KR102645547B1 - 3d 세포 구성물을 제조하기 위한 바이오 프린터 - Google Patents

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KR102645547B1
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에이단 패트릭 오마호니
줄리오 세자르 칼데이라 리베이로
사무엘 제임스 마이어스
키에란 조셉 오마호니
앤드류 리언 벨라
테오필 알라드
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인벤티아 라이프 사이언스 피티와이 엘티디
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Abstract

3차원(3D) 세포 구성물을 제조하기 위한 바이오 프린터이며, 유체 샘플을 유지하기 위한 하나 이상의 유지 저장조; 샘플 용기를 유지하고 3D 세포 구성물이 인쇄될 기판을 지지하기 위한 인쇄 스테이지; 하나 이상의 유지 저장조와 유체 연통하는 샘플 로딩 시스템으로서, 샘플을 샘플 용기로부터 하나 이상의 유지 저장조로 로딩하도록 구성된 것인, 샘플 로딩 시스템; 샘플 로딩 시스템과 유체 연통하는 펌프로서, 샘플 용기로부터 샘플을 흡인하고 하나 이상의 유지 저장조로 샘플을 펌핑하도록 구성된 것인, 펌프; 및 하나 이상의 저장조와 유체 연통하는 액적 분배 시스템으로서, 하나 이상의 저장조로부터 인쇄 스테이지에 의해 지지되는 기판 상에 샘플 액적을 인쇄하도록 구성되는 것인, 액적 분배 시스템을 포함한다.

Description

3D 세포 구성물을 제조하기 위한 바이오 프린터
기술 분야
본 기술은 3차원(three-dimensional)(3D) 세포 구성물을 제조하기 위한 바이오 프린터, 3D 세포 구성물을 바이오 인쇄하는 프로세스, 및 바이오 인쇄된 3D 세포 구성물에 관한 것이다.
관련 출원
본 출원은 2017년 12월 8일자로 출원된 호주 가특허 출원 제2017904946호에 기초하고 그 우선권을 주장하며, 그 내용은 그 전체가 참조로 포함된다.
시험관내 세포 생물학의 주력은 세포 배양이며, 세포 배양에서 1차 또는 무한증식 세포는 단순히 플라스틱 또는 유리 표면 상에 배양된다. 세포 증식, 분화 및 외부 자극에 대한 반응과 같은 다수의 세포 특성은 생체내에서 발견되는 2차원(two dimensional)(2D) 및 3D 환경에서 근본적으로 세포에 대해 상이하다. 특히, 약물 개발 및 정밀 의약 프로그램의 경우, 3D 동물 환경을 더 잘 반영하고 따라서 실패한 동물 실험의 수를 제한하는 세포 배양 조건이 매우 유리할 것이다.
예를 들어, 암세포 생물학에서, 3D 모델은, 2D 세포 배양 모델과 비교하여, 저산소 영역, 화학적 및 생물학적 인자의 구배 분포, 및 신생 혈관 유발(pro-angiogenic) 및 다약제 내성(multidrug resistance) 단백질의 발현을 비롯하여 보다 많은 생체내 종양-유사 특징을 나타낸다.
그러한 이유로, 3D 다세포 모델은 일반적으로 보다 널리 사용되는 2D 세포 배양보다 생체내 시스템의 우수한 모델로 고려된다.
또한, 다세포 생물학에서 대부분의 세포 구성물은 3차원적으로 조직되어 있다. 수많은 연구에 따르면 3D 바이오 인쇄 기술을 사용한 세포의 인쇄가 보고되었다((Murphy and Atala, 2014)에서 검토됨).
많은 상업적으로 이용 가능한 3D 바이오 프린터, 예를 들어:EnvisionTEC에 의한 3D-Bioplotter®; GeSiM에 의한 BioScaffolder; Cellink에 의한 Bio X; RegenHU에 의한 BioFactory®; BioBots에 의한 BioBot 2가 존재한다. 상업적으로 이용 가능한 3D 바이오 프린터는 가장 일반적으로 미세 압출, 열 잉크젯 또는 압전 잉크젯 기술을 기반으로 한다. 상업적으로 이용 가능한 3D 바이오 프린터는 가장 일반적으로 프린터에 물질을 로딩하기 위한 카트리지(예를 들어, Nordson Optimum® Syringe Barrels)를 사용한다. 이들 카트리지 각각은 흔히 단일 프린트 헤드에 결합된다. 카트리지 충전, 취급, 설치 및 제거 중에 멸균 상태의 유지 관리가 도전 의식을 불러일으킨다.
3D 바이오 인쇄 용례를 위한 장기 또는 조직 아키텍처의 3D 모델 설계는 크게 다음을 기반으로 한다:
1) 데이터 수집을 위한 비침습적 의료 영상 기술(예로서, 컴퓨터 단층 촬영(computed tomography)(CT) 및 자기 공명 영상(magnetic resonance imaging)(MRI)); 및
2) 정보 디지털화, 3D 렌더링 모델의 생성 및 2D 단면 이미지의 생성을 위한 컴퓨터 지원 설계 및 컴퓨터 지원 제조(computer-aided design and computer-aided manufacturing)(CAD-CAM) 툴 및 수학적 모델링(Murphy and Atala, 2014; Horn and Harrysson, 2012).
3D 세포 배양 모델을 확장 가능하고 반복 가능하며 비용 효율적인 방식으로 약물 발견, 개인화된 의약 및 일반적인 세포 생물학에 용이하게 적용하는 툴 및 기술에 대한 요구가 존재한다.
본 발명자는 시험관내 3D 세포 배양 분석 및 그 어레이를 제조하기 위한 디바이스, 시스템 및 방법을 개발하였다.
제1 양태에서, 본 발명은 3차원(3D) 세포 구성물을 제조하기 위한 바이오 프린터를 제공하는 것으로, 바이오 프린터는:
유체 샘플을 유지하기 위한 하나 이상의 유지 저장조;
샘플 용기를 유지하고 3D 세포 구성물이 인쇄될 기판을 지지하기 위한 인쇄 스테이지;
하나 이상의 유지 저장조와 유체 연통하는 샘플 로딩 시스템으로서, 샘플을 샘플 용기로부터 하나 이상의 유지 저장조로 로딩하도록 구성된 것인, 샘플 로딩 시스템;
샘플 로딩 시스템과 유체 연통하는 펌프로서, 샘플 용기로부터 샘플을 흡인하고 하나 이상의 유지 저장조로 샘플을 펌핑하도록 구성된 것인, 펌프; 및
하나 이상의 저장조와 유체 연통하는 액적 분배 시스템으로서, 하나 이상의 저장조로부터 인쇄 스테이지에 의해 지지되는 기판 상에 샘플 액적을 인쇄하도록 구성되는 것인, 액적 분배 시스템을 포함한다.
일 실시예에서, 바이오 프린터는 하나 이상의 유지 저장조, 인쇄 스테이지, 홀더, 샘플 로딩 시스템, 펌프, 및 액적 분배 시스템을 둘러싸는 하우징을 더 포함한다.
일 실시예에서, 바이오 프린터는 하우징 내에 배치된 공기 유동 시스템을 더 포함하며, 공기 유동 시스템은 하우징 내에 층류 공기 유동을 유도하도록 구성된다.
일 실시예에서, 공기 유동 시스템은 하우징 내에 층류 공기 유동을 유도하기 위한 팬을 포함한다.
일 실시예에서, 공기 유동 시스템은 적어도 하나의 공기 필터를 포함한다.
일 실시예에서, 샘플 로딩 시스템은 샘플 용기에 삽입하기 위한 니들을 포함하고, 펌프는 니들이 샘플 용기에 삽입될 때 니들을 통해 유체를 흡인하도록 구성된다.
일 실시예에서, 바이오 프린터는 니들에 결합된 제1 위치설정 유닛을 더 포함하고, 제1 위치설정 유닛은 샘플 용기에 니들을 삽입하고 샘플 용기로부터 니들을 인출하도록 구성된다.
일 실시예에서, 바이오 프린터는 트랙을 갖는 제2 위치설정 유닛을 더 포함하고, 제2 위치설정 유닛은 니들 및 액적 분배 시스템에 결합되고 제2 위치설정 유닛의 트랙을 따라 니들 및 액적 분배 시스템을 이동시키도록 구성된다.
일 실시예에서, 바이오 프린터는 트랙을 갖는 제3 위치설정 유닛을 더 포함하고, 제3 위치설정 유닛은 인쇄 스테이지에 결합되고 제3 위치설정 유닛의 트랙을 따라 인쇄 스테이지를 이동시키도록 구성된다.
일 실시예에서, 제2 위치설정 유닛의 트랙은 제3 위치설정 유닛의 트랙에 실질적으로 직각으로 연장된다.
일 실시예에서, 바이오 프린터는 복수의 유지 저장조를 더 포함하고, 샘플 로딩 시스템은 샘플 용기로부터 샘플을 복수의 저장조 중 임의의 하나에 로딩하도록 구성된다.
일 실시예에서, 샘플 용기는 복수의 샘플 웰(sample well)을 갖는 트레이이고, 샘플 웰은 샘플을 수용하도록 구성되고, 샘플 로딩 시스템은 샘플 웰 중 임의의 하나로부터 샘플을 유지 저장조 중 임의의 하나로 로딩하도록 구성된다.
일 실시예에서, 바이오 프린터는 샘플 로딩 시스템으로부터 폐기물을 수용하도록 구성된 폐기물 용기를 더 포함한다.
일 실시예에서, 폐기물 용기는 트레이 상에 제공된다
일 실시예에서, 펌프는 유지 저장조 중 하나로부터 샘플을 흡인하고 샘플 로딩 시스템으로부터 샘플을 펌핑하도록 구성된다.
일 실시예에서, 바이오 프린터는 각각의 유지 저장조 내의 압력을 조절하기 위해 각각의 유지 저장조와 유체 연통하도록 결합된 압력 조절기를 더 포함한다.
일 실시예에서, 바이오 프린터는 펌프, 샘플 로딩 시스템, 각각의 유지 저장조, 및 압력 조절기와 유체 연통하는 선택기 밸브를 더 포함하고, 선택기 밸브는 펌프를 샘플 로딩 시스템 및 각각의 유지 저장조에 유체 연통하게 선택적으로 결합시키도록 구성된다.
일 실시예에서, 압력 조절기는 압축 공기 공급원에 유체 연통하도록 제거 가능하게 결합된다.
제2 양태에서, 본 발명은 제1 양태의 바이오 프린터를 사용하여 하나 이상의 샘플의 액적을 퇴적시키는 단계를 포함하는 3차원 세포 구성물을 제조하는 방법을 제공한다.
