CN212293386U - 一种细胞组分自动提取装置 - Google Patents

Abstract

本实用新型属于生物技术领域，公开了一种细胞组分自动提取装置，包括：移液系统、过滤系统、冷却系统，该分离装置还包括自动控制系统，自动控制系统分别与移液系统、过滤系统、冷却系统连接；过滤系统包括：包括滤管放置盒、通气供压系统、滤管，其中滤管包括滤柱、收集管，滤柱包括滤芯，滤芯在压缩气体加压过滤过程中使细胞膜致敏的细胞破碎并将核酸DNA滤除，分离出蛋白质和/或亚细胞组分。该装置有别于传统方法中完全依靠裂解液的化学破碎，或者研磨法破碎，使细胞破碎更均一。该装置即适用于单个样本微量，也适用于样本总数量大的情况下的批处理，有效节省人力，避免人力操作的差异性。

Description

一种细胞组分自动提取装置

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种可自动分离动植物细胞中蛋白和亚细胞结构的装置和方法，适用于多样品批处理。

背景技术

在后基因组时代，开展功能组学的研究是生命科学研究的主要内容，蛋白质是生命活动的主要执行者，因此是研究的重点。通过分析不同生理/病理条件下，组织、细胞或亚细胞结构中蛋白质的异同，以揭示复杂的生命现象，为疾病诊治寻找靶点。由于一个细胞内蛋白质种类繁多（超过10万种），不同蛋白的动态分布范围极广（从10²到10⁹个分子），性质各异，这些因素为蛋白质的分离分析带来困难。采取一些预分离手段使蛋白与非蛋白的生物大分子分离，减少样品复杂性，是对特异蛋白质进行分析研究的基本方法。随着生命科学研究的深入和精细化，已进入对亚细胞结构特异性分布的蛋白质进行研究的阶段，因此分离出亚细胞特异分布的蛋白是亚细胞蛋白质组学研究的前提。

传统分离细胞蛋白的方法是采用RIPA裂解液裂解细胞，蛋白溶解到裂解液中，通过离心机高速离心，丢弃不溶部分，上清液即为分离得到的蛋白溶液，能够被该方法分离的蛋白必须能够被细胞裂解液溶解，事实上约有30%的蛋白是不溶于RIPA裂解液的，这部分蛋白存在于离心沉淀中被丢弃，可能造成目标蛋白丢失或者蛋白定量不准。经典的分离亚细胞结构的方法是对细胞裂解匀浆以后，以差速离心结合密度梯度离心进行分离，该方法需要配置复制的密度梯度介质，需要超高速离心机，因此对研究人员的实验技能和实验设备要求高，且操作繁琐，样本量需求大，耗时长，重复性差。近年相继出现一些基于抗体亲和法亚细胞分离方法，该方法利用免疫亲和的专一性，因此需要为每种结构制备专门的抗体，抗体价格高昂，实验成本过高。同时由于传统法中大量使用RIPA进行细胞裂解和蛋白溶解，所含的SDS等阴离子表面活性剂虽然能高效裂解，但是也会造成蛋白的丢失变性。传统匀浆手段为超声或玻璃匀浆器匀浆，匀浆效果人为随机性大，容易出现匀浆效果不够或过分匀浆，破坏亚细胞结构，影响下游分离。同时手工操作匀浆，难以保证全程低温环境，造成蛋白变性或降解。同时释放的基因组核酸会使细胞匀浆液极为粘稠，影响进一步的分离实验。

在传统方法中，低温高速离心甚至是超高速离心是必要的分离方法，离心操作需要人工完成样品放置和回收，不适合与其它操作环节进行整合实现自动化，因此目前尚无细胞蛋白自动提取装置。在多样本分离提取的要求下，人工操作工作强度大，批件差异性风险提高，势必影响实验结果的科学性，因此有必要进行技术革新，开发自动提取装置。

发明内容

为克服离心操作的不足，本实用新型提供了一种细胞组分自动提取装置，该装置有别于传统方法中完全依靠裂解液的化学破碎，或者研磨法破碎，使细胞破碎更均一。该装置即适用于单个样本微量，也适用于样本总数量大的情况下的批处理，有效节省人力，避免人力操作的差异性。

