CN113817589A - 一种细胞转染装置、细胞转染方法及微流道制作方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种细胞转染装置、细胞转染方法及微流道制作方法，装置包括微流控芯片及可调谐挤压机构，微流控芯片内设有微流道，微流道内设有一受限空间，多个外源物质设于微流道内；可调谐挤压机构包括微针尖、压电致动器及悬臂梁；当压电致动器振动时，带动微针尖上下运动、挤压或脱离微流控芯片，带动受限空间内的细胞的细胞膜破坏产生通孔，外源物质通过通孔进入到细胞内。上述细胞转染装置、细胞转染方法及微流道制作方法，通过可调谐挤压机构规律性的挤压或脱离微流控芯片，使得微流道的宽度可变，从而适用于不同大小的细胞，解决了传统固定宽度的微流道只适用于特定大小或者变形力的细胞，对大分子的纳米外源物质的转染效率低下的问题。

Description

一种细胞转染装置、细胞转染方法及微流道制作方法

技术领域

本发明涉及生物转染技术领域，特别涉及一种细胞转染装置、细胞转染方法及微流道制作方法。

背景技术

微流控技术是指研究人员可以通过精妙的结构设计和先进微电子工艺以期达到对单个细胞进行力学、电学等物理加载。微尺度的电极技术、剪切力加载和局域加热技术与微流控技术相结合都能够用来使单个细胞膜产生暂时性通孔。

细胞内输运(Intracellular Delivery)是将诸如基因、蛋白和生物大分子等纳米尺度外源性物质转染到目标细胞的胞体内并成功表达的过程。细胞转染是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术，是基因编辑、细胞治疗、再生医学和众多细胞研究领域的重要组成环节。结合了微流控技术的细胞转染技术相较于宏观的细胞转染技术具有明显的优势：可以对单细胞进行操纵并实现穿孔、同时可以在微观层面研究细胞膜穿孔的力学机理、并且可以实现目标细胞高活性等。

机械挤压(Cell Squeezing)指的是当细胞通过大约为其直径一半大小的微流控机械流道时，细胞会产生大的形变并在细胞膜上产生大量通孔。当细胞受到微流道侧壁挤压后会产生细胞膜上暂时性通孔(图1所示)，外源物质如蛋白、核酸、量子点、碳纳米管和其他纳米材料都能穿过细胞膜上通孔进入到目标细胞体内。基于机械挤压的转染方法最大的特点是器件简单，不需要其他的能量来源。细胞膜的暂时性通孔是由流体通过微流道侧壁与细胞进行相互挤压产生。然而机械挤压方法存在两个很大的弊端：

(1)转染效率与细胞大小及变形力有关。这意味着对于固定宽度的微流道只适用于特定大小或者变形力的细胞。对于体积偏大的细胞会直接裂解造成细胞死亡；而对于体积偏小的细胞又无法产生足够的细胞膜变形以产生通孔。因此对于不同尺寸的细胞，需要设计不同的大小和形状的微流道机械结构来达到较高的转染效率。

(2)对大分子的纳米外源物质的转染效率低下。这是由于机械挤压方法对细胞的剪切作用时间在数百毫秒量级，可被看成准静态剪切拉伸；经典的微管吸允法实验(即准静态拉伸)证明红细胞膜的极限临界应变值为2-4％。较小的细胞膜形变无法产生更大的细胞膜通孔，因此对大分子质量的外源物质的转染效率很低。

对于传统的机械挤压细胞转染技术而言，只能通过加大流体压力或者减少微流道的宽度来使得细胞膜的变形增大。而相较于准静态拉伸，瞬态的冲击拉伸可以使细胞膜发生更大的形变而不影响细胞的活性。

发明内容

基于此，本发明的目的是提供一种细胞转染装置及方法，用于解决现有技术中传统固定宽度的微流道只适用于特定大小或者变形力的细胞，对大分子的纳米外源物质的转染效率低下的问题。

