

図１５は、単一の保持リザーバを有するバイオプリンタの背面斜視図である；

図１６は、組み立てられたバイオプリンタの正面斜視図である；

図１７は、図１６のバイオプリンタの背面斜視図である；

図１８は、バイオプリンタの構成要素のフローチャート図である；

図１９は、層流空気流システムの構成要素間の空気流路を示すバイオプリンタの各構成要素の側面図である；

図２０は、制御システムコンピュータに動作可能に関連付けられたバイオプリンタのフローチャート図である；

図２１は、三次元細胞構築物設計を示す、コンピュータ上に実装された制御システムソフトウェアの例示的なグラフィカルユーザインタフェースである；

図２２はマルチウェルプレートにおける３Ｄ細胞構築物の印刷を示す、コンピュータ上に実装された制御システムソフトウェアの例示的なグラフィカルユーザインタフェースであり、そして

図２３は、バイオプリンタと一体化された３Ｄ細胞構築物を設計するフローチャートの概略図である。

実施形態の説明
図面に示されるように、３Ｄ細胞構築物を作製するためのバイオプリンタ１０が本明細書に開示される。バイオプリンタ１０は、試料容器１１０から試料１００を保持リザーバ１２０内に装填するための試料装填システム２０と；試料１００を保持リザーバ１２０内に導くための保持リザーバ１２０と流体連通するセレクタバルブ３０と；保持リザーバ１２０と流体連通する液滴分注システム２５と；保持リザーバ１２０から基板１２５上に試料液滴１０１を印刷するように適合された液滴分注システム２５と；試料装填システム２０、セレクタバルブ３０、および液滴分注システム４０の動作を制御するための制御システム４０と；層流空気流システム５０と；試料装填システム２０、セレクタバルブ３０、液滴分注システム４０、および層流空気流システム５０を包含するハウジング６０とを備える。

試料装填システム
図１〜４を参照すると、試料装填システム２０は、１つまたは複数の試料容器１１０に含まれる試料１００にアクセスするように適合され、かつ、１つまたは複数の保持リザーバ１２０と流体連通している。保持リザーバ１２０は、試料容器１１０からの試料１００を保持するように構成される。試料容器１１０は、試料の貯蔵および輸送のための実験室で使用されるゴム隔壁１１３を含むキャップ１１２を有する標準クロマトグラフィーバイアル１１１であり得る。バイアル１１１は、典型的にはガラス、プラスチック、またはバイアル１１１内の無菌環境を維持することができる任意の適切な材料から製造される。バイアル１１１は様々な試料１００を収容するために複数のサイズで作製され、典型的には約５ｍｌを貯蔵するより小さなバイアルおよび約１０ｍｌを貯蔵するより大きなバイアルである。試料装填システム２０は、バイオプリンタ１０によって印刷される３Ｄ細胞構築物に応じて、１つの試料容器１１０、または複数の試料容器１１０を含んでもよい。

各保持リザーバ１２０は、試料容器１１０のうちの１つから受け取った試料１００を格納するように適合される。各保持リザーバ１２０は、リザーバハウジング１２１内に巻き付けられた細長いチューブ１２２から製造される。細長いチューブ１２２は、コイル状に巻かれ、ハウジング１２１内に収容され得る。細長いチューブ１２２は、可撓性チューブ１２２のスプールである。特定の実施形態では、可撓性チューブ１２２がポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）チューブ、またはフッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）、エチルトリフルオロエチレン（ＥＴＦＥ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、シリコーン、熱可塑性エラストマー（ＴＰＥ）、またはステンレス鋼などの他の適切な材料から作製される。代替の実施形態では、各保持リザーバ１２０が試料１００を格納するための入口、出口、および格納キャビティを有する容器である。バイオプリンタ１０は、１つまたは複数の個々の異なる試料１００に対応する１つまたは複数の保持リザーバ１２０を含むことができる。

各試料容器１１０中の試料１００は、細胞懸濁液、水、エタノール、バイオインク、活性化剤、洗浄溶液、フラッシング流体、細胞培養培地、または溶液中に分散された薬物であり得、これらは以下に詳細に記載される。試料容器１１０内に貯蔵された試料１００は、無菌であってもなくてもよい。

試料装填システム２０は各試料バイアル１１１に挿入可能であり、１つまたは複数の保持リザーバ１２０と流体連通している少なくとも１つの針１３０を備える。図面に示す実施形態では、単一の針１３０がある。針１３０は長さ５０ｍｍ、斜角先端、１６ゲージであり、ステンレス鋼から製造されている。針１３０は各バイアル１１１から試料１００を除去するために、試料装填システム２０と動作可能に関連付けられてもよい。針１３０は、第１の位置決めユニット１４０によって上方からバイアル１１１内に針１３０を挿入するためにｚ方向に移動可能である。第１の位置決めユニット１４０は、図３および図４に図示されているステッパモータ１４０ｃに結合された親ねじ１４０ｂによって駆動されるストローク６０ｍｍの小型電動リニアアクチュエータ１４０ａである。

バイオプリンタ１０は、試料容器１１０から採取された試料１００を保持リザーバ１２０に導くフローセレクタバルブ３０を含む。これは、各バイアル１１１から採取された各試料１００が滅菌状態を維持するために各試料１００を分離するために、別個の保持リザーバ１２０内に保持されるようにする。

バイオプリンタ１０の試料装填システム２０および液滴分注システム２５は、チューブ１５０によって接続される。チューブ１５０は、その所望の位置および機能的要件に基づいて、多数の異なる材料、直径および長さから選択される。試料装填システム２０を各保持リザーバ１２０に接続するチューブ１５０は、内径２．１６ｍｍ、外径３．１７５ｍｍのＰＴＦＥチューブである。各保持リザーバ１２０内の細長いチューブ１２２は、１／８”のＰＴＦＥチューブである。

試料１００で各保持リザーバ１２０をプライムするために、試料１００はバイアル１１１から動き、そしてポンプ１６０を使ってセレクタバルブ３０を通る。ポンプ１６０は、蠕動ポンプ、ダイアフラムポンプ、またはシリンジポンプなどの容積型ポンプであってもよい。ポンプ１６０は、試料１００を適切な（および隔離された）保持リザーバ１２０に導くための適切なチャネル３１を備えるセレクタバルブ３０に接続される。バルブ３０は、ＶＩＣＩ Ｖａｌｃｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏ．製の低圧フロースルーセレクタバルブ３０である。フローセレクタバルブ３０は、４、６、８、１０、１２又は１６のチャネルなどの多くのチャネル３１を備えている。フローセレクタバルブ３０は、ポンプ１６０および針１３０に接続された共通の注入口を有する。チャネル３１が選択されると、選択されたチャネル３１は、ポンプ１６０および針１３０に流体的に接続される。チャネル３１が選択されない場合、そのチャネル３１は、圧力レギュレータマニホールド１７０内の空気圧力レギュレータ１７１からの加圧空気に流体的に接続される。各保持リザーバ１２０またはチャネル３１内の圧力は、レギュレータマニホールド１７０内のそれぞれのレギュレータ１７１によって独立して設定される。レギュレータマニホールド１７０内の各レギュレータ１７１は、４ｍｍナイロンチューブおよび１／８”ＰＴＦＥチューブを使用して、セレクタバルブ３０に接続される。レギュレータマニホールド１７０内の圧力レギュレータ１７１の番号は、保持リザーバ１２０またはチャネル３１の番号と同等である。これにより、液滴分注システム２５の各バルブ２５２に対して独立して圧を設定することができ、それは、バイオプリンタ１０が、各バルブ２５２内の広範囲の液体粘度を支持することができることを意味する。