本实用新型的目的是由以下技术方案实现的：

一种细胞组分自动提取装置，包括：移液系统、过滤系统、冷却系统，冷却系统为移液系统和/或过滤系统提供0-4℃低温，其特征在于，该分离装置还包括自动控制系统，自动控制系统分别与移液系统、过滤系统、冷却系统连接；所述过滤系统包括：包括滤管放置盒、通气供压系统、滤管，其中滤管包括滤柱、收集管，滤柱包括滤芯，滤芯在压缩气体加压过滤过程中使细胞膜致敏的细胞破碎并将核酸DNA滤除，所得滤液即为不含DNA的其他细胞组分。

进一步的，本实用新型的目的还可以由以下技术方案实现：

所述滤芯为疏水聚烯烃高分子材料制成的微孔结构。

所述高分子材料包括聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯。

所述滤芯用高分子材料加工成粒径10-150μm的颗粒，通过加压烧结成微孔结构，孔径范围为20-60μm，厚度范围为1mm-10mm。

所述移液系统包括：移液器吸头放置盒、加样槽、移液器、吸头。

所述移液器为排式移液器，与加样槽平行排列，所述加样槽为成排连通的尖底圆孔组，其数量和位置与移液器吸头放置盒孔对应。

所述通气供压系统包括围栏、压缩气瓶、通气管道、喷气嘴；压缩气瓶通过通气管道与喷气嘴相接，压缩气瓶与通气管道之间设有总阀门，通气管道与喷气嘴之间通过螺纹连接，通气管道与喷气嘴之间设有分阀门，喷气嘴与滤管接触处设有橡胶垫圈。

所述通气供压系统所用气体为氮气。

所述冷却系统可以是接入冰水的水冷换热管，也可以是压缩机冷却系统。

细胞致敏剂包括质量百分比为0.10% ~ 2.00%的聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、质量百分比为0.10% ~ 2.50%的乙基苯基聚乙二醇（NP-40）、缓冲盐溶液；其中缓冲盐溶液为：10-250mM 氯化钠、1-20mM 氯化镁、20-70mM Tris-盐酸缓冲盐溶液、pH为6.5-8.0，或者0.1倍~3倍PBS磷酸缓冲盐溶液，pH为6.5-8.0。本发明中，所述聚乙二醇辛基苯基醚是一种非离子型表面活性剂，配合低渗缓冲，能温和高效的致敏细胞膜，只需要普通涡旋振荡器混合样品，无需专业破碎仪，或其他破碎仪器。低温下孵育5-10min，可使细胞对机械力敏感。

系列细胞组分抽提液包括：质量百分比为0.30% ~ 2.20% 的聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）；质量百分比为0.10% ~ 4.00%的 聚氧乙烯（20）山梨醇酐单月桂酸酯（Tween20）；质量百分比为0.20% ~ 2.10% 的乙基苯基聚乙二醇（NP-40）；质量百分比为0.10% ~ 3.00% 的3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐（chaps）。缓冲液体系包括100-250mM 氯化钠、20-70mM Tris-盐酸 缓冲盐溶液，pH为6.5-8.0或0.1倍~ 3倍 PBS磷酸盐缓冲溶液，pH为6.5-8.0。能有效溶解各类双亲性或疏水性的难溶组分。

本实用新型的工作原理为：

（1）将吸头放入移液器吸头放置盒中，将预定数量的滤管放入滤管放置盒，最后将一定量的细胞样本和致敏剂混合后加入加样槽孵育；

（2）启动自动提取程序，在孵育5-10min后，移液器移动到移液器吸头放置盒上方，下移插取吸头；移液器移动到加样槽上方，下移吸取样本混合液；移液器移动到滤管放置盒上方，下移将样品加到滤管中；移液器回移归位；