제3 양태에서, 본 발명은 3차원 세포 구성물을 제조하는 방법을 제공하는 것으로, 방법은:
제1 양태의 바이오 프린터를 제공하는 단계;
기판을 인쇄 스테이지에 제공하는 단계;
샘플을 포함하는 샘플 용기를 인쇄 스테이지에 제공하는 단계;
샘플을 샘플 로딩 시스템에 의해 유지 저장조 중 하나에 로딩하는 단계; 및
액적 분배 시스템을 사용하여 유지 저장조로부터 기판 상에 샘플을 인쇄하여 3차원 세포 구성물을 형성하는 단계를 포함한다.
3D 세포 구성물을 제조하기 위한 바이오 프린터가 또한 개시되며, 바이오 프린터는:
샘플을 샘플 용기로부터 유지 저장조로 로딩하기 위한 샘플 로딩 시스템;
샘플을 유지 저장조로 지향시키기 위해 유지 저장조와 유체 연통하는 선택기 밸브;
유지 저장조와 유체 연통하는 액적 분배 시스템으로서, 샘플 액적을 유지 저장조로부터 기판 상에 인쇄하도록 구성된 것인, 액적 분배 시스템;
샘플 로딩 시스템, 선택기 밸브 및 액적 분배 시스템의 작동을 제어하기 위한 제어 시스템;
층류 공기 유동 시스템; 및
샘플 로딩 시스템, 선택기 밸브, 액적 분배 시스템 및 층류 공기 유동 시스템을 둘러싸는 하우징을 포함한다.
일 실시예에서, 샘플 로딩 시스템은 복수의 샘플 용기 및 각각의 용기로부터 샘플을 유지하기 위한 복수의 유지 저장조를 포함한다.
일 실시예에서, 복수의 샘플 용기는 제거 가능한 샘플 트레이에 수용된다.
일 실시예에서, 제거 가능한 샘플 트레이는 샘플 용기를 어레이로 유지하기 위한 10개의 위치를 포함한다.
일 실시예에서, 샘플 용기는 캡 및 격막을 갖는 바이알이다.
일 실시예에서, 제거 가능한 샘플 트레이는 샘플 로딩 시스템을 세척하는 것으로부터 폐기물을 수용하기 위한 폐기물 용기를 더 포함한다.
일 실시예에서, 제거 가능한 샘플 트레이는 샘플 로딩 시스템, 선택기 밸브 및 액적 분배 시스템을 세정하기 위한 세정 용기를 더 포함한다.
일 실시예에서, 샘플 로딩 시스템은 샘플 용기에 삽입하기 위한 니들, 샘플 용기 내의 샘플을 유지 저장조로 전달하기 위해 니들에 동작 가능하게 결합된 펌프를 포함한다.
일 실시예에서, 펌프는 용적형 펌프이다.
일 실시예에서, 펌프는 연동, 다이아프램 또는 주사기 펌프이다.
일 실시예에서, 펌프는 용기 내의 샘플의 재현탁을 위해 동작 가능하게 가역적이다.
일 실시예에서, 샘플 로딩 시스템은 니들에 동작 가능하게 결합된 제1 위치설정 유닛을 더 포함하며, 제1 위치설정 유닛은 니들을 샘플 용기와의 천공-맞물림 관계로 그리고 샘플 용기와의 천공-맞물림 해제 관계로 위치설정한다.
일 실시예에서, 샘플 용기 내의 샘플은 세포 현탁액, 물, 에탄올, 바이오 잉크, 활성제, 세정 용액, 세척액, 세포 배양 배지, 또는 용액에 분산된 약물일 수 있다.
일 실시예에서, 샘플 용기 내의 샘플은 멸균 상태이다.
일 실시예에서, 샘플 로딩 시스템은 니들에 동작 가능하게 결합된 제2 위치설정 유닛을 더 포함하며, 제2 위치설정 유닛은 2차원 공간에 니들을 위치설정한다.
일 실시예에서, 유지 저장조는 세장형 튜브이다.
일 실시예에서, 세장형 튜브는 코일형이고 챔버 내에 수납된다.
일 실시예에서, 유지 저장조는 가요성 튜브의 스풀로 형성된다.
일 실시예에서, 가요성 튜브는 폴리테트라플루오로에틸렌(Polytetrafluoroethylene)(PTFE) 튜브로 제조된다.
일 실시예에서, 액적 분배 시스템은 복수의 유지 저장조에 동작 가능하게 결합되고 샘플 액적을 각각의 유지 저장조로부터 기판 상에 분배하도록 구성된 적어도 하나의 프린트 헤드를 포함한다.
일 실시예에서, 적어도 하나의 프린트 헤드는 밸브들의 어레이이다.
일 실시예에서, 각각의 밸브는 마이크로-솔레노이드 밸브이다.
일 실시예에서, 샘플은 마이크로-솔레노이드 밸브의 상류에 있는 유지 저장조 내에 저장된다.
일 실시예에서, 각각의 유지 저장조는 각각의 프린트 헤드를 갖는다.
일 실시예에서, 각각의 유지 저장조는 압력 조절기에 결합된다.
일 실시예에서, 압축 공기 공급원은 조절기 매니폴드에 결합된다.
일 실시예에서, 각각의 마이크로-솔레노이드 밸브는 각각의 압력 조절기에 결합된다.
일 실시예에서, 액적 분배 시스템은 조절기 매니폴드 내의 복수의 압력 조절기, 적어도 하나의 체크 밸브를 포함하고, 압축 공기 공급원은 조절기 매니폴드 내의 각각의 압력 조절기에 동작 가능하게 결합된다.
일 실시예에서, 압력 조절기는 선택기 밸브에 결합된다.
일 실시예에서, 샘플은 샘플 로딩 시스템을 사용하여 샘플 용기로부터 유지 저장조로 취해지고, 액적 분배 시스템의 작동을 통해 유지 저장조로부터 프린트 헤드로 취해지며, 액적 분배 시스템의 압력 조절기 및 샘플 로딩 시스템의 선택기 밸브는 샘플을 유지 저장조로부터 프린트 헤드로 이동시키도록 동작 가능하게 작동한다.
일 실시예에서, 액적 분배 시스템은 기판을 지지하기 위한 인쇄 스테이지를 더 포함한다.
일 실시예에서, 기판은 멀티-웰 판(multi-well plate)이다.
일 실시예에서, 액적 분배 시스템은 인쇄 스테이지에 동작 가능하게 결합된 제3 위치설정 유닛을 더 포함하고, 제3 위치설정 유닛은 2차원 공간에 인쇄 스테이지를 위치설정한다.
일 실시예에서, 제어 시스템은 사용자 입력으로부터 샘플 용기 내의 샘플의 아이덴티티를 기록한다.
일 실시예에서, 제어 시스템은 바이오 프린터를 작동시키기 위한 프로그래밍된 명령을 포함하는 비일시적 컴퓨터 판독 가능한 매체를 포함한다.
일 실시예에서, 비일시적 컴퓨터 판독 가능한 매체는 바이오 프린터와 별도로 위치되고 바이오 프린터에 동작 가능하게 연결될 수 있다.
일 실시예에서, 층류 유동 시스템은 공기를 하우징 내로 흡인하기 위한 팬, 공기가 유입되는 공기 입구, 필터 및 공기 출구를 포함한다.
일 실시예에서, 팬은 원심 팬이다.
일 실시예에서, 팬은 인쇄 스테이지 아래로부터 하우징의 전방으로, 샘플 로딩 시스템 주위로 그리고 하나 이상의 필터를 통해 그리고 하우징 밖으로 공기를 흡인한다.
일 실시예에서, 팬은 바이오 프린터 하우징의 전방 액세스 도어를 통해 공기를 흡인한다.
일 실시예에서, 층류 유동 시스템은 2개의 필터, 즉 배기를 위한 필터, 인쇄 스테이지를 향한 공기를 수용하기 위한 필터를 포함한다.
일 실시예에서, 각각의 필터는 고효율 미립자 공기(high efficiency particulate air)(HEPA) 필터이다.
일 실시예에서, 각각의 필터는 공기 유동의 약 50%를 수용한다.
일 실시예에서, 하우징은 사용자가 바이오 프린터의 내부에 접근하게 하도록 힌지형 도어를 수용한다.
일 실시예에서, 제거 가능한 샘플 트레이는 도어를 통해 바이오 프린터에 로딩 가능하다.
일 실시예에서, 제거 가능한 샘플 트레이는 뚜껑을 갖는다.
일 실시예에서, 하우징은 샘플 트레이 뚜껑 및 멀티-웰 판용 뚜껑을 수용하기 위한 리세스를 갖는다.
일 실시예에서, 샘플 용기는 바이오 프린터 내부의 제거 가능한 샘플 트레이에 로딩 가능하다.
제2 양태에서, 제1 양태에 따른 바이오 프린터를 사용하여 복수의 샘플 액적을 퇴적시킴으로써 적어도 하나의 3차원 세포 구성물을 제조하는 방법이 제공된다.
본 명세서 전체에 걸쳐서, 맥락상 달리 요구되지 않는 한, 단어 "포함한다", 또는 "포함한" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 그룹의 포함을 의미하는 것으로 이해되고 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 그룹의 배제를 의미하지 않는다.
본 명세서에 포함된 문헌, 행위, 재료, 디바이스, 논문 등의 임의의 설명은 본 발명의 맥락을 제공하기 위한 목적일 뿐이다. 이들 자료 중 어떤 것 또는 모두가 종래 기술 기초의 일부를 형성하거나 본 명세서의 각 청구항의 우선일 이전에 존재하는 본 발명과 관련된 분야의 흔한 일반적인 지식이었다는 것을 인정하는 것으로 고려되어서는 안된다.
본 발명이 보다 명확하게 이해될 수 있도록 하기 위해, 바람직한 실시예가 다음의 도면 및 예를 참조하여 설명될 것이다.
도 1은 3D 세포 구성물을 제조하기 위한 바이오 프린터의 후방 사시도로서, 샘플 로딩 시스템을 도시한다.
도 2는 도 1의 샘플 로딩 시스템의 정면 사시도이다.
도 3은 샘플 로딩 시스템의 정면 사시도로서, 샘플을 각각 수용하는 복수의 샘플 용기를 도시한다.
도 4는 도 3의 샘플 로딩 시스템의 후방 사시도이다.
도 5는 샘플 로딩 시스템에 사용되는 제거 가능한 샘플 트레이의 사시도이다.
도 6은 층류 공기 유동 시스템이 부착된 바이오 프린터의 정면 사시도이다.
도 7은 층류 공기 유동 시스템만을 도시하는 바이오 프린터의 후방 사시도이다.
도 8은 도 7의 층류 공기 유동 시스템만을 도시하는 바이오 프린터의 후방 사시도이다.
도 9 및 도 10은 층류 공기 유동 시스템의 공기 유로를 예시하는 명확한 패널을 갖는 바이오 프린터를 도시한다.
도 11은 예시된 액적 분배 시스템 및 샘플 로딩 시스템을 위한 위치설정 유닛을 갖는 바이오 프린터의 상부 사시도이다.
도 12는 복수의 유지 저장조 및 압축 공기 공급 시스템을 갖는 바이오 프린터의 측면 사시도이다.
