TWI638890B - 原位轉殖之方法及其應用 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種原位轉殖的方法，包含：經由含有內部直徑為25μm至1200μm的針頭或噴嘴的注射或擠壓裝置將一可注射性水膠、一生物性分子以及一細胞以25Pa至800Pa的平均剪切力共擠出至一所需位置，在共擠出時將該生物性分子轉殖至該細胞中，以使該細胞或幹細胞往一特定之方向分化。本發明之方法可應用於任何組織修復或再生。
Description
本發明提供一種生物分子的轉殖方法，特別係一種生物分子的原位轉殖方法，不需要使用任何轉殖試劑或病毒載體。
修復中樞神經系統(central nervous system)長期以來是一直是醫學上無法克服的難題之一，中樞系統損傷例如是患有阿茲海默症、帕金森氏症以及中風之具有神經破壞性後果之病症，對於這些病症，希望能發展出重建神經網路系統以及恢復神經系統功能的細胞群。基於這個原因，科學家不斷發展出的神經幹細胞及前驅細胞，直至目前為止，已知多能性神經前驅細胞在早期分化途徑中調控限制性神經細胞或限制性神經膠質細胞。
在過去幾十年中，神經幹細胞可使損傷組織再生，因此幹細胞替代作為修復神經系統疾病的治療方式已經引起了廣泛關注。然而，這種治療方法將需要精確地控制細胞的功能以建立必需的細胞類型。目前尚未對調節細胞增殖和分化機制的完全理解，因此難以充分發掘來自於腦或發育中的胎兒的任何特定區域的神經幹細胞群之可塑性。
生物分子的細胞內傳遞在基礎研究和治療應用中是一個挑戰。目前已經開發了各種策略來解決這個問題，但每種方法都有自己的優缺點。基於聚合物奈米顆粒和脂質體的方法在將分子遞送到建立的細胞中展現出一些效
果，但是它們常常難以用於幹細胞的轉殖。病毒載體可以在一些基因傳遞方法中有效果；然而，病毒載體往往局限於DNA和RNA的傳遞，且可能引起細胞毒性以及由於免疫反應使轉殖的蛋白質功能喪失。電穿孔(electropration)是一種物理轉殖方法，已經證明轉殖幹細胞之功效；但其除了具有低的細胞存活力外，電穿孔會受到目標遞送材料的昂貴成本之限制。
有鑑於此，本發明之一目的在於提供一種原位轉殖的方法，包含：經由含有內部直徑為25μm至1200μm的針頭或噴嘴的注射或擠壓裝置將一可注射性水膠、至少一生物性分子以及一細胞以25Pa至800Pa的平均剪切力(shear stress)共擠出至一所需位置，在共擠出時將該生物性分子轉殖至該細胞中，而獲得一含轉殖的生物性分子之細胞的組織修復水膠；其中該可注射之水膠包含一溫感水膠或一多重反應(multi-responsive)水膠，且該多重反應水膠係為一pH感應水膠或一具自癒能力水膠。
本發明之又一目的在於提供一種組織修復水膠用於製備促進細胞或幹細胞分化的醫藥組合物之用途，其中該組織修復水膠係為由前述之方法獲得。
本發明之再一目的在於提供一種調控細胞或幹細胞分化方法，包含：經由含有內部直徑為25μm至1200μm的針頭或噴嘴的注射或擠壓裝置將一可注射性水膠、至少一生物性分子以及一細胞以25Pa至800Pa的平均剪切力(shear stress)共擠出至一所需位置，在共擠出時將該生物性分子轉殖至該細胞中，而獲得一含轉殖的生物性分子之細胞的組織修復水膠，以使該細胞或幹細
胞往一特定之方向分化；其中該可注射之水膠包含一溫感水膠或一多重反應(multi-responsive)水膠，且該多重反應水膠係為一pH感應水膠或一具自癒能力水膠。
在本發明之一實施例中，其中該生物性分子係為一DNA、一RNA或一蛋白質；且該蛋白質係為光敏因子蛋白質。