試料装填システム２０のレギュレータマニホールド１７０内の圧力レギュレータ１７１は、セレクタバルブ３０の各チャネル３１および保持リザーバ１２０への供給圧力を独立して制御する。圧力レギュレータマニホールド１７０は、圧縮空気供給入口１８０および静圧リザーバ（図示せず）に動作可能に接続される。バイオプリンタ１０は圧縮空気供給入口１８０からの空気を濾過するために、ハウジング６０内に空気フィルタ１９０を含む。ポンプ１６０は試料容器１１０内の試料１００を保持リザーバ１２０に移送するために、針１３０に動作可能に連結される。ポンプ１６０は試料容器１１０内の試料１００の再懸濁のために、操作可能に可逆的であってもよい。

シール１１４は各試料容器１１０のゴム隔壁１１３によって形成され、第１位置決めユニット１４０の動作時に、第１位置決めユニット１４０によって駆動される針１３０を使用して穿刺される。第１位置決めユニット１４０は、制御システム４０およびロボット式リニアアクチュエータ１４０ａによって動作される。制御システム４０は、リニアアクチュエータ１４０ａ上のステッパモータ１４０ｃを所望のステップ数だけ移動させることによって、第１位置決めユニット１４０を位置決めする。第１の位置決めユニット１４０は針１３０を試料容器１１０と穿刺係合し、試料容器１１０と穿刺係合しないように位置決めするために、針１３０に動作可能に連結される。チャネル３１はセレクタバルブ３０上で選択され、マイクロソレノイドバルブ２５２が開かれ、ポンプ１６０がオンにされて、試料バイアル１１１から試料１００を移動させ、針１３０、チューブ１５０、ポンプ１６０、セレクタバルブ３０を通り、保持リザーバ１２０に入る。次いで、ポンプ１６０をオフにし、マイクロソレノイドバルブ２５２を閉じる。チャネル３１は、フローセレクタバルブ３０上で選択解除される。次いで、圧力はレギュレータマニホールド１７０のそれぞれのレギュレータ１７１によって設定され、マイクロソレノイドバルブ２５２は全ての空気がチューブライン１５０から出て、試料１００が保持リザーバ１２０から発射されるまで、繰り返し発射される。上記のプロセスは、使用されるべき各保持リザーバ１２０をプライミングするために繰り返される。

試料装填システム２０はさらに、液滴分注ユニット２５の針１３０およびプリントヘッド２５０に動作可能に結合された第２の位置決めユニット１４１と、針１３０およびプリントヘッド２５０を試料容器１１０および基板１２５の上の２次元空間内に位置決めするための第２の位置決めユニット１４１とを備える。第２の位置決めユニット１４１は、針１３０及びプリントヘッド２５０をトラック１４２に沿って移動させるように構成されている。第２の位置決め部１４１は、３軸動作制御ステージユニットであってもよい。第２の位置決めユニット１４１は、ストローク３００ｍｍのベルト駆動型リニアアクチュエータ１４１ａである。ベルト１４１ｂは歯付きベルトであり、ステッパモータ１４１ｃによって駆動される。

試料液滴１０１を印刷するために、１つまたは複数の保持リザーバ１２０およびマイクロソレノイドバルブ２５２が上述のようにプライミングされ、試料液滴１０１が液滴分注システム２５のプリントヘッド２５０の１つまたは複数のノズル２５３から発射され、コンピュータ制御ソフトウェア４０によって制御される所定の方法で、基板１２５上に堆積される。この液滴分注システム２５は、以下でより詳細に説明される。

バイオプリンタ１０を洗浄するために、上述したように、試料装填システム２０を使用して、針１３０を使用して試料バイアル１１１から、チューブライン１５０、セレクタバルブ３０、保持リザーバ１２０へ、およびそれらを通って、洗浄剤を移動させることができる。洗浄剤は、液滴分注システム２５のノズル２５３から廃棄物容器２０５内に放出される。このプロセスは、７０％エタノールおよび水などの他の洗浄化学物質について繰り返される。バイオプリンタ１０のクリーニングは全ての水がラインを通って洗い流され、以下に詳細に説明するように、液滴分注システム２５のノズル２５３から空気のみが噴射されたときに終了する。

バイアル１１１内の試料を再懸濁するために、針１３０が試料バイアル隔壁１１３を穿刺し、試料１００に係合するまで、針１３０は、第１および第２の位置決めユニット１４０および１４１を使用して、それぞれの試料バイアル１１１に向かって移動され得る。試料バイアル１１１内の細胞含有試料１００は、蠕動ポンプ１６０を使用して、試料バイアル１１１から針１３０およびチューブ１５０を通って移動される。細胞含有試料１００は蠕動ポンプ１６０を逆に使用して反対方向に（すなわち、試料バイアル１１１に向かって）移動される。針１３０およびチューブを介してバイアル１１１からおよびバイアルに向かって細胞含有試料を移動させるこのプロセスは、必要に応じて繰り返すことができる。

試料トレイ
試料容器１１０は、無菌であってもよい取り外し可能な試料トレイ２００に収容されてもよい。１４個までのバイアル１１１が取り外し可能な試料トレイ２００に収容され得ることが想定されるが、任意の適切な数のバイアル１１１が取り外し可能な試料トレイ２００に収容され得る。取り外し可能な試料トレイ２００は、バイアル１１１および廃棄物容器２０５のような、異なるサイズの試料容器１１０を保存するように適合された１つまたは複数の試料容器ハウジング２０１を有する。図５に示されるような取り外し可能な試料トレイ２００は、蓋２０２およびトレイ２０３を有する。取り外し可能な試料トレイ２００は、プラスチックまたは他の適切な材料から製造されてもよい。取り外し可能な試料トレイ２００は図１３および図１６に示すように、ヒンジドア２１０を介してバイオプリンタ１０のプリントステージ１２８の凹部１２９に装填可能である。代替の実施形態では、試料容器１１０が取り外し可能な試料トレイ２００に装填可能である。取り外し可能な試料トレイ２００はバイアル１１１を保管するための実質的に無菌の環境を提供し、各バイアル１１１は無菌である。