도 13은 층류 공기 유동 시스템이 설치된 도 11의 바이오 프린터의 정면 사시도이다.
도 14는 도 13의 바이오 프린터의 후방 사시도이다.
도 15는 단일 유지 저장조를 갖는 바이오 프린터의 후방 사시도이다.
도 16은 조립된 바이오 프린터의 정면 사시도이다.
도 17은 도 16의 바이오 프린터의 후방 사시도이다.
도 18은 구성요소 바이오 프린터의 개략적인 흐름도이다.
도 19는 층류 공기 유동 시스템의 구성요소들 사이의 공기 유로를 도시하는 바이오 프린터의 각 구성요소의 측면도이다.
도 20은 제어 시스템 컴퓨터에 동작 가능하게 연관된 바이오 프린터의 개략적인 흐름도이다.
도 21은 3D 세포 구성물 설계를 보여주는 컴퓨터 상에 구현된 제어 시스템 소프트웨어의 예시적인 그래픽 사용자 인터페이스이다.
도 22는 멀티-웰 판에서 3D 세포 구성물의 인쇄를 보여주는 컴퓨터 상에 구현된 제어 시스템 소프트웨어의 예시적인 그래픽 사용자 인터페이스이다.
도 23은 바이오 프린터와 통합된 3D 세포 구성물을 설계하는 개략적인 흐름도이다.
도면에 도시된 바와 같이, 3D 세포 구성물을 제조하기 위한 바이오 프린터(10)가 본 명세서에 개시되어 있다. 바이오 프린터(10)는 샘플(100)을 샘플 용기(110)로부터 유지 저장조(120)로 로딩하기 위한 샘플 로딩 시스템(20); 샘플(100)을 유지 저장조(120)로 지향시키기 위해 유지 저장조(120)와 유체 연통하는 선택기 밸브(30); 유지 저장조(120)와 유체 연통하는 액적 분배 시스템(25)으로서, 액적 분배 시스템(25)은 샘플 액적(101)을 유지 저장조(120)로부터 기판(125) 상에 인쇄하도록 구성된 것인, 액적 분배 시스템; 샘플 로딩 시스템(20), 선택기 밸브(30) 및 액적 분배 시스템(40)의 작동을 제어하기 위한 제어 시스템(40); 층류 공기 유동 시스템(50); 및 샘플 로딩 시스템(20), 선택기 밸브(30), 액적 분배 시스템(40) 및 층류 공기 유동 시스템(50)을 둘러싸는 하우징(60)을 포함한다.
샘플 로딩 시스템
도 1 내지 도 4를 참조하면, 샘플 로딩 시스템(20)은 하나 이상의 샘플 용기(110) 내에 수용된 샘플(100)에 접근하도록 구성되고 하나 이상의 유지 저장조(120)와 유체 연통한다. 유지 저장조(120)는 샘플 용기(110)로부터 샘플(100)을 유지하도록 구성된다. 샘플 용기(110)는 샘플의 저장 및 운반을 위해 실험실에서 사용되는 고무 격막(113)을 포함하는 캡(112)을 갖는 표준 크로마토그래피 바이알(111)일 수 있다. 바이알(111)은 통상적으로 바이알(111) 내에 멸균 환경을 유지할 수 있는 유리, 플라스틱 또는 임의의 적절한 재료로 제조된다. 바이알(111)은 다양한 샘플(100)을 수용하도록 다수의 크기로 제조되고, 통상적으로 보다 작은 바이알은 약 5 ml를 저장하고 보다 큰 바이알은 약 10 ml을 저장한다. 샘플 로딩 시스템(20)은 바이오 프린터(10)에 의해 인쇄될 3D 세포 구성물에 따라 하나의 샘플 용기(110) 또는 복수의 샘플 용기(110)를 포함할 수 있다.
각각의 유지 저장조(120)는 샘플 용기(110) 중 하나로부터 수용된 샘플(100)을 저장하도록 구성된다. 각각의 유지 저장조(120)는 저장조 하우징(121) 내부에 래핑된 세장형 튜브(122)로 제조된다. 세장형 튜브(122)는 코일형이고 하우징(121) 내에 수납될 수 있다. 세장형 튜브(122)는 가요성 튜브(122)의 스풀이다. 특정 실시예에서, 가요성 튜브(122)는 폴리테트라플루오로에틸렌(Polytetrafluoroethylene)(PTFE) 튜브, 또는 플로리네이티드 에틸렌 프로필렌(fluorinated ethylene propylene)(FEP), 에틸트리플루오로에틸렌(ethyltrifluoroethylene)(ETFE), 폴리에테르 에테르 케톤(polyether ether ketone)(PEEK), 실리콘, 열가소성 엘라스토머(thermoplastic elastomer)(TPE) 또는 스테인리스강과 같은 다른 적절한 재료로 제조된다. 대안 실시예에서, 각각의 유지 저장조(120)는 입구, 출구, 및 샘플(100)을 저장하기 위한 저장 공동을 갖는 용기이다. 바이오 프린터(10)는 하나 이상의 개별적이고 상이한 샘플(100)에 대응하는 하나 이상의 유지 저장조(120)를 포함할 수 있다.
각각의 샘플 용기(110) 내의 샘플(100)은 세포 현탁액, 물, 에탄올, 바이오 잉크, 활성제, 세정 용액, 세척액, 세포 배양 배지, 또는 용액에 분산된 약물일 수 있으며, 이는 아래에 상세히 설명된다. 샘플 용기(110) 내에 저장된 샘플(100)은 멸균될 수 있거나 멸균되지 않을 수 있다.
샘플 로딩 시스템(20)은 각각의 샘플 바이알(111)에 삽입될 수 있고 하나 이상의 유지 저장조(120)와 유체 연통하는 적어도 하나의 니들(130)을 포함한다. 도면에 도시된 실시예에서, 단일 니들(130)이 존재한다. 니들(130)은 스테인리스강으로 제조된, 50 mm 길이의 베벨 팁, 16 게이지이다. 니들(130)은 각각의 바이알(111)로부터 샘플(100)을 제거하기 위해 샘플 로딩 시스템(20)과 동작 가능하게 연관될 수 있다. 니들(130)은 제1 위치설정 유닛(140)에 의해 니들(130)을 위쪽에서 바이알(111)에 삽입하도록 z-방향으로 이동 가능하다. 제1 위치설정 유닛(140)은, 도 3 및 도 4에 도시된 스테퍼 모터(140c)에 결합된 리드 스크류(140b)에 의해 구동되는 60 mm의 스트로크를 갖는 소형 전기 선형 액추에이터(140a)이다.
바이오 프린터(10)는 샘플 용기(110)로부터 취한 샘플(100)을 유지 저장조(120)로 지향시키는 유동 선택기 밸브(30)를 포함한다. 이는 각각의 바이알(111)로부터 취한 각각의 샘플(100)이 별도의 유지 저장조(120) 내에 유지되어 각각의 샘플(100)을 분리시켜 멸균 조건을 유지하도록 하기 위함이다.
바이오 프린터(10)의 샘플 로딩 시스템(20) 및 액적 분배 시스템(25)은 튜브(150)에 의해 연결된다. 튜브(150)는 그 원하는 위치 및 기능적 요건에 기초하여 다수의 상이한 재료, 직경 및 길이로부터 선택된다. 샘플 로딩 시스템(20)을 각각의 유지 저장조(120)에 연결하는 튜브(150)는 2.16 mm 내경 및 3.175 mm 외경의 PTFE 튜브이다. 각각의 유지 저장조(120) 내의 세장형 튜브(122)는 1/8" PTFE 튜브이다.
각각의 유지 저장조(120)를 샘플(100)로 프라이밍하기 위해, 샘플(100)은 펌프(160)를 사용하여 바이알(111)로부터 선택기 밸브(30)로 그리고 선택기 밸브를 통해 이동된다. 펌프(160)는 연동, 다이아프램 또는 주사기 펌프와 같은 용적형 펌프(positive displacement pump)일 수 있다. 펌프(160)는 샘플(100)을 적절한(및 격리된) 유지 저장조(120)로 지향시키기 위한 적절한 채널(31)을 포함하는 선택기 밸브(30)에 연결된다. 밸브(30)는 VICI Valco Instruments Co Inc에 의해 제조된 저압 유수식 선택기 밸브(30)이다. 유동 선택기 밸브(30)는 4, 6, 8, 10, 12 또는 16개의 채널과 같은 많은 채널(31)을 포함한다. 유동 선택기 밸브(30)는 펌프(160) 및 니들(130)에 연결된 공통 입구를 갖는다. 채널(31)이 선택된 경우, 선택된 채널(31)은 펌프(160) 및 니들(130)에 유체 연결된다. 채널(31)이 선택되지 않은 경우, 그 채널(31)은 압력 조절기 매니폴드(170) 내의 공기 압력 조절기(171)로부터 가압 공기에 유체 연결된다. 각각의 유지 저장조(120) 또는 채널(31) 내의 압력은 조절기 매니폴드(170) 내의 각각의 조절기(171)에 의해 독립적으로 설정된다. 조절기 매니폴드(170) 내의 각각의 조절기(171)는 4 mm 나일론 튜브 및 1/8" PTFE 튜브를 사용하여 선택기 밸브(30)에 연결된다. 조절기 매니폴드(170) 내의 압력 조절기(171)의 수는 유지 저장조(120) 또는 채널(31)의 수와 동일하다. 이는 액적 분배 시스템(25)의 각 밸브(252)에 대해 압력이 독립적으로 설정될 수 있게 하며, 이는 바이오 프린터(10)가 각각의 밸브(252)에서 광범위한 유체 점도를 지지할 수 있음을 의미한다.
샘플 로딩 시스템(20)의 조절기 매니폴드(170) 내의 압력 조절기(171)는 선택기 밸브(30)의 각 채널(31) 및 유지 저장조(120)로 공급되는 압력을 독립적으로 제어한다. 압력 조절기 매니폴드(170)는 압축 공기 공급 입구(180) 및 정압 저장조(도시되지 않음)에 동작 가능하게 연결된다. 바이오 프린터(10)는 압축 공기 공급 입구(180)로부터 공기를 여과시키기 위해 하우징(60) 내에 공기 필터(190)를 포함한다. 펌프(160)는 샘플 용기(110) 내의 샘플(100)을 유지 저장조(120)로 전달하기 위해 니들(130)에 동작 가능하게 결합된다. 펌프(160)는 샘플 용기(110) 내의 샘플(100)의 재현탁(resuspension)을 위해 동작 가능하게 가역적일 수 있다.
