CN112342137A - 一种基于图像处理和微流控打印的单细胞分选装置及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于图像处理和喷墨打印的单细胞分选装置及方法，包括微流控芯片、图像采集装置、图像处理与控制单元、位移致动器、液体容器和位移台；包含有细胞的液体在压力驱动下在微流控芯片中的管道中流动，当图像采集装置拍摄、识别到所需筛选的目标对象时，控制单元驱动位移致动器产生敲击芯片的动作，从微流控芯片的喷口打印出包含单个细胞的微液滴，结合位移台，将不同目标细胞分割在不同液滴中。本发明提供的微流控细胞打印技术，结合原位图像检测技术，能够实现高精度细胞分选。

Description

一种基于图像处理和微流控打印的单细胞分选装置及方法
技术领域
本发明属于生物医疗仪器技术领域，具体涉及一种基于图像处理和微流控打印的单细胞分选装置及方法。
背景技术
在癌细胞筛查、单细胞克隆、细胞分化机理研究、药物开发、单细胞测序等生物医疗领域中，经常需要利用细胞分选装置从一种或多种细胞溶液中分离出单个的目标细胞。目前，流式细胞仪是最常用的单细胞分选装置，其利用激光器激发检测被染色细胞内部的荧光信号，从而识别细胞种类，并通过挤压产生带电荷液滴分选细胞。但利用荧光信号对细胞进行分类，能反映的细胞信息有限，而且荧光染色会对细胞造成损伤。因此，近年来基于图像处理的细胞分选方法通过非荧光标记的方法被用于检测细胞种类：如2018年《cell》(10卷，1016)报道了采用图像处理分选海藻细胞和血小板，2019年《nature methods》(10卷，1038)把这种方法用于分选血细胞，中国专利CN 201780046504.9《基于图像的细胞分选系统和方法》也提出了一种基于图像的细胞分选方法，但是他们都不能进行单个细胞的分选。这是因为细胞只能在致动器的作用下轻微偏移，进入指定管道，导致只能把细胞进行分类，而不能进行单细胞分离。采用打印的方法可以生产包含单个细胞的液滴，如中国专利CN201811382635.7《一种使用单细胞打印机进行单细胞分选的方法》，但是现有方案都是基于传统喷墨打印机来产生细胞液滴，这种毛细力进液的方式导致细胞在喷嘴是不可控的，分配效率不高，且没有办法对多种细胞分选，为此我们提出一种基于图像处理和微流控打印的单细胞分选装置，该装置采用微流控打印技术，可以在流动环境下直接从多种细胞中分选出单个目标细胞，采用微流控芯片结合喷墨打印的方案，其精度高，成本低，具有巨大应用前景。图像处理方法不需要荧光标记，而且可以获取更多细胞信息。采用图像检测，可以非常准确获取细胞在喷口处的位置，使分选更加精确。采用高分子材料制作微流控芯片，芯片与位移致动器分离，成本低，无污染。
发明内容
本发明技术解决问题：克服现有技术的不足，提供一种无需荧光标记，高效率单细胞分选装置及方法，不需要荧光标记，对细胞的损伤小，还可提供更多关于细胞形态信息，有助于实现对细胞更精细的分选；微流控打印不仅可以实现细胞的种群分类，还能实现单个细胞的隔离，为单细胞的分析提供更便捷的手段。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案，通过结合图像检测技术和微流控打印技术，实现单细胞的隔离与分选。
本发明一种基于图像处理和微流控打印的单细胞分选装置，包括微流控芯片、图像采集装置、图像处理与控制单元、位移致动器、液体容器和位移台；其中：
微流控芯片，包含有细胞的液体在外部压力的作用下在微流控芯片的微管道中流动；
图像采集装置，用于拍摄微流控芯片的喷嘴及其附近微管道内液体的图像，并把图像实时传输给图像处理与控制单元；
图像处理与控制单元，图像处理单元对采集的图像数据进行分析，从中获取与细胞相关的信息，并基于所述细胞相关的信息与设定条件进行比较，如果检测到目标细胞，控制单元发送触发信号给位移致动器和位移台。