また、取り外し可能な試料トレイ２００の代わりに、試料容器ハウジング２０１をプリントステージ１２８と一体化することも考えられる。この場合、各試料容器１１０は、バイオプリンタ１０のヒンジドア２１０を介してプリントステージ１２８に装填可能である。

試料容器１１０を収容する取り外し可能な試料トレイ２００は、試料装填システム２０をフラッシングするときに廃棄物を受け取るための廃棄物容器２０５をさらに含んでもよい。取り外し可能なトレイ２００は、試料装填システム２０、セレクタバルブ３０、および液滴分注システム２５を洗浄するための洗浄容器２０４をさらに含んでもよい。

液滴分注システム
図１１〜図１５を参照すると、液滴分注システム２５は、複数の保持リザーバ１２０に動作可能に結合され、各保持リザーバ１２０から基板１２５上に試料液滴１０１を分配するように適合されたプリントヘッド２５０を含む。少なくとも１つのプリントヘッド２５０は、バルブ２５１のアレイであってもよい。バルブ２５１のアレイは、複数のマイクロソレノイドバルブ２５２を含んでもよい。マイクロソレノイドバルブ２５２は、Ｔｈｅ Ｌｅｅ Ｃｏｍｐａｎｙによって製造されたＶＨＳシリーズソレノイドバルブであってもよい。各マイクロソレノイドバルブ２５２は、０．００３”、０．００５”または０．００７”のオリフィス径を有するノズル２５３を含む。各マイクロソレノイドバルブ２５２は、ソレノイドコイルの両端にスパイクおよびホールド電圧を印加することによって開く。スパイク電圧は２４Ｖ、ホールド電圧は５Ｖ である。スパイク電圧の持続時間は０．２〜０．５ｍｓである。電圧がスイッチオフされるとバルブ２５２は閉位置に戻る。

各ノズル２５３は、マイクロコントローラ、すなわち制御システム４０によって制御される宝石オリフィス分配ノズル２５３であってもよい。試料１００は、マイクロソレノイドバルブ２５２およびノズル２５３の上流の保持リザーバ１２０に貯蔵される。宝石オリフィスノズル２５３の内径は、流体粘度及び試料液滴１０１の所望の液滴体積に応じて、１２７〜２５４μｍとすることができる。

液滴分注システム２５は、エアフィルタ１９０を介して圧力レギュレータマニホールド１７０に動作可能に連結された、圧縮空気供給入口１８０を含む。プリントヘッド２５０のノズル２５３を介して分配されるように、空気は、試料１００を試料装填システム２０および液滴分注システム２５の周りに移動させる。また、所望の試料液滴１０１容積は、レギュレータマニホールド１７０の圧力レギュレータ１７１によって設定された背圧、およびそれぞれのバルブ２５２の開放時間を使用して調整することができる。典型的には、背圧は１〜６０ｐｓｉの圧力に設定され、バルブ２５１の開放時間は０．３ｍｓ以上であり、液滴容積は１〜５００ｎｌである。

液滴分注システム２５はプリントステージ１２８に動作可能に連結された第３の位置決めユニット３００をさらに含んでもよく、第３の位置決めユニット３００はプリントステージ１２８を二次元空間に位置決めするためのものである。第３の位置決めユニット３００は、トラック３０１に沿ってプリントステージ１２８を移動させるように構成されている。トラック１４２はトラック３０１に対して垂直に延びている。図１３を参照すると、プリントステージ１２８は基板１２５を支持し、試料トレイ２００を取り外し可能に受け入れるように構成された凹部１２９を有する。３軸運動制御ステージは、３つの（Ｘ、ＹおよびＺ）寸法すべてにおいて、１０μｍの分解能で液滴分注システムを正確に位置決めすることができる。

滅菌環境では、活性化剤、バイオインク、および細胞含有バイオインクまたはセルインク（すなわち、試料１００）の各々は試料装填システム２０を使用して、適切な保持リザーバ１２０にゆっくりと装填され、小さな気泡の発生を回避する。

バイオプリンタは、２４V DC電源（図示せず）の形態の電源を備えている。

圧縮空気供給入口１８０は、エアコンプレッサ（図示せず）から供給される。エアコンプレッサーは、３〜１０ｂａｒのエアー圧を供給できる。圧縮空気は、研究室で一般的である、一般的な圧縮空気ラインから供給することができる。

液滴分注システム２５内のチューブ１５０は、４０ｍｍの１／１６”テフロン（登録商標）チューブである。このチューブ１５０は、保持リザーバ１２０をプリントヘッド２５０のバルブ２５１のアレイに接続する。

試料装填システム２０は、印刷のために試料１００を保持リザーバ１２０に自動的に装填することができる。このシステムは、現在の最先端のバイオプリンティングシステムに勝るいくつかの利点を有する。第１に、バイオインクは、ガラス又はプラスチックバイアル１１１のような取り扱いが容易な試料容器１１０内に貯蔵することができる。これらの試料容器１１０は、バイオインク試料を充填する前に容易に滅菌される。生物学者などのエンドユーザは、通常の方法、例えばピペットを使用して、適切なバイアル１１１内に細胞を沈着させる。バイオインクバイアル１１１の内側に細胞を堆積させることは、試料１００が汚染されないことを確実にするために、バイオセーフティキャビネットの内側で行うことができる。細胞を堆積させた後、バイアル１１１は、バイオプリンタ１０内の適切な位置に配置することができる。

試料装填システム２０はゴム隔壁１１３でシールされた個々のバイアル１１１から、バイオインクおよび細胞を含むバイオインクを装填することを可能にする。これは、ｚ軸リニアアクチュエータ１４０を使用して位置決めされた針１３０を使用して達成される。針１３０は容積型ポンプ１６０に流体的に接続されている。針１３０の先端が隔壁１１３を穿孔し、バイアル１１１の内側に配置されると、ポンプ１６０が係合し、流体試料１００がバイアル１１１からポンプで送り出される。

プリントヘッド２５０は、ユーザ入力、試料構成物、および／または所望の細胞構成物に基づいて、広範囲の粘度、液滴サイズなどを印刷するために個別に調整可能な複数の電子圧力レギュレータ１７１を備えてもよい。電子式圧力レギュレータ１７１は、バルブのアレイ２５１に動作可能に接続される。

圧力レギュレータ１７１のバンク（バイオプリンタ１０は最大１０個の保持リザーバ１２０があるので、１０個を含むことができることが想定される）は圧力レギュレータマニホールド１７０内に含まれる。マニホールド１７０の機能は、供給入口１８０に接続された外部空気コンプレッサから、各レギュレータ１７１に加圧空気を分配することである。図１１および図１２では、単一のレギュレータ１７１およびマニホールド１７０の片側のみが示されている。図１４および図１５には、１０個のレギュレータ１７１のバンクが示されている。