시일(114)은 각각의 샘플 용기(110)의 고무 격막(113)에 의해 형성되고, 제1 위치설정 유닛(140)에 의해 구동되는 니들(130)을 사용하여 제1 위치설정 유닛(140)의 작동시 천공된다. 제1 위치설정 유닛(140)은 제어 시스템(40) 및 로봇식 선형 액추에이터(140a)에 의해 작동된다. 제어 시스템(40)은 선형 액추에이터(140a) 상의 스테퍼 모터(140c)를 원하는 단계 수만큼 이동시킴으로써 제1 위치설정 유닛(140)을 위치설정한다. 제1 위치설정 유닛(140)은 니들(130)에 동작 가능하게 결합되어 니들(130)을 샘플 용기(110)와의 천공-맞물림 관계로 그리고 샘플 용기(110)와의 천공-맞물림 해제 관계로 위치설정한다. 채널(31)이 선택기 밸브(30)에서 선택되고, 마이크로-솔레노이드 밸브(252)가 개방되고 펌프(160)는 턴온되어 샘플(100)을 샘플 바이알(111)로부터, 니들(130), 튜브(150), 펌프(160), 선택기 밸브(30)를 통해, 그리고 유지 저장조(120)로 이동시킨다. 이어서, 펌프(160)가 턴오프되고 마이크로-솔레노이드 밸브(252)는 폐쇄된다. 유동 선택기 밸브(30)에서 채널(31)이 선택 해제된다. 이어서, 압력은 조절기 매니폴드(170)의 각각의 조절기(171)에 의해 설정되고, 마이크로-솔레노이드 밸브(252)는 모든 공기가 튜브 라인(150)으로부터 빠져나가고 샘플(100)이 유지 저장조(120)로부터 토출될 때까지 반복적으로 토출된다. 상기 프로세스는 사용되는 각각의 유지 저장조(120)를 프라이밍하도록 반복된다.
샘플 로딩 시스템(20)은 니들(130) 및 액적 분배 유닛(25)의 프린트 헤드(250)에 동작 가능하게 결합된 제2 위치설정 유닛(141)을 더 포함하고, 제2 위치설정 유닛(141)은 니들(130) 및 프린트 헤드(250)를 샘플 용기(110) 및 기판(125) 위의 2차원 공간에 위치설정한다. 제2 위치설정 유닛(141)은 트랙(142)을 따라 니들(130) 및 프린트 헤드(250)를 이동시키도록 구성된다. 제2 위치설정 유닛(141)은 3축 운동 제어 스테이지 유닛일 수 있다. 제2 위치설정 유닛(141)은 300 mm의 스트로크를 갖는 벨트 구동식 선형 액추에이터(141a)이다. 벨트(141b)는 치형 벨트이며 스테퍼 모터(141c)에 의해 구동된다.
샘플 액적(101)을 인쇄하기 위해, 하나 이상의 유지 저장조(120) 및 마이크로-솔레노이드 밸브(252)가 전술한 바와 같이 프라이밍되고, 샘플 액적(101)은 액적 분배 시스템(25)의 프린트 헤드(250)의 하나 이상의 노즐(253)로부터 토출되어, 컴퓨터-제어 소프트웨어(40)에 의해 제어되는 미리 결정된 방식으로 기판(125) 상에 퇴적된다. 이 액적 분배 시스템(25)은 아래에서 보다 상세히 설명된다.
바이오 프린터(10)를 세정하기 위해, 세제는 니들(130)을 사용하여 샘플 바이알(111)로부터, 전술한 바와 같이 샘플 로딩 시스템(20)을 사용하여 튜브 라인(150), 선택기 밸브(30), 유지 저장조(120)로 그리고 이들을 통해 이동될 수 있다. 세제는 액적 분배 시스템(25)의 노즐(253)로부터 폐기물 용기(205) 내로 분출된다. 이 프로세스는 70% 에탄올 및 물과 같은 다른 세정 화학 물질에 대해서도 반복된다. 바이오 프린터(10)의 세정은 모든 물이 라인을 통해 세척되고 아래에서 상세히 설명되는 액적 분배 시스템(25)의 노즐(253)로부터 공기만이 분출될 때 완료된다.
바이알(111) 내의 샘플을 재현탁시키기 위해, 니들(130)은, 니들(130)이 샘플 바이알 격막(113)을 천공하고 샘플(100)과 맞물릴 때까지 제1 및 제2 위치설정 유닛(140 및 141)을 사용하여 각각의 샘플 바이알(111)을 향해 이동될 수 있다. 샘플 바이알(111) 내의 세포 함유 샘플(100)은 연동 펌프(160)를 사용하여 샘플 바이알(111)로부터 니들(130) 및 튜브(150)를 통해 이동된다. 세포 함유 샘플(100)은 연동 펌프(160)를 반대로 사용하여 반대 방향으로(즉, 샘플 바이알(111)을 향해) 이동된다. 니들(130) 및 튜브를 통해 바이알(111)로부터 및 바이알을 향해 세포 함유 샘플을 이동시키는 이 프로세스는 필요에 따라 반복될 수 있다.
샘플 트레이
샘플 용기(110)는 또한 멸균 상태일 수 있는 제거 가능한 샘플 트레이(200) 내에 수용될 수 있다. 최대 14개의 바이알(111)이 제거 가능한 샘플 트레이(200) 내에 수용될 수 있지만, 임의의 적절한 수의 바이알(111)이 제거 가능한 샘플 트레이(200) 내에 수용될 수 있는 것으로 예상된다. 제거 가능한 샘플 트레이(200)는 바이알(111) 및 폐기물 용기(205)와 같이 상이한 크기의 샘플 용기(110)를 저장하도록 구성된 하나 이상의 샘플 용기 하우징(201)을 갖는다. 도 5에 도시된 바와 같이 제거 가능한 샘플 트레이(200)는 뚜껑(202) 및 트레이(203)를 갖는다. 제거 가능한 샘플 트레이(200)는 플라스틱 또는 다른 적절한 재료로 제조될 수 있다. 제거 가능한 샘플 트레이(200)는 도 13 및 도 16에 도시된 바와 같이 힌지형 도어(210)를 통해 바이오 프린터(10)의 인쇄 스테이지(128)의 리세스(129)로 로딩 가능하다. 대안 실시예에서, 샘플 용기(110)는 제거 가능한 샘플 트레이(200)로 로딩 가능하다. 제거 가능한 샘플 트레이(200)는 바이알(111)을 저장하기 위한 실질적으로 멸균 환경을 제공할 뿐만 아니라 각각의 바이알(111)이 멸균되어 있다.
또한, 제거 가능한 샘플 트레이(200) 대신에, 샘플 용기 하우징(201)은 인쇄 스테이지(128)와 일체형일 수 있음이 예상된다. 이 경우, 각각의 샘플 용기(110)는 바이오 프린터(10)의 힌지형 도어(210)를 통해 인쇄 스테이지(128)로 로딩 가능하게 된다.
샘플 용기(110)를 수용하는 제거 가능한 샘플 트레이(200)는 샘플 로딩 시스템(20)을 세척할 때 폐기물을 수용하기 위한 폐기물 용기(205)를 더 포함할 수 있다. 제거 가능한 트레이(200)는 샘플 로딩 시스템(20), 선택기 밸브(30), 및 액적 분배 시스템(25)을 세정하기 위한 세정 용기(204)를 더 포함할 수 있다.
액적 분배 시스템
도 11 내지 도 15를 참조하면, 액적 분배 시스템(25)은 복수의 유지 저장조(120)에 동작 가능하게 결합되고 각각의 유지 저장조(120)로부터 기판(125) 상에 샘플 액적(101)을 분배하도록 구성된 프린트 헤드(250)를 포함한다. 적어도 하나의 프린트 헤드(250)는 밸브(251)의 어레이일 수 있다. 밸브의 어레이(251)는 복수의 마이크로-솔레노이드 밸브(252)를 포함할 수 있다. 마이크로-솔레노이드 밸브(252)는 The Lee Company에 의해 제조된 VHS 시리즈 솔레노이드 밸브일 수 있다. 각각의 마이크로-솔레노이드 밸브(252)는 오리피스 직경이 0.003", 0.005" 또는 0.007"인 노즐(253)을 포함한다. 각각의 마이크로-솔레노이드 밸브(252)는 솔레노이드 코일을 가로질러 스파이크 및 홀드 전압을 인가함으로써 개방된다. 스파이크 전압은 24V이고 홀드 전압은 5V이다. 스파이크 전압의 지속 기간은 0.2 내지 0.5 ms이다. 전압이 스위치 오프되면, 밸브(252)는 폐쇄 위치로 복귀된다.
각각의 노즐(253)은 마이크로컨트롤러, 즉 제어 시스템(40)에 의해 제어되는 보석형 오리피스 분배 노즐(jeweled orifice dispensing nozzle)(253)일 수 있다. 샘플(100)은 마이크로-솔레노이드 밸브(252) 및 노즐(253)의 상류에 있는 유지 저장조(120) 내에 저장된다. 보석형 오리피스 노즐(253)의 내경은 유체 점도 및 샘플 액적(101)의 원하는 액적 체적에 따라 127 내지 254 ㎛일 수 있다.
액적 분배 시스템(25)은 공기 필터(190)를 통해 압력 조절기 매니폴드(170)에 동작 가능하게 결합된 압축 공기 공급 입구(180)를 포함한다. 공기는 샘플 로딩 시스템(20) 및 액적 분배 시스템(25) 주위로 샘플(100)을 이동시켜 프린트 헤드(250)의 노즐(253)을 통해 분배되도록 한다. 원하는 샘플 액적(101)의 체적은 또한 조절기 매니폴드(170)의 압력 조절기(171)에 의해 설정된 배압 및 각각의 밸브(252)의 개방 시간을 사용하여 조절될 수 있다. 통상적으로, 배압은 1 내지 60 psi의 압력으로 설정되고, 밸브(251)의 개방 시간은 0.3 ms 이상이며 액적 체적은 1 내지 500 nl이다.
액적 분배 시스템(25)은 인쇄 스테이지(128)에 동작 가능하게 결합된 제3 위치설정 유닛(300)을 더 포함할 수 있고, 제3 위치설정 유닛(300)은 2차원 공간에 인쇄 스테이지(128)를 위치설정한다. 제3 위치설정 유닛(300)은 트랙(301)을 따라 인쇄 스테이지(128)를 이동시키도록 구성된다. 트랙(142)은 트랙(301)에 수직으로 연장된다. 도 13을 참조하면, 인쇄 스테이지(128)는 기판(125)을 지지하고 샘플 트레이(200)를 제거 가능하게 수용하도록 구성된 리세스(129)를 갖는다. 3축 운동 제어 스테이지는 모든 3차원(X, Y 및 Z)에서 10 ㎛의 해상도로 액적 분배 시스템을 정확하게 위치설정할 수 있다.
멸균 환경에서, 각각의 활성제, 바이오 잉크 및 세포 함유 바이오 잉크 또는 세포 잉크(즉, 샘플(100))는 작은 기포의 생성을 피하기 위해 샘플 로딩 시스템(20)을 사용하여 적절한 유지 저장조(120)로 천천히 로딩된다.
바이오 프린터에는 24V DC 전력 공급원(도시되지 않음) 형태의 전력 공급원이 장착되어 있다.
