CN113477282A - 一种基于液滴微流控的单细胞分离系统及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于液滴微流控的单细胞分离系统及方法。所述系统包括微流控芯片、显微镜、高速相机、电脑、单片机和柱塞泵，高速相机捕获显微镜下液滴的图像传给电脑进行图像处理，电脑再给出分选信号给单片机，单片机控制柱塞泵运动，形成负压对液滴进行偏转，致使包裹单个细胞的液滴流向收集通道。本发明通过机器视觉的方法进行液滴识别，即通过高速相机拍摄显微镜下微流控芯片通道中的液滴图像，进行图像分析进行液滴的识别。本方法不需要对细胞做任何处理，对细胞几乎没有伤害，且操作简单，自动化程度高，能够高效快速进行单细胞的分离，解决了以往单细胞分离过程中存在的自动化低、容易给细胞造成伤害、通量比较低、操作比较繁琐等问题。

Description

一种基于液滴微流控的单细胞分离系统及方法
技术领域
本发明涉及微流控技术领域，更具体地，涉及一种基于液滴微流控的单细胞分离系统及方法。
背景技术
传统的细胞生物学和临床样本的分析，是基于组织(很多细胞)层面的，是所有结果的平均值。但是，细胞与细胞之间是有差异性的，传统的分析方法使细胞与细胞之间的差异性损失了。生物学单细胞分析显示了在生理条件下全面理解组织微工程的细胞维持异质性和复杂性的广阔前景。
要进行单细胞的分析，首先需要获取单个细胞，即单细胞的分离。传统的单细胞分离方法有很多，梯度稀释法和显微操作法人工成本很高，通量取决于操作人员的熟练程度；激光捕获显微切割技术容易在操作过程中对细胞造成伤害；荧光激活细胞分选技术需要给细胞加上荧光标记，不易操作且对细胞有损害。
基于液滴微流控的方法可以为细胞提供封闭的微环境，从而降低细胞的污染率；在微尺度上对目标细胞进行分离，对样本和试剂的损耗非常少；分离全自动化，能够高通量获得包裹单个细胞的液滴。现在大部分的液滴微流控的方法都是基于荧光信号进行液滴识别(例如中国专利CN109554333A公开了一种使用Namocell单细胞分离仪进行单细胞分选的方法)，在微流控芯片的电极上面加上高压产生介电泳力进行液滴的分选(例如中国专利CN111500524A公开了一种组织单细胞的捕获方法)。首先是荧光带来的问题，加荧光的不便和对细胞的伤害；其次是高压带来的问题，高压容易造成微流控芯片的损坏，而且高压可能使液滴和细胞裂解，容易影响细胞的活性。因此，现有技术还存在很多问题，需要改进和进一步发展。亟需提供一种不需要加荧光标记，不需要用高压电源进行液滴分选的单细胞分离系统和方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种用于单细胞分离的微流控芯片。
本发明的第二个目的在于提供一种基于液滴微流控的单细胞分离系统。
本发明的第三个目的在于提供一种基于液滴微流控的单细胞分离方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种用于单细胞分离的微流控芯片，具体设置有下述结构：油相入口、水相入口、负压口、收集口、废液口、液滴生成十字通道、人字通道、油相进液通道、水相进液通道、液体流出通道、液体收集通道和废液通道；
所述油相入口连接油相进液通道；
所述水相入口连接水相进液通道；
所述油相进液通道和水相进液通道交汇处呈“十”字交叉，形成液滴生成十字通道；
所述液滴生成十字通道通过液体流出通道连接人字通道一端，人字通道另两端分别通过液体收集通道连接收集口、废液通道连接废液口；
所述液体收集通道上设有负压口。
所述油相入口作为间隔油的入口，水相入口作为包裹细胞的液滴的入口；负压口连接柱塞泵，作为负压的入口；收集口作为包裹单个细胞的液滴的出口；废液口作为包裹多个细胞的液滴和空液滴的出口；间隔油和液滴在十字入口相遇，使得液滴之间的间隔变大，再通过机器视觉直接进行液滴的识别和分选；液滴流经人字通道，有两个方向，在不加负压情况下，液滴流向废液通道，在加负压情况下，液滴流向收集通道，进而实现不需要加荧光标记，不需要用高压电源进行液滴分选。