本申请一方面提供一种细胞转染装置，包括微流控芯片、及位于所述微流控芯片上方、且以一定频率挤压所述微流控芯片的可调谐挤压机构，所述微流控芯片内设有微流道，所述微流道内设有一受限空间，所述受限空间的截面尺寸不大于细胞的直径，多个外源物质设于所述微流道内；

所述可调谐挤压机构包括微针尖、压电致动器、以及连接所述微针尖与所述压电致动器的悬臂梁，所述微针尖位于所述受限空间的上方，且所述微针尖与所述受限空间的中心轴线位于同一垂直方向；

当所述压电致动器以一定频率振动时，通过所述悬臂梁带动所述微针尖随所述压电致动器的振动频率上下运动、并挤压或脱离所述微流控芯片，从而挤压或脱离所述微流道，带动所述受限空间内的细胞的细胞膜破坏产生通孔，使得所述外源物质通过所述通孔进入到细胞内。

上述细胞转染装置，通过在微流道内设置受限空间，同时，加设可调谐挤压机构规律性的挤压或脱离微流控芯片，使得微流道的宽度可变，从而适用于不同大小的细胞，满足对大分子的纳米外源物质的转染，避免了传统的微流道的宽度固定不变，导致只适用于特定大小或者变形力的细胞的方案，具体的，通过悬臂梁带动微针尖随压电致动器的振动频率上下运动、并挤压或脱离微流控芯片，从而挤压或脱离微流道，带动受限空间内的细胞的细胞膜破坏产生通孔，使得外源物质通过通孔进入到细胞内，解决了传统固定宽度的微流道只适用于特定大小或者变形力的细胞，对大分子的纳米外源物质的转染效率低下的问题。

另外，根据本发明上述的细胞转染装置，还可以具有如下附加的技术特征：

进一步的，所述装置还包括动力机构，通过所述动力机构将细胞压入至所述微流道内，进而穿过所述受限空间，带动细胞在所述微流道内完成转运。

进一步的，所述装置还包括可移动的微位移平台，所述微流控芯片设于所述微位移平台上，通过调整所述微位移平台的位置，从而调整所述微流控芯片与所述可调谐挤压机构的相对空间位置。

进一步的，所述微流控芯片为高分子材料。

进一步的，所述受限空间位于所述微流道的中部、且横截面的尺寸小于所述微流道的横截面尺寸。

进一步的，所述装置还包括控制机构，所述控制机构连接所述可调谐挤压机构、且为其提供工作指令。

本申请另一方面提供细胞转染方法，采用上述的细胞转染装置，所述方法包括：

当计算机设备获取到波形信号时，通过信号发生器将所述波形信号转换成控制信号，并将所述控制信号传递给压电驱动器；

当所述压电驱动器接收到所述控制信号时，将所述控制信号转换为固定频率并输出至悬臂梁，带动所述悬臂梁规律性运动，从而带动设于所述悬臂梁端部的微针尖规律性的敲击微流控芯片；

当所述微针尖敲击所述微流控芯片时，所述微流控芯片内的微流道被挤压，使得所述微流道的侧壁变形并挤压所述微流道内的液态，导致当细胞经过所述微流道内的受限空间时，所述细胞受到来自所述微流道的挤压；

当所述细胞受到来自所述微流道的挤压时，所述细胞的细胞膜产生暂时性通孔，使得外源物质穿过所述通孔进入到所述细胞的体内，实现细胞内输运，完成细胞转染。

另外，根据本发明上述的细胞转染方法，还可以具有如下附加的技术特征：

进一步的，所述通过信号发生器将所述波形信号转换为控制信号的步骤包括：

所述信号发生器获取所述波形信号；

将获取到的所述波形信号转换为电信号，并将所述电信号输出至信号放大器；

当所述信号放大器接收到所述电信号时，将获取到的所述电信号转换为所述控制信号。

本申请另一方面还提供一种微流道制作方法，应用于上述的细胞转染装置中的微流道，所述制作方法包括：

选择目标光刻胶，将所述目标光刻胶在硅片上旋涂一定厚度，并将涂有光刻胶的硅片进行热板前烘处理；

将经热板前烘处理后的硅片进行紫外曝光处理，所述曝光处理的曝光剂量由汞灯光强和曝光时间进行控制，将经曝光处理后的硅片放入所述光刻胶的专用显影液中显影并清洗后烘得到模板；