（3）通气供压系统下移，喷气嘴插入滤管，滤管上沿与橡胶垫圈压紧密封，喷气嘴喷出加压气体，使致敏剂处理过的细胞悬液迅速通过滤芯，细胞在剪切力和惯性冲击作用下破碎，通气供压系统上移回原位；取出滤管，收集管内所得滤液即为不含DNA的其他细胞组分；

（4）如需收集细胞总蛋白或某种亚细胞结构特殊分布的蛋白，可将步骤（3）所得产物预处理后将系列细胞组分抽提液加入到过滤产物中，待不溶物全部溶解后所得产物即为某种特定蛋白提取液。

有益效果

本发明提供了一种用于从细胞中自动提取不含DNA的细胞蛋白及其他组分的装置，该装置通过化学致敏剂结合机械作用实现细胞破碎，该机械作用利用了在气体压力作用下，细胞悬液迅速通过多孔过滤材料时的剪切力和惯性冲击作用，有别于传统方法中完全依靠裂解液的化学破碎，或者研磨法破碎，使细胞破碎更均一。该装置适用于单个样本微量处理，也适用于样本总数量大的情况下的批处理，有效节省人力，避免人力操作的差异性。

多孔结构的过滤柱，一方面发挥了机械破碎细胞的作用，另一方面对细胞破碎释放出来的生物大分子具有过滤作用，有效去除了DNA分子，使蛋白质和亚细胞结构得到分离。该方法相较于传统的差速离心分离、密度梯度离心分离，分离速度更快，且不需要复杂密度梯度介质和高档的设备。

细胞预处理采用的致敏剂与传统裂解液不同，改变了表面活性剂的种类，用温和的非离子型表面活性剂替代传统离子型表面活性剂，配合低渗缓冲液。该致敏剂不会直接裂解细胞膜，而是致敏细胞膜，使其对机械力更敏感，有利于样品通过过滤柱时机械破碎细胞，可以减少对蛋白质的损伤。在膜蛋白分离中，能使细胞膜结构维持较大的碎片，有利于进一步分离；保持细胞器的相对完整，有利于降低后续亚细胞结构的分离难度，不需要超速离心即可分离。

优化的细胞蛋白抽提液，作用在于溶解滤液中的蛋白或抽提亚细胞结构中包含的特殊蛋白。用多种温和的非离子型表面活性剂，替代传统单种离子型表面活性剂，使得溶解蛋白种类范围更广，抽提效果更温和。不同于传统的RIPA，由强阴离子表面活性剂SDS和脱氧胆酸盐组成，能溶解部分蛋白但易使蛋白高级结构受破坏。

附图说明

图1为本实用新型的自动蛋白提取装置结构示意图。

图2为图1中所述通气供压系统结构示意图。

图3为本实用新型的滤管结构示意图。

图4为图3中所述收集管结构示意图。

图5为图3中所述滤芯结构示意图。

图中标号：1为移液器吸头放置盒，2为移液器，6为通气供压系统，7为滤管放置盒，8为加样槽，9为滤管。

具体实施方式

为了能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，并结合其附图，对本实用新型进行详细阐述。应当注意，在附图中所图示的部件不一定按比例绘制。本实用新型省略了对公知组件和公知技术描述，以避免不必要地限制本实用新型。所描述的实施例是本实用新型的一部分实施例，而不是全部的实施例。实施例是示例性的，旨用于解释本实用新型，而不能理解为对本实用新型的限制，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本实用新型保护的范围。下面结合附图对本实用新型的实施例进行详细说明。

下面结合附图对本申请的具体实施方式作进一步详细地说明。

实施例1

如图1~3所示，一种细胞组分自动提取装置，包括：移液系统、过滤系统、冷却系统，冷却系统为移液系统和/或过滤系统提供0-4℃低温，该冷却系统可以是接入冰水的水冷换热管，也可以是压缩机冷却系统。该分离装置还包括自动控制系统，自动控制系统分别与移液系统、过滤系统、冷却系统连接；所述过滤系统包括：包括滤管放置盒7、通气供压系统6、滤管9，其中滤管9包括滤柱9-3、收集管9-1，滤柱9-3包括滤芯9-2，滤芯9-2在压缩气体加压过滤过程中使细胞膜致敏的细胞破碎并将核酸DNA滤除，所得滤液即为不含DNA的其他细胞组分。所述过滤柱上径小于收集管内径，形成空隙使气体排出。多孔结构的过滤柱，一方面发挥了机械破碎细胞的作用，另一方面对细胞破碎释放出来的生物大分子具有过滤作用，有效去除了DNA分子，使蛋白质和亚细胞结构得到分离。该方法相较于传统的差速离心分离、密度梯度离心分离，分离速度更快，且不需要复杂密度梯度介质和高档的设备。