압축 공기 공급 입구(180)는 공기 압축기(도시되지 않음)로부터 공급된다. 공기 압축기는 3 내지 10 bar의 공기 압력을 공급할 수 있다. 압축 공기는 연구소에서 일반적으로 사용되는 공통 압축 공기 라인으로부터 공급될 수 있다.
액적 분배 시스템(25) 내의 튜브(150)는 40 mm 1/16" 테플론 튜브이다. 이 튜브(150)는 유지 저장조(120)를 프린트 헤드(250)의 밸브의 어레이(251)에 연결한다.
샘플 로딩 시스템(20)은 인쇄를 위해 샘플(100)을 유지 저장조(120)로 자동으로 로딩할 수 있다. 시스템은 현재의 최신 바이오 인쇄 시스템에 비해 몇 가지 이점이 있다. 먼저, 바이오 잉크는 유리 또는 플라스틱 바이알(111)과 같은 샘플 용기(110)를 다루기 쉽게 저장될 수 있다. 이들 샘플 용기(110)는 바이오 잉크 샘플로 충전하기 전에 쉽게 멸균된다. 생물 학자와 같은 최종 사용자는 일반적인 방법, 예를 들어 피펫을 사용하여 적절한 바이알(111) 내에 세포를 퇴적시킨다. 바이오 잉크 바이알(111) 내부에 세포를 퇴적시키는 것은 샘플(100)이 오염되지 않는 것을 보장하도록 바이오 안전 캐비닛 내부에서 수행될 수 있다. 세포를 퇴적한 후, 바이알(111)은 적절한 위치에서 바이오 프린터(10) 내부에 위치될 수 있다.
샘플 로딩 시스템(20)은 바이오 잉크 및 세포 함유 바이오 잉크가 고무 격막(113)으로 밀봉된 개별 바이알(111)로부터 로딩되게 한다. 이는 z-축 선형 액추에이터(140)를 사용하여 위치설정된 니들(130)을 사용하여 달성된다. 니들(130)은 용적형 펌프(160)에 유체 연결된다. 니들(130)의 팁이 격막(113)을 관통하고 바이알(111) 내부에 위치설정될 때, 펌프(160)가 맞물리고 유체 샘플(100)은 바이알(111)로부터 펌핑된다.
프린트 헤드(250)는 사용자 입력, 샘플 구성물, 및/또는 원하는 세포 구성물에 기초하여 넓은 범위의 점도, 액적 크기 등을 인쇄하기 위해 개별적으로 조절 가능한 다수의 전자 압력 조절기(171)를 포함할 수 있다. 전자 압력 조절기(171)는 밸브의 어레이(251)에 동작 가능하게 연결된다.
압력 조절기(171)의 뱅크(바이오 프린터(10)는, 최대 10개의 유지 저장조(120)가 있기 때문에 10개를 포함할 수 있을 것으로 예상됨)가 압력 조절기 매니폴드(170) 내에 수용된다. 매니폴드(170)의 기능은 공급 입구(180)에 연결된 외부 공기 압축기로부터 가압 공기를 각각의 조절기(171)로 분배하는 것이다. 도 11 및 도 12에는, 오직 단일 조절기(171) 및 매니폴드(170)의 일 측면만이 도시되어 있다. 도 14 및 도 15에는, 10개의 조절기(171)의 뱅크가 도시되어 있다.
바이오 프린터(10)의 샘플 로딩 시스템의 예시적인 실시예는 다음과 같이 샘플(100)을 유지 저장조(120)로 로딩하는 단계를 포함한다:
1. 선택기 밸브(30)를 선택된 채널(31)로 이동시키는 단계;
2. 마이크로-솔레노이드 밸브(252)를 개방하는 단계;
3. x-축 및 y-축 액추에이터를 사용하여 바이알(111) 위에 니들(130)을 위치설정하는 단계;
4. z-축 액추에이터를 사용하여 니들(130)을 바이알(111) 내로 하강시켜 바이알 격막(113)을 관통시키는 단계;
5. 연동 펌프(160)와 맞물리게 하는 단계;
6. 유체를 바이알(111)로부터 선택기 밸브(30)를 통해 튜브 유지 저장조(120)로 펌핑하는 단계;
7. 유체가 마이크로-솔레노이드 밸브(252)의 노즐에 도달할 때 펌프(160)를 정지시키는 단계; 및
8. 마이크로-솔레노이드 밸브(252)를 폐쇄하는 단계.
바이오 프린터(10)의 샘플 로딩 시스템(20)의 다른 예시적인 실시예, 특히 세정 및 멸균 단계는 다음 단계를 포함한다:
1. 폐기물 스피툰(waste spittoon) 또는 바이알 위에 마이크로-솔레노이드 밸브(252)를 위치설정하는 단계;
2. 인쇄 작업 후 남아 있는 임의의 유체를 폐기물 용기(205)에 비우는 단계;
3. 선택기 밸브(30)를 세정을 위해 선택된 채널로 이동시키는 단계;
4. x-축 및 y-축 액추에이터를 사용하여 에탄올을 수용하는 바이알(111) 위에 니들(130)을 위치설정하는 단계;
5. z-축 액추에이터를 사용하여 니들(130)을 바이알(111) 내로 하강시켜 바이알 격막을 관통시키는 단계;
6. 마이크로-솔레노이드 밸브(252)를 개방하는 단계;
7. 연동 펌프와 맞물리게 하는 단계;
8. 바이알(111)로부터 에탄올을 선택기 밸브(30) 및 개방된 마이크로-솔레노이드 밸브(252)를 통해 펌핑하는 단계;
9. 충분한 에탄올이 개방된 마이크로-솔레노이드 밸브(252)를 통과한 경우 펌프를 정지시키는 단계;
10. 마이크로-솔레노이드 밸브(252)를 폐쇄하는 단계;
11. 세제로 프로세스를 반복하는 단계; 및
12. 물로 프로세스를 반복하는 단계.
바이오 프린터(10)는 마이크로-웰 판 및 페트리 접시(Petri dish)와 같은 많은 종류의 기판(125) 상에 인쇄하도록 구성된다. 도 20을 참조하면, 기판(125)은 온도 제어 유닛(280)을 사용하여 세포 증식을 보조하기 위해 37℃로 가열될 수 있다. 온도 제어 유닛(280)은 최적 성장 조건에 필요한 3D 세포 구성물 조건의 필요성에 기초하여 바이오 프린터(10) 내부의 온도를 조절한다. 온도 제어 유닛(280)은 프린트 헤드(250)의 온도, 인쇄 스테이지(128) 상에 배치된 기판(125), 및/또는 바이오 프린터(10)의 내부를 조절하기 위해 36℃ 내지 38℃로 조절 가능하다.
인쇄 스테이지 상에 배치되고 인쇄 스테이지에 의해 지지되는 기판(125)은 멀티-웰 판(126)일 수 있다. 기판(125)은 인쇄된 세포 구성물을 둘러싸고 배양하는 데에 사용되는 생체 적합성 소모품일 수 있다. 이들 기판은 다음을 포함할 수 있다:
·상이한 웰 구성(6, 12, 24, 48, 96 및 384-웰)의 마이크로타이터 판(Microtitre plate);
·상이한 웰 구성(6, 12, 24, 48, 96 및 384-웰)의 커버 슬립 바닥을 갖는 마이크로타이터 판;
·커버 슬립 및 현미경 슬라이드;
·다양한 크기의 플루오로디시(Fluorodish); 및
·다른 챔버 구성(1, 2, 4, 8 및 16)의 챔버 슬라이드.
튜브 라인(150), 밸브(251)의 어레이 및 노즐(253)을 세정하기 위해, 세제는 샘플 바이알(111)로부터 전술한 바와 같이 액적 분배 시스템(25)을 사용하여 밸브(252) 및 노즐(253)로 그리고 이들을 통해 이동될 수 있다. 세제는 노즐(253)로부터 폐기물 용기(205)로 분출된다. 이 프로세스는 70% 에탄올 및 물과 같은 다른 세정 화학 물질에 대해서도 반복된다. 튜브 라인(150) 및 프린트 헤드(250)의 세정은 모든 물이 라인(150), 밸브(251)의 어레이 및 노즐(253)을 통해 세척되고 공기만이 노즐(253)로부터 분출될 때 완료된다.
층류 유동 시스템
도 6 내지 도 10을 참조하면, 바이오 프린터(10)는 도 6 내지 도 10에 도시된 바와 같은 층류 유동 시스템(50)을 더 포함한다. 멸균 및 조작자 안전은 3D 바이오 인쇄 용례에서 주요 관심사이다. 이는, 일반적으로 바이오 프린터를 바이오 안전 캐비닛 또는 청정실 내부에 배치함으로써 달성된다. 통상적으로, 바이오 안전 캐비닛과 청정실은 조직 배양 실험실에서 귀중하고 값비싼 공간으로 고려된다. 따라서, 3D 바이오 인쇄 용례에서 바이오 안전 캐비닛 및 청정실 공간의 사용을 최소화하는 해결책에 대한 요구가 존재한다.
바이오 프린터(10)에 통합된 일체형 층류 유동 시스템(50)은 바이오 안전 캐비닛 또는 청정실 설비를 요구하지 않고 세포 및 3D 조직 배양 모델의 바이오 인쇄를 위한 멸균 환경을 제공한다. 더욱이, 조작자는 전방 액세스를 통해 외부 환경에서 공기를 흡인하도록 방향성 공기 유동을 사용하여 보호된다.
층류 공기 유동 시스템(50)은 금속 프레임(500), 예를 들어 스테인리스강을 갖는 챔버 또는 인클로저를 포함하고, 오염된 공기 유동이 전동식 송풍기 팬 또는 원심 팬(510)으로 흡인될 수 있도록 베이스에 금속 격자가 제공된다. 오염된 공기는 팬(510)을 사용하여 덕트 입구(520)를 통해 2개의 고효율 미립자 포집(High-Efficiency Particulate Arresting)(HEPA) 필터(525, 530)로 구성되는 양압 챔버(535)로 펌핑된다. HEPA 필터(525 및 530)는 오염된 공기 유동으로부터 입자의 적어도 99%를 제거할 수 있다. 하나의 HEPA 필터(525)는 외부 환경에 대한 배기구로서 작용하고 다른 HEPA 필터(530)는 멸균 챔버(535)로의 공기 유동을 재순환시킨다. 각각의 필터는 공기 유동의 약 50%를 차지할 것으로 예상된다. 도 21은 공기 유동이 바이오 프린터(10) 내로, 송풍기 팬(510)을 거쳐 덕트 입구(520)를 통해, HEPA 필터(525 및 530)를 통해, 그리고 배기되거나 재순환되는 것을 도시한다. 재순환 HEPA 필터(525)로부터 멸균 챔버(535)로의 공기 유동은 통상적인 속도가 0.45 m/s인 멸균 챔버(535)로 단방향 하향 공기 유동을 제공한다. 이 공기 유동은 바이오 인쇄된 샘플 액적(101) 위에 균일하고 청정한 공기 유동을 제공하여 샘플(100)에서 입자 오염의 위험을 상당히 감소시킨다.
