WO2016020992A1

WO2016020992A1 - 培養装置、これを用いた培養方法及び細胞凝集塊の選別方法

Info

Publication number: WO2016020992A1
Application number: PCT/JP2014/070639
Authority: WO
Inventors: 伊藤　三郎
Original assignee: ヤマハ発動機株式会社
Priority date: 2014-08-05
Filing date: 2014-08-05
Publication date: 2016-02-11
Also published as: JPWO2016020992A1; JP6293900B2

Abstract

　培養装置（１）は、生物の培養領域を提供する容器であって、前記培養領域中に培養対象の生物（Ｃ）を投入させるための上部開口を備える培養容器（１０１）と、前記培養領域を閉鎖するように、前記上部開口の少なくとも一部を覆う蓋部材（１０２）と、前記培養領域を経由してガスを流通させるガス交換機構（３）とを備える。

Description

培養装置、これを用いた培養方法及び細胞凝集塊の選別方法

　本発明は、例えば細胞凝集塊のような生物の培養装置、培養方法及び細胞凝集塊の選別方法に関する。

　例えば細胞凝集塊のような生物は、生物化学的実験などの目的で、培養液を貯留する培養容器内で一定期間保持されることがある。細胞凝集塊は、ウェルプレートのような保持部材に担持された状態で、培養液中に保持される。特許文献１には、前記細胞凝集塊を保持可能な複数の貫通孔が形成されたプレートに、細胞や生体試験用のビーズを保持させるようにした装置が開示されている。

　細胞凝集塊を培養容器内で保持させる目的は、当該細胞凝集塊の現状を維持した状態での保管、細胞凝集塊の成育、細胞凝集塊のスクリーニングのための一時的な保管、或いは薬品添加による反応観察などの各種実験のための保管などを例示することができる。細胞凝集塊が培養容器内で保持されている間、当該培養容器内は細胞凝集塊にダメージを与えない環境に維持されることが肝要である。しかし、従来の技術では、培養容器単位で前記ダメージ対策に十分な注意が払われていない。培養容器が配置される室内環境全体を培養に適した条件とすることは解決方法の一つであるが、その解決手段は室内全体が対象となるため、大掛かりとなってしまう。

特表２００９－５０４１６１号公報

　本発明の目的は、簡易な構成で、培養容器に保持された生物にダメージを可及的に与えないようにする機構を備えた培養装置、これを用いた培養方法及び細胞凝集塊の選別方法を提供することにある。

　本発明の一局面に係る培養装置は、生物の培養領域を提供する容器であって、前記培養領域中に培養対象の生物を投入させるための上部開口を備える培養容器と、前記培養領域を閉鎖するように、前記上部開口の少なくとも一部を覆う蓋部材と、前記培養領域を経由してガスを流通させるガス交換機構とを備える。

　本発明の他の局面に係る培養方法は、培養対象の生物を含む培養液を貯留するチューブと、上記の培養装置と、前記培養液を吸引及び吐出可能な分注チップとを準備するステップと、前記分注チップにより、前記チューブから前記培養対象の生物を含む培養液を吸引するステップと、前記吸引された培養液を、前記上部開口のうち前記蓋部材で覆われていない投入開口を通して、前記分注チップから前記培養容器内に吐出するステップと、前記ガス交換機構により、成分調整された培養ガスの前記閉鎖空間を経由した流通を開始するステップと、前記培養ガスを前記閉鎖空間に流通させつつ、前記培養対象の生物を前記培養容器内で保持するステップと、を含む。

　本発明のさらに他の局面に係る細胞凝集塊の選別方法は、培養対象の生物としての細胞凝集塊を含む培養液を貯留する第１容器と、上記の培養装置と、前記培養液を吸引及び吐出可能な分注チップと、前記細胞凝集塊を吸引及び吐出可能なシリンダチップと、前記細胞凝集塊の移送先となる第２容器とを準備するステップと、前記分注チップにより、前記第１容器から前記細胞凝集塊を含む培養液を吸引するステップと、前記吸引された培養液を、前記投入開口を通して前記分注チップから前記培養容器内に吐出し、前記プレートの前記保持部に前記細胞凝集塊を担持させるステップと、前記ガス交換機構により、成分調整された培養ガスの前記閉鎖空間を経由した流通を開始するステップと、前記培養ガスを前記閉鎖空間に流通させつつ、前記保持部に担持された前記細胞凝集塊を、前記シリンダチップで個別に吸引するステップと、前記吸引された細胞凝集塊を、前記シリンダチップから前記第２容器に吐出するステップと、を含む。

　本発明の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明と添付図面とによって、より明白となる。

図１は、本発明の第１実施形態に係る培養装置の概略的な側断面図である。図２は、本発明の第２実施形態に係る培養装置の概略的な側断面図である。図３は、前記培養装置に用いられる培養容器の斜視図である、図４は、前記培養装置に用いられるプレートの上面図である。図５は、図４のＶ－Ｖ線断面図である。図６は、細胞凝集塊（生物）の前記プレートによる担持状況を示す模式図である。図７は、本発明の第３実施形態に係る培養装置のブロック図である。図８は、第３実施形態の培養装置の動作を示すフローチャートである。図９は、本発明に係る培養方法の１ステップを示す側断面図である。図１０は、前記培養方法の１ステップを示す側断面図である。図１１は、前記培養方法の１ステップを示す側断面図である。図１２は、前記培養方法の１ステップを示す側断面図である。図１３は、前記培養方法の１ステップを示す側断面図である。図１４は、前記培養方法の１ステップを示す側断面図である。図１５は、前記培養方法の１ステップを示す側断面図である。図１６は、前記培養方法の１ステップを示す側断面図である。図１７は、本発明に係る細胞凝集塊の選別方法の１ステップを示す側断面図である。図１８は、前記細胞凝集塊の選別方法の１ステップを示す側断面図である。図１９は、前記細胞凝集塊の選別方法の１ステップを示す側断面図である。図２０は、前記細胞凝集塊の選別方法の１ステップを示す側断面図である。図２１は、前記細胞凝集塊の選別方法の１ステップを示す側断面図である。図２２は、前記細胞凝集塊の選別方法の１ステップを示す側断面図である。図２３は、ウェルプレートの一例を示す側断面図である。図２４は、本発明の第４実施形態に係る培養装置の概略的な側断面図である。

　以下、本発明に係る培養装置の実施形態を、図面に基づいて詳細に説明する。この実施形態においては、培養対象となる生物が細胞凝集塊である場合について説明する。細胞凝集塊（スフェロイド；ｓｐｈｅｒｏｉｄ）は、細胞が数個～数十万個凝集して形成されている。そのため、細胞凝集塊の大きさは様々である。生きた細胞が形成する細胞凝集塊は略球形であるが、細胞凝集塊を構成する細胞の一部が変質したり、死細胞となっていたりすると、細胞凝集塊の形状は歪になる、あるいは密度が不均一となる場合がある。バイオ関連技術や医薬の分野における試験において、種々の形状を呈する複数の細胞凝集塊を本実施形態の培養装置にて維持乃至は培養させること、或いは本実施形態の培養装置にて保持した状態で試験に適した形状の細胞凝集塊のみを選別する作業を行うことは、当該培養装置の好適な用途である。

　＜第１実施形態＞
　図１は、本発明の第１実施形態に係る培養装置１の概略的な側断面図である。培養装置１は、細胞凝集塊Ｃ（生物）を維持乃至は培養するための装置であって、培養容器１０１と蓋部材１０２とからなるコンテナ１００と、コンテナ１００内に配置されたプレート２Ａと、ガス交換機構３とを備えている。コンテナ１００は、高さに比べて横幅が長い扁平な円柱型、角柱型の形状を有している。

　培養容器１０１は、細胞凝集塊Ｃの培養領域Ｒを提供する容器であって、その下面側に平坦な底壁を有し、上面側に上部開口を備える有底筒状の容器である。培養容器１０１のキャビティは培養領域Ｒであり、前記上部開口を通して培養対象の細胞凝集塊Ｃが投入される。培養容器１０１には、細胞凝集塊Ｃの培養液Ｌが貯留されている。培養液Ｌは、予め定められた液面ＬＴの高さになるよう、培養容器１０１に注入される。

　蓋部材１０２は、培養容器１０１のキャビティ、つまり培養領域Ｒを閉鎖するように、前記上部開口を完全に覆っている。培養液Ｌは培養容器１０１に満杯には注液されていないので、培養容器１０１のキャビティは上方部分において残存している。蓋部材１０２が培養容器１０１の上部開口に被せられることで、液面ＬＴの上（液面ＬＴと蓋部材１０２の内面との間）に閉鎖空間Ａが形成される。従って、コンテナ１００内部の培養領域Ｒは、培養液Ｌとその上の閉鎖空間Ａとで占有されることになる。蓋部材１０２には、閉鎖空間Ａへ培養ガスを流通させるために、閉鎖空間Ａに連通する入気アダプタ１０３（入口部）及び出気アダプタ１０４（出口部）が付設されている。

　培養容器１０１に貯留される培養液Ｌは、細胞凝集塊Ｃの性状を劣化させないものであれば特に限定されず、細胞凝集塊の種類により適宜選定することができる。培養液Ｌとしては、たとえば基本培地、合成培地、イーグル培地、ＲＰＭＩ培地、フィッシャー培地、ハム培地、ＭＣＤＢ培地、血清などの培地（細胞培養液）のほか、冷凍保存前に添加するグリセロール、セルバンカー（十慈フィールド（株）製）等の細胞凍結液、ホルマリン、蛍光染色のための試薬、抗体、精製水、生理食塩水などを挙げることができる。たとえば、細胞凝集塊としてＢｘＰＣ－３（ヒト膵臓腺癌細胞）を用いる場合には、培養液ＬとしてはＲＰＭＩ－１６４０培地に牛胎児血清ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ）を１０％混ぜたものに、必要に応じて抗生物質、ピルビン酸ナトリウムなどのサプリメントを添加したものを用いることができる。