一种基于液滴微流控的单细胞分离系统，包括上述微流控芯片、液滴图像检测器、信号分析与分选控制单元和液压动力元件；
所述液滴图像检测器用于采集流经所述微流控芯片液体流出通道的液滴图像，并将其传送至信号分析与分选控制单元；
所述信号分析与分选控制单元用于分析、识别来自所述液滴图像检测器的信号液滴图像，并控制液压动力元件的工作；
所述液压动力元件连接微流控芯片负压口，用于接收所述信号分析与分选控制单元发送的分选控制指令，液压动力元件运动，形成负压，使得微流控芯片的液体收集通道流阻减小，液滴向液体收集通道移动，通过收集口收集包裹单个细胞的液滴。
优选地，所述液滴图像检测器包括显微镜和高速相机。
优选地，所述信号分析与分选控制单元包括电脑和单片机，电脑的输出端和单片机输入端相连。
优选地，所述液压动力元件为柱塞泵。由于柱塞泵体积小，成本低廉，利于系统小型化。
进一步优选地，所述微流控芯片置于所述显微镜的载物台上；所述高速相机设于所述显微镜的目镜上；所述电脑分别连接高速相机和单片机，单片机连接并控制柱塞泵；所述柱塞泵连接微流控芯片负压口。
通过将包裹细胞的液滴输入设计的微流控芯片后，高速相机捕获显微镜下液滴的图像传给电脑进行图像处理，电脑再给出分选信号给单片机，单片机控制柱塞泵运动，形成负压对液滴进行偏转，致使包裹单个细胞的液滴流向收集通道。
进一步优选地，所述系统还包括油相注射泵和水相注射泵；所述油相注射泵连接微流控芯片油相入口；所述水相注射泵连接微流控芯片水相入口。
本发明还提供一种基于微流控芯片的单细胞分离方法，包括如下步骤：
S1.液体注入和液滴的形成：利用油相注射泵驱动间隔油通过油相入口进入微流控芯片的油相进液通道，利用水相注射泵驱动包裹细胞的液滴通过水相入口进入微流控芯片的水相进液通道，所述间隔油和液滴在液滴生成十字通道处相遇，使得液滴之间的间隔变大；在压力驱动下，液滴在液体流出通道内定向流动，且默认流入废液通道；
S2.液滴信号采集和分析：当液滴通过液体流出通道流经液滴图像检测器时(显微镜、高速相机)，液滴的图像信号将被采集并传送到信号分析与分选控制单元(电脑、单片机)，通过将所接收的信号与设定的分选规则进行比对，判定所采集的液滴图像是否满足所述分选规则的条件；
S3.液滴分选：当采集的液滴信号满足包裹单个细胞的液滴分选条件时，信号分析与分选控制单元触发柱塞泵工作，使液滴受到柱塞泵施加的负压，进而改变其运动方向，流向液体收集通道的收集口。
优选地，步骤S2以阳性概率为80％作为阈值判断，高于80％判断为目标液滴，其他为废液滴。当目标液滴通过人字通道的时候，给单片机发送分选信号，控制柱塞泵运动，形成负压，液滴向收集通道运动。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明基于液滴微流控的单细胞分离系统和方法，主要分为两个部分：液滴的识别和液滴的分选。通过机器视觉的方法进行液滴的识别，即通过高速相机拍摄显微镜下微流控芯片通道中的液滴图像，进行图像分析进行液滴的识别。本方法不需要对细胞做任何处理，对细胞几乎没有伤害。本方法对大小相同但种类不同的细胞同样适用。通过柱塞泵形成负压，进行液滴的偏转，不会对液滴和细胞造成损害，并且，柱塞泵体积小，成本低廉，可以小型化。与现有技术相比，本发明能够高速有效地进行单细胞的分离，并且能够对细胞几乎无害、不同种类相同大小的细胞可以在不修改系统参数的情况下进行分离、成本低、能够小型化。
附图说明
图1为基于液滴微流控的单细胞分离系统的示意图。
图2为微流控芯片的设计示意图。
图3为微流控芯片实物图。
图4为基于液滴微流控的单细胞分离系统的实物图。
图5为微流控芯片的液滴进入水相入口的示例。
图6为液体在微流控芯片十字通道的液滴间隔示例。
图7为通过高速相机捕获显微镜下微流控芯片中液滴的图像；左图为包裹单个细胞的液滴，中间图为空液滴，右图为包裹多个细胞的液滴。