将PDMS溶液与固化剂按10:1的配比进行混合、去气并浇注于所述模板上，得到含有PDMS溶液与固化剂的模板，将所述含有PDMS溶液与固化剂的模板至于烘箱内加热固化；

取出固化后的模板，得到PDMS结构，将所述PDMS结构从模板上转移，通过等离子体键合技术将所述PDMS结构与盖玻片进行键合密封，得到所述微流道。

附图说明

图1为本发明申请中细胞膜上产生暂时性通孔的原理示意图；

图2为本发明第一实施例中细胞转染装置的工作原理示意图；

图3为本发明第二实施例中细胞转染方法的流程步骤图；

图4为本发明第二实施例中波形信号的转换流程步骤图；

图5为本发明第三实施例中微流道制作方法的流程步骤图；

图6为本发明第三实施例中微流控芯片的加工示意图。

主要元件符号说明：

压电致动器	110	悬臂梁	120
				微针尖	130	微流控芯片	200
计算机	300	信号发生器	400
				信号放大器	500

如下具体实施方式将结合上述附图进一步说明本发明。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的若干实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。

需要说明的是，当元件被称为“固设于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。本文所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例一

请参阅图2，所示为本发明第一实施例中的细胞转染装置，装置包括微流控芯片200、及位于微流控芯片200上方、且以一定频率挤压微流控芯片200的可调谐挤压机构，微流控芯片200内设有微流道，微流道内设有一受限空间，受限空间的截面尺寸不大于细胞的直径，多个外源物质设于微流道内，具体的，外源物质为需转染的纳米分子，受限空间位于微流道的中部、且横截面的尺寸小于常态下的微流道的横截面尺寸，当细胞流经受限空间时，受限空间限位细胞，可调谐挤压机构通过挤压微流控芯片200进而挤压位于受限空间内的细胞，此时，细胞的细胞膜经挤压而生成多个通孔，外源物质经过通孔进入到细胞内，当可调谐挤压机构脱离微流控芯片200时，细胞膜回缩复位，通孔关闭，完成细胞转染。

具体的，可调谐挤压机构采用压电冲击驱动器，在实际使用中，压电冲击驱动器频率可控，便于根据不同的需求，设置不同的频率挤压微流控芯片200，进一步的，压电冲击驱动器具有多个单元，包括微针尖130、压电致动器110、以及连接微针尖130与压电致动器110的悬臂梁120，微针尖130位于受限空间的上方，且微针尖130与受限空间的中心轴线位于同一垂直方向。微针尖130随着压电致动器110的可调谐压电冲击挤压微流控芯片200，具体的，微流控芯片200设于压电致动器110的下方，且通过微针尖130柔性机械挤压微流控芯片200。

装置还包括动力机构，通过动力机构将细胞压入至微流道内，进而穿过受限空间，带动细胞在微流道内完成转运。具体的，柔性微流控芯片200注满所需转染的纳米分子，通过泵将细胞压入微流道中。细胞通过受限部位时，受到被针尖冲击过后的微流道的挤压，保证了每一个通过的细胞受到了合适的挤压，发生细胞内输运，从而达到所需要的目标。