　プレート２Ａは、細胞凝集塊Ｃを保持するための部材である。プレート２Ａは、細胞凝集塊Ｃを保持した状態で、培養容器１０１に貯留されている培養液Ｌ内に浸漬される。プレート２Ａとしては、細胞凝集塊Ｃを個別に独立して保持できる構造を備えたものが好ましい。なお、プレート２Ａを用いず、細胞凝集塊Ｃを培養容器１０１の底壁で保持させたり、培養液Ｌ中で浮遊させたりしても良い。

　ガス交換機構３は、閉鎖空間Ａ（培養領域Ｒ）を経由して培養ガスを流通させる機構であって、ボンベ３１（ガス供給源）、ポンプ３２、供給配管３０１及び排気配管３０２（配管系統）を備えている。供給配管３０１は、一端が入気アダプタ１０３に接続され、他端がボンベ３１に接続されている。排気配管３０２は、一端が出気アダプタ１０４に接続され、他端が大気中に開放されている。なお、供給配管３０１及び排気配管３０２に、それぞれ開閉弁を取り付け、入気アダプタ１０３の上流側及び出気アダプタ１０４の下流側を閉止できるようにすることが望ましい。また、供給配管３０１にガスマスフローコントローラ等の流量制御部材を組み込むことが望ましい。

　ボンベ３１は、細胞凝集塊Ｃの培養に適した培養ガスを貯留する。例えば、細胞凝集塊Ｃが炭酸ガス条件下での発育が促進される性質を有する場合は、培養ガスは炭酸ガスである。一般に、炭酸ガス培養では、５％～１０％程度の炭酸ガス濃度が必要となる。この場合、ボンベ３１は、２０％～１００％濃度の炭酸ガスを貯留していることが望ましい。マルチガスによる培養が行われる場合には、例えば炭酸ガス、窒素ガス及び酸素ガスのボンベ３１が用いられる。

　ポンプ３２は、供給配管３０１、閉鎖空間Ａ及び排気配管３０２を通して、培養ガスを流通させるためのガス流を発生させる。ポンプ３２は、少なくとも吐出機能を備えていれば良く、ダイアフラム式、ベローズ式、電磁式、ピストン式などの各種のエアーポンプを用いることができる。或いは、ポンプ３２に代替して、ボンベ３１からのガス噴出圧のみでガス流を発生させ、ガスマスフローコントローラ等によってガス流量を制御するガス交換機構３としても良い。

　細胞凝集塊Ｃを培養する手順の一例は次の通りである。先ず、蓋部材１０２を取り外した状態で、培養容器１０１のキャビティ内にプレート２を設置し、上部開口から培養液Ｌを所定量だけ培養容器１０１に注ぐ。次いで、ピペットチップなどの、細胞凝集塊Ｃを吸引して吐出することが可能なチップ部材を用い、細胞凝集塊Ｃをプレート２Ａ上に吐出する。細胞凝集塊Ｃをプレート２Ａ上に良好に担持させることができたら、蓋部材１０２で培養容器１０１の上部開口を塞ぐ。

　その後、コンテナ１００にガス交換機構３を組み付ける。すなわち、ボンベ３１及びポンプ３２が接続された供給配管３０１の一端を入気アダプタ１０３に、排気配管３０２の一端を出気アダプタ１０４にそれぞれ接続する。そして、ポンプ３２を作動させ、ボンベ３１の培養ガスを閉鎖空間Ａへ供給する。培養ガスの供給態様は、特に限定はなく、閉鎖空間Ａが細胞凝集塊Ｃにダメージを与えない環境に維持できる態様であれば良い。

　例えば、所定濃度に調整された培養ガス、一例としては５％の濃度の炭酸ガスを、一定の流量で入気アダプタ１０３から閉鎖空間Ａへ供給し、同じ量だけ出気アダプタ１０４から培養ガスを排出する態様を例示できる。あるいは、閉鎖空間Ａが所定濃度に調整された培養ガスで満たされた後、入気アダプタ１０３及び出気アダプタ１０４を閉止し、所定時間経過後に培養ガスを入れ替える態様でも良い。この場合、所定時間の経過を待つのではなく、閉鎖空間Ａ内にガス濃度センサを配置し、培養ガスの濃度が所定の閾値範囲よりも低下したときに、培養ガスを入れ替えるようにすることもできる。さらに、閉鎖空間Ａにガス濃度センサを配置する態様では、閉鎖空間Ａに常時培養ガスを流通させつつ、培養ガスの濃度に応じてガス流量を制御することで、閉鎖空間Ａ内を一定のガス濃度に保つようにしても良い。

　第１実施形態の培養装置１によれば、培養容器１０１の上部開口が蓋部材１０２で覆われ、培養領域Ｒが閉鎖的な領域とされる。このような閉鎖的な培養領域Ｒにガスを流通させることにより、培養領域Ｒの汚染を防止しつつ、コンテナ１００内に細胞凝集塊Ｃの保管若しくは培養に適した環境を形成することができる。また、閉鎖空間Ａの環境を、細胞凝集塊Ｃの培養に適した環境に維持することができる。すなわち、培養液Ｌ中に浸漬された細胞凝集塊Ｃは、その活動によってガスを発生することがあり、このため閉鎖空間Ａの環境は変化し得る。培養装置１では、閉鎖空間Ａを経由してガスを流通させることができるので、閉鎖空間Ａの環境を一定に維持することが可能となる。これにより、環境変化に伴い細胞凝集塊Ｃにダメージが与えられることを抑止することができる。

　＜第２実施形態＞
　図２は、本発明の第２実施形態に係る培養装置１Ａの概略的な側断面図である。培養装置１Ａは、培養液Ｌを貯留する培養容器１０と、細胞凝集塊Ｃを培養液Ｌ中において担持するプレート２と、第１実施形態と同様なガス交換機構３とを備えている。図３は、培養容器１０の斜視図、図３は、プレート２の上面図、図５は、図４のＶ－Ｖ線断面図である。第１実施形態と相違する点は、蓋部材１０２Ａが培養容器１０に一体的に形成され、蓋部材１０２Ａが培養容器１０の上部開口１Ｈの全てではなく、一部を覆っている点である。蓋部材１０２Ａは、上部開口１Ｈの中央部領域を覆わず、周縁付近を覆っている。

　培養容器１０は、円柱形の形状を備える。培養容器１０の形状は特に限定されないが、ここでは操作性や安定性等の観点から、高さが横幅（直径）に比べて比較的広い扁平な円柱形状のものを培養容器１０として例示している。上部開口１Ｈ（投入開口）は、培養容器１０の上面側に形成され、矩形の形状を有している。上部開口１Ｈは、細胞凝集塊Ｃの投入、並びに、選別された細胞凝集塊Ｃをピックアップするための開口である。上部開口１Ｈの形状には特に限定はなく、例えば円形の上部開口１Ｈとしても良い。プレート２は、この上部開口１Ｈの下方に配置されている。培養容器１０は、透光性の樹脂材料やガラスで作製されていることが望ましい。これにより、培養容器１０の下方に配置されたカメラ等により、プレート２に保持された細胞凝集塊Ｃを観察することができる。

　細胞凝集塊Ｃの投入の際、図１３～図１５に基づき後記で詳述する通り、細胞凝集塊Ｃを含む細胞懸濁液を吸引し保持している分注チップ６４が、上部開口１Ｈに対向して配置される。そして、分注チップ６４から前記細胞懸濁液が、培養容器１０に貯留された細胞凝集塊を含まない培養液Ｌ中に吐出される。また、細胞凝集塊Ｃのピックアップの際、図１７～図１９に基づき後記で詳述する通り、細胞凝集塊Ｃを吸引及び吐出可能なシリンダチップ６７が、上部開口１Ｈに対向して配置される。そして、シリンダチップ６７により、細胞凝集塊Ｃが個別にプレート２上から吸引される。

　培養容器１０は、底壁１１と、外周壁１２と、内周壁１３と天壁１４とからなる蓋部材１０２Ａとを備える。底壁１１は、培養容器１０の底部を区画する平坦な円板部材である。外周壁１２は、底壁１１の外周縁から立設された円筒状の部材である。内周壁１３は、外周壁１２の内部に配置された角筒状の部材である。天壁１４は、培養容器１０の上面側において、内周壁１３の上端部と外周壁１２の上縁部との間を覆う板部材である。

　内周壁１３の上端部は、矩形の上部開口１Ｈを画定している。内周壁１３は、上部開口１Ｈから底壁１１に向けて開口面積が徐々に縮小するように傾斜している。内周壁１３の下端部は、プレート２の外周縁を保持している。天壁１４には、上下方向への貫通孔からなる第１作業孔１５Ｈ及び第２作業孔１６Ｈが穿孔されている。これら作業孔１５Ｈ、１６Ｈを通して、培養容器１０のキャビティへの培養液Ｌの注液、薬品類の注液、若しくは培養液Ｌの吸液などの作業が行われる。さらに本実施形態では、ガス交換機構３の培養容器１０への組み付けのために、第１作業孔１５Ｈには入気アダプタ１５（入口部）が、第２作業孔１６Ｈには出気アダプタ１６（出口部）が取り付けられる。