在本發明之一實施例中，其中該DNA係為一轉錄因子基因或一光敏因子基因；且該轉錄因子基因係為叉頭框(forkhead box，FOX)D3、心肌轉錄調節因子(critical transcription factor GATA，GATA)4、肌細胞增强因子(myocyte enhancer factor，MEF)2C或T-box轉錄因子(T-box transcription factor，TBX)5；該光敏因子基因係為細菌視紫紅質(Highly-Expressed Bacteriorhodopsin，HEBR)基因或光敏感通道-2(Channelrhodopsin-2)基因。
在本發明之一實施例中，其中該細胞係為一纖維母細胞或一幹細胞。
在本發明之一實施例中，其中該溫感水膠係為聚胺酯水膠；且該具自癒能力水膠係為幾丁質水膠；該pH感應水膠係為幾丁質水膠。
在本發明之一實施例中，其中該剪切力最佳為100Pa至200Pa。
在本發明之一實施例中，其中該注射器的針頭或噴嘴的內部直徑最佳為110μm至410μm。
在本發明之一實施例中，其中當該可注射性水膠為該多重反應水膠、該生物性分子為細菌視紫紅質(HEBR)基因以及該細胞係為神經幹細胞時，在共擠出時將該HEBR基因轉殖至該神經幹細胞中，該經轉殖的神經幹細胞會發育為一成熟神經細胞。
在本發明之一實施例中，其中當該可注射性水膠為該溫感水膠、該生物性分子為叉頭框(forkhead box，FOX)D3基因以及該細胞係為纖維母細胞時，在共擠出時將該FOXD3基因轉殖至該纖維母細胞中，該經轉殖的纖維母細胞會發育為一類神經脊幹細胞；且該溫感水膠係為以分子量為1500g/mol製備之聚乳酸二元醇(poly-DL-lactic acid diol，PDLLA diol)之聚胺酯水膠。
在本發明之一實施例中，其中當該可注射性水膠為該溫感水膠、該生物性分子為心肌轉錄調節因子(critical transcription factor GATA，GATA)4、肌細胞增强因子(myocyte enhancer factor，MEF)2C以及T-box轉錄因子(T-box transcription factor，TBX)5基因以及該細胞係為人臍血間充質幹細胞時，在共擠出時將該GATA4、MEF2C以及TBX5基因轉殖至該人臍血間充質幹細胞中，該經轉殖的人臍血間充質幹細胞會發育為一類心肌幹細胞；且該溫感水膠係為以分子量為1500g/mol製備之聚乳酸二元醇(poly-DL-lactic acid diol，PDLLA diol)之聚胺酯水膠。
在本發明之一實施例中，其中該組織修復水膠係為神經、心臟或微腦組織修復水膠。
在本發明之一實施例中，其中該細胞為一幹細胞。
在本發明之一實施例中，其中當該可注射性水膠為該多重反應水膠、該生物性分子為細菌視紫紅質(HEBR)基因以及該細胞係為神經幹細胞時，在共擠出時將該HEBR基因轉殖至該神經幹細胞中，該經轉殖的神經幹細胞會往一成熟神經細胞之方向分化。
在本發明之一實施例中，其中當該可注射性水膠為該溫感水膠、該生物性分子為叉頭框(forkhead box，FOX)D3基因以及該細胞係為纖維母細胞
時，在共擠出時將該FOXD3基因轉殖至該纖維母細胞中，該經轉殖的纖維母細胞會往一類神經脊幹細胞之方向分化；且該溫感水膠係為以分子量為1500g/mol製備之聚乳酸二元醇(poly-DL-lactic acid diol，PDLLA diol)之聚胺酯水膠。
在本發明之一實施例中，其中當該可注射性水膠為該溫感水膠、該生物性分子為心肌轉錄調節因子(critical transcription factor GATA，GATA)4、肌細胞增强因子(myocyte enhancer factor，MEF)2C以及T-box轉錄因子(T-box transcription factor，TBX)5基因以及該細胞係為人臍血間充質幹細胞時，在共擠出時將該GATA4、MEF2C以及TBX5基因轉殖至該人臍血間充質幹細胞中，該經轉殖的人臍血間充質幹細胞會往一類心肌幹細胞之方向分化；且該溫感水膠係為以分子量為1500g/mol製備之聚乳酸二元醇(poly-DL-lactic acid diol，PDLLA diol)之聚胺酯水膠。