バイオプリンタ１０の試料装填システムの例示的な実施形態は、以下のように試料１００を保持リザーバ１２０に装填するステップを含む：
１． セレクタバルブ３０を選択したチャネル３１に移動；
２． マイクロソレノイドバルブ２５２を開く；
３． ｘ軸およびｙ軸アクチュエータを使用して、バイアル１１１の上方に針１３０を位置決めする；
４． ｚ軸アクチュエータを使用してバイアル隔壁１１３を穿孔するバイアル１１１内に下針１３０を挿入する；
５． 蠕動ポンプ１６０を係合させる；
６． バイアル１１１からセレクタバルブ３０を通ってチューブ保持リザーバ１２０内に流体をポンプする；
７． 流体がマイクロソレノイドバルブ２５２のノズルに到達したらポンプ１６０を停止し；
８． マイクロソレノイドバルブ２５２を閉じる。

バイオプリンタ１０の試料装填システム２０の別の例示的な実施形態、特に洗浄および滅菌のためのステップは、以下のステップを含む：
１． マイクロソレノイドバルブ２５２を廃液スピトンまたはバイアルの上に配置する；
２． 印刷ジョブ後に残っている流体を廃棄物容器２０５に空にする；
３． 洗浄するためにセレクタバルブ３０を選択したチャネルに移動する；
４． ｘ軸およびｙ軸アクチュエータを使用して、エタノールを含むバイアル１１１の上方に針１３０を位置決めする；
５． ｚ軸アクチュエータを使用してバイアル隔壁を穿孔するバイアル１１１内に下針１３０を挿入する；
６． マイクロソレノイドバルブ２５２を開く；
７． 蠕動ポンプを係合させる；
８． バイアル１１１からセレクタバルブ３０を通してエタノールをポンプし、マイクロソレノイドバルブ２５２を開く；
９． 十分なエタノールが開放マイクロソレノイドバルブ２５２を通過したときにポンプを停止する；
１０． マイクロソレノイドバルブ２５２を閉じる；
１１． 洗剤で処理を繰り返し；
１２．水で処理を繰り返す。

バイオプリンタ１０は、マイクロウェルプレートおよびペトリ皿などの多くの種類の基板１２５上に印刷するように適合されている。図２０を参照すると、基板１２５を３７℃に加熱して、温度制御ユニット２８０を用いて細胞増殖を補助することができる。両方の温度制御ユニット２８０は、最適な増殖状態に必要な３Ｄ細胞構築状態の必要性に基づいて、バイオプリンタ１０内部の温度を調節する。温度制御ユニット２８０はプリントヘッド２５０、プリントステージ１２８上に配置された基板１２５、および／またはバイオプリンタ１０の内部の温度を調節するために、３６℃〜３８℃に調節可能である。

プリントステージ上に配置されて支持される基板１２５は、マルチウェルプレート１２６であってもよい。基板１２５は、印刷された細胞構造を封入および培養するために使用される生体適合性消耗品であってもよい。これらの基板は、以下を含んでもよい：
・ 異なるウェル構成（６、１２、２４、４８、９６および３８４ウェル）のマイクロタイタープレート；
・ 異なるウェル構成（６、１２、２４、４８、９６および３８４ウェル）のカバースリップ底部を有するマイクロタイタープレート；
・ カバーガラスと顕微鏡スライド；
・ 種々のサイズのフルオロディッシュ；および
・ 異なるチャンバ構成（１、２、４、８および１６）のチャンバースライド。

チューブライン１５０、バルブ２５１のアレイおよびノズル２５３を洗浄するために、洗浄剤は上記のように、液滴分注システム２５を使用して、試料バイアル１１１からバルブ２５２およびノズル２５３へ、そしてそれらを通って移動され得る。洗浄剤は、ノズル２５３から廃棄物容器２０５内に噴出される。このプロセスは、７０％エタノールおよび水などの他の洗浄化学物質について繰り返される。チューブライン１５０およびプリントヘッド２５０の洗浄は、全ての水がライン１５０、バルブ２５１のアレイおよびノズル２５３を通って洗浄され、空気のみがノズル２５３から排出されているときに終了する。

層流システム
図６〜図１０を参照すると、バイオプリンタ１０は、図６〜図１０に示すような層流システム５０をさらに含む。無菌性および操作者の安全性は、３Ｄバイオプリンティングアプリケーションにおいて主要な関心事である。これは、通常、バイオプリンタをバイオセーフティキャビネットまたはクリーンルーム内に配置することによって達成される。典型的には、バイオセーフティキャビネットおよびクリーンルームが組織培養ラボにおいて貴重かつ高価な空間と見なされている。したがって、３Ｄバイオ印刷用途におけるバイオセーフティキャビネットおよびクリーンルーム空間の使用を最小限に抑えるための解決策が必要とされている。

一体化された層流システム５０はバイオプリンタ１０に一体化され、バイオセーフティキャビネットまたはクリーンルーム設備を必要とせずに、細胞および３Ｄ組織培養モデルのバイオ印刷のための無菌環境を提供する。さらに、オペレータはフロントアクセスを通じて外部環境から空気を引き込むために、方向性気流を使用して保護される。

層流空気流システム５０は金属フレーム５００、例えばステンレススチールを備えたチャンバまたはエンクロージャを含み、汚染された空気流を電気的に動力供給される送風ファンまたは遠心ファン５１０に引き込むことを可能にするために、ベースに金属製の格子が設けられている。汚染された空気は、ファン５１０を使用してダクト入口５２０を通って、および２つの高効率粒子アレスティング（ＨＥＰＡ）フィルタ５２５および５３０から成る陽圧チャンバ５３５内にポンピングされる。ＨＥＰＡフィルタ５２５および５３０は、汚染空気流から少なくとも９９％の粒子を除去することができる。一方のＨＥＰＡフィルタ５２５は外部環境への排気として作用し、他方のＨＥＰＡフィルタ５３０は、無菌チャンバ５３５への空気流を再循環させる。各フィルタは、空気流の約５０％を占めることが想定される。図２１は送風ファン５１０を介してダクト入口５２０を通って、ＨＥＰＡフィルタ５２５および５３０を通ってバイオプリンタ１０に入り、排気されるか、またはリサイクルされる空気の流れを示す。再循環ＨＥＰＡフィルタ５２５から無菌チャンバ５３５への空気流は、０．４５ｍ／ｓの典型的な速度で無菌チャンバ５３５への一方向下向き空気流を提供する。この空気流はバイオプリントされた試料液滴１０１上に均一な清浄な空気流を提供し、試料１００内の粒子汚染の危険性を著しく低減する。