位移致动器，在触发信号的作用下，敲击所述微流控芯片的打印腔，使微管道中包含有单个细胞的液体从微流控芯片的喷嘴中喷出，形成包含单细胞的液滴；
液体容器，用于接收打印产生的液滴；
位移台，用于液体容器的移动，使打印产生的液滴滴落在容器不同位置。
所述微流控芯片包括入口，出口、微管道、喷嘴和打印腔，喷嘴宽度尺寸范围20微米至200微米。
所述微流控芯片分为弹性层，微管道层，基底层，所述弹性层、管道层与基底层为高分子材料或玻璃，所述高分子材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)或聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)，微管道层的厚度范围20微米至200微米。
所述图像采集装置采集帧率大于1000FPS。
所述细胞相关的信息包括细胞在微管道中的位置、细胞尺寸、细胞形态、细胞数量。
所述位移致动器的前端固结有一个微针，微针与微流控芯片的打印腔对准，在控制单元作用下，位移致动器带动微针垂直敲击在微流控芯片上表面，每一次敲击产生一个液滴；所述位移致动器是压电致动器、电磁致动器或气动致动器。
所述液滴大小与位移致动器的驱动电压成正相关。
一种图像处理和微流控打印的单细胞分选装置的实现方法，包括以下步骤：
(1)包含细胞的液体在外部压力的作用下在微流控芯片中流动；
(2)图像采集装置采集喷嘴及其附近微管道内液体的图像，并把图像实时传输给图像处理与控制单元；
(3)图像处理与控制单元处理采集到的图像，从中获取与细胞相关的信息，并基于细胞相关的信息与设定条件进行比较，如果检测到目标细胞，控制单元发送触发信号给位移致动器和位移台；
(4)位移致动器在触发信号的作用下，敲击所述微流控芯片的打印腔，使微管道中包含有单个细胞的液体从微流控芯片的喷嘴中喷出，形成包含单细胞的液滴，实现对单个细胞的隔离；
(5)位移台带动液体容器的移动，使打印产生的液滴滴落在容器不同位置。
相比于现有技术，本发明的有益效果在于：
(1)本发明采用微流控打印技术，可以在流动环境下直接从多种细胞中分选出单个目标细胞，且采用微流控芯片结合喷墨打印的方案，其精度高，成本低，具有巨大应用前景。
(2)本发明采用图像处理不需要荧光标记，而且可以获取更多细胞信息。
(3)本发明采用图像检测，可以非常准确获取细胞在喷口处的位置，使分选更加精确。
(4)本发明微流控芯片采用高分子材料制作，并且芯片与位移致动器分离，成本低，无污染。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的示例实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
图1为本发明示例实施例的结构示意图；
图2为本发明示例实施的微流控芯片的结构示意图；
图3为本发明示例实施例的芯片截面结构与液滴产生原理示意图；
图4为本发明图像处理过程的示意图；
图5为本发明产生的单粒子液滴阵列的示意图。
附图标记说明：
1为微流控芯片；2为图像采集装置；3为图像处理与控制单元；4为位移制动器；5为液体容器；6为位移台；7为入口；8为打印腔；9为微管道；10为喷嘴；11为出口；12为弹性层；13为微管道层；14为基底层；15为微针。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
如图1所示，本发明提出了一种具体实施技术方案：一种基于图像处理和微流控打印的单细胞分选装置，包括：