바이오 인쇄 작동 동안, 입자 오염의 위험을 감소시키기 위해 전방 액세스 힌지형 도어(210)는 폐쇄되어야 한다. 따라서, 송풍기 팬(510)의 유량은 송풍기 rpm을 감소시킴으로써 감소될 수 있다. 멸균 챔버(535)에서의 감소된 공기 유동은 프린트 헤드(250) 및 샘플(100)에 대한 탈수의 영향을 감소시킨다. 또한, 이는 프린트 헤드(250)로부터 인쇄 기판(125)으로 비행하는 동안 공기 유동 방해 샘플 액적(101)의 영향을 감소시킨다.
제어 소프트웨어
바이오 프린터(10)는 생물학적 분석을 인쇄하기 위해 개발된 맞춤형 소프트웨어를 통해 제어된다. 제어 시스템(40)은 바이오 프린터(10)를 작동시키기 위해 프로그래밍된 명령을 갖는 비일시적 컴퓨터 판독 가능한 매체를 포함하는 제어 소프트웨어를 포함한다. 비일시적 컴퓨터 판독 가능한 매체는 바이오 프린터(10)와 별도로 위치되고 바이오 프린터(10)에 동작 가능하게 연결될 수 있다.
소프트웨어는 도 21 및 도 22에 도시된 바와 같이 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를 포함한다. 최종 사용자는 GUI를 통해 상이한 분석 인쇄 루틴을 선택하고 액적 간격 및 액적 체적과 같은 분석 파라미터를 변경할 수 있다. 사용자는 또한 액적 분배 시스템의 공간 위치를 수동으로 제어하고 액적의 맞춤형 패턴을 생성할 수도 있다. 소프트웨어의 추가 특징은 액적 분배 시스템의 세정, 프라이밍 및 퍼지 루틴을 포함한다.
바이오 인쇄는 인쇄할 물체의 3D 모델을 필요로 한다. 조직 공학 용례의 경우, 이는 통상적으로 CAD/CAM 소프트웨어와 같은 공학 툴을 사용하여 생성된다. 이들 툴은 고가이고 고도의 복잡도를 가져, 과학자가 공학 툴을 배우는 데 시간과 자원을 소비하게 한다. 3D 조직 배양 용례의 경우, 인쇄될 구성물의 복잡도는 더 낮다. 3D 조직 배양 용례에서 바이오 인쇄를 위한 3D 구성물을 생성하는 간단하고 직관적인 방법에 대한 요구가 존재한다.
바이오 프린터(10)와 함께 제공되는 소프트웨어는 인쇄될 3D 구성물의 각각의 층을 설계하는 방법을 제공한다. 일 실시예에서, 사용자가 구성물의 각각의 층에 대한 패턴을 묘화하도록 그리드가 제공된다. 인쇄될 재료는 프린트 헤드(250)의 여러 노즐(253)로부터 분배되는 다수의 재료의 혼합물로서 정의될 수 있다. 예를 들어, 히드로겔은 활성제의 액적과 혼합된 바이오 잉크의 액적으로 정의될 수 있다.
조직 배양을 위해 생물학 실험실에서 사용되는 통상적인 기판은 6, 12, 24, 48, 96 및 384-웰 판과 같은 멀티-웰 판이다. 일 실시예에서, 인터페이스(670)는 멀티-웰 판 상의 각각의 웰 내부에 미리 정해진 3D 구성물을 인쇄하기 위해 제공된다. 사용자는 먼저 웰 또는 웰 어레이를 선택한 다음 해당 웰에서 인쇄될 인쇄 루틴을 선택한다.
맞춤형 소프트웨어는 사용자가 어레이에서 3D 세포 구성물의 층을 바이오 인쇄하고 싶은 곳에 사용자가 입력할 수 있는 사용자 인터페이스를 제공한다. 인쇄 프리뷰 버튼(671)은 인쇄하기 전에 소프트웨어와 함께 제공되어, 사용자가 세포가 인쇄되는 위치 및 구성물이 어떻게 보일지를 시각화할 수 있게 한다. 이 소프트웨어의 특징은 바이오 프린터 액적 크기를 제어하여 세포 구성물이 인쇄되는 방법을 변경할 수 있다는 것이다. 세포 구성물의 층형성의 배후 의도는 생물 학자가 현미경에서 z 스택 층형성을 사용하는 방법을 모방하는 것이다.
일반적으로, 바이오 프린터(10)는 3D 세포 구성물을 구축할 때 20-25개의 층을 인쇄하지만, 층의 수는 제어 시스템 및 관련 제어 소프트웨어를 사용하여 제어된다.
컴퓨터-제어 소프트웨어에 의해 제어되는 프린트 헤드(250)에 결합된 위치설정 유닛(141)은 바이오 잉크, 활성제, 세포, 세포 잉크 또는 이들의 조합의 샘플 액적(101)의 각각의 분출 동안 밸브(251) 및 노즐(253)을 공간적으로 위치설정시킨다. 솔레노이드 밸브 및 노즐의 컴퓨터-제어된 공간 위치설정, 및 밸브(251) 및 노즐(253)로부터의 컴퓨터-제어된 액적 분출은 3D 조직 구성물의 생성을 용이하게 한다.
3D 조직 구성물의 어레이를 생성하기 위해, 3D 조직 구성물을 생성하는 프로세스는 기판(125) 상의 여러 위치에서 반복되었다.
제어 시스템은 사용자 입력 또는 자동 기록에 의해 샘플 용기(110) 내의 각각의 샘플(100)의 아이덴티티를 기록한다. 의도는 어떤 샘플 용기(110)가 어떤 샘플(100)을 수용하고 있는지를 알아, 인쇄 동안 유지 저장조(120)가 그 각각의 샘플을 저장할 때 필요한 샘플이 원하는 위치에 인쇄되게 하는 것이다.
바이오 프린터 하우징
바이오 프린터(10)는 샘플 로딩 시스템(20), 액적 분배 시스템(25) 및 층류 공기 유동 시스템(50)을 둘러싸는 하우징(60)을 포함한다. 하우징(60)은 강철, 알루미늄 및 스테인리스강으로 제조되고 나사 파스너(600)를 사용하여 조립되는 수많은 패널로 조립된다. 하우징(60)은 사용자가 바이오 프린터(10)의 멸균 챔버(535)에 액세스하게 하도록 전방 표면에 힌지형 도어(210)를 더 포함한다. 제거 가능한 샘플 트레이(200)는 도어(210)를 통해 바이오 프린터(10) 내에 로딩 가능하다. 전방 패널 및 힌지형 도어(210)는 유리 또는 투명 플라스틱으로 제조될 수 있다. 도 16 및 도 17은 바이오 프린터 조립체(10)를 도시한다.
방법
작동시, 바이오 프린터(10)는 샘플을 샘플 용기로부터 유지 저장조로 전달하여 3D 세포 구성물을 바이오 인쇄하도록 프린트 헤드에 의해 사용될 준비가 되게 하는 다음의 단계를 갖는다. 유체로 프린터 유지 저장조(120) 및 솔레노이드 밸브를 프라이밍하기 위해, 유체는 샘플 로딩 시스템을 사용하여 샘플 용기로부터 솔레노이드 밸브로 그리고 솔레노이드 밸브를 통해 이동된다. 유동 선택기 밸브에서 적절한 채널이 선택된다. 샘플 바이알의 시일은 니들(130)을 사용하여 천공되고, 솔레노이드 밸브가 개방된다. 연동 펌프가 턴온되어 원하는 양의 유체를 샘플 용기로부터 니들, 튜브, 펌프, 튜브, 유동 선택기 밸브를 통해 그리고 유지 저장조로 이동시킨다. 연동 펌프가 턴오프되고 솔레노이드 밸브가 폐쇄된다. 유동 선택기 밸브에서 적절한 채널이 선택 해제된다. 압력은 조절기(171)에 의해 설정되고 솔레노이드 밸브(252)는 모든 공기가 라인에서 빠져나가고 바이오 잉크, 활성제, 세포, 세포 잉크 또는 이들의 조합의 액적이 노즐(253)로부터 토출될 때까지 반복적으로 토출된다. 상기 프로세스는 사용되는 각각의 프린터 유체 저장조 및 솔레노이드 밸브에 대해 반복된다.
유지 저장조로 바이오 잉크를 로딩하는 단계:
1. 선택기 밸브를 선택된 채널로 이동시키는 단계;
2. 솔레노이드 밸브를 개방하는 단계;
3. x-축 및 y-축 액추에이터를 사용하여 바이알 위에 니들을 위치설정하는 단계;
4. z-축 액추에이터를 사용하여 니들을 바이알 내로 하강시켜 바이알 격막을 관통시키는 단계;
5. 연동 펌프와 맞물리게 하는 단계;
6. 유체를 바이알로부터 선택기 밸브를 통해 튜브 유지 저장조로 펌핑하는 단계;
7. 유체가 솔레노이드 밸브의 노즐에 도달할 때 펌프를 정지시키는 단계; 및
8. 솔레노이드 밸브를 폐쇄하는 단계.
솔레노이드 밸브로부터 바이오 잉크, 활성제, 세포, 세포 잉크 또는 이들의 조합을 인쇄하기 위해서는, 프린터 유체 저장조 및 솔레노이드 밸브가 전술한 바와 같이 프라이밍되고, 바이오 잉크, 활성제, 세포, 세포 잉크 또는 이들의 조합의 액적이 컴퓨터-제어 소프트웨어에 의해 제어되는 미리 결정된 방식으로 노즐로부터 토출되고 기판 상에 퇴적된다.
위치설정 유닛은 프린트 헤드(250)에 결합되고, 컴퓨터-제어 소프트웨어에 의해 제어되어, 바이오 잉크, 활성제, 세포, 세포 잉크 또는 이들의 조합의 액적을 각각 분출하는 동안 솔레노이드 밸브 및 노즐을 공간적으로 위치설정한다. 솔레노이드 밸브 및 노즐의 컴퓨터-제어된 공간 위치설정, 및 솔레노이드 밸브 및 노즐로부터의 컴퓨터-제어된 액적 분출은 3D 조직 구성물의 생성을 용이하게 한다.
3D 조직 구성물의 어레이를 생성하기 위해, 3D 조직 구성물을 생성하는 프로세스는 기판 상의 여러 위치에서 반복된다.
바이오 잉크
본 명세서에서, 바이오 잉크는 세포가 현탁되거나 수용될 수 있는 하나 이상의 유형의 거대 분자의 수용액으로 정의된다. 활성화 또는 가교시에, 바이오 잉크의 화학적 및 물리적 조성에 의해 정의된 물리적 및 화학적 특성을 갖는 히드로겔 구성물이 생성된다. 거대 분자는 합성 및 천연 폴리머, 단백질 및 펩티드의 어레이로 정의된다. 거대 분자는 자연 상태이거나 아민 또는 티올-반응성 작용기로 화학적으로 변성될 수 있다.