具体的，当所述压电致动器110以一定频率振动时，通过所述悬臂梁120带动所述微针尖130随所述压电致动器110的振动频率上下运动、并挤压或脱离所述微流控芯片200，从而挤压或脱离所述微流道，带动所述受限空间内的细胞的细胞膜破坏产生通孔，使得所述外源物质通过所述通孔进入到细胞内。作为一个具体示例，在本申请中，微流控芯片200为高分子材料，具体的，使用的高分子材料PDMS制作微流控芯片200，使得微流控芯片200具有柔性。

在本实施例中，装置还包括可移动的微位移平台，微流控芯片200设于微位移平台上，通过调整微位移平台的位置，从而调整微流控芯片200与可调谐挤压机构的相对空间位置。进一步的，装置还包括控制机构，控制机构连接可调谐挤压机构、且为其提供工作指令。

压电冲击驱动器的结构上将带有微针尖130的微悬臂梁120与压电致动器110进行粘合固定，压电信号通过软件控制数模转换器输出，经过信号放大器500控制压电致动器110并带动悬臂梁120往复运动敲击微流道侧壁。其中主要的压电控制参数为：偏置电压、脉冲频率、振幅和相位。为了实现微悬臂梁120针尖与微流控芯片200位置调整，拟将微流控芯片200放置在微位移平台上，通过调整微位移平台来调整悬臂梁120和微流控芯片200的相对空间位置。

在本申请中，计算机300输入波形，通过信号发生器400将波形信号发送至信号放大器500，信号放大器500连接着压电驱动器，计算机300控制压电制动器进而控制微针尖130的微悬臂梁120的频率。柔性微流控芯片200注满所需转染的纳米分子，通过泵将细胞压入微流道中。细胞通过受限部位时，受到被微针尖130冲击过后的微流道的挤压，保证了每一个通过的细胞受到了合适的挤压，发生细胞内输运，从而达到所需要的目标。

综上，本发明上述实施例当中的细胞转染装置，通过在微流道内设置受限空间，同时，加设可调谐挤压机构规律性的挤压或脱离微流控芯片，使得微流道的宽度可变，从而适用于不同大小的细胞，满足对大分子的纳米外源物质的转染，避免了传统的微流道的宽度固定不变，导致只适用于特定大小或者变形力的细胞的方案，具体的，通过悬臂梁带动微针尖随压电致动器的振动频率上下运动、并挤压或脱离微流控芯片，从而挤压或脱离微流道，带动受限空间内的细胞的细胞膜破坏产生通孔，使得外源物质通过通孔进入到细胞内，解决了传统固定宽度的微流道只适用于特定大小或者变形力的细胞，对大分子的纳米外源物质的转染效率低下的问题。

实施例二

请查阅图3，所示为本发明第二实施例中的细胞转染方法，细胞转染方法采用上述实施例中的细胞转染装置，方法包括步骤S201至步骤S204：

S201、当计算机设备获取到波形信号时，通过信号发生器将波形信号转换成控制信号，并将控制信号传递给压电驱动器；

S202、当压电驱动器接收到控制信号时，将控制信号转换为固定频率并输出至悬臂梁，带动悬臂梁规律性运动，从而带动设于悬臂梁端部的微针尖规律性的敲击微流控芯片；

S203、当微针尖敲击微流控芯片时，微流控芯片内的微流道被挤压，使得微流道的侧壁变形并挤压微流道内的液态，导致当细胞经过微流道内的受限空间时，细胞受到来自微流道的挤压；