　プレート２は、上面２Ｕと下面２Ｂとを有する矩形の板状部材である。プレート２は、下面２Ｂが培養容器１０の底壁１１に対して間隔を置いた状態で、内周壁１３の下端部にて保持されている。プレート２は、培養容器１０内の培養液Ｌ中に浸漬されている。つまり、プレート２の上面２Ｕが培養液Ｌの液面ＬＴよりも下方に位置するよう、培養容器１０に培養液Ｌが注液される。

　プレート２は、上面２Ｕ側に配置され細胞凝集塊Ｃを担持する複数の保持部２１と、各保持部２１の配置位置に形成され上面２Ｕから下面２Ｂに直線状に貫通する貫通孔２２とを備えている。本実施形態では、上面視で四角形の保持部２１がマトリクス状に配列されている例を示している。これは一例であり、保持部２１の上面視形状は、丸形、三角形、五角形、六角形等であってもよく、これらがハニカム状、直線状、ランダムに配置されていても良い。或いは、一つの保持部２１だけが備えられているプレート２としても良い。なお、培養容器１０と同様にプレート２も、担持された細胞凝集塊Ｃの下面２Ｂ側からの撮像を可能とするために、透明な部材で形成されることが望ましい。

　図５に示すように、保持部２１の縦断面の形状は、上方に開口した凹曲面２１１（凹部）である。貫通孔２２の上面２Ｕ側の開口は、保持部２１の凹曲面２１１の底面（もっとも深い位置）に配置されている。１の保持部２１とこれに隣接する保持部２１（凹曲面２１１）の上縁部２１２は、互いに近接している。図４では、各保持部２１の形状を際立たせるため、上縁部２１２が比較的広幅を有するように描いているが、実際は図５に示すように上縁部２１２同士は隣接している。このため、隣接する凹曲面２１１の上縁部２１２同士が接することにより形成される稜線部分は、鋭利な凸状の部分となっている。保持部２１の変形実施形態では、凹曲面２１１に代えて、保持部２１の開口面積が上方から下方に向けて小さくなるような直線状の傾斜壁面、階段状の壁面とされる。或いは、開口面積が上方から下方に向けて一定の、円筒型、角筒形の凹部からなる保持部２１とすることもできる。

　保持部２１には、一般は１個の細胞凝集塊が収容されることが企図されている。但し、１の保持部２１に、指定個数の細胞凝集塊を収容させたり、指定量（総体積又は総面積）の細胞凝集塊を収容させたりする場合もある。貫通孔２２のサイズは、所望のサイズの細胞凝集塊は通過できず、所望のサイズ以外の小さな細胞凝集塊や夾雑物を通過させるサイズに選ばれている。プレート２の下面２Ｂと培養容器１０の底壁１１との間の距離は、夾雑物等を底壁１１上に堆積させるのに十分な高さに選ばれる。

　培養容器１０内には、当該容器１０の底壁１１、外周壁１２、内周壁１３、天壁１４及びプレート２によって囲まれた領域が形成されている。この囲まれた領域と外部とは、上述の第１作業孔１５Ｈ及び第２作業孔１６Ｈと貫通孔２２とによって連通している。第１作業孔１５Ｈ又は第２作業孔１６Ｈから細胞凝集塊Ｃを含まない細胞培養液Ｌが注液され、該培養液Ｌの液面ＬＴがプレート２よりも高いレベルになると、培養液Ｌは貫通孔２２を通してプレート２の上面２Ｕ側に至る。培養液Ｌは、液面ＬＴがプレート２を完全に浸漬する高さであって、天壁１４よりも低い高さ（内周壁１３の上下方向の中間付近の高さ）まで注液される。このような注液によって、上部開口１Ｈに対応する領域においてプレート２上には、上部液体層ＬＳが存在するようになる。また、蓋部材１０２Ａの内側には、空間が形成される。

　上記のレベルの液面ＬＴの高さに培養容器１０が培養液Ｌを貯留した状態（図２はこの状態を示す）であって、第１作業孔１５Ｈ及び第２作業孔１６Ｈ（入気アダプタ１５及び出気アダプタ１６）が封止された状態においては、上部開口１Ｈに対応する領域においてプレート２上に存在する上部液体層ＬＳにて貫通孔２２が塞がれることによって、前記空間は密閉された空間（閉鎖空間Ａ）となる。閉鎖空間Ａは、外周壁１２及び内周壁１３の上方部分と、天壁１４と、液面ＬＴとで囲まれる空間である。図３から理解される通り、本実施形態の閉鎖空間Ａは、上部開口１Ｈの領域を除いた環状の領域である。また、培養液Ｌ、上部液体層ＬＳ及び閉鎖空間Ａが存在する領域が、細胞凝集塊Ｃの培養領域Ｒである。

　図６は、細胞凝集塊がプレート２に担持される状況を説明するための模式図である。ここでの細胞凝集塊の担持作業は、種々の細胞凝集塊や夾雑物の中から所望の細胞凝集塊を選別する作業でもある。この細胞選別動作が行われる際、細胞凝集塊を含まない培養液Ｌが上記の通り予め培養容器１０内に注液される。その後、上部開口１Ｈを通してプレート２上の上部液体層ＬＳに向けて、選別対象となる細胞凝集塊Ｃと不可避的に混在する夾雑物Ｃｘとを含む細胞懸濁液が注入される。

　注入された前記細胞懸濁液に含まれる細胞凝集塊Ｃ及び夾雑物Ｃｘは、液面ＬＴから下方に向けて自重により培養液Ｌ内を沈降する。図６では、２つの細胞凝集塊Ｃ１、Ｃ２と３つの夾雑物Ｃｘ１、Ｃｘ２、Ｃｘ３を模式的に示している。プレート２が備える多数の保持部２１は、半球状のキャビティ（凹曲面２１１）が密に配列されており、保持部２１同士を区切る稜線（上縁部２１２）は鋭利である。従って、沈降する細胞凝集塊Ｃ１、Ｃ２及び夾雑物Ｃｘ１、Ｃｘ２、Ｃｘ３は、上縁部２１２付近に滞留することなく、いずれかの保持部２１の凹曲面２１１内に導かれる。

　所定のサイズを備える細胞凝集塊Ｃ１、Ｃ２は、貫通孔２２を通過することができない。従って、これら細胞凝集塊Ｃ１、Ｃ２は、導入された保持部２１上で担持されることになる。一方、夾雑物Ｃｘは、一般に細胞凝集塊Ｃよりは相当小さいサイズであり、貫通孔２２を通過し得る。このため、凹曲面２１１内に導かれた夾雑物Ｃｘは、貫通孔２２を通過して、培養容器１０の底壁１１上に落下する。図６では、夾雑物Ｃｘ１が貫通孔２２を通過しつつあり、夾雑物Ｃｘ２、Ｃｘ３が底壁１１上に落下した状態を示している。このように、選別対象の細胞凝集塊Ｃ１、Ｃ２はプレート２の保持部２１にトラップされ、無用な夾雑物Ｃｘ１、Ｃｘ２、Ｃｘ３は、底壁１１に回収される。以上のような細胞選別動作は、１回のみ実行される場合、或いは必要に応じて複数回繰り返される場合がある。

　一つの代表的な培養装置１Ａの使用例では、上記の細胞選別動作の後、容器１の下方に配置されたカメラにより、細胞凝集塊Ｃを担持したプレート２の画像が撮像される。取得された画像が解析され、図４のようにｎ列ｍ行にマトリクス配置された保持部２１群のうち、どの保持部２１に細胞凝集塊Ｃが担持されているかが座標情報で特定される。ここで把握される細胞凝集塊Ｃの担持状況に基づいて、再度の細胞懸濁液の培養容器１０への注液を行うか否かが判断される。並行して、シリンダチップ６７が装着され、ＸＹＺ方向に移動可能なヘッドユニット６０が準備される（図１７参照）。ヘッドユニット６０が上部開口１Ｈ上に配置され、前記座標情報に基づきターゲットとする保持部２１にシリンダチップ６７がアプローチする。そして、シリンダチップ６７により、当該保持部２１に担持されている細胞凝集塊Ｃが吸引される（図１８、図１９参照）。

　ガス交換機構３は、第１実施形態と同様の構成であり、ボンベ３１、ポンプ３２、供給配管３０１及び排気配管３０２を備える。入気アダプタ１５及び出気アダプタ１６は、閉鎖空間Ａに連通している。供給配管３０１は、一端が入気アダプタ１５に接続され、他端がボンベ３１に接続されている。排気配管３０２は、一端が出気アダプタ１６に接続され、他端が大気中に開放されている。ポンプ３２が作動されることで、ボンベ３１から吐出される培養ガスは、閉鎖空間Ａを経由して入気アダプタ１５から出気アダプタ１６へ流通される。

　培養ガスの前記流通の具体的態様も、第１実施形態と同様な態様を採用することができる。例えば、所定濃度に調整された培養ガスを、一定の流量で入気アダプタ１５から閉鎖空間Ａへ供給し、同じ量だけ出気アダプタ１６から培養ガスを排出する態様を例示できる。あるいは、閉鎖空間Ａが所定濃度に調整された培養ガスで満たされた後、入気アダプタ１５及び出気アダプタ１６を閉止し、所定時間経過後に培養ガスを入れ替える態様でも良い。また、閉鎖空間Ａにガス濃度センサを配置し、閉鎖空間Ａに常時培養ガスを流通させつつ、培養ガスの濃度に応じてガス流量を制御することで、閉鎖空間Ａ内を一定のガス濃度に保つ態様でも良い。