优选的，本实施例所述滤芯为疏水聚烯烃高分子材料制成的微孔结构。

优选的，本实施例所述高分子材料包括聚乙烯、聚丙烯、聚四氟乙烯。

优选的，本实施例所述滤芯用高分子材料加工成粒径10-150μm的颗粒，通过加压烧结成微孔结构，孔径范围为20-60μm，厚度范围为1mm-10mm。

优选的，本实施例所述移液系统包括：移液器吸头放置盒1、加样槽8、移液器2、吸头。

优选的，本实施例所述移液器2为排式移液器，与加样槽平行排列，所述加样槽为成排连通的尖底圆孔组，其数量和位置与移液器吸头放置盒孔对应。所述移液器吸头放置盒，为一个适用于市面方形移液器吸头盒的插槽，可将开盖移液器吸头盒放入其中。加样槽，为成排连通的尖底圆孔组，其数量和位置与放置盒孔对应，可从任意孔加入细胞和试剂混合样品，并通过连通使每个孔的样品量相同。

优选的，本实施例所述通气供压系统6包括围栏6-1、压缩气瓶6-4、通气管道6-5、喷气嘴6-7；压缩气瓶通过通气管道与喷气嘴相接，压缩气瓶与通气管道之间设有总阀门6-6，通气管道与喷气嘴之间通过螺纹连接，通气管道与喷气嘴之间设有分阀门6-3，喷气嘴6-7与滤管接触处设有橡胶垫圈6-2。外围栏长宽略大于放置盒，带一定角度倒角，以保证长期使用中通气供压系统与放置盒对齐合上。内部有成排喷气口，喷气口上有橡胶垫圈，于过滤管柱组中过滤管的上沿合上后可实现密封。喷气口通过内螺纹与管道和压缩气瓶相连，每个气口所连管道由一个电控阀门控制，气瓶端连有总阀门，方便更换气瓶。所述过滤管放置盒，有可放入过滤管柱组的排孔组成。

优选的，本实施例所述通气供压系统所用气体为氮气。

优选的，本实施例所述冷却系统可以是接入冰水的水冷换热管，也可以是压缩机冷却系统。

细胞致敏剂包括质量百分比为0.10% ~ 2.00%的聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、质量百分比为0.10% ~ 2.50%的乙基苯基聚乙二醇（NP-40）、缓冲盐溶液；其中缓冲盐溶液为：10-250mM 氯化钠、1-20mM 氯化镁、20-70mM Tris-盐酸缓冲盐溶液、pH为6.5-8.0，或者0.1倍~3倍PBS磷酸缓冲盐溶液，pH为6.5-8.0。本发明中，所述聚乙二醇辛基苯基醚是一种非离子型表面活性剂，配合低渗缓冲，能温和高效的致敏细胞膜，只需要普通涡旋振荡器混合样品，无需专业破碎仪，或其他破碎仪器。低温下孵育5-10min，可使细胞对机械力敏感。

系列细胞组分抽提液包括：质量百分比为0.30% ~ 2.20% 的聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）；质量百分比为0.10% ~ 4.00%的 聚氧乙烯（20）山梨醇酐单月桂酸酯（Tween20）；质量百分比为0.20% ~ 2.10% 的乙基苯基聚乙二醇（NP-40）；质量百分比为0.10% ~ 3.00% 的3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐（chaps）。缓冲液体系包括100-250mM 氯化钠、20-70mM Tris-盐酸 缓冲盐溶液，pH为6.5-8.0或0.1倍~ 3倍 PBS磷酸盐缓冲溶液，pH为6.5-8.0。能有效溶解各类双亲性或疏水性的难溶组分。