バイオ印刷動作中、前部アクセスヒンジドア２１０は、粒子汚染の危険性を低減するために閉じられなければならない。したがって、送風ファン５１０は送風機回転数を低下させることによって流量を低減することができる。滅菌チャンバ５３５内の気流が減少すると、プリントヘッド２５０および試料１００に対する脱水の影響が減少する。さらに、プリントヘッド２５０から印刷基板１２５への飛行中に試料液滴１０１を妨害する空気流の効果を減少させる。

制御ソフトウェア
バイオプリンタ１０は、生物学的アッセイを印刷するために開発されたカスタムソフトウェアを介して制御される。制御システム４０は、バイオプリンタ１０を動作させるためのプログラムされた命令を有する非一時的なコンピュータ可読媒体を含む制御ソフトウェアを備える。非一時的なコンピュータ可読媒体は、バイオプリンタ１０とは別個に配置され、バイオプリンタ１０に動作可能に接続可能である。

ソフトウェアは図２１および図２２に示すようなグラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）を含む。ＧＵＩを通して、エンドユーザは異なるアッセイ印刷ルーチンを選択し、液滴間隔および液滴体積などのアッセイパラメータを変更することができる。ユーザは液滴分注システムの空間位置を手動で制御し、液滴のカスタムパターンを作成することもできる。ソフトウェアのさらなる特徴は、液滴分注システムの洗浄、プライミング、およびパージのためのルーチンを含む。

バイオプリンティングは、印刷されるオブジェクトの３Ｄモデルを必要とする。組織工学用途では、これは典型的にはＣＡＤ／ＣＡＭソフトウェアなどの工学ツールを使用して作成される。これらのツールは高価であり、高度の複雑さを有し、科学者に時間と資源を学習エンジニアリングツールに費やすことを余儀なくさせる。３Ｄ組織培養アプリケーションでは、印刷される構造の複雑さはより低い。３Ｄ組織培養アプリケーションにおけるバイオ印刷のための３Ｄ構造を作製するための単純かつ直感的な方法が必要とされている。

バイオプリンタ１０に提供されるソフトウェアは、印刷される３Ｄ構造の各層を設計する方法を提供する。一実施形態では、ユーザが構造の各層のパターンを描くためのグリッドが提供される。印刷される材料は、プリントヘッド２５０内の異なるノズル２５３から分配される複数の材料の混合物として定義することができる。例えば、ハイドロゲルは、活性化剤の液滴と混合されたバイオインクの液滴を規定することができる。

組織培養のための生物学実験室で使用される典型的な基板は、６、１２、２４、４８、９６および３８４ウェルプレートなどのマルチウェルプレートである。一実施形態では、インターフェース６７０がマルチウェルプレート上の各ウェルの内側に予め画定された３Ｄ構造を印刷するために提供される。ユーザはまず、ウェルまたはウェルのアレイを選択し、次に、それらのウェルに印刷される印刷ルーチンを選択する。

カスタムソフトウェアは、ユーザがアレイ内のどこに三次元細胞構築物の層をバイオプリントしたいかを入力するためのユーザインタフェースを提供する。プリントプレビューボタン６７１はユーザが細胞がどこでプリントされ、どのような構造になるかを視覚化することを可能にするために、プリント前にソフトウェアと共に提供される。ソフトウェアの特徴は、バイオプリンタの液滴サイズを制御して、細胞構築物がどのように印刷されるかを変化させることができることである。細胞構築物の層化の背後にある意図は、生物学者が顕微鏡においてｚスタック層化をどのように使用するかを模倣することである。

一般に、バイオプリンタ１０は３Ｄ細胞構築物を構築する際に２０〜２５層を印刷するが、層の数は制御システムおよび関連する制御ソフトウェアを使用して制御される。

プリントヘッド２５０に結合された位置決めユニット１４１は、コンピュータ制御のソフトウェアによって制御され、バイオインク、活性化剤、細胞、細胞−インク、またはそれらの組み合わせの試料液滴１０１の各噴射中に、バルブ２５１およびノズル２５３を空間的に位置決めする。ソレノイドバルブおよびノズルのコンピュータ制御による空間的位置決め、およびバルブ２５１およびノズル２５３からのコンピュータ制御による液滴射出は、３Ｄ組織構築物の生成を容易にする。

３Ｄ組織構築物のアレイを生成するために、３Ｄ組織構築物を生成するプロセスを、基板１２５上の複数の位置で繰り返した。

制御システムは、ユーザ入力または自動記録のいずれかによって、試料容器１１０内の各試料１００の同一性を記録する。その意図は、どの試料容器１１０がどの試料１００を収容しているかを知ることであり、その結果、印刷中に、保持リザーバ１２０がそれぞれの試料を貯蔵しているときに、必要な試料が所望の位置に印刷される。

バイオプリンタハウジング
バイオプリンタ１０は、試料装填システム２０、液滴分注システム２５、および層流空気流システム５０を包囲するハウジング６０を備える。ハウジング６０は、鋼、アルミニウム及びステンレス鋼から作られた多数のパネルから組み立てられ、ねじ締結具６００を用いて組み立てられる。ハウジング６０は、ユーザがバイオプリンタ１０の滅菌チャンバ５３５にアクセスできるように、前面にヒンジドア２１０をさらに含む。取り外し可能な試料トレイ２００は、ドア２１０を介してバイオプリンタ１０に装填可能である。前面パネルおよびヒンジドア２１０は、ガラスまたは透明なプラスチックから作ることができる。図１６および図１７は、バイオプリンタアセンブリ１０を示す。

方法
動作中、バイオプリンタ１０は試料を試料容器から、３Ｄ細胞構築物をバイオプリントするためにプリントヘッドによって利用される準備ができている保持リザーバに移送するための以下のステップを有する。プリンタ保持リザーバ１２０およびソレノイドバルブを流体でプライミングするために、流体は、試料装填システムを使用して、試料容器からソレノイドバルブへ、およびソレノイドバルブを通って移動される。適切なチャネルは、フローセレクタバルブで選択する。針１３０を用いて試料バイアルのシールを穿刺し、ソレノイドバルブを開く。蠕動ポンプを作動させて、所望の量の流体を試料容器から針、チューブ、ポンプ、チューブ、フローセレクタバルブを通って保持リザーバ内に移動させる。蠕動ポンプがオフになり、ソレノイドバルブが閉じる。適切なチャネルは、フローセレクタバルブ上で選択解除される。圧力はレギュレータ１７１によって設定され、ソレノイドバルブ２５２は全ての空気がラインから出て、液滴（単数又は複数）バイオインク、活性化剤、細胞、細胞−インク、またはそれらの組み合わせがノズル２５３から発射されるまで、繰り返し発射される。上記のプロセスは、使用されるプリンタ流体リザーバおよびソレノイドバルブごとに繰り返される。