　ところで、上記の細胞選別動作において、１つの保持部２１に複数個の細胞凝集塊Ｃが収容されてしまう場合がある。一般に、一つの保持部２１には一つの細胞凝集塊Ｃが保持されることが、細胞凝集塊Ｃの画像観察やシリンダチップ６７による個別吸引が容易であるという観点から望ましい。しかし、このような細胞凝集塊Ｃの望ましい保持状態を、分注チップ６４を用いた通常の細胞懸濁液の注液動作だけで形成することは難しい。つまり、細胞凝集塊Ｃが概ね均等にプレート２上にばら撒かれた状態を形成することは難しい。

　このような不具合を、本実施形態では、入気アダプタ１５及び出気アダプタ１６の開閉操作と、ポンプ３２の動作とを活用して解消することができる。すなわち、プレート２の貫通孔２２に、下面２Ｂの側から上面２Ｕの側に向けて流れる液流を発生させ、保持部２１に担持された細胞凝集塊Ｃを一旦舞い上がらせる。これにより、折り重なって保持部２１に担持されている細胞凝集塊Ｃを分散させることができる。

　具体的には、前記液流を発生させる際、入気アダプタ１５が開とされ、出気アダプタ１６が閉とされる。そして、ポンプ３２から所定量のガスを閉鎖空間Ａ内に供給させ、当該閉鎖空間Ａを加圧させる。この加圧力の逃げ場は、出気アダプタ１６が閉じられていることから、貫通孔２２のみとなる。従って、貫通孔２２には、前記液流が発生する。液流が発生すると、保持部２１に重なり合うように担持されている細胞凝集塊Ｃは、四散して上方に舞い上がる。この際、上部液体層ＬＳの液面ＬＴは上昇する。その後、出気アダプタ１６が開とされることで閉鎖空間Ａは大気圧に戻り、液面ＬＴも元のレベルに戻る。舞い上がった細胞凝集塊Ｃは、分散状態でプレート２上へ沈降する。しかる後、培養ガスを閉鎖空間Ａに流通させる運転に移行する。

　以上の通りの第２実施形態の培養装置１Ａによれば、細胞凝集塊Ｃを培養容器１０に投入させる領域（投入開口）を除いて、培養領域Ｒが蓋部材１０２Ａで覆われ、培養領域Ｒが閉鎖的な領域とされる。このような閉鎖的な培養領域Ｒの閉鎖空間Ａに培養ガスを流通させることにより、培養領域Ｒの汚染を防止しつつ、培養容器１０内に細胞凝集塊Ｃの保管若しくは培養に適した環境を形成することができる。従って、細胞凝集塊Ｃの投入作業性を良好としつつ、プレート２に担持されている細胞凝集塊Ｃにダメージが与えられることを抑止することができる。

　＜第３実施形態＞
　図７は、本発明の第３実施形態に係る培養装置１Ｂのブロック図である。第３実施形態では、第２実施形態において用いた培養容器１０に、循環配管系統を備えたガス交換機構３Ａが組み合わされてなる培養装置１Ｂを例示する。培養液Ｌを貯留する培養容器１０と、細胞凝集塊Ｃを培養液Ｌ中において担持するプレート２とについては、先に説明したものと同じであるので、ここでは説明を省略する。

　ガス交換機構３Ａは、循環配管３０と、この循環配管３０に分岐接続された供給配管３０３及び排気配管３０４とを含む。循環配管３０は、培養容器１０の入気アダプタ１５（入口部）に一端３０Ａが接続され、出気アダプタ１６（出口部）に他端３０Ｂが接続されてなる配管である。つまり、循環配管３０は、培養容器１０内の閉鎖空間Ａ（培養領域Ｒ）を経由して、培養ガスを循環させることが可能な配管である。供給配管３０３は、一端３０Ａに近い側（培養ガスの循環方向の上流側）において、その下流端が循環配管３０に分岐接続されている。排気配管３０４は、他端３０Ｂに近い側（培養ガスの循環方向の下流側）において、その上流端が循環配管３０に分岐接続されている。なお、図７において循環配管３０、供給配管３０３及び排気配管３０４を矢印で示しており、該矢印の方向はガスの流れる方向を表している。

　さらにガス交換機構３Ａは、先の実施形態で説明したボンベ３１（ガス供給源）及びポンプ３２を含む。ボンベ３１は、供給配管３０３の上流端に接続されている。つまり、ボンベ３１は、循環配管３０に分岐接続されている。ポンプ３２は、循環配管３０の途中に組み入れられている。ポンプ３２の作動により、循環配管３０及び閉鎖空間Ａ内を循環するガス流が発生する。このようなガス交換機構３Ａによれば、培養ガスを循環配管３０で循環させながら、閉鎖空間Ａへ供給することができるので、培養ガスを有効利用することができる。また、閉鎖空間Ａ乃至は循環配管３０内において培養ガスの濃度が変化した場合には、分岐接続されているボンベ３１からの培養ガスの供給、若しくは排気配管３０４からのガス排気によって、閉鎖空間Ａの培養ガスの濃度を調整することが可能となる。

　上記に加え、ガス交換機構３Ａは、流量調整弁３３、三方弁３４（第１弁装置）、調圧弁３５（第２弁装置）、フィルタ３６、湿度調整部４１、温度調整部４２、温度センサ４３、ガスセンサ４４及び制御部５０を備えている。これらは、培養ガスの濃度、温度及び湿度を所望のコンデションに調整するために、ガス交換機構３Ａに備えられている。

　流量調整弁３３は、供給配管３０３に取り付けられ、ボンベ３１から噴出する培養ガスの循環配管３０への流入量を規制する。流量調整弁３３の弁の開度は、制御部５０によってコントロールされる。

　三方弁３４は、入気アダプタ１５よりも培養ガスの循環方向上流側において循環配管３０に組み入れられている。三方弁３４は、循環配管３０内を流れるガスと、ボンベ３１から供給される新たな培養ガスとを混合させるために配置されている。三方弁３４の３つの出入口の内、常時「開」とされる２つの出入口には循環配管３０の上流端と下流端とが各々接続され、必要に応じて開閉される残り１つの出入口には供給配管３０３の下流端が接続されている。ボンベ３１は三方弁３４を介して循環配管３０に接続されており、供給配管３０３が接続された三方弁３４の出入口が「開」とされると、流量調整弁３３で規制された流入量で、培養ガスが循環配管３０に供給される。勿論、三方弁３４の出入口が「閉」とされると、培養ガスは循環配管３０に供給されない。この三方弁３４の開閉制御は、制御部５０によって行われる。なお、流量調整弁３３に供給配管３０３を「閉」とする機能が備えられている場合は、三方弁３４を、弁機能を備えない三方分岐管に置換することができる。

　調圧弁３５は、出気アダプタ１６よりも培養ガスの循環方向下流側において循環配管３０に組み入れられている。調圧弁３５は、循環配管３０と培養容器１０の閉鎖空間Ａとからなる循環経路の内圧を一定に保つために配置されている。調圧弁３５の逃がし口には、排気配管３０４の上流端が接続されている。つまり、排気配管３０４は、調圧弁３５を介して循環配管３０に接続されている。調圧弁３５は常時「閉」であり、「開」とされると、循環配管３０と排気配管３０４とが連通し、循環経路内のガスが排気配管３０４を介して排出される。この調圧弁３５の開閉制御も、制御部５０によって行われる。

　調圧弁３５は、ボンベ３１から培養ガスが循環配管３０に供給される際、その供給の前に、例えば数十ミリ秒前に「開」とされる。培養ガスの供給により循環経路内の内圧が高まると、培養容器１０内の培養液Ｌの液面ＬＴに押圧力が加わることになる。該押圧力によって、培養液Ｌ中の細胞凝集塊Ｃがプレート２上に舞い上がり、良好な細胞凝集塊Ｃの担持状態が乱れてしまうことがある。培養ガスの供給開始前に、予め調圧弁３５を「開」としておけば、培養ガスの流入に伴う前記循環経路の内圧上昇を防止することができる。

　フィルタ３６は、入気アダプタ１５の直ぐ上流側において循環配管３０に組み付けられ、前記循環経路内を循環する培養ガスを清浄に維持する。フィルタ３６は、塵埃や細菌などをトラップすることが可能なフィルタエレメントを備える。入気アダプタ１５から閉鎖空間Ａに入るガスは、事前にフィルタ３６によって清浄化される。

　湿度調整部４１は、三方弁３４とフィルタ３６との間において循環配管３０に組み付けられ、培養ガスが閉鎖空間Ａに導入される前に、当該培養ガスの湿度を調整する。培養容器１０に収容されている培養液Ｌ（培地）は、上部開口１Ｈが存在することから、蒸発し得る。湿度調整部４１は、培地が乾燥しないように、閉鎖空間Ａに供給される培養ガスに適度な水分を含有させるために配置されている。湿度調整部４１としては、電熱により水を加熱してスチームを発生させるタイプ、常温水を超音波により微細な粒子にして放出させるタイプなどを用いることができる。湿度調整部４１の動作は、制御部５０によって制御される。