图8为获得的液滴图像处理后得到的阳性概率。
图注：1-油相入口，2-水相入口，3-负压口，4-收集口，5-废液口，6-液滴生成十字通道，7-人字通道，8-油相进液通道，9-水相进液通道，10-液体流出通道，11-液体收集通道，12-废液通道，13-显微镜，14-高速相机，15-柱塞泵，16-油相注射泵，17-水相注射泵。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1
如图1，一种基于液滴微流控的单细胞分离系统，包括微流控芯片、液滴图像检测器(显微镜和高速相机)、信号分析与分选控制单元(电脑和单片机)和液压动力元件(柱塞泵)；
所述微流控芯片具体设置有下述结构：油相入口1、水相入口2、负压口3、收集口4、废液口5、液滴生成十字通道6、人字通道7、油相进液通道8、水相进液通道9、液体流出通道10、液体收集通道11和废液通道12；所述油相入口1连接油相进液通道8；所述水相入口2连接水相进液通道9；所述油相进液通道8和水相进液通道9交汇处呈“十”字交叉，形成液滴生成十字通道6；所述液滴生成十字通道6通过液体流出通道10连接人字通道7一端，人字通道7另两端分别通过液体收集通道11连接收集口4、废液通道12连接废液口5；所述液体收集通道11上设有负压口3；所述微流控芯片的制备方法包括如下步骤：
(1)提供图2所示微流控芯片设计图；
(2)经过加工得到微流控芯片模具；
(3)将PDMS Base与固化剂以10:1混合，倒入模具，在60摄氏度下，加热6h；
(4)将固化后的PDMS从模具中切出，在油相入口1、水相入口2、负压口3、收集口4、废液口5打孔；
(5)将(4)处理后的PDMS和一块载玻片放入等离子体清洗机一分钟。将PDMS与载玻片贴合，然后在110摄氏度下加热20分钟。至此，微流控芯片完成，并对微流控芯片通道进行疏水处理，其实物如图3所示。
所述液滴图像检测器为显微镜和高速相机；所述液滴图像检测器用于采集流经所述微流控芯片液体流出通道10的液滴图像，并将其传送至信号分析与分选控制单元；
所述信号分析与分选控制单元为电脑和单片机；所述信号分析与分选控制单元用于分析、识别来自所述液滴图像检测器的信号液滴图像，并控制液压动力元件的工作；
所述液压动力元件为柱塞泵；所述液压动力元件连接微流控芯片负压口3，用于接收所述信号分析与分选控制单元发送的分选控制指令，液压动力元件运动，形成负压，使得微流控芯片的液体收集通道11流阻减小，液滴向液体收集通道11移动，通过收集口4收集包裹单个细胞的液滴。
具体地，所述基于液滴微流控的单细胞分离系统的实物图如图4所示，包括微流控芯片、显微镜13、高速相机14、电脑、单片机、柱塞泵15、油相注射泵16和水相注射泵17；所述微流控芯片置于显微镜13载物台上；所述高速相机14设于显微镜13目镜上；所述电脑分别连接高速相机14和单片机，单片机连接并控制柱塞泵；所述柱塞泵15连接微流控芯片负压口3；所述油相注射泵16连接微流控芯片油相入口1；所述水相注射泵17连接微流控芯片水相入口2。
S1.液体注入和液滴的形成：利用油相注射泵驱动间隔油通过油相入口1进入微流控芯片的油相进液通道8，利用水相注射泵驱动包裹细胞的液滴通过水相入口2进入微流控芯片的水相进液通道9(如图5)，所述间隔油和液滴在液滴生成十字通道6处相遇，使得液滴之间的间隔变大，如图6；同时在压力驱动下，液滴在液体流出通道10内定向流动，且默认流入废液通道12；
S2.液滴信号采集和分析：当液滴通过液体流出通道10流经液滴图像检测器时，液滴的图像信号将被采集并传送到信号分析与分选控制单元，通过将所接收的信号与设定的分选规则进行比对，判定所采集的液滴图像是否满足所述分选规则的条件；通过高速相机捕获显微镜下微流控芯片中液滴的图像，液滴的类型总共有三种，包裹单个细胞的液滴、空液滴、包裹多个细胞的液滴，如图7。将获得的图像进行图像处理，得到阳性概率，即每个液滴包含单个细胞的可能性，如图8，包裹单个细胞的液滴的阳性概率为92％，空液滴的阳性概率为6％，包裹多个细胞的液滴的阳性概率为7％。