합성 거대 분자는 다음을 포함할 수 있다:
·과당, 자당 또는 포도당 작용기를 함유하는 폴리머와 같은 다당류;
·폴리(에틸렌 글리콜)(poly(ethylene glycol))(PEG), 폴리(히드록시에틸 메타크릴레이트)(poly(hydroxyethyl methacrylate)(PHEMA), 폴리(ε-카프로락톤)(poly(ε-caprolactone))(PCL), 폴리(비닐 알코올)(poly(vinyl alcohol))(PVA), 폴리(비닐피롤리돈)(poly(vinylpyrrolidone))(PVP), 폴리(NIPAAM) 및 폴리(프로필렌 푸마레이트)(poly(propylene fumarate))(PPF) 및 유도체와 같은 비-이온성 폴리머;
·다가 전해질 - 양전하 또는 음전하, 양쪽성 뿐만 아니라 짝이온성 폴리머(zwitterionic polymer)를 갖는 폴리머;
·폴리펩티드 - 아미드 결합에 의해 함께 유지되는 많은 아미노산(최소 2개의 아미노산)의 단일 선형 사슬; 및
·핵염기 함유 합성 폴리머 - 핵염기(아데닌, 티민, 구아닌 또는 시토신) 반복 단위를 갖는 폴리머.
천연 거대 분자는 다음을 포함할 수 있다:
·알기네이트, 키토산, 겔란 검(gellan gum), 히알루론산, 아가로스 및 글리코사미노글리칸과 같은 다당류;
·젤라틴, 피브린 및 콜라겐과 같은 단백질;
·단일 가닥 DNA(single stranded DNA)(ssDNA), 이중 가닥 DNA(double stranded DNA)(dsDNA) DNAzymes 및 압타머(Aptamer)와 같은 DNA 및 올리고뉴클레오티드(Oligonucleotide); 및
·기저막 추출물.
아민-반응성 작용기는 알데히드, 에폭시, N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide)(NHS) 및 2-비닐-4,4-디메틸아즈락톤(2-vinyl-4,4-dimethylazlactone)(VDM)을 포함할 수 있다.
티올-반응성 작용기는 알켄, 알킨, 아지드, 할로겐 및 시아네이트를 포함할 수 있다.
사용되고 적절한 것으로 판명된 바이오 잉크는 10 v/v% FCS, L-글루타민 및 피루브산 나트륨이 보충된 무칼슘 DMEM에 용해된 알기네이트(2 w/v%)이었다.
SK-N-BE(2) 신경 모세포종 세포가 분산된 바이오 잉크를 세포 함유 바이오 잉크라고 지칭한다.
활성제
활성제는 바이오 잉크와 상호 작용하여 히드로겔 구성물을 형성하는 소분자 또는 거대 분자를 포함하는 수용액이다. 활성제의 조성은 결과적인 히드로겔의 물리적 특성을 제어하도록 변경될 수 있다. 사용되는 활성제의 유형은 사용된 거대 분자 및 의도된 가교 프로세스에 따라 크게 좌우된다.
활성제는 다음에서 선택될 수 있다:
·탄산칼슘, 염화칼슘, 염화나트륨, 황산마그네슘, 수산화나트륨 및 염화바륨과 같은 무기 염;
·2,2-디메톡시-2-페닐아세토페논(2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone)(DMPA) 및 이르가큐어(Irgacure)와 같은 광개시제(photoinitiator);
·다가 전해질 - 바이오 잉크의 거대 분자에 반대 전하를 전달하는 폴리머. 양이온성, 음이온성, 양쪽성 및 짝이온성일 수 있음;
·폴리펩티드 - 아미드 결합에 의해 함께 유지되는 많은 아미노산(최소 2개의 아미노산)의 단일 선형 사슬;
·DNA 링커 - 바이오 잉크의 거대 분자에 존재하는 것을 보충하는 뉴클레오티드 또는 DNA 서열을 지닌 거대 분자; 및
·본래 또는 화학적 변성을 통해 아민 또는 티올기를 갖는 천연 또는 합성 거대 분자.
알기네이트 바이오 잉크에 사용된 활성제는 MilliQ 물에 용해된 4 w/v%의 염화칼슘이었다.
가교 또는 겔화
이는 개별 거대 분자 사슬이 활성제에 의해 서로 연결되어 히드로겔을 형성하는 프로세스이다. 가교 프로세스는 화학적 또는 물리적 가교로 분류될 수 있다. 물리적 가교 또는 비공유 가교는 다음을 포함할 수 있다:
·이온 가교 - 거대 분자와 활성제에 존재하는 반대 전하의 상호 작용을 통한 가교. 활성제는 하전된 올리고머, 이온성 염 및 이온성 분자를 포함할 수 있음;
·수소 결합 - 극성 분자의 정전기적 인력을 통한 가교. 이 경우에, 거대 분자와 활성제는 극성 작용기를 지니고 있음;
·온도 가교 - 온도 변화(가열 또는 냉각)에 대한 응답으로 거대 분자 사슬의 재배열을 통한 가교; 및
·소수성 상호 작용 또는 반 데르 발스 힘.
화학적 또는 공유 가교는 거대 분자와 활성제 사이의 화학 반응을 수반한다. 반응의 유형은 다음을 포함할 수 있다:
·가교 반응이 UV 또는 광 조사에 의해 촉진되는 광가교 결합(Photocrosslinking);
·수성 배지에서 티올과 비닐-함유 거대 분자 사이의 마이클-유형 부가 반응(Michael-type addition reaction);
·아미노기와 알데히드기 사이의 쉬프 염기 반응(Schiff base reaction);
·딜스-알더 반응(Diels-alder reaction);
·클릭 화학(Click chemistry);
·활성 에스테르기에 대한 아미노 분해 반응(aminolysis reaction); 및
·효소 가교.
다른 바이오 잉크 및 활성제 조합의 예가 아래의 표에 기술된다:
Figure 112020069118528-pct00001
세포 잉크
세포 잉크는 세포가 존재하고 3D 바이오 인쇄 프로세스에 걸쳐 균일하게 현탁된 상태로 유지되는 하나 이상의 유형의 분자 또는 거대 분자의 수용액이다. 세포 잉크의 농도는 세포가 침전되는 것을 방지하지만 여전히 높은 세포 생존력을 유지하도록 최적화된다.
세포 잉크는 다음에서 선택될 수 있다:
·글리세롤과 같은 소분자; 및
·Ficoll™, 덱스트란, 알기네이트, 겔란 검, 메틸셀룰로스 및 폴리(비닐피롤리돈)(PVP)과 같은 거대 분자.
Ficoll™은 수용액에 쉽게 용해되는 중성, 고분지형, 고질량의 친수성 다당류이다. Ficoll™ 반경은 2 내지 7 nm의 범위이고, 다당류와 에피클로로히드린의 반응에 의해 준비된다. Ficoll™은 GE Healthcare사가 소유한 등록 상표이다.
사용된 세포 잉크는 PBS에 용해된 Ficoll™ 400(10 w/v%)이었다.
SK-N-BE(2) 신경 모세포종 세포가 분산된 세포 잉크를 세포 함유 세포 잉크라고 지칭한다.
겔란 검은 박테리아 스핑고나스 엘로데아(bacterium Sphingomonas elodea)(이전의 슈도모나스 엘로데아(Pseudomonas elodea))에 의해 생성된 수용성 음이온성 다당류이다.
세포 배양 용액
세포 배양 용액은 배양된 세포와 접촉하는 액체이며 다양한 세포 관련 작업에 적절하다. 준비 프로세스는 염 및 pH 잔부의 신중한 분석, 생체 적합성 분자만의 혼입 및 멸균을 포함한다.
세포 배양 용액 중 일부는 다음을 포함한다:
·듈베코의 변성 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(DMEM), 최소 필수 배지(Minimum Essential Media)(MEM), 이스코브의 변성 듈베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)(IMDM), 배지 199(Media 199), 햄의 F10(Ham's F10), 햄의 F12(Ham's F12), 맥코이의 5A(McCoy's 5A) 및 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(Roswell Park Memorial Institute)(RPMI) 배지와 같은 세포 배양 배지;
·태아 송아지 혈청(foetal calf serum)(FCS), 표피 성장 인자(epidermal growth factor)(EGF), 기본 섬유 모세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor)(bFBF), 섬유 모세포 성자 인자(FBF), 내피 세포 성장 인자(endothelial cell growth factor)(ECGF), 인슐린 유사 성장 인자 1(insulin-like growth factor 1)(IGF-1) 및 혈소판 유래 성장 인자(platelet-derived growth factor)(PDGF)와 같은 성장 보조제;
·PBS, HEPES 및 CHES와 같은 생물학적 완충제;
·킬레이트 및 안정화 용액; 및
·멸균된 MilliQ 물.
세포 배양 조건
세포 및 3D 조직 배양 모델은 표준 세포 배양 기술을 사용하여 인큐베이션, 배양 및 유지될 수 있다. 히드로겔 몰드 내에 캡슐화된 세포를 포함하는 3D 조직 배양 모델은 세포 성장 또는 스페로이드 형성을 허용 또는 유지하기 위한 조건 하에서 인큐베이션될 수 있다. 인큐베이션은 통상적으로 대부분의 동물 및 인간 세포계(cell line)에 대해 적어도 24 시간 동안 CO2 수준이 5%인 약 37℃에서 수행된다. 인큐베이션은 히드로겔 몰드에서 세포 또는 세포들의 유형의 성장, 유지 또는 스페로이드 형성을 허용하는 임의의 적절한 조건, 온도 및 지속 기간에서 수행될 수 있음이 이해될 것이다.
다용도 용액
다용도 용액은 세포와 접촉하지 않지만 세포에 노출된 모든 프린터 표면을 세정하고 멸균하는 데에 사용되는 용액으로 정의된다. 이들 용액은 다음을 포함할 수 있다:
·정확한 농도의 에탄올;
·멸균 MilliQ 물;
·세포 배양 배지;
·세제; 및
·과산화수소 용액(2 w/v% 최대 농도).
바이오 잉크의 준비
초기에, 바이오 잉크는 올바른 유형 및 양의 거대 분자를 적절한 세포 배양액에서 혼합하여 준비된다. 균질성을 달성한 후, 블랭크 바이오 잉크는 UV 조사 및 여과(0.22 ㎛ 필터) 모두를 통해 멸균된다. 이어서, 바이오 잉크는 추가 사용까지 4℃에서 유지된다.