　温度調整部４２は、三方弁３４とフィルタ３６との間において循環配管３０に組み付けられ、培養ガスが閉鎖空間Ａに導入される前に、当該培養ガスを予め定められた温度に調整する。細胞凝集塊Ｃを培養には、当該細胞凝集塊Ｃの成育にとって望ましい温度帯が存在する。また、実験の目的によっては、企図する温度にて細胞凝集塊Ｃの培養が行われる場合がある。温度調整部４２は、ターゲットとする温度で培養ガスが閉鎖空間Ａに導入されるよう、当該培養ガスを加熱又は冷却する。温度調整部４２の動作は、制御部５０によって制御される。

　培養ガスの加熱のみが専ら予定されている場合は、温度調整部４２として電気ヒーターを用いることができる。培養ガスの加熱及び冷却の双方が予定されている場合は、温度調整部４２としてペルチェ素子を用いることができる。すなわち、培養ガスを冷却する場合は、当該培養ガスと熱交換する面をペルチェ素子の冷却面とし、培養ガスを加熱する場合は、培養ガスと熱交換する面を放熱面とすれば良い。

　温度センサ４３及びガスセンサ４４は、出気アダプタ１６と調圧弁３５との間において循環配管３０に付設されている。温度センサ４３は、循環配管３０内を流れる培養ガスの温度を計測する。ガスセンサ４４は、循環配管３０内を流れる培養ガスの濃度を検出する。培養ガスとして炭酸ガスが用いられる場合は、ガスセンサ４４として炭酸ガスセンサが用いられる。ガスセンサ４４は、出気アダプタ１６の直ぐ下流に配置されているので、検出されるガス濃度は、閉鎖空間Ａから排出されて来る培養ガスの濃度となる。温度センサ４３及びガスセンサ４４の計測値は、制御部５０に送信される。

　制御部５０は、マイクロコンピュータ等からなり、ガス交換機構３Ａの動作を制御する。具体的には制御部５０は、ポンプ３２を制御して循環配管３０内に循環ガス流を発生させると共に、ガスセンサ４４の計測値に基づいて流量調整弁３３、三方弁３４及び調圧弁３５を制御することで、循環配管３０と閉鎖空間Ａとからなる循環経路内の培養ガス濃度を一定に維持する。例えば、培養ガスが５％濃度の炭酸ガスとする。この場合、制御部５０は、ガスセンサ４４の計測する炭酸ガス濃度が５％であれば、三方弁３４を「閉」とし、ボンベ３１から新たな培養ガスを循環配管３０に供給させない。一方、制御部５０は、ガスセンサ４４の計測する炭酸ガス濃度が５％未満であれば、三方弁３４を「開」とし、ボンベ３１から新たな培養ガスを循環配管３０に供給させる。上述の通り、この培養ガス供給の僅かに前に、制御部５０は調圧弁３５を「開」とし、前記循環経路内の内圧が高くなることを防止する。

　また、制御部５０は、温度センサ４３の計測値に基づいて温度調整部４２を制御することで、前記循環経路内の培養ガスの温度を所定温度に維持する。温度調整部４２が電気ヒーターである場合、目標とするガス温度をＴとすると、制御部５０は温度センサ４３の計測値が温度Ｔを超過していると前記ヒーターの出力を低下させ、逆に温度Ｔ未満であると前記ヒーターの出力を上昇させるフィードバック制御を行う。さらに制御部５０は、予め定められたインターバルで湿度調整部４１を動作させ、培養ガスを加湿する。勿論、湿度センサを循環配管３０に配置し、その計測値に基づき湿度調整部４１をフィードバック制御しても良い。

　続いて、制御部５０の制御シーケンスを説明する。図８は、制御部５０の制御下における培養装置１Ｂの動作例を示すフローチャートである。ここでは、温度調整部４２が電気ヒーターである場合を例示している。制御部５０は、初期設定として、三方弁３４の供給配管３０３側及び調圧弁３５を「閉」とし、循環配管３０と閉鎖空間Ａとからなる循環経路を完全に閉じた循環系とする（ステップＳ１）。また、制御部５０は、流量調整弁３３の開度を、予め設定された培養ガスの単位時間当たりの供給量に対応した開度に設定する（ステップＳ２）。

　次いで制御部５０は、ポンプ３２を動作させる（ステップＳ３）。これにより、ポンプ３２の吐出口、循環配管３０の往路、一端３０Ａ、入気アダプタ１５、閉鎖空間Ａ、出気アダプタ１６、他端３０Ｂ、循環配管３０の復路及びポンプ３２の受入口を順次経由する循環ガス流が発生する。そして、制御部５０は、温度調整部４２のヒーターをＯＮとすると共に、湿度調整部４１を動作させ、循環配管３０内のガスの加熱及び加湿を開始する（ステップＳ４）。

　所定のサンプリング周期で、制御部５０はガスセンサ４４から培養ガス濃度の計測値を取得する（ステップＳ５）。サンプリング周期は、例えば３０ｍｓ～５ｍｉｎ程度である。そして、制御部５０は、取得したガス濃度計測値が、予め定められた閾値（上掲の例では５％濃度の炭酸ガス）以下であるか否かを判定する（ステップＳ６）。

　ガス濃度計測値が閾値以下である場合（ステップＳ６でＹＥＳ）、循環配管３０に培養ガスを補充する必要がある。このため制御部５０は、先ず調圧弁３５を「開」とし（ステップＳ７）、続いて三方弁３４を「開」とする（ステップＳ８）。このように制御部５０は、ボンベ３１から培養ガスの補充が必要な際、三方弁３４を制御してボンベ３１から培養ガスを循環配管３０内に導入させるタイミングよりも所定時間だけ早いタイミングに、調圧弁３５を制御して循環配管３０と排気配管３０４とを連通させる。これにより、培養ガスが循環配管３０内に導入されても、前記循環経路内の圧力が上昇することを抑止できる。従って、閉鎖空間Ａを介して培養液Ｌの液面ＬＴに押圧力が与えられることを防止でき、培養液Ｌ内の細胞凝集塊Ｃが揺動したり舞い上がったりすることを回避できる。

　これに対し、ガス濃度計測値が閾値を維持している場合（ステップＳ６でＮＯ）、当該状態を維持するために（培養ガス濃度が上昇しないようにするために）、調圧弁３５は「閉」とされ（ステップＳ９）、三方弁３４も「閉」とされる（ステップＳ１０）。

　続いて制御部５０は、温度センサ４３から培養ガス温度の計測値を取得する（ステップＳ１１）。そして、制御部５０は、取得した温度計測値に基づき、温度調整部４２のヒーター出力を調整する（ステップＳ１２）。つまり、培養ガスの温度を、設定されている温度に維持できるよう、温度調整部４２における培養ガスの加熱度合いを調整する。なお、この温度調整ステップＳ１１、Ｓ１２を、ガス濃度調整ステップＳ５～Ｓ１０と並行して実行しても良い。すなわち、温度センサ４３から培養ガス温度の計測値を取得するサンプリング周期を、ガスセンサ４４のサンプリング周期と異ならせても良い。

　その後、制御部５０は、培養装置１Ｂによる細胞凝集塊Ｃの培養期間が継続しているか否かを確認する（ステップＳ１３）。培養期間が継続しているならば（ステップＳ１３でＹＥＳ）、ステップＳ５以下の動作が繰り返される。一方、培養期間が終了するタイミングであれば（ステップＳ１３でＮＯ）、制御部５０は処理を終了する。

　＜培養方法／細胞凝集塊の選別方法＞
　続いて、図９～図２２を参照して、図２に示した培養装置１Ａを用いた細胞凝集塊Ｃの選別方法について説明する。勿論、用いる培養装置は、図１に示す培養装置１、或いは図７に示す培養装置１Ｂであっても良い。なお、図９～図１６に示すステップは、本発明の培養方法に係る実施形態にも相当する。

　図９及び図１７に示すように、当該選別方法の実施に際しては、ヘッドユニット６０と、このヘッドユニット６０の駆動装置９０とが用いられる。なお、ヘッドユニット６０及び駆動装置９０は、図示の簡略化のために図９及び図１７以外では記載を省いている。また、当該選別方法の実施に際し、培養装置１Ａが備える培養容器１０のほか、培養対象の細胞凝集塊Ｃを含む細胞懸濁液Ｌ１（培養液）を貯留するチューブ７０（第１容器；図９）と、細胞懸濁液Ｌ１を吸引及び吐出可能な分注チップ６４（図９）と、細胞凝集塊Ｃを吸引及び吐出可能なシリンダチップ６７（図１７）と、細胞凝集塊Ｃの移送先となる保持容器８０（第２容器；図１７）とが準備される（準備するステップ）。

　ヘッドユニット６０は、ユニット本体６１と、分注チップ６４が下端に装着される第１ヘッド６２（図９）と、シリンダチップ６７が下端に装着される第２ヘッド６５（図１７）とを含む。第１ヘッド６２及び第２ヘッド６５は、ユニット本体６１に対して上下方向に移動可能である。第１ヘッド６２内には、上下方向に移動するピストンロッド６３が配置されている。また、第２ヘッド６５内には、上下方向に移動するロッド６６が配置されている。ヘッドユニット６０は、水平２方向（ＸＹ方向）に移動可能である。

　図９に示すように、分注チップ６４は、断面積が上方から下方に向けて徐々に小さくなる円錐状の筒体であり、その下端に吸引又は吐出のための開口６４Ｔを備える。ピストンロッド６３が上昇すると、開口６４Ｔには吸引力が発生し、分注チップ６４内に細胞懸濁液Ｌ１が吸引・保持される。一方、ピストンロッド６３が下降すると、開口６４Ｔには吐出力が発生し、分注チップ６４内に保持されている細胞懸濁液Ｌ１が吐出される。ピストンロッド６３の前記上昇及び下降動作、並びに第１ヘッド６２の上下方向への移動動作は、ユニット本体６１内の第１駆動部６３Ｄによって実行される。