本实施例的工作原理为：

（1）将吸头放入移液器吸头放置盒中，将预定数量的滤管放入滤管放置盒，最后将一定量的细胞样本和致敏剂混合后加入加样槽孵育；

（2）启动自动提取程序，在孵育5-10min后，移液器移动到移液器吸头放置盒上方，下移插取吸头；移液器移动到加样槽上方，下移吸取样本混合液；移液器移动到滤管放置盒上方，下移将样品加到滤管中；移液器回移归位；

（3）通气供压系统下移，喷气嘴插入滤管，滤管上沿与橡胶垫圈压紧密封，喷气嘴喷出加压气体，使致敏剂处理过的细胞悬液迅速通过滤芯，细胞在剪切力和惯性冲击作用下破碎，通气供压系统上移回原位；取出滤管，收集管内所得滤液即为不含DNA的其他细胞组分；

（4）如需收集细胞总蛋白或某种亚细胞结构特殊分布的蛋白，可将步骤（3）所得产物预处理后将系列细胞组分抽提液加入到过滤产物中，待不溶物全部溶解后所得产物即为某种特定蛋白提取液。

应该指出的是，上述说明并非是对本实用新型的限制，本实用新型也并不仅限于上述举例，本技术领域的普通技术人员在本实用新型的实质范围内所做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本实用新型的保护范围。

任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例应用于其它领域，但是凡是未脱离本实用新型技术方案内容，依据本实用新型的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本实用新型技术方案的保护范围。

Claims (8)

1.一种细胞组分自动提取装置，包括：移液系统、过滤系统、冷却系统，冷却系统为移液系统和/或过滤系统提供0-4℃低温，其特征在于，该自动提取装置还包括自动控制系统，自动控制系统分别与移液系统、过滤系统、冷却系统连接；所述过滤系统包括：包括滤管放置盒(7)、通气供压系统(6)、滤管(9)，其中滤管(9)包括滤柱(9-3)、收集管(9-1)，滤柱(9-3)包括滤芯(9-2)，滤芯(9-2)在压缩气体加压过滤过程中使细胞膜致敏的细胞破碎并将核酸DNA滤除，分离出蛋白质和/或亚细胞组分。

2.根据权利要求1所述的一种细胞组分自动提取装置，其特征在于，所述滤芯为生物惰性的高分子材料制成的微孔结构。

3.根据权利要求2所述的一种细胞组分自动提取装置，其特征在于，所述滤芯用高分子材料加工成粒径10-150μm的颗粒，通过加压烧结成微孔结构，孔径范围为20-60μm，厚度范围为1mm-10mm。

4.根据权利要求1、2、3任一项所述的一种细胞组分自动提取装置，其特征在于，所述移液系统包括：移液器吸头放置盒(1)、加样槽(8)、移液器(2)、吸头。

5.根据权利要求4所述的一种细胞组分自动提取装置，其特征在于，所述移液器(2)为排式移液器，与加样槽平行排列，所述加样槽为成排连通的尖底圆孔组，其数量和位置与移液器吸头放置盒孔对应。

6.根据权利要求5所述的一种细胞组分自动提取装置，其特征在于，所述通气供压系统(6)包括围栏(6-1)、压缩气瓶(6-4)、通气管道(6-5)、喷气嘴(6-7)；压缩气瓶通过通气管道与喷气嘴相接，压缩气瓶与通气管道之间设有总阀门(6-6)，通气管道与喷气嘴之间通过螺纹连接，通气管道与喷气嘴之间设有分阀门(6-3)，喷气嘴(6-7)与滤管接触处设有橡胶垫圈(6-2)。

7.根据权利要求1、2、3任一项所述的一种细胞组分自动提取装置，其特征在于，所述通气供压系统所用气体为氮气。

8.根据权利要求1、2、3任一项所述的一种细胞组分自动提取装置，其特征在于，所述冷却系统可以是接入冰水的水冷换热管，也可以是压缩机冷却系统。

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