本發明中提供一種新穎的原位轉殖方法，藉由注射在含有轉殖基因細胞的水膠中，在注射過程中產生的25Pa至800Pa的平均剪切力可能促進細胞膜的打開使基因質體進入細胞以完成含基因質體的轉殖細胞。因此，本發明之原位轉殖的方法能有效地將質體遞送到細胞中，不需要使用任何轉殖試劑或病毒載體。此外，經由本發明之方法獲得的轉殖細胞具有較低的細胞毒性，且沒有病毒誘發免疫反應之優點。此外，與傳統的PolyFect轉殖試劑的相比，經由本發明之方法產生的轉殖細胞除了低毒性外，更具有較高的轉殖效率。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範
圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
圖1A係為製備本發明之一實施例的聚胺酯溫感水膠的反應式。
圖1B係為製備本發明之一實施例的以幾丁質為基礎之多重反應水膠的反應式。
圖2A係為細菌視紫紅質(Highly-Expressed Bacteriorhodopsin，HEBR)基因的紫外-可見光光譜。
圖2B係為細菌視紫紅質基因在非緩衝溶液的電流圖。
圖2C係為細菌視紫紅質基因以幾丁質為基礎之多重反應水膠中之電流圖。
圖3係為本發明之一實施例中原位轉殖的方法之示意圖。
圖4A係為本發明之細胞負載水膠的免疫螢光染色圖。紅色為Flag；藍色為細胞核及染色體反染色。
圖4B係為本發明之一實施例的細胞負載水膠的轉殖效率。
圖4C係為本發明之一實施例的細胞負載水膠的細胞活性。
圖5A係為本發明之一實施例的細胞負載水膠活體外光學刺激的細胞型態。
圖5B係為本發明之一實施例的細胞負載水膠活體外光學刺激的細胞存活率。
圖6A係為本發明之一實施例的細胞負載水膠的Ki67蛋白質的免疫螢光染色圖。
圖6B係為本發明之一實施例的細胞負載水膠的Ki67蛋白質表現倍率數據圖。
圖7A係為本發明之一實施例的細胞負載水膠的神經相關蛋白質(巢蛋白(Nestin)、β-微管蛋白(β-tubulin)及MAP2、GFAP)的免疫螢光染色圖。
圖7B係為本發明之一實施例的細胞負載水膠的神經相關基因(巢蛋白(Nestin)、β-微管蛋白(β-tubulin)及MAP2、GFAP)的表現量。
圖8A係為本發明之一實施例的細胞負載水膠在活體內神經受損的斑馬魚胚胎之孵化率(hatching rate)。mb表示中腦；hb表示後腦；fb表示腦。
圖8B係為本發明之一實施例的細胞負載水膠在活體內神經受損的斑馬魚胚胎之組織免疫染色圖。
圖9係為聚胺酯1500(PU 1500)以及聚胺酯2000(PU 2000)溫感水膠的流變特性。A為聚胺酯1500水膠的儲能模量(storage modulus)以及損失模量(loss molulus)；B為聚胺酯2000水膠的儲能模量以及損失模量；C為聚胺酯1500以及聚胺酯2000水膠的動態複合模量(dynamic complex modulus)；D為聚胺酯1500以及聚胺酯2000水膠的動態複合黏度(dynamic complex viscosity)；E為聚胺酯1500以及聚胺酯2000水膠的穩態黏度(steady state viscosity)。
圖10係為本發明之方法分別使用聚胺酯1500(PU 1500)水膠以及聚胺酯2000(PU 2000)水膠獲得的含有FOXD3質體以及人類真皮纖維母細胞的水膠之免疫螢光染色圖。