　シリンダチップ６７は、細胞凝集塊Ｃの吸引経路となる管状通路を内部に備えるシリンジと、この管状通路の内周壁と摺接しつつ前記管状通路内を進退移動するプランジャとを備えている。図１７に示すように、シリンダチップ６７の下端には、細胞凝集塊Ｃの吸引又は吐出のための開口６７Ｔが備えられている。ロッド６６の下端に前記プランジャが取り付けられている。ロッド６６が上昇すると、前記プランジャが前記シリンジに対して相対的に上昇するのに伴い開口６７Ｔには吸引力が発生し、シリンダチップ６７内（前記管状通路内）に細胞凝集塊Ｃが吸引・保持される。一方、ロッド６６が下降すると、開口６７Ｔには吐出力が発生し、シリンダチップ６７内に保持されている細胞凝集塊Ｃが吐出される。ロッド６６の前記上昇及び下降動作、並びに第２ヘッド６５の上下方向への移動動作は、ユニット本体６１内の第２駆動部６６Ｄによって実行される。

　駆動装置９０は、駆動モータ９１と、駆動モータ９１により回転駆動されるねじ軸９２と、ねじ軸９２に係合される図略のナット部材と、駆動制御部９３とを含む。ねじ軸９２は、チューブ７０の配置位置の上空から、保持容器８０の上空まで水平方向に延びている。前記ナット部材は、ねじ軸９２が正回転又は逆回転すると、水平方向に移動する。ユニット本体６１は、前記ナット部材に取り付けられている。従って、駆動モータ９１によりねじ軸９２が回転駆動されることで、ヘッドユニット６０は水平方向に移動する。

　駆動制御部９３は、駆動モータ９１、第１駆動部６３Ｄ及び第２駆動部６６Ｄの動作を制御する。これにより駆動制御部９３は、ヘッドユニット６０の移動動作、第１ヘッド６２及び第２ヘッド６５の上下動、ピストンロッド６３の上下動に伴う分注チップ６４による細胞懸濁液Ｌ１の吸引・吐出動作、並びに、ロッド６６の上下動に伴うシリンダチップ６７による細胞凝集塊Ｃの吸引・吐出動作を制御する。

　図９は、ヘッドユニット６０がチューブ７０の上空に移動している状態を示している。チューブ７０は、上面に開口部７１を有する容器であり、細胞凝集塊Ｃを含む細胞懸濁液Ｌ１を貯留している。この開口部７１に、第１ヘッド６２の下端に装着された分注チップ６４が対向している。第１ヘッド６２は上昇位置にあり、ピストンロッド６３は、上下方向の可動範囲の最下位置まで下降している。

　図１０は、駆動制御部９３が第１駆動部６３Ｄを動作させ、第１ヘッド６２を下降位置に移動させた状態を示している。この下降によって、分注チップ６４の開口６４Ｔを含む下方部分が、チューブ７０内の細胞懸濁液Ｌ１に浸漬された状態となる。図１１は、第１駆動部６３Ｄによりピストンロッド６３が上昇された状態を示している。これにより、開口６４Ｔには吸引力が発生し、チューブ７０に貯留された細胞凝集塊Ｃを含む細胞懸濁液Ｌ１の一部が、分注チップ６４内に吸引される（吸引するステップ）。

　続いて、ヘッドユニット６０が培養容器１０の上空に移動される。先ず、図１２に示すように、第１駆動部６３Ｄにより第１ヘッド６２が上昇位置に移動される。これにより、細胞懸濁液Ｌ１を保持した分注チップ６４も、細胞懸濁液Ｌ１の液中から離れ、チューブ７０の上に移動する。その後、駆動制御部９３により駆動モータ９１が駆動され、ヘッドユニット６０がねじ軸に沿って右方へ移動される。ヘッドユニット６０は、図１３に示すように、培養容器１０の上空で停止される。分注チップ６４は、培養容器１０の上部開口１Ｈ（投入開口）と対向している。

　その後、図１４に示すように、駆動制御部９３は第１駆動部６３Ｄを制御し、第１ヘッド６２を下降位置に移動させる。この状態では、分注チップ６４が上部開口１Ｈに入り込み、プレート２に接近している。分注チップ６４の開口６４Ｔは、培養液Ｌに入り込んでいても、培養液Ｌの液面よりもやや上方であっても良い。

　しかる後、駆動制御部９３は第１駆動部６３Ｄを制御し、ピストンロッド６３を下降させる。これにより、分注チップ６４に保持されている細胞懸濁液Ｌ１は、上部開口１Ｈを通して培養容器１０内に吐出される（吐出するステップ）。図１５は、前記吐出が行われた後の状態を示している。吐出された細胞懸濁液Ｌ１に含まれていた細胞凝集塊Ｃは、プレート２上に担持されている。この後、図示は省略しているが、第１ヘッド６２は上昇位置に移動される。

　そして、図１６に示す通り、培養容器１０に付設されているガス交換機構３により、成分調整された培養ガス（例えば５％濃度の炭酸ガス）の、培養容器１０内の閉鎖空間Ａを経由した流通が開始される（流通を開始するステップ）。具体的には、図略のコントローラがポンプ３２を動作させ、ボンベ３１に貯留されている培養ガスを、供給配管３０１を通して閉鎖空間Ａへ導入すると共に、導入された培養ガスを排気配管３０２から排出する。実際の装置では、ガス交換機構３のコントローラ（図７では制御部５０）と上述の駆動制御部９３とを統括的にコントロールする統括制御部が存在し、当該統括制御部が上述の動作をシーケンシャルに実行させる。

　その後、このような培養ガスの閉鎖空間Ａへの流通を維持しつつ、細胞凝集塊Ｃがプレート２で保持される（保持するステップ）。細胞凝集塊Ｃを、当該培養容器１０にてそのまま培養する場合は、この状態が所定の培養期間だけ維持される。この際には、上部開口１Ｈに蓋部材を被せ、細胞凝集塊Ｃを覆い隠すようにしても良い。一方、細胞凝集塊Ｃの選別が行われる場合は、次の図１７～図２２のステップが実行される。

　図１７は、ヘッドユニット６０の第２ヘッド６５に装着されているシリンダチップ６７が、培養容器１０の上空で上部開口１Ｈと対向している状態を示している。ここでは、第１ヘッド６２の記載は省かれている。以後、シリンダチップ６７によりプレート２上の細胞凝集塊Ｃが個別に吸引され、保持容器８０に移送される。保持容器８０は、上面に開口８１を有する扁平な容器であり、細胞の培養液Ｌ２を貯留している。培養液Ｌ２中には、ウェルプレート８２が浸漬されている。この細胞凝集塊Ｃの個別吸引～移送の作業の間、ガス交換機構３は稼働を続ける。すなわち、閉鎖空間Ａへの培養ガスの流通を継続し、細胞凝集塊Ｃの劣化を抑止する。なお、培養ガスは、閉鎖空間Ａに導入される前に、予め定められた温度及び／又は湿度に調整される。

　図２３は、ウェルプレート８２の拡大断面図である。ウェルプレート８２は、上面視で矩形の部材であり、上面８２Ｕと下面８２Ｂとを有する。下面８２Ｂは平坦であるが、上面８２Ｕにはマトリクス配置された多数のウェル８３（凹部）を有している。ウェル８３は、縦断面がＵ字型の凹部である。プレート２の保持部２１には貫通孔２２が付設されているが、ウェル８３には貫通孔は付設されていない。各ウェル８３には、図示の通り１の細胞凝集塊Ｃが担持される。なお、このウェルプレート８２を、プレート２に代替して培養容器１０に設置し、ウェルプレート８２のウェル８３に細胞凝集塊Ｃを担持させ、これを培養するようにしても良い。また、図１７では、ウェルプレート８２が培養液Ｌ２中に浸漬されている例を示しているが、各ウェル８３にだけ培養液Ｌ２が注液され、ウェルプレート８２自体は培養液Ｌ２に浸漬されない態様としても良い。

　シリンダチップ６７により細胞凝集塊Ｃを吸引させる前に、細胞凝集塊Ｃを担持しているプレート２の画像が撮像される。好ましくは、透明な部材で形成された培養容器１０及びプレート２を用い、培養容器１０の下方にカメラを配置してプレート２の撮像を行う。取得された画像に基づき、プレート２に担持されている細胞凝集塊Ｃのうち、予め定められた基準を満たす合格検体が特定される。すなわち、細胞凝集塊Ｃの中には、十分な大きさを有していない、又は形状が歪であるというような、その後の培養や試験等に適さないものが混在している。従って、合格検体を選別するステップが必要となる。この選別は、ユーザーの目視、若しくは取得された画像の解析により行われる。その後、合格検体として特定された細胞凝集塊Ｃの、プレート２上における担持位置（保持部２１の位置）を特定する座標情報が導出される。この座標情報は、第２ヘッド６５（シリンダチップ６７）の下降位置を特定する情報となる。

　図１７の状態において、吸引ターゲットする１の細胞凝集塊Ｃが特定され、その座標情報に応じて第２ヘッド６５の位置合わせが行われる。図示は省略しているが、ヘッドユニット６０は、ねじ軸９２の延伸方向（Ｘ方向）だけでなく、該ねじ軸９２と水平面で直交する方向（Ｙ方向）にも移動可能である。駆動制御部９３は、ヘッドユニット６０をＸＹ方向に微小移動させることで、第２ヘッド６５の位置合わせを行う。このとき、ロッド６６は下降位置である。