バイオインクを保持リザーバに装填するためのステップ：
１． セレクタバルブを選択したチャネルに移動する；
２． ソレノイドバルブを開く；
３． ｘ軸およびｙ軸アクチュエータを使用してバイアル上方に針を配置する；
４． ｚ軸アクチュエータを使用して、バイアル中に針を下げ、バイアル隔壁を穿孔する；
５． 蠕動ポンプを係合する；
６． バイアルからセレクタバルブを通ってチュービング保持リザーバに流体をポンプで送り込む；
７． ソレノイドバルブのノズルに流体が到達したらポンプを停止し；
８． ソレノイドバルブを閉じる。

ソレノイドバルブからバイオインク、活性化剤、細胞、細胞−インク、又はそれらの組み合わせを印刷するために、プリンタ流体リザーバ及びソレノイドバルブは上述したようにプライミングされ、バイオインク、活性化剤、細胞、細胞−インク、又は組み合わせの液滴をノズルから発射し、コンピュータ制御のソフトウェアによって制御される所定の方法で基板上に堆積させる。

位置決めユニットがプリントヘッド２５０に結合され、コンピュータ制御のソフトウェアによって制御され、バイオインク、活性剤、細胞、細胞−インク、またはそれらの組み合わせの液滴の各噴射中に、ソレノイドバルブおよびノズルを空間的に位置決めする。ソレノイドバルブおよびノズルのコンピュータ制御による空間的位置決め、およびソレノイドバルブおよびノズルからのコンピュータ制御による液滴射出は、３Ｄ組織構築物の生成を容易にする。

３Ｄ組織構築物のアレイを生成するために、３Ｄ組織構築物を生成するプロセスは、基板上の複数の位置で繰り返される。

バイオインク
本明細書において、バイオインクは、細胞が懸濁または収容され得る１つまたは複数のタイプの高分子の水溶液として定義される。活性化または架橋の際に、それは、バイオインクの化学的および物理的組成によって規定される物理的および化学的特性を有するハイドロゲル構造を生成する。高分子は、合成および天然ポリマー、タンパク質およびペプチドの両方のアレイとして定義される。高分子は、その天然の状態であってもよく、またはアミンもしくはチオール反応性官能基で化学的に修飾されていてもよい。

合成高分子は、以下を含んでもよい：
・ 多糖類、例えば、フルクトース、スクロースまたはグルコース官能基を含有するポリマー；
・ 非イオン性ポリマー、例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）（ＰＨＥＭＡ）、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリ（ＮＩＰＡＡＭ）およびポリ（プロピレンフマレート）（ＰＰＦ）および誘導体；
・ 高分子電解質−正または負の電荷をもつポリマー、両性および両性イオン性ポリマー；
・ ポリペプチド−アミド結合によって一緒に保持された多くのアミノ酸の一本鎖（最低２アミノ酸）；および
・ 核酸塩基含有合成ポリマー核酸塩基（アデニン、チミン、グアニンまたはシトシン）反復単位を有するポリマー。

天然高分子は、以下を含んでもよい：
・ 多糖類、例えば、アルギネート、キトサン、ゲランガム、ヒアルロン酸、アガロースおよびグリコサミノグリカンなど；
・ タンパク質、例えば、ゼラチン、フィブリンおよびコラーゲンなど；
・ ＤＮＡおよびオリゴヌクレオチド、例えば一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ＤＮＡ酵素およびアプタマー；および
・ 基底膜抽出物。

アミン反応性官能基としては、アルデヒド、エポキシ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および２−ビニル−４，４−ジメチルアズラクトン（ＶＤＭ）が含まれてもよい。

チオール反応性官能基としては、アルケン、アルキン、アジド、ハロゲンおよびシアネートが含まれてもよい。

使用され、適切であることが見出されたバイオインクは、１０v/v% FCS、Ｌ−グルタミンおよびピルビン酸ナトリウムを補充したカルシウムを含まないＤＭＥＭに溶解したアルギネート（２ｗ／ｖ％）であった。

分散型ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）ニューロブラストマ細胞を有するバイオインクを、細胞を含んだバイオインクと呼ぶ。

活性化剤
活性化剤は、バイオインクと相互作用してハイドロゲル構造を形成する小分子または高分子のいずれかを含む水溶液である。活性化剤の組成は、得られるハイドロゲルの物理的性質を制御するために変更することができる。使用される活性化剤のタイプは、使用される高分子ならびに意図される架橋プロセスに非常に依存する。

活性化剤は、以下から選択され得る：
・ 無機塩、例えば、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム。水酸化ナトリウムおよび塩化バリウム；
・ 光開始剤、例えば、２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡ）およびイルガキュア等；
・ 高分子電解質−バイオインク中の高分子とは反対の電荷をもつポリマー。これは、カチオン性、アニオン性、両性および両性イオン性であり得る；
・ ポリペプチド−アミド結合によって結合された多くのアミノ酸の一本鎖（最低２アミノ酸）；
・ ＤＮＡリンカー−バイオインクの高分子上に存在するものを補完するヌクレオチドまたはＤＮＡ配列を有する高分子；および、
・ 天然または化学修飾を介してアミンまたはチオール基を有する天然または合成高分子。

アルギネートバイオインクに使用した活性剤は、ＭｉｌｌｉＱ水に溶解した４ｗ／ｖ％の塩化カルシウムであった。

架橋またはゲル化
これは、個々の高分子鎖が活性化剤によって一緒に連結されてハイドロゲルを形成するプロセスである。架橋プロセスは、化学的架橋または物理的架橋のいずれかに分類することができる。物理的架橋または非共有架橋は、以下を含んでもよい：
・ イオン架橋−高分子中に存在する反対電荷と活性化剤との相互作用による架橋。活性化剤は、荷電オリゴマー、イオン性塩およびイオン性分子を含んでもよい；
・ 水素結合−極性分子の静電引力による架橋。この場合、高分子および活性化剤は極性官能基を有している；
・ 温度架橋−温度変化（加熱または冷却）に対する応答としての高分子鎖の転位による架橋；および
・ 疎水性相互作用またはファンデルワールス力。

化学的または共有結合的架橋は、高分子と活性化剤との間の化学反応を含む。反応のタイプは、以下を含んでもよい：
・ ＵＶまたは光照射により架橋反応を促進する光架橋；
・ 水性媒体中でのチオールとビニル担持高分子との間のマイケル型付加反応（Ｍｉｃｈａｅｌ−ｔｙｐｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）；
・ アミノ基とアルデヒド基のシッフ塩基反応；
・ Ｄｉｅｌｓ−ａｌｄｅｒ反応；
・ クリック化学（Ｃｌｉｃｋ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）；
・ エステル基を活性化するためのアミノリシス反応；および
・ 酵素架橋。