微流控芯片1，包含有细胞的液体在外部压力的作用下在微流控芯片的微管道9中流动；图像采集装置2，用于拍摄微流控芯片1的喷嘴10及其附近微管道内液体的图像，并把图像实时传输给图像处理与控制单元3；图像处理与控制单元3，图像处理单元对采集的图像数据进行分析，从中获取与细胞相关的信息，并基于所述细胞相关的信息与设定条件进行比较，如果检测到目标细胞，控制单元发送触发信号给位移致动器4和位移台6。位移致动器4，在触发信号的作用下，带动其端部的微针15敲击所述微流控芯片1的打印腔8，使微管道9中包含有单个细胞的液体从微流控芯片1的喷嘴中喷出，形成包含单细胞的液滴；液体容器5，用于接收打印产生的液滴；位移台6，用于液体容器5的移动，使打印产生的液滴滴落在容器不同位置。
如图2所示，微流控芯片1由入口7、打印腔8、微管道9、喷嘴10、出口11组成。本发明微流控芯片1加工工艺如下：旋涂光刻胶到指定厚度，通过光刻得到光刻胶膜具，然后旋涂PDMS覆盖在模具上到指定厚度，加热固化后脱模，形成了带有微管道9的薄膜；同时在玻璃上旋涂PDMS，通过加热固化形成指定厚度的PDMS作为基底；对两次得到的PDMS层进行等离子体处理后键合，并对侧边采用切刀切割得到喷嘴10，喷嘴10经过飞秒激光处理形成超疏水结构，同时为了增加刚度，可以把芯片键合到玻璃上，形成完整的微流控芯片1。其中典型的管道为70微米，喷嘴宽度为120微米。
如图3所示，微流控芯片1分为弹性层12、微管道层13、基底层14三层。位移致动器4端部固结有微针15，位移致动器4在触发信号的作用下发生位移，带动微针15敲击所述微流控芯片1的打印腔8，使弹性层12变形，微管道9中液体受到挤压，部分液体从微流控芯片1的喷嘴10中喷出，形成液滴；微流控芯片1的弹性层12、微管道层13、基底层14材料可以是聚二甲基硅氧烷(PDMS)或聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)。
如图4所示，采集图像的处理过程包括3步：背景消减、阈值分割、轮廓检测。背景消减是指用采集图像的数据矩阵与背景图像的数据矩阵做减法运算，使图片中细胞更加清晰。阈值分割是指选取一个合适的阈值，把图像转化为黑白图像，使细胞轮廓更清晰，易于识别。轮廓检测是指通过轮廓标识，得到细胞的周长、面积、圆度值。
图像处理与控制单元3把接收到的图像保存为8位灰度图像，首先对图像进行背景消减使图像中细胞更清晰，然后进行高斯模糊去除图像噪声，然后使用全局阈值分割得到二值图像，使细胞轮廓更清晰，易于识别，最后，通过轮廓检测可以很容易地得到图像中细胞的数量、大小、形态和位置。若所采集图像中只有一个细胞，且细胞处于设定的坐标内，发送触发信号给位移致动器4和位移台6。
整个系统的工作流程如下：首先，压力泵或注射泵把包含细胞的液体从入口7挤压到微流控芯片1中，细胞随着液体朝出口11方向流动到微管道9中，图像采集装置2以1000FPS的帧率采集图像，并实时传输图像给图像处理与控制单元3。图像处理与控制单元3可以是由计算机、单片机、功率放大器组成，计算机把图像转化为8位的灰度图，灰度值范围为0-255。然后对图像进行背景消减，接着进行高斯模糊去除图像噪声，图像卷积采用维数为9×9、方差为2的高斯模糊核进行，然后使用全局阈值分割得到二值图像，阈值tb＝100，使细胞轮廓更清晰，易于识别。最后，通过轮廓检测可以很容易地得到图像中细胞的数量、大小、形态和位置。整个识别过程用时0.3微秒。当检测得到的细胞数量为一个时，且细胞的位置处于已选定的最佳打印区域内，计算机发送触发信号给单片机，单片机产生5V的低压脉冲信号，经过功率放大器放大得到高压脉冲信号。位移致动器4在高压脉冲信号的驱动下产生位移，带动其端部的微针15运动。微针15挤压弹性层12，从而从喷嘴10处产生含有单个细胞的液滴。液滴可以直接收集在液体容器5的单个位置，也可以通过位移台6配合移动产生单细胞液滴阵列或者各种细胞液滴图案。
如图5所示，采用载玻片作为液体容器5，每当位移致动器4触发一次，图像采集与控制单元3控制位移台6移动一步，形成液滴阵列，阵列中单个粒子的比例占94％。