　図１８は、駆動制御部９３により第２駆動部６６Ｄが制御され、第２ヘッド６５が下降位置に移動された状態を示している。このとき、シリンダチップ６７の下端の開口６７Ｔは培養液Ｌ内に入り込み、ターゲットとする１の細胞凝集塊Ｃに近接している。その後、駆動制御部９３は、第２駆動部６６Ｄを制御し、前記プランジャが取り付けられているロッド６６を上昇位置に移動する。これにより、前記１の細胞凝集塊Ｃは、シリンダチップ６７内（前記シリンジの前記管状通路内）に吸引される（個別に吸引するステップ）。

　そして、駆動制御部９３は第２駆動部６６Ｄを制御し、第２ヘッド６５を上昇位置に移動させる。図１９は、前記移動の後の状態を示している。シリンダチップ６７内には、僅かな培養液Ｌと１の細胞凝集塊Ｃが保持されている。この状態から駆動制御部９３は駆動モータ９１を駆動し、ヘッドユニット６０を、図２０に示すように、保持容器８０の上空まで移動させる。その後、駆動制御部９３は、細胞凝集塊Ｃの吐出先となるウェルプレート８２上の１のウェル８３の直上にシリンダチップ６７が位置合わせされるよう、ヘッドユニット６０を微小移動させる。

　続いて、図２１に示すように、駆動制御部９３は第２駆動部６６Ｄを制御し、第２ヘッド６５を下降位置に移動させる。これにより、シリンダチップ６７の開口６７Ｔが、吐出対象の１のウェル８３内に入り込んだ状態となる。そして、駆動制御部９３は第２駆動部６６Ｄを制御し、ロッド６６を下降させる。これにより、開口６７Ｔには吐出力が発生し、シリンダチップ６７内に保持されている細胞凝集塊Ｃがウェル８３内に吐出される（第２容器に吐出するステップ）。

　しかる後、駆動制御部９３は第２駆動部６６Ｄを制御し、第２ヘッド６５を上昇位置に移動させる。図２２は、前記移動の後の状態を示している。ウェル８３には細胞凝集塊Ｃが保持されている。この後、駆動制御部９３は駆動モータ９１を駆動し、ヘッドユニット６０を、培養容器１０の上空まで再び移動させる。そして、図１７～図２２の動作が、合格検体と判定された細胞凝集塊Ｃをプレート２から全てウェルプレート８２に移送するまで繰り返される。この間、閉鎖空間Ａへの培養ガスの流通が継続される。

　以上説明した通りの本実施形態の培養装置によれば、閉鎖的な培養領域Ｒ（閉鎖空間Ａ）に培養ガスを流通させることにより、培養領域Ｒの汚染の問題を軽減化しつつ、培養容器１０内に細胞凝集塊Ｃの保管若しくは培養に適した環境を形成することができる。また、同様な環境をチャンバー内などで作成する場合、或いは実験室内全体の環境を調整する場合に比べて、本実施形態では培養容器１０のみに培養ガスを流通させるだけで済むので、装置構成を大幅に簡略化、コンパクト化することができる。

　上記で説明した実施形態は本発明の一例であり、本発明はこれらに限定されるものではない。例えば、上記実施形態では、培養容器１０に貯留した培養液Ｌ中にプレート２を浸漬し、該プレート２に細胞凝集塊Ｃを担持させる例を示した。しかし、プレート２を培養液Ｌに浸漬することは必須ではない。

　図２４は、本発明の第４実施形態に係る培養装置１Ｃの概略的な側断面図である。培養装置１Ｃは、培養容器１０１と蓋部材１０２とからなるコンテナ１００と、コンテナ１００内に配置された多孔プレート８４と、ガス交換機構３とを備えている。コンテナ１００及びガス交換機構３は、第１実施形態と同じである。多孔プレート８４は、平板状のプレートであり、上下方向に貫通する多数の保持孔８５（保持部）を備える。保持孔８５には、培養液の液滴ＬＤが保持されている。この液滴ＬＤ内には、細胞凝集塊Ｃが含まれている。コンテナ１００内の閉鎖空間は培養領域Ａ０であるが、培養液は貯留されておらず、多孔プレート８４が担持する液滴ＬＤのみが培養液として存在する。培養領域Ａ０内には、加湿用に蒸留水等を保持する部位を設けることが望ましい。

　コンテナ１００の内部において、多孔プレート８４の下面と培養容器１０１の底壁との間に空間が存在するよう、多孔プレート８４はコンテナ１００にて保持されている。ガス交換機構３は、コンテナ１００内の培養領域Ａ０を通して培養ガスを流通させる。培養ガスは、液滴ＬＤ中の細胞凝集塊Ｃに作用し、当該細胞凝集塊Ｃの成育を促進する。このような実施形態であっても、本発明は実施可能である。

　なお、図２４では、多孔プレート８４がコンテナ１００で完全に覆われている例を示したが、これに代えて、多孔プレート８４の下面側が閉鎖空間に臨み、上面側は外部に露出している態様としても良い。この態様によれば、多孔プレート８４の保持孔８５に対して上方から分注チップ６４をアクセスさせることができ、また、多孔プレート８４の下面側に垂下している液滴ＬＤを培養ガスに曝すことができる。

　なお、上述した具体的実施形態には以下の構成を有する発明が主に含まれている。

　この培養装置によれば、培養容器の上部開口の少なくとも一部が蓋部材で覆われ、培養領域が閉鎖的な領域とされる。このような閉鎖的な培養領域にガスを流通させることにより、前記培養領域の汚染の問題を軽減化しつつ、前記培養容器内に生物の保管若しくは培養に適した環境を形成することができる。

　上記の培養装置において、前記培養容器は、生物の培養液を所定の液面高さで貯留する容器であり、前記蓋部材は、前記培養液の液面上に閉鎖空間が形成されるように、前記上部開口の一部を覆い、前記培養領域は前記培養液及び前記閉鎖空間を含み、前記ガス交換機構は、前記閉鎖空間を経由してガスを流通させることが望ましい。

　この培養装置によれば、前記閉鎖空間の環境を、生物の培養に適した環境に維持することができる。すなわち、培養液中に浸漬された生物は、その活動によってガスを発生することがあり、このため前記閉鎖空間の環境は変化し得る。上記培養装置では、閉鎖空間を経由してガスを流通させることができるので、前記閉鎖空間の環境を一定に維持することが可能となる。これにより、環境変化に伴い生物にダメージが与えられることを抑止することができる。

　上記の培養装置において、前記ガス交換機構は、前記生物の培養に適した培養ガスを貯留するガス供給源と、前記閉鎖空間に前記培養ガスを導く供給配管と、前記閉鎖空間の前記培養ガスを排気させる排気配管とを含む配管系統と、前記配管系統及び前記閉鎖空間内において前記培養ガスを流通させるポンプとを含む構成とすることができる。

　この場合、前記培養容器又は前記蓋部材には、前記閉鎖空間に連通する入口部及び出口部が備えられ、前記配管系統は、前記入口部に一端が接続され、前記出口部に他端が接続された循環配管を含み、前記ポンプは、前記循環配管に組み入れられ、前記ガス供給源及び前記排気配管は、前記循環配管に分岐接続されていることが望ましい。

　この培養装置によれば、前記培養ガスを前記循環配管で循環させながら、前記閉鎖空間へ供給することができるので、培養ガスを有効利用することができる。また、前記循環配管内において培養ガスの濃度が変化した場合には、分岐接続されているガス供給源からの培養ガスの供給、若しくは循環配管からのガス排気によって、前記培養ガスの濃度を調整することが可能となる。さらに、閉ループ内で培養ガスが循環されるので、前記培養ガスのコンタミネーションを防止できる利点もある。

　上記の培養装置において、前記循環配管の、前記入口部よりも前記培養ガスの循環方向上流側に組み入れられる第１弁装置と、前記循環配管の、前記出口部よりも前記培養ガスの循環方向下流側に組み入れられる第２弁装置と、前記ポンプ、前記第１弁装置及び前記第２弁装置の動作を制御する制御部と、をさらに備え、前記ガス供給源は、前記第１弁装置を介して前記循環配管に接続され、前記排気配管は、前記第２弁装置を介して前記循環配管に接続されていることが望ましい。

　この培養装置によれば、制御部は、前記循環配管への培養ガスの供給が必要な場合、前記第１弁装置を制御して前記ガス供給源から前記培養ガスを供給させ得る。また、制御部は、前記循環配管のガスの排気が必要な場合は、前記第２弁装置を制御して前記排気配管からの排気を行わせ得る。

　この場合、前記制御部は、前記培養ガスを流通させる際、前記第１弁装置を制御して前記ガス供給源から前記培養ガスを前記循環配管内に導入させるタイミングよりも所定時間だけ早いタイミングに、前記第２弁装置を制御して前記循環配管と前記排気配管とを連通させることが望ましい。

　この培養装置によれば、ガス供給源から培養ガスを循環配管内に導入されるよりも所定時間前に、循環配管と排気配管とが連通される。従って、培養ガスが循環配管内に導入されても、前記循環配管内の圧力が上昇することを抑止できる。圧力変動が生じると、前記閉鎖空間を介して前記培養液の液面に押圧力を与えることとなり、前記培養液内の生物を揺動したり舞い上がらせたりして、当該生物に悪影響を及ぼし得る。上記培養装置によれば、このような問題を回避できる。