S204、当细胞受到来自微流道的挤压时，细胞的细胞膜产生暂时性通孔，使得外源物质穿过通孔进入到细胞的体内，实现细胞内输运，完成细胞转染。

具体的，请参阅图4，通过信号发生器将波形信号转换为控制信号的步骤包括步骤S2011至步骤S2013：

S2011、信号发生器获取波形信号；

S2012、将获取到的波形信号转换为电信号，并将电信号输出至信号放大器；

S2013、当信号放大器接收到电信号时，将获取到的电信号转换为控制信号。

综上，本发明上述实施例当中的细胞转染方法，通过在微流道内设置受限空间，同时，加设可调谐挤压机构规律性的挤压或脱离微流控芯片，使得微流道的宽度可变，从而适用于不同大小的细胞，满足对大分子的纳米外源物质的转染，避免了传统的微流道的宽度固定不变，导致只适用于特定大小或者变形力的细胞的方案，具体的，通过悬臂梁带动微针尖随压电致动器的振动频率上下运动、并挤压或脱离微流控芯片，从而挤压或脱离微流道，带动受限空间内的细胞的细胞膜破坏产生通孔，使得外源物质通过通孔进入到细胞内，解决了传统固定宽度的微流道只适用于特定大小或者变形力的细胞，对大分子的纳米外源物质的转染效率低下的问题。

实施例三

请查阅图5，所示为本发明第三实施例中的微流道制作方法，应用于上述实施例中的细胞转染装置中的微流道，制作方法包括步骤S301至步骤S304：

S301、获取目标光刻胶，将目标光刻胶在硅片上旋涂一定厚度，并将涂有光刻胶的硅片进行热板前烘处理；

作为一个具体示例，采用高分子材料PDMS通过MEMS软光刻技术来制作加工微流道，如图6所示为微流控芯片的加工示意图。所述MEMS加工方法，可以大批量生产微流控芯片，降低了微流控芯片的加工成本。

通过SU-8光刻胶型号与旋涂转数可以控制光刻胶的厚度，从而决定PDMS微流道的厚度。由于单细胞直径通常为20微米以下，在本实施例中，选择2030型号SU-8光刻胶进行旋涂，其标称厚度在3000转/分转速下为30微米。

S302、将经热板前烘处理后的硅片进行紫外曝光处理，曝光处理的曝光剂量由汞灯光强和曝光时间进行控制，将经曝光处理后的硅片放入光刻胶的专用显影液中显影并清洗后烘得到模板；

在旋涂SU-8光刻胶结束后需对其进行热板前烘处理；其后将旋涂有光刻胶的硅片进行紫外曝光处理，曝光剂量由汞灯光强和曝光时间进行控制；再其次将曝光过的硅片放入SU-8专用显影液中显影并清洗后烘得到模板。

S303、将PDMS溶液与固化剂按10:1的配比进行混合、去气并浇注于模板上，得到含有PDMS溶液与固化剂的模板，将含有PDMS溶液与固化剂的模板至于烘箱内加热固化；

S304、取出固化后的模板，得到PDMS结构，将PDMS结构从模板上转移，通过等离子体键合技术将PDMS结构与盖玻片进行键合密封，得到微流道。

将PDMS溶液与固化剂按10:1的配比进行混合、去气并浇注于SU-8模板上，在烘箱内加热固化；最后将PDMS结构从SU-8模板上转移，并通过等离子体键合技术将PDMS结构与盖玻片进行键合密封。

综上，本发明上述实施例当中的微流道制作方法，通过在微流道内设置受限空间，同时，加设可调谐挤压机构规律性的挤压或脱离微流控芯片，使得微流道的宽度可变，从而适用于不同大小的细胞，满足对大分子的纳米外源物质的转染，避免了传统的微流道的宽度固定不变，导致只适用于特定大小或者变形力的细胞的方案，具体的，通过悬臂梁带动微针尖随压电致动器的振动频率上下运动、并挤压或脱离微流控芯片，从而挤压或脱离微流道，带动受限空间内的细胞的细胞膜破坏产生通孔，使得外源物质通过通孔进入到细胞内，解决了传统固定宽度的微流道只适用于特定大小或者变形力的细胞，对大分子的纳米外源物质的转染效率低下的问题。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种细胞转染装置，其特征在于，包括微流控芯片、及位于所述微流控芯片上方、且以一定频率挤压所述微流控芯片的可调谐挤压机构，所述微流控芯片内设有微流道，所述微流道内设有一受限空间，所述受限空间的截面尺寸不大于细胞的直径，多个外源物质设于所述微流道内；