圖11係為本發明之一實施例的細胞負載水膠的神經相關基因(FOXD3、SOX10、OCT4、SOX2、NANOG、巢蛋白(Nestin)、βIII-微管蛋白(βIII-tubulin)、GFAP)的表現量。
圖12A係為本發明之一實施例中原位轉殖的方法的示意圖；箭頭1表示細胞膜孔洞允許質體進入，箭頭2表示針頭通道擠壓PU水膠強化轉殖效率。
圖12B係為本發明之一實施例中在PU水膠中轉殖的hMSCs細胞的示意圖。
圖13A係為本發明之一實施例的細胞負載水膠的細胞型態。
圖13B係為本發明之一實施例的細胞負載水膠的細胞存活率。
圖14係為本發明之一實施例的細胞負載水膠的心臟相關基因(GATA4、MEF2C以及TBX5)的表現量。
圖15係為本發明之一實施例的未轉殖的人臍血間充質幹細胞的心臟相關基因(GATA4、MEF2C、TBX5、NKX2.5、MYH6以及TNNT2)的表現量。
圖16係為本發明之一實施例含有GATA4質體或GMT質體的細胞負載水膠的心臟相關基因(GATA4、MEF2C、TBX5、NKX2.5、MYH6以及TNNT2)的表現量。
圖17A係為本發明之一實施例含有GATA4質體或GMT質體的細胞負載水膠的心臟相關蛋白質(GATA4、NKX2.5以及MYH6以及ZO-1)的免疫螢光染色圖。
圖17B係為本發明之一實施例含有GATA4質體或GMT質體的細胞負載水膠的心臟相關蛋白質(GATA4、NKX2.5以及MYH6以及ZO-1)的免疫螢光染色定量分析。
圖18A係為本發明之一實施例的PUG1、PUG2水膠以及PBS的心臟率。
圖18B係為本發明之一實施例的PUG1、PUG2水膠以及PBS的心臟組織學分析。
圖19係為本發明之一實施例含有GATA4質體或GMT質體的細胞負載水膠治療斑馬魚心臟缺陷後的心跳率。
圖20係為本發明之一實施例含有GATA4質體或GMT質體的細胞負載水膠治療斑馬魚心臟缺陷後的心臟組織學分析。
圖21A係為本發明之一實施例所使用水膠帶電荷對細胞存活率的影響。
圖21B係為本發明之一實施例所使用水膠帶電荷對GATA4、MEF2C以及TBX5的基因表現量的影響。
圖22A係為本發明之一實施例使用18G、23G、27G以及32G針頭與1公分孔徑的微量吸管尖進行本發明之原位轉殖的方法後之細胞存活率分析。
圖22B係為本發明之一實施例使用18G、23G、27G以及32G針頭與1公分孔徑的微量吸管尖進行本發明之原位轉殖的方法後之GATA4基因表現量。
本發明中提供一種新穎的原位轉殖方法，注射在含有轉殖基因細胞的水膠，在注射過程中產生的25Pa至800Pa的平均剪切力可能促進細胞膜的打開使基因質體進入細胞以完成含基因質體的轉殖細胞。在本發明之一實施例中利用斑馬魚作為實驗模組，當神經缺陷的斑馬魚胚胎注入本發明之方法產生的HEBR轉殖的細胞並用綠光照射後，該細胞會分佈在大面積的大腦區域以及促進中樞神經系統功能恢復，表示幾丁質水膠提供轉殖細胞有利的增殖和分化的環境，使斑馬魚神經功能恢復。本發明另產生FOXD3質體細胞，證實起具有類神經脊幹細胞的相關基因表現；以及GATA4質體、MEF2C質體及TBX5質體細胞，證實其具有類心肌幹細胞的相關基因表現，同時使心臟缺陷的斑馬魚心跳增加且心臟組織型態恢復於正常心臟組織之型態。
本發明之實驗數據皆以平均數±標準差表示。活體外每個實驗的再現性皆獨立地從三個不同授予者的細胞確認三次。在實驗群組織間的統計差異經由單因子變異數分析(one way ANOVA)確認，當p值<0.05時實驗結果在統計學上認為是有顯著意義的。
本發明所述之溫感水膠係表示溫度為調控變因的高分子水膠。藉由溫度的改變影響高分子鏈間凡得瓦力、疏水性作用力與氫鍵等次級作用力造成最後有相轉換的情況發生。例如：聚胺酯水膠。