　上記の培養装置において、前記ガス交換機構は、前記閉鎖空間に導入される前に、前記培養ガスを予め定められた温度に調整する温度調整部をさらに備えることが望ましい。また、前記ガス交換機構は、前記閉鎖空間に導入される前に、前記培養ガスの湿度を調整する湿度調整部をさらに備えることが望ましい。

　これらの培養装置によれば、前記閉鎖空間の温度及び湿度を、生物の培養に適した温度及び湿度に維持することができる。

　上記の培養装置において、前記上部開口のうち前記蓋部材で覆われていない投入開口に対向した状態で前記培養液中に浸漬され、前記培養対象の生物を担持する複数の保持部を有するプレートをさらに備えることが望ましい。

　この培養装置によれば、培養対象となる生物を、培養液中においてプレートによって安定的に保持することができる。

　上記の培養装置において、前記プレートは、上面と下面とを有し、前記下面が前記培養容器の底壁に対して間隔を置いた状態で前記培養体中に浸漬され、前記保持部は、前記上面側に配置され、各保持部の配置位置に形成され前記上面から前記下面に貫通する貫通孔をさらに備えていることが望ましい。

　この培養装置によれば、所定サイズの生物を保持部で保持させる一方で、小サイズの夾雑物などの異物を前記貫通孔から落下させ、培養容器の底壁で回収することができる。従って、必要な生物だけをプレートで担持させ、培養させることができる。

　上記の培養装置において、前記プレートは、上面と下面とを有し、前記培養液中に浸漬され、前記保持部は、前記上面側に配置された複数の凹部であることが望ましい。

　この培養装置によれば、培養液中に浸漬した状態で生物をプレートの凹部で担持させ、培養させることができる。

　また、培養装置は、前記培養領域中に配置され、前記培養対象の生物を保持する複数の保持部を有するプレートをさらに備え、前記保持部は、前記生物を含む培養液を液滴の状態で保持する態様とすることができる。

　この培養装置によれば、内部に生物が含まれた液滴が前記培養領域に配置され、前記ガスに曝されることとなる。従って、培養容器内の閉鎖された環境において、前記液滴内で前記生物を培養することができる。

　上記の培養方法によれば、分注チップにより培養対象の生物を含む培養液をチューブから培養容器へ移送した後、当該培養容器の前記閉鎖空間の環境を、生物の培養に適した環境に維持することができる。すなわち、培養液中に浸漬された生物は、その活動によってガスを発生することがあり、このため前記閉鎖空間の環境は変化し得る。上記培養方法では、閉鎖空間を経由して培養ガスを流通させることができるので、前記閉鎖空間の環境を一定に維持することが可能となる。これにより、環境変化に伴い生物にダメージが与えられることを抑止することができる。

　上記の細胞凝集塊の選別方法によれば、分注チップにより細胞凝集塊を含む培養液をチューブから培養容器へ移送した後、前記細胞凝集塊がシリンダチップにより前記培養容器から吸引されるまでの間、当該培養容器の前記閉鎖空間の環境を、細胞凝集塊の培養に適した環境に維持することができる。

　上記の細胞凝集塊の選別方法において、前記培養ガスは、前記閉鎖空間に導入される前に、予め定められた温度及び／又は湿度に調整されることが望ましい。

　以上説明した本発明によれば、簡易な構成で、培養容器に保持された生物にダメージを可及的に与えないようにする機構を備えた培養装置、これを用いた培養方法及び細胞凝集塊の選別方法を提供することができる。

Claims

　生物の培養領域を提供する容器であって、前記培養領域中に培養対象の生物を投入させるための上部開口を備える培養容器と、
　前記培養領域を閉鎖するように、前記上部開口の少なくとも一部を覆う蓋部材と、
　前記培養領域を経由してガスを流通させるガス交換機構と、
を備える培養装置。
　請求項１に記載の培養装置において、
　前記培養容器は、生物の培養液を所定の液面高さで貯留する容器であり、
　前記蓋部材は、前記培養液の液面上に閉鎖空間が形成されるように、前記上部開口の一部を覆い、
　前記培養領域は前記培養液及び前記閉鎖空間を含み、
　前記ガス交換機構は、前記閉鎖空間を経由してガスを流通させる、培養装置。
　請求項１又は２に記載の培養装置において、
　前記ガス交換機構は、
　　前記生物の培養に適した培養ガスを貯留するガス供給源と、
　　前記閉鎖空間に前記培養ガスを導く供給配管と、前記閉鎖空間の前記培養ガスを排気させる排気配管とを含む配管系統と、
　　前記配管系統及び前記閉鎖空間内において前記培養ガスを流通させるポンプと、
を含む、培養装置。
　請求項３に記載の培養装置において、
　前記培養容器又は前記蓋部材には、前記閉鎖空間に連通する入口部及び出口部が備えられ、
　前記配管系統は、前記入口部に一端が接続され、前記出口部に他端が接続された循環配管を含み、
　前記ポンプは、前記循環配管に組み入れられ、
　前記ガス供給源及び前記排気配管は、前記循環配管に分岐接続されている、培養装置。
　請求項４に記載の培養装置において、
　前記循環配管の、前記入口部よりも前記培養ガスの循環方向上流側に組み入れられる第１弁装置と、
　前記循環配管の、前記出口部よりも前記培養ガスの循環方向下流側に組み入れられる第２弁装置と、
　前記ポンプ、前記第１弁装置及び前記第２弁装置の動作を制御する制御部と、をさらに備え、
　前記ガス供給源は、前記第１弁装置を介して前記循環配管に接続され、
　前記排気配管は、前記第２弁装置を介して前記循環配管に接続されている、培養装置。
　請求項５に記載の培養装置において、
　前記制御部は、前記培養ガスを流通させる際、前記第１弁装置を制御して前記ガス供給源から前記培養ガスを前記循環配管内に導入させるタイミングよりも所定時間だけ早いタイミングに、前記第２弁装置を制御して前記循環配管と前記排気配管とを連通させる、培養装置。
　請求項２～６のいずれか１項に記載の培養装置において、
　前記ガス交換機構は、前記閉鎖空間に導入される前に、前記培養ガスを予め定められた温度に調整する温度調整部をさらに備える、培養装置。
　請求項２～７のいずれか１項に記載の培養装置において、
　前記ガス交換機構は、前記閉鎖空間に導入される前に、前記培養ガスの湿度を調整する湿度調整部をさらに備える、培養装置。
　請求項２～８のいずれか１項に記載の培養装置において、
　前記上部開口のうち前記蓋部材で覆われていない投入開口に対向した状態で前記培養液中に浸漬され、前記培養対象の生物を担持する複数の保持部を有するプレートをさらに備える、培養装置。
　請求項９に記載の培養装置において、
　前記プレートは、
　　上面と下面とを有し、前記下面が前記培養容器の底壁に対して間隔を置いた状態で前記培養体中に浸漬され、
　　前記保持部は、前記上面側に配置され、
　　各保持部の配置位置に形成され前記上面から前記下面に貫通する貫通孔をさらに備えている、培養装置。
　請求項９に記載の培養装置において、
　前記プレートは、上面と下面とを有し、前記培養液中に浸漬され、
　前記保持部は、前記上面側に配置された複数の凹部である、培養装置。
　請求項１に記載の培養装置において、
　前記培養領域中に配置され、前記培養対象の生物を保持する複数の保持部を有するプレートをさらに備え、
　前記保持部は、前記生物を含む培養液を液滴の状態で保持する、培養装置。
　培養対象の生物を含む培養液を貯留するチューブと、請求項２～８のいずれか１項に記載の培養装置と、前記培養液を吸引及び吐出可能な分注チップとを準備するステップと、
　前記分注チップにより、前記チューブから前記培養対象の生物を含む培養液を吸引するステップと、
　前記吸引された培養液を、前記上部開口のうち前記蓋部材で覆われていない投入開口を通して、前記分注チップから前記培養容器内に吐出するステップと、
　前記ガス交換機構により、成分調整された培養ガスの前記閉鎖空間を経由した流通を開始するステップと、
　前記培養ガスを前記閉鎖空間に流通させつつ、前記培養対象の生物を前記培養容器内で保持するステップと、
を含む培養方法。
　培養対象の生物としての細胞凝集塊を含む培養液を貯留する第１容器と、請求項９～１１のいずれか１項に記載の培養装置と、前記培養液を吸引及び吐出可能な分注チップと、前記細胞凝集塊を吸引及び吐出可能なシリンダチップと、前記細胞凝集塊の移送先となる第２容器とを準備するステップと、
　前記分注チップにより、前記第１容器から前記細胞凝集塊を含む培養液を吸引するステップと、
　前記吸引された培養液を、前記投入開口を通して前記分注チップから前記培養容器内に吐出し、前記プレートの前記保持部に前記細胞凝集塊を担持させるステップと、
　前記ガス交換機構により、成分調整された培養ガスの前記閉鎖空間を経由した流通を開始するステップと、
　前記培養ガスを前記閉鎖空間に流通させつつ、前記保持部に担持された前記細胞凝集塊を、前記シリンダチップで個別に吸引するステップと、
　前記吸引された細胞凝集塊を、前記シリンダチップから前記第２容器に吐出するステップと、
を含む細胞凝集塊の選別方法。
　請求項１４に記載の細胞凝集塊の選別方法において、
　前記培養ガスは、前記閉鎖空間に導入される前に、予め定められた温度及び／又は湿度に調整される、細胞凝集塊の選別方法。