S3.液滴分选：当采集的液滴信号满足包裹单个细胞的液滴分选条件时，信号分析与分选控制单元触发柱塞泵工作，使液滴受到柱塞泵施加的负压，进而改变其运动方向，流向液体收集通道11的收集口4。以阳性概率为80％作为阈值判断，高于80％判断为目标液滴，其他为废液滴。当目标液滴通过人字通道7的时候，给单片机发送分选信号，控制柱塞泵运动，形成负压，液滴向收集通道12运动。

Claims (8)

1.一种用于单细胞分离的微流控芯片，其特征在于，具体设置有下述结构：油相入口(1)、水相入口(2)、负压口(3)、收集口(4)、废液口(5)、液滴生成十字通道(6)、人字通道(7)、油相进液通道(8)、水相进液通道(9)、液体流出通道(10)、液体收集通道(11)和废液通道(12)；
所述油相入口(1)连接油相进液通道(8)；
所述水相入口(2)连接水相进液通道(9)；
所述油相进液通道(8)和水相进液通道(9)交汇处呈“十”字交叉，形成液滴生成十字通道(6)；
所述液滴生成十字通道(6)通过液体流出通道(10)连接人字通道(7)一端，人字通道(7)另两端分别通过液体收集通道(11)连接收集口(4)、废液通道(12)连接废液口(5)；
所述液体收集通道(11)上设有负压口(3)。
2.一种基于液滴微流控的单细胞分离系统，其特征在于，包括权利要求1所述微流控芯片、液滴图像检测器、信号分析与分选控制单元和液压动力元件；
所述液滴图像检测器用于采集流经所述微流控芯片液体流出通道(10)的液滴图像，并将其传送至信号分析与分选控制单元；
所述信号分析与分选控制单元用于分析、识别来自所述液滴图像检测器的信号液滴图像，并控制液压动力元件的工作；
所述液压动力元件连接微流控芯片负压口(3)，用于接收所述信号分析与分选控制单元发送的分选控制指令，液压动力元件运动，形成负压，使得微流控芯片的液体收集通道(11)流阻减小，液滴向液体收集通道(11)移动，通过收集口(4)收集包裹单个细胞的液滴。
3.根据权利要求2所述系统，其特征在于，所述液滴图像检测器包括显微镜和高速相机。
4.根据权利要求3所述系统，其特征在于，所述信号分析与分选控制单元包括电脑和单片机，电脑的输出端和单片机输入端相连。
5.根据权利要求4所述系统，其特征在于，所述液压动力元件为柱塞泵。
6.根据权利要求5所述系统，其特征在于，所述微流控芯片置于所述显微镜的载物台上；所述高速相机设于所述显微镜的目镜上；所述电脑分别连接高速相机和单片机，单片机连接并控制柱塞泵；所述柱塞泵连接微流控芯片负压口(3)。
7.根据权利要求6所述系统，其特征在于，还包括油相注射泵和水相注射泵；所述油相注射泵连接微流控芯片油相入口(1)；所述水相注射泵连接微流控芯片水相入口(2)。
8.一种基于微流控芯片的单细胞分离方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.液体注入和液滴的形成：利用油相注射泵驱动间隔油通过油相入口(1)进入微流控芯片的油相进液通道(8)，利用水相注射泵驱动包裹细胞的液滴通过水相入口(2)进入微流控芯片的水相进液通道(9)，所述间隔油和液滴在液滴生成十字通道(6)处相遇，使得液滴之间的间隔变大；在压力驱动下，液滴在液体流出通道(10)内定向流动，且默认流入废液通道(12)；
S2.液滴信号采集和分析：当液滴通过液体流出通道(10)流经液滴图像检测器时，液滴的图像信号将被采集并传送到信号分析与分选控制单元，通过将所接收的信号与设定的分选规则进行比对，判定所采集的液滴图像是否满足所述分选规则的条件；
S3.液滴分选：当采集的液滴信号满足包裹单个细胞的液滴分选条件时，信号分析与分选控制单元触发柱塞泵工作，使液滴受到柱塞泵施加的负压，进而改变其运动方向，流向液体收集通道(11)的收集口(4)。
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