本發明所述之多重反應(multi-responsive)水膠係表示一pH感應水膠或一具自癒能力(self-healing)水膠。
本發明所述之pH感應水膠係表示當水膠在低pH值的環境下，會由膠體態(gel)變溶液態(sol)，當水膠再回到高pH值的環境下，會再由溶液態(sol)變膠體態(gel)，例如：幾丁質水膠。
本發明所述之自癒能力水膠係表示當水膠遭遇較大的應變下，水膠的結構會被破壞，由膠體態(gel)變溶液態(sol)，而當水膠回復到較小的應變下，會由溶液態(sol)變膠體態(gel)，例如：幾丁質水膠。
本發明所述之細胞負載(cell-laden)水膠或組織修復水膠，係表示經由本發明之原位轉殖的方法獲得之一含轉殖基因的細胞之水膠。
如於本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。
本發明所使用之水膠為可注射性水膠，並為一溫感性或一多重反應(multi-responsive)水膠，其中該溫感水膠之一實施例可為聚胺酯(plyurethane，
PU)，該多重反應水膠之實施例可為一pH感應水膠或一具自癒能力(self-healing)水膠，其中該多重反應水膠係為幾丁質水膠，其同時具有自癒能力及pH感應能力。
本發明之原位轉殖的方法中，使用不同硬度的水膠可以調節神經幹細胞的分化命運，例如：在0.1至1kPa模量的底物基材上培養的神經幹細胞傾向於分化為神經元，而在7至10kPa模量的底物基材上培養的神經幹細胞傾向於分化成膠質細胞。與未轉殖的細胞相比，轉殖細胞可能對不同的培養基質更敏感。因此，可透過水膠成分、水膠軟硬的不同或是否透過光活化使在轉殖同一種生物分子而達到不同的治療效果，例如可利用同一基因(HEBR、ChR與NpHR等)，且於不同組織位點、或同一組織但不同區域(如腦部每個位置的組織軟硬程度都不同)進行客製化基因治療與組織修復。
聚胺酯溫感水膠的合成步驟為將聚己內酯二元醇(polycaprolactone diol，簡稱PCL diol，Mw 2000g/mol，購於Aldrich)與DL型聚乳酸二元醇(poly-DL-lactic acid diol，PDLLA diol)，PDLLA之合成係由DL-丙交酯(DL-lactide)與1,4丁二醇(1,4-BDO)莫耳比例13：1，並在催化劑T-9添加下於溫度150℃反應10至12小時進行開環，待反應完成降溫至0至4℃，控制溫度在120℃以真空昇華法純化得到。
上述化合物PCL diol以及PDLLA diol加入500mL分離式四頸反應瓶內，調至適當之預聚合溫度(prepolymerization temperature)，以轉速180rpm機械攪拌混合均勻。待反應物呈現均相液體後，加入催化劑二辛酸亞錫(tin(II)2-ethylhexanoate,T-9,Alfa Aesar)與異佛爾酮二異氰酸鹽(isophorone diisocyanate，簡稱IPDI，Evonik Degussa GmbH)，以轉速180rpm攪拌並以預聚合溫度95℃進行反應三小時。
之後，溫度降至75℃，將二羥甲基丙酸(2,2-bis(hydroxymethyl)propionic acid,DMPA,Aldrich)與丁酮(methyl ethyl ketone，簡稱MEK，J.T.Baker)加入反應瓶內，溫度維持在75℃，以轉速180rpm反應一小時後，降溫至50℃後加入三乙基胺(triethylamine，簡稱TEA，RDH)中和反應半小時。反應完全後，在50℃，提高轉速至1100rpm迅速加入二次蒸餾水，待水分散後，分兩段加入以水稀釋之鏈延長劑乙二胺(ethylenediamine，簡稱EDA，Tedia)，各別以50、50mol%前後間隔15分鐘後加入，即完成聚胺酯溫感水膠，合成步驟如圖1A所示，其中分別使用分子量為2000g/mol或1500g/mol的聚乳酸二元醇(poly-DL-lactic acid diol，PDLLA diol)形成至聚胺酯1500(以PUG1表示)及聚胺酯2000(以PUG2表示)的溫感水膠。