所述可调谐挤压机构包括微针尖、压电致动器、以及连接所述微针尖与所述压电致动器的悬臂梁，所述微针尖位于所述受限空间的上方，且所述微针尖与所述受限空间的中心轴线位于同一垂直方向；

当所述压电致动器以一定频率振动时，通过所述悬臂梁带动所述微针尖随所述压电致动器的振动频率上下运动、并挤压或脱离所述微流控芯片，从而挤压或脱离所述微流道，带动所述受限空间内的细胞的细胞膜破坏产生通孔，使得所述外源物质通过所述通孔进入到细胞内。

2.根据权利要求1所述的细胞转染装置，其特征在于，所述装置还包括动力机构，通过所述动力机构将细胞压入至所述微流道内，进而穿过所述受限空间，带动细胞在所述微流道内完成转运。

3.根据权利要求1所述的细胞转染装置，其特征在于，所述装置还包括可移动的微位移平台，所述微流控芯片设于所述微位移平台上，通过调整所述微位移平台的位置，从而调整所述微流控芯片与所述可调谐挤压机构的相对空间位置。

4.根据权利要求1所述的细胞转染装置，其特征在于，所述微流控芯片为高分子材料。

5.根据权利要求1所述的细胞转染装置，其特征在于，所述受限空间位于所述微流道的中部、且横截面的尺寸小于所述微流道的横截面尺寸。

6.根据权利要求1所述的细胞转染装置，其特征在于，所述装置还包括控制机构，所述控制机构连接所述可调谐挤压机构、且为其提供工作指令。

7.一种细胞转染方法，其特征在于，采用上述权利要求1-6任一项所述的细胞转染装置，所述方法包括：

当计算机设备获取到波形信号时，通过信号发生器将所述波形信号转换成控制信号，并将所述控制信号传递给压电驱动器；

当所述压电驱动器接收到所述控制信号时，将所述控制信号转换为固定频率并输出至悬臂梁，带动所述悬臂梁规律性运动，从而带动设于所述悬臂梁端部的微针尖规律性的敲击微流控芯片；

当所述微针尖敲击所述微流控芯片时，所述微流控芯片内的微流道被挤压，使得所述微流道的侧壁变形并挤压所述微流道内的液态，导致当细胞经过所述微流道内的受限空间时，所述细胞受到来自所述微流道的挤压；

当所述细胞受到来自所述微流道的挤压时，所述细胞的细胞膜产生暂时性通孔，使得外源物质穿过所述通孔进入到所述细胞的体内，实现细胞内输运，完成细胞转染。

8.根据权利要求7所述的细胞转染方法，其特征在于，所述通过信号发生器将所述波形信号转换为控制信号的步骤包括：

所述信号发生器获取所述波形信号；

将获取到的所述波形信号转换为电信号，并将所述电信号输出至信号放大器；

当所述信号放大器接收到所述电信号时，将获取到的所述电信号转换为所述控制信号。

9.一种微流道制作方法，其特征在于，应用于上述权利要求1-6任一项所述的细胞转染装置中的微流道，所述制作方法包括：

选择目标光刻胶，将所述目标光刻胶在硅片上旋涂一定厚度，并将涂有光刻胶的硅片进行热板前烘处理；

将经热板前烘处理后的硅片进行紫外曝光处理，所述曝光处理的曝光剂量由汞灯光强和曝光时间进行控制，将经曝光处理后的硅片放入所述光刻胶的专用显影液中显影并清洗后烘得到模板；

将PDMS溶液与固化剂按10:1的配比进行混合、去气并浇注于所述模板上，得到含有PDMS溶液与固化剂的模板，将所述含有PDMS溶液与固化剂的模板至于烘箱内加热固化；

取出固化后的模板，得到PDMS结构，将所述PDMS结构从模板上转移，通过等离子体键合技术将所述PDMS结构与盖玻片进行键合密封，得到所述微流道。

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