세포의 준비
PBS로 세척하여 세포를 수확한다. PBS를 흡인한다. 트립신을 첨가하고 37℃에서 인큐베이션하여 플라스크 표면으로부터 세포를 해리시킨다. 조직 배양 배지를 추가하여 해리된 세포를 튜브에 수집한다. 세포를 원심 분리하고, 상청액을 흡인하며 새로운 배지에서 펠릿을 재현탁시킨다. 동일한 체적의 세포 현탁액과 트리판 블루 스테인(trypan blue stain)을 혼합하여 세포 카운트를 수행한다. 세포 농도를 결정하도록 계산을 수행한다. 이어서, 원하는 수의 세포를 바이오 잉크, 세포 잉크에 첨가하거나 세포 배양 용액에 첨가할 수 있다.
활성제의 준비
올바른 유형 및 양의 분자를 적절한 세포 배양 용액에 용해시킨다. 결과적인 용액을 사용 전에 UV 조사 및 여과를 통해 멸균시킨다.
세포 잉크의 준비
올바른 유형 및 양의 분자를 적절한 세포 배양 용액에 용해시킨다. 균질성을 달성한 후, 결과적인 용액을 사용 전에 UV 조사 및 여과를 통해 멸균시킨다. 이어서, 세포 잉크를 추가 사용까지 실온에서 유지시킨다.
세포 수확
특정 전면 생장률(confluency)에서 관심 배양 세포는 미리 확립된 프로토콜에 따라 수확된다. 세포 함유 바이오 잉크 또는 세포 잉크를 구성하기 위해, 수확된 세포는 정확한 세포 농도로 재현탁되어 바이오 잉크 또는 세포 잉크의 200 μl에서 2억 5천만 세포/ml 농도를 제공한다. 이어서, 결과적인 세포 펠릿을 정확한 체적의 바이오 잉크 또는 세포 잉크로 재분산시킨다. 세포 함유 바이오 잉크 또는 세포 잉크는 3D 바이오 프린터에서 사용할 준비가 된다.
히드로겔 몰드의 인쇄
히드로겔 몰드는 바이오 잉크의 액적과 활성제의 액적이 서로 상하로 퇴적되어 히드로겔을 생성하는 드롭-온-드롭(drop-on-drop) 프로세스를 사용하여 인쇄될 수 있다. 이 프로세스는 반복되어 히드로겔의 층을 축적함으로써 3D 히드로겔 구성물을 형성하는 데에 사용될 수 있다.
세포 유형
스페로이드와 같은 3D 조직 배양 모델은, 포유 동물 간 세포, 위장 세포, 췌장 세포, 신장 세포, 폐 세포, 기관 세포, 혈관 세포, 골격근 세포, 심장 세포, 피부 세포, 평활근 세포, 결합 조직 세포, 각막 세포, 비뇨 생식 세포, 유방 세포, 생식 세포, 내피 세포, 상피 세포, 섬유 모세포, 신경 세포, 슈반 세포, 지방 세포, 골 세포, 골수 세포, 연골 세포, 혈관 주위 세포, 중피 세포, 내분비 조직으로부터 유래된 세포, 기질 세포, 줄기 세포, 전구 세포, 림프 세포, 혈액 세포, 내배엽 유래 세포, 외배엽 유래 세포, 중배엽 유래 세포, 또는 이들의 조합과 같은 부착 세포를 포함하는 임의의 적절한 세포 유형으로부터 준비될 수 있다.
추가적인 세포 유형은 다른 진핵 세포(예를 들어, 중국 햄스터 난소(chinese hamster ovary)), 박테리아(예를 들어, 헬리코박터 필로리(helicobacter pylori)), 진균(예를 들어, 페니실륨 크리소게눔(Penicillium chrysogenum)) 및 효모(예를 들어, 사카로미세스 세레비지아에(saccharomyces cerevisiae))를 포함할 수 있다).
세포계 SK-N-BE(2)(신경 모세포종 세포)는 다양한 조건 하에서 3D 조직 배양 모델을 생성하는 프로세스에서 성공적으로 사용되었다. 다른 세포계는 개발된 프로세스에 의해 생성된 3D 조직 모델에서 필요시 수행될 것임이 이해될 것이다. 사용된 다른 세포계는 DAOY(인간 수모세포종 암 세포), H460(인간 비소 세포 폐암) 및 p53R127H(인간 췌장암 세포)를 포함한다. 적절할 수 있는 다른 세포계는 088 및 089에 열거되어 있다.
3D 바이오 인쇄 기술은 드롭-온-디멘드형 기술(drop-on-demand technique)을 통해 히드로겔 몰드에 캡슐화된 고밀도 3D 조직 배양 모델을 생성하도록 개발되었다. 구체적으로, 3D 인쇄 기술은 다양한 3D 구성물을 제조하기 위해 층별 방식으로 구성되는 바이오 잉크 및 활성제를 사용하여 생체 적합성 히드로겔 몰드를 인쇄하는 데에 사용되었다. 히드로겔 몰드의 제조 동안, 높은 세포 밀도 액적이 히드로겔 몰드에 포함될 수 있다.
본 기술 분야의 숙련자라면, 광범위하게 설명된 바와 같이 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어나지 않으면서 특정 실시예에 도시된 바와 같이 본 발명에 대해 많은 변형 및/또는 수정이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 그러므로, 본 실시예는 모든 면에서 제한이 아니라 예시적인 것으로 고려되어야 한다.
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Claims (20)

  1. 3차원(3D) 세포 구성물을 제조하기 위한 바이오 프린터이며,
    유체 샘플을 유지하기 위한 하나 이상의 유지 저장조;
    샘플 용기를 유지하고 3D 세포 구성물이 인쇄될 기판을 지지하기 위한 인쇄 스테이지;
    하나 이상의 유지 저장조와 유체 연통하는 샘플 로딩 시스템으로서, 샘플을 샘플 용기로부터 하나 이상의 유지 저장조로 자동으로 로딩하도록 구성된 것인, 샘플 로딩 시스템;
    샘플 로딩 시스템과 유체 연통하는 펌프로서, 샘플 용기로부터 샘플을 흡인하고 하나 이상의 유지 저장조로 샘플을 펌핑하도록 구성된 것인, 펌프; 및
    하나 이상의 저장조와 유체 연통하는 액적 분배 시스템으로서, 하나 이상의 저장조로부터 인쇄 스테이지에 의해 지지되는 기판 상에 샘플 액적을 인쇄하도록 구성되는 것인, 액적 분배 시스템을 포함하며,
    여기서 액적 분배 시스템과 샘플 로딩 시스템은 바이오 프린터의 별도의 장치인, 바이오 프린터.
  2. 제1항에 있어서, 하나 이상의 유지 저장조, 인쇄 스테이지, 샘플 로딩 시스템, 펌프, 및 액적 분배 시스템을 둘러싸는 하우징을 더 포함하는, 바이오 프린터.
  3. 제2항에 있어서, 하우징 내에 배치된 공기 유동 시스템을 더 포함하고, 공기 유동 시스템은 하우징 내에 층류 공기 유동을 유도하도록 구성되는, 바이오 프린터.
  4. 제3항에 있어서, 상기 공기 유동 시스템은 하우징 내에 층류 공기 유동을 유도하기 위한 팬을 포함하는, 바이오 프린터.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 공기 유동 시스템은 적어도 하나의 공기 필터를 포함하는, 바이오 프린터.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플 로딩 시스템은 샘플 용기에 삽입하기 위한 니들을 포함하고, 펌프는 니들이 샘플 용기에 삽입될 때 니들을 통해 유체를 흡인하도록 구성되는, 바이오 프린터.
  7. 제6항에 있어서, 니들에 결합된 제1 위치설정 유닛을 더 포함하고, 제1 위치설정 유닛은 샘플 용기에 니들을 삽입하고 샘플 용기로부터 니들을 인출하도록 구성되는, 바이오 프린터.
  8. 제7항에 있어서, 트랙을 갖는 제2 위치설정 유닛을 더 포함하고, 제2 위치설정 유닛은 니들 및 액적 분배 시스템에 결합되고 제2 위치설정 유닛의 트랙을 따라 니들 및 액적 분배 시스템을 이동시키도록 구성되는, 바이오 프린터.
  9. 제8항에 있어서, 트랙을 갖는 제3 위치설정 유닛을 더 포함하고, 제3 위치설정 유닛은 인쇄 스테이지에 결합되고 제3 위치설정 유닛의 트랙을 따라 인쇄 스테이지를 이동시키도록 구성되는, 바이오 프린터.
  10. 제9항에 있어서, 상기 제2 위치설정 유닛의 트랙은 제3 위치설정 유닛의 트랙에 직각으로 연장되는, 바이오 프린터.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 유지 저장조를 포함하고, 샘플 로딩 시스템은 샘플을 샘플 용기로부터 복수의 저장조 중 임의의 하나로 로딩하도록 구성되는, 바이오 프린터.
  12. 제11항에 있어서, 상기 샘플 용기는 복수의 샘플 웰을 갖는 트레이이고, 샘플 웰은 샘플을 수용하도록 구성되고, 샘플 로딩 시스템은 샘플을 샘플 웰 중 임의의 하나로부터 유지 저장조 중 임의의 하나로 로딩하도록 구성되는, 바이오 프린터.
  13. 제12항에 있어서, 상기 샘플 로딩 시스템으로부터 폐기물을 수용하도록 구성된 폐기물 용기를 더 포함하는, 바이오 프린터.
  14. 제13항에 있어서, 상기 폐기물 용기는 트레이 상에 제공되는, 바이오 프린터.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펌프는 유지 저장조 중 하나로부터 샘플을 흡인하고 샘플 로딩 시스템으로부터 샘플을 펌핑하도록 구성되는, 바이오 프린터.
  16. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 유지 저장조 내의 압력을 조절하기 위해 각각의 유지 저장조와 유체 연통하도록 결합된 압력 조절기를 더 포함하는, 바이오 프린터.
  17. 제16항에 있어서, 펌프, 샘플 로딩 시스템, 각각의 유지 저장조, 및 압력 조절기와 유체 연통하는 선택기 밸브를 더 포함하고, 선택기 밸브는 펌프를 샘플 로딩 시스템 및 각각의 유지 저장조에 유체 연통하게 선택적으로 결합시키도록 구성되는, 바이오 프린터.
  18. 제16항에 있어서, 상기 압력 조절기는 압축 공기 공급원에 유체 연통하도록 제거 가능하게 결합되는, 바이오 프린터.
  19. 3차원 세포 구성물의 제조 방법이며, 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 바이오 프린터를 사용하여 하나 이상의 샘플의 액적을 퇴적시키는 단계를 포함하는, 방법.
  20. 3차원 세포 구성물의 제조 방법이며,
    제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 바이오 프린터를 제공하는 단계;
    기판을 인쇄 스테이지에 제공하는 단계;
    샘플을 포함하는 샘플 용기를 인쇄 스테이지에 제공하는 단계;
    샘플을 샘플 로딩 시스템에 의해 유지 저장조 중 하나에 로딩하는 단계; 및
    액적 분배 시스템을 사용하여 유지 저장조로부터 기판 상에 샘플을 인쇄하여 3차원 세포 구성물을 형성하는 단계를 포함하는, 방법.
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