首先，經由羥基末端具有4-甲醯基苯甲酸(4-formylbenzoic acid)的PEG的酯化獲得遙爪(telechelic)的雙官能聚(乙二醇)(difunctional poly(ethylene glycol)，DF-PEG)。經由將合成的聚合物溶解在蒸餾水和去離子水中製備DF-PEG溶液，合成步驟如圖1B所示。經由以蒸餾水和去離子水溶解乙二醇幾丁質粉末(Sigma，美國)製備乙二醇幾丁質溶液。幾丁質水膠的凝膠模量可以經由各成分的濃度進行調整。本發明之以幾丁質為基礎之多重反應水膠在最終凝膠中含有1.5%乙二醇幾丁質和1%DF-PEG，其同時具有自癒能力及pH感應能力。在目前的實施例中，各組分的濃度在凝膠化前對細胞的嵌入進行了優化，並且在凝膠化後獲得適當的硬度(約1.2kPa)用於神經幹細胞的存活和分化。
本發明採用高度表現的細菌視紫紅質(Highly-Expressed Bacteriothodopsin，HEBR)Hmbop1/D94N(HEBR)基因，細菌視紫紅質基因可產
生光敏視蛋白，其具有觸發神經修復的潛力。在本實施例中，將神經幹細胞(NSCs)與HEBR質體摻入可注射以及多重反應的幾丁質水膠中。在注射過程中，將神經幹細胞、HEBR質體以及水膠伴隨25Pa至800Pa的平均剪切力擠出。在不需要轉殖試劑的情況下，剪切力促進在水膠中的HEBR質體轉殖至細胞。經由暴露於綠色發光二極管(LED)光源可以激發經轉殖的神經幹細胞中HEBR基因表現，分析細胞負載(cell-laden)水膠的增殖和基因表現。此外，經由活體內斑馬魚胚胎神經損傷模型證實細胞負載水膠在中樞神經系統的修復潛力。本發明使用多重反應的幾丁質水膠結合原位轉殖方法提供改善中樞神經系統損傷後功能恢復的可能性。
先前文獻建構有高表現量及穩定性，且有較緩慢光週期的細菌視紫紅質基因，命名為高表現細菌視紫紅質基因Hmbop1/D94N(HEBR)(參考Zhang,Y.,Tao,L.,Li,S.& Wei,Y.Synthesis of multiresponsive and dynamic chitosan-based hydrogels for controlled release of bioactive molecules.Biomacromolecules 12,2894-2901(2011))。然後將該基因接入至pET21b載體的5'末端NdeI和3'末端HindIII的切割位置，在大腸桿菌表現系統表現。而在神經幹細胞(neural stem cells，NSCs)中的HEBR基因的表現，是接入帶有Flag標籤序列(tag)的pCMV-Tag2B質體的EcoRI和HindIII切割位置。
將細菌視紫紅質(HEBR)質體在大腸桿菌C43(DE3)中表現，其在含有50μg/mL氨芐青黴素的LB培養基中在37℃下生長。當培養物的密度達到OD600為0.4至0.6時，於37℃下加入1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷
(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)和10μM全反式維甲酸(all-trans retinoic acid)(Sigma公司，美國)誘導蛋白質表達4至6小時。經由離心(6,000×g)收獲細胞，並再懸浮於緩衝液A(含有50mM Tris、4M NaCl、0.2mM苯甲基磺醯氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)、14.7mMβ-硫醇基乙醇(mercaptoethanol)、pH 7.8)中。經超音波處理後，利用離心(6,000×g)除去細胞碎片。在10℃下細胞膜以100,000×g離心沉降1小時，並在4℃下溶解於含有2%(wt/vol)n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷(n-dodecyl-β-D-maltoside，DAT)(Anatrace公司。中國)的緩衝液A中16小時。將溶解的細胞膜離心(75,100×g，45分鐘，4℃)，上清液用Ni-次氮基三乙酸(Ni-nitrilotriacetic acid，NTA)瓊脂凝膠處理5小時，再以緩衝液B(含有50mM Tris、4M NaCl、0.02%DDM、pH 7.8)。然後用含250mM咪唑(imidazole)的緩衝液B從管柱中洗提HEBR蛋白質。經由以緩衝液C(50mM嗎啉乙磺酸(morpholineethanesulfonic acid，MES)、100mM NaCl、0.02%DDM、pH 5.8)透析以除去咪唑。獲得的HEBR蛋白質用於進一步的分析和長期儲存。
氧化銦錫(Indium tin oxide，ITO)被用作質子檢測材料。用ITO塗覆玻璃載玻片，依照以下順序從上到下組裝樣品室：ITO塗覆的載玻片、樣品、透析膜、空白溶液以及另一個ITO塗覆的載玻片。經由電線以及用於光電流測量的信號放大器(SR570，Stanford Research Systems公司，美國)連接兩個ITO塗覆的載玻片。用綠色雷射(532nm連續波，0.5W)進行光刺激，850ms的照明持續時間用於蛋白質刺激。關於每個測量進行了32次試驗，並取平均值。利用含有100mM NaCl和0.02%洗滌劑n-十二烷基-β-D-麥芽苷
(n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside，DDM)的非緩衝溶液在pH7下透析HEBR蛋白質。
細菌視紫紅質蛋白質在質子幫浦下吸收特定波長的光，這可以經由紫外-可見光光譜來驗證。在本實施例中，洗滌劑(DDM)中純化的HEBR蛋白的最大吸光度為549nm(圖2A)。為了確保HEBR蛋白質的功能，利用光電流系統來檢查在非緩衝溶液及本發明之以幾丁質為基礎之多重反應(multi-responsive)水膠中光驅質子幫浦的功能。當光照時，兩種情況都觀察到正電流，表明質子被HEBR蛋白質幫浦排出。當光照熄滅時，HEBR蛋白質從溶液中吸收質子，產生負電流。這些實驗數據證實，經純化的HEBR蛋白質在非緩衝溶液(圖2B)或本發明之以幾丁質為基礎之多重反應(multi-responsive)水膠中都起作用(圖2C)。
從成年小鼠腦海馬迴中分離出小鼠神經幹細胞，並用F1B-綠色螢光蛋白(F1B-GFP)啟動子轉殖。之後將細胞培養在含有10%胎牛血清(Gibco公司，美國)、400μg/ml G418(Invitrogen公司，美國)與100U/mL青黴素/鏈黴素(Caisson Labs公司，美國)的高葡萄糖達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)以及Ham’s F-12(Gibco公司，美國)，置於37℃、5% CO2的培養箱中，每兩天更換一次培養液。