他のバイオインクと活性剤の組み合わせの例を以下の表に示す：

セルインク
セルインクは、３Ｄバイオプリンティングプロセス全体にわたって細胞が均等に懸濁され、かつ懸濁されたままである１または複数のタイプの分子または高分子の水溶液である。セルインクの濃度は細胞が沈降するのを防止するが、依然として高い細胞生存率を維持するように最適化される。

セルインクは、以下から選択され得る：
・ グリセロールなどの小分子；および
・ Ｆｉｃｏｌｌ（商標）、デキストラン、アルギン酸塩、ゲランガム、メチルセルロースおよびポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）などの高分子。

Ｆｉｃｏｌｌ（商標）は、水溶液に容易に溶解する中性、高度に分岐した高質量の親水性多糖である。Ｆｉｃｏｌｌ（商標）半径は２〜７ｎｍの範囲であり、多糖とエピクロロヒドリンとの反応によって調製される。Ｆｉｃｏｌｌ（商標）は、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社が所有する登録商標である。

使用したセルインクは、ＰＢＳに溶解したＦｉｃｏｌｌ（商標）４００（１０ｗ／ｖ％）であった。

分散したＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）神経芽細胞腫細胞を有するセルインクは、セルインク含有細胞と呼ばれる。

ゲランガムは、細菌Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｅｌｏｄｅａ（以前はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｅｌｏｄｅａ）によって産生される水溶性アニオン性多糖である。

細胞培養液
細胞培養液は培養細胞と接触する液体であり、様々な細胞関連作業に適している。調製プロセスは塩およびｐＨバランスの注意深い分析、生体適合性分子のみの取り込み、および滅菌を含む。

細胞培養溶液のいくつかは、以下を含む：
・ ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、アイスコーブ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、培地１９９、ハムＦ１０、ハムＦ１２、マッコイ５Ａおよびロスウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）培地などの細胞培養培地；
・ ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＢＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＢＦ）、内皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ）、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ‐１）および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）などの成長サプリメント；
・ ＰＢＳ、ＨＥＰＥＳおよびＣＨＥＳなどの生物学的緩衝液；
・ キレート化および安定化溶液；および
・ 滅菌ＭｉｌｌｉＱ水。

細胞培養条件
細胞および３Ｄ組織培養モデルは標準的な細胞培養技術を用いてインキュベートし、培養し、維持することができる。ハイドロゲル鋳型中にカプセル化された細胞を含む３Ｄ組織培養モデルは、細胞増殖またはスフェロイド形成を可能にするかまたは維持する条件下でインキュベートされ得る。培養は、典型的には大部分の動物細胞株およびヒト細胞株について、５％のＣＯ２濃度で少なくとも２４時間、約３７℃で行われる。インキュベーションは、ハイドロゲル鋳型中の細胞の型の増殖、維持またはスフェロイド形成を可能にする任意の適切な条件、温度および持続時解間で実施され得ることが理解されるだろう。

有用溶液
有用溶液は細胞と接触しないが、細胞に暴露された全てのプリンタ表面を洗浄および滅菌するために使用される溶液として定義される。これらの溶液は、以下を含んでもよい：
・ 正しい濃度のエタノール；
・ 滅菌ミリＱ水；
・ 細胞培養培地；
・ 洗浄剤；および
・ 過酸化水素溶液（２ｗ／ｖ％最大濃度）。

バイオインクの調製
最初に、適切な細胞培養溶液中で適切な種類および量の高分子を混合することによって、バイオインクを調製する。均一性を達成した後、ブランクバイオインクを、ＵＶ照射および濾過（０．２２μｍフィルター）の両方を介して滅菌する。その後、バイオインクは、さらに使用されるまで、４℃に保持される。

細胞の調製
ＰＢＳで洗浄することによって細胞を回収する。ＰＢＳを吸引する。トリプシンを添加し、３７℃でインキュベートして、細胞をフラスコ表面から解離させる。組織培養培地を加えて、解離した細胞をチューブに集める。細胞を遠心分離し、上清を吸引し、ペレットを新鮮な培地に再懸濁する。等量の細胞懸濁液とトリパンブルー染色液を混合して細胞数を測定する。細胞濃度を決定するために計算を行う。次いで、所望の数の細胞を、バイオインク、セルインクに添加するか、または細胞培養溶液に添加することができる。

活性化剤の準備
適切な種類および量の分子を適切な細胞培養溶液に溶解した。得られた溶液を、使用前にＵＶ照射および濾過によって滅菌した。

セルインクの調製
適切な種類および量の分子を適切な細胞培養溶液に溶解した。均一性を達成した後、得られた溶液を、使用前にＵＶ照射および濾過によって滅菌した。次いで、セルインクは、更に使用するまで室温に保たれた。

細胞採取
特定のコンフルエンシーで目的の培養細胞を、既に確立されたプロトコールに従って収集する。細胞を含有するバイオインクまたはセルインクを作製するために、採取した細胞を正確な細胞濃度で再懸濁して、２００μｌのバイオインクまたはセルインク中に２億５０００万細胞／ｍｌ濃度を得る。次いで、得られた細胞ペレットを、正確な体積のバイオインクまたはセルインク中に再分散させる。次いで、細胞含有バイオインクまたはセルインクは、３Ｄバイオプリンタでの使用の準備が整う。

ハイドロゲル鋳型の印刷
ハイドロゲル鋳型はドロップオンドロップ法を用いて印刷することができ、それによって、バイオインクの液滴と活性化剤の液滴とが、相互の上に堆積されて、ハイドロゲルを生成した。このプロセスを繰り返し、ハイドロゲルの層を構築することによって３Ｄハイドロゲル構造を形成するために使用することができる。

細胞型
スフェロイドなどの３Ｄ組織培養モデルは、哺乳動物肝細胞、消化管細胞、膵臓細胞、腎臓細胞、肺細胞、気管細胞、血管細胞、骨格筋細胞、心臓細胞、皮膚細胞、平滑筋細胞、結合組織細胞、角膜細胞、尿生殖細胞、乳房細胞、生殖細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、神経細胞、シュワン細胞、脂肪細胞、骨細胞、骨髄細胞、軟骨細胞、周皮細胞、中皮細胞、内分泌組織に由来する細胞、間質細胞、幹細胞、幹細胞、前駆細胞、リンパ細胞、血液細胞、内胚葉由来細胞、外胚葉由来細胞、中胚葉由来細胞、またはこれらの組合せなどの接着細胞を含む任意の適当な細胞型から調製することができる。

さらなる細胞型は他の真核細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣）、細菌（例えば、ヘリコバクターピロリ）、真菌（例えば、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）および酵母（例えば、出芽酵母（ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））を含んでもよい。