这种装置不仅可以用于单种细胞的分离，还可以用于多种细胞混合液中特定细胞的分选，尤其适合稀有细胞的分选，如外周血中的循环肿瘤细胞。通过图像处理，分离血液中多种细胞的形态尺寸差异，提取循环肿瘤细胞的特征。当计算机检测到目标肿瘤细胞时，发送信号给单片机，完成循环肿瘤细胞的单个分选。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种基于图像处理和微流控打印的单细胞分选装置，包括微流控芯片、图像采集装置、图像处理与控制单元、位移致动器、液体容器和位移台，其特征在于：
微流控芯片，包含有细胞的液体在外部压力的作用下在微流控芯片的微管道中流动；
图像采集装置，用于拍摄微流控芯片的喷嘴及其附近微管道内液体的图像，并把图像实时传输给图像处理与控制单元；
图像处理与控制单元，图像处理单元对采集的图像数据进行分析，从中获取与细胞相关的信息，并基于所述细胞相关的信息与设定条件进行比较，如果检测到目标细胞，控制单元发送触发信号给位移致动器和位移台。
位移致动器，在触发信号的作用下，敲击所述微流控芯片的打印腔，使微管道中包含有单个细胞的液体从微流控芯片的喷嘴中喷出，形成包含单细胞的液滴；
液体容器，用于接收打印产生的液滴；
位移台，用于液体容器的移动，使打印产生的液滴滴落在容器不同位置。
2.根据权利要求1所述的基于图像处理和微流控打印的单细胞分选装置，其特征在于：所述微流控芯片包括入口，出口、微管道、喷嘴和打印腔，喷嘴宽度尺寸范围20微米至200微米。
3.根据权利要求1所述的基于图像处理和微流控打印的单细胞分选装置，其特征在于：所述微流控芯片分为弹性层，微管道层，基底层，所述弹性层、管道层与基底层为高分子材料或玻璃，所述高分子材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)或聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)，微管道层的厚度范围20微米至200微米。
4.根据权利要求1所述的基于图像处理和微流控打印的单细胞分选装置，其特征在于：所述图像采集装置采集帧率大于1000FPS。
5.根据权利要求1所述的基于图像处理和微流控打印的单细胞分选装置，其特征在于：所述细胞相关的信息包括细胞在微管道中的位置、细胞尺寸、细胞形态、细胞数量。
6.根据权利要求1所述的基于图像处理和微流控打印的单细胞分选装置，其特征在于：所述位移致动器的前端固结有一个微针，微针与微流控芯片的打印腔对准，在控制单元作用下，位移致动器带动微针垂直敲击在微流控芯片上表面，每一次敲击产生一个液滴；所述位移致动器是压电致动器、电磁致动器或气动致动器。
7.根据权利要求1所述的基于图像处理和微流控打印的单细胞分选装置，其特征在于：所述液滴大小与位移致动器的驱动电压成正相关。
8.一种基于权利要求1-7任意之一所述的图像处理和微流控打印的单细胞分选装置的实现方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)包含细胞的液体在外部压力的作用下在微流控芯片中流动；
(2)图像采集装置采集喷嘴及其附近微管道内液体的图像，并把图像实时传输给图像处理与控制单元；
(3)图像处理与控制单元处理采集到的图像，从中获取与细胞相关的信息，并基于细胞相关的信息与设定条件进行比较，如果检测到目标细胞，控制单元发送触发信号给位移致动器和位移台；
(4)位移致动器在触发信号的作用下，敲击所述微流控芯片的打印腔，使微管道中包含有单个细胞的液体从微流控芯片的喷嘴中喷出，形成包含单细胞的液滴，实现对单个细胞的隔离；
(5)位移台带动液体容器的移动，使打印产生的液滴滴落在容器不同位置。
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