如圖3所示，經由本發明之原位轉殖的方法將HEBR質體轉殖至神經幹細胞。在凝膠形成之前，將2×106細胞/mL的神經幹細胞(neural stem cells，NSC)接種至含有HEBR質體(0.15mg/mL)的水膠中，以形成NSC-HEBR的水
膠。將NSC-HEBR的水膠填充在針筒中並經由26號針頭擠壓到培養皿中，以獲得本發明之含有HEBR質體的細胞負載(cell-laden)水膠(NSC-HEBR)。為了比較本發明之原位轉殖的方法和常規轉殖的方法對HEBR質體轉殖的影響，採用Polyfect轉殖試劑(Qiagen，美國)神經幹細胞，轉殖方法以製造商所提供的操作手冊進行。將神經幹細胞培養在24-孔一般培養皿(TCPS)(約3.4×104細胞數/cm2)12小時，接著在每個孔洞中以1mL含有1.5mg的HEBR質體溶液以及2.5μg Polyfect轉殖試劑取代培養基，使細胞與質體接觸6小時。之後，將每個孔洞更換回新鮮的培養基進行培養，之後獲得的含有HEBR質體的傳統轉殖神經幹細胞(TCPS-HEBR)。
為了驗證HEBR-Flag質體是否可以轉殖到神經幹細胞中，轉殖後經由免疫螢光染色來檢測細胞。如圖4A，本發明之原位轉殖方法獲得的NSC-HEBR中HEBR陽性染色細胞的螢光訊號大於傳統的純化轉殖的神經幹細胞(TCPS-HEBR)。這些結果表示，HEBR質體可以經由傳統的Polyfect轉殖方法或本發明之原位轉殖的方法成功遞送到神經幹細胞，但本發明之原位轉殖的方法的轉殖效率較高。TCPS-HEBR和CS-HEBR中的細胞活力和細胞數顯示在圖4B及4C中。使用Polyfect轉殖方法獲得的神經幹細胞顯示細胞活力降低(約80%)。相較之下，沒有觀察到經由本發明之原位轉殖的方法獲得的神經細胞有任何細胞毒性，表示與傳統的Polyfect轉殖方法相比，本發明之原位轉殖的方法遞送HEBR可以成功地預防細胞死亡。
HEBR質體轉殖24小時後，本發明使用LED燈(綠色：525nm；紅色：632nm；激發距離：0.5cm)每天2分鐘連續10天激發細胞。之後，本發明進行HEBR轉殖的神經幹細胞的增殖、基因表現和電活性的分析。
將細胞負載水膠培養10天，每2天更換一次培養基。在進行細胞數分析之前，將細胞負載水膠在磷酸鹽緩衝鹽水(phosphate buffered saline，PBS)中洗滌，然後在木瓜蛋白酶(Sigma，美國)溶液於60℃下分解至隔天。本發明利用DNA Hoechst 33528螢光染色分析(Sigma公司，美國)以多功能微量盤分析儀(microplate reader)(螢光模式，SpectraMax M5)在365nm及458nm波長下確認螢光強度，並將螢光強度數值利用標準曲線計算出細胞數目，計算公式如下：細胞活力%=[(樣品-空白對照組的平均光密度)/(對照組-空白的平均光密度)]×100，p<0.05。
將HEBR轉殖的神經幹細胞暴露於紅色LED(632nm)下作為陰性對照。經由顯微鏡檢查各種處理的神經幹細胞的形態。結果如圖5A及圖5B所示，經由本發明之原位轉殖的方法以及利用綠光激發的神經幹細胞(CS-HEBR+G)在10天內聚集並成為球體。在所有其他組中，經由本發明之原位轉殖但無光激發組(CS-HEBR)、經由本發明之原位轉殖的方法以及紅光激發組(CS-HEBR+R)以及經由Polyfect轉殖方法但無光激發組(TCPS-HEBR)、經由Polyfect轉殖方法以及綠光激發組(TCPS-HEBR+G)以及經由Polyfect轉殖方法以及紅光激發組(TCPS-HEBR+R)，關於細胞形態方面，神經幹細胞皆沒有明顯的細胞形態變化；而關於細胞增殖方面，CS-HEBR+G組和TCPS-HEBR+G組的細胞增殖在10天內比其他組快。
此外，本發明利用免疫螢光染色法分析細胞負載水膠的蛋白質