細胞株ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）（神経芽腫細胞）は、様々な条件の下で３Ｄ組織培養モデルを作製するプロセスで使用されている。他の細胞株が、開発されたプロセスによって作製された３Ｄ組織モデルにおいて必要とされるように機能することが期待されることが理解されるであろう。使用される他の細胞系には、ＤＡＯＹ（ヒト髄芽腫癌細胞）、Ｈ４６０（ヒト非小肺癌）およびｐ５３Ｒ１２７Ｈ（ヒト膵臓癌細胞）が含まれる。適切であり得る他の細胞株は、０８８および０８９に列挙される。

３次元バイオ印刷技術は、ドロップオンデマンド技術によりハイドロゲル鋳型に封入された高密度３次元組織培養モデルを作製するために開発された。具体的には、３Ｄ印刷技術を使用して、様々な３Ｄ構造を作製するために層ごとに構築されたバイオインクおよび活性化剤を使用して、生体適合性ハイドロゲル鋳型を印刷した。ハイドロゲル鋳型の製造中に、高細胞密度の液滴をハイドロゲル鋳型に含めることができる。

当業者であれば、広く説明された本発明の精神または範囲から逸脱することなく、特定の実施形態に示されるように、本発明に多数の変形および／または修正を行うことができることを理解するのであろう。したがって、本実施形態はすべての点で例示的であり、限定的ではないと考えられるべきである。

参考文献
Murphy, S. and Atala, A. (2014). 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnol, 32(8), pp 773-785.

Horn, T. and Harrysson, O. (2012). Overview of current additive manufacturing technologies and selected applications. Sci. Prog, 95, pp 255-282.

Claims (20)

1. 三次元（３Ｄ）細胞構築物を製造するためのバイオプリンタであって、前記バイオプリンタは、以下：
   流体試料を保持するための１つまたは複数の保持リザーバ；
   試料容器を保持し、３Ｄ細胞構築物が印刷される基板を支持するためのプリントステージ；
   前記１つまたは複数の保持リザーバと流体連通する試料装填システムであって、試料を試料容器から前記１つまたは複数の保持リザーバに装填するように構成された試料装填システム；
   前記試料装填システムと流体連通するポンプであって、前記試料を試料容器から引き出し、前記試料を前記１つまたは複数の保持リザーバ内に送り込むように構成されたポンプ；および、
   前記１つまたは複数のリザーバと流体連通する液滴分注システムであって、前記１つまたは複数のリザーバからの試料液滴を前記プリントステージによって支持された基板上に印刷するように構成された液滴分注システム
   を含む、バイオプリンタ。
2. 前記１つまたは複数の保持リザーバ、前記プリントステージ、前記ホルダ、前記試料装填システム、前記ポンプ、および前記液滴分注システムを包含するハウジングをさらに備える、請求項１に記載のバイオプリンタ。
3. 前記ハウジング内に配置された空気流システムをさらに含み、前記空気流システムは、前記ハウジング内に層流空気流を誘導するように構成される、請求項２に記載のバイオプリンタ。
4. 前記空気流システムは、前記ハウジング内に前記層流空気流を誘導するためのファンを備える、請求項３に記載のバイオプリンタ。
5. 前記空気流システムは、少なくとも１つのエアフィルタを備える、請求項３または４に記載のバイオプリンタ。
6. 前記試料装填システムは、試料容器内に挿入するための針を含み、前記ポンプは、前記針が前記試料容器内に挿入されると、前記針を通して流体を引き込むように構成される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のバイオプリンタ。
7. 前記針に連結された第１の位置決めユニットをさらに含み、前記第１の位置決めユニットは前記針を試料容器に挿入し、前記針を前記試料容器から引き抜くように構成される、請求項６に記載のバイオプリンタ。
8. トラックを有する第２の位置決めユニットをさらに含み、第２の位置決めユニットは、前記針および前記液滴分注システムに結合され、第２の位置決めユニットのトラックに沿って前記針および前記液滴分注システムを移動させるように構成される、請求項６または７に記載のバイオプリンタ。
9. トラックを有する第３の位置決めユニットをさらに備え、前記第３の位置決めユニットは、前記プリントステージに連結され、前記プリントステージを前記第３の位置決めユニットのトラックに沿って移動させるように構成されている、請求項８に記載のバイオプリンタ。
10. 前記第２の位置決めユニットのトラックが、前記第３の位置決めユニットのトラックに対して実質的に垂直に延在する、請求項９に記載のバイオプリンタ。
11. 複数の保持リザーバと、前記試料容器から複数のリザーバのいずれか１つに試料を装填するように構成された前記試料装填システムとを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のバイオプリンタ。
12. 前記試料容器は複数の試料ウェルを有するトレイであり、前記試料ウェルは試料を収容するように構成され、前記試料装填システムは前記試料ウェルのいずれか１つから前記保持リザーバのいずれか１つに試料を装填するように構成される、請求項１１に記載のバイオプリンタ。
13. 前記試料装填システムから廃棄材料を受け取るように構成された廃棄物容器をさらに備える、請求項１２に記載のバイオプリンタ。
14. 前記廃棄物容器は、前記トレイ上に提供される、請求項１３に記載のバイオプリンタ。
15. 前記ポンプは前記保持リザーバのうちの１つから前記試料を引き出し、前記試料装填システムから前記試料を送り出すように構成される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のバイオプリンタ。
16. 各保持リザーバ内の圧力を調整するために、各保持リザーバに流体連通して連結された圧力レギュレータをさらに備える、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のバイオプリンタ。
17. 前記ポンプ、前記試料装填システム、各保持リザーバ、及び前記圧力レギュレータと流体連通するセレクタバルブをさらに含み、前記セレクタバルブは、前記ポンプを前記試料装填システム及び各保持リザーバに流体連通するように選択的に連結するように構成された、請求項１６に記載のバイオプリンタ。
18. 前記圧力レギュレータは、圧縮空気供給源に流体連通して取り外し可能に連結される、請求項１６または１７に記載のバイオプリンタ。
19. 請求項１〜１８のいずれか１項に記載のバイオプリンタを使用して、１つまたは複数の試料の液滴を堆積させることを含む、三次元細胞構築物を作製する方法。
20. 三次元細胞構築物を製造する方法であって、前記方法は以下：
    請求項１〜１８のいずれか１項に記載のバイオプリンタを提供すること；
    前記プリントステージへ基板を提供すること；
    試料容器をプリントステージに提供することであって、前記試料容器は試料を含む；
    試料を前記試料装填システムによって前記保持リザーバの１つに装填すること；および
    前記液滴分注システムを使用して前記保持リザーバから前記基板上に前記試料を印刷して、前記三次元細胞構築物を形成すること
    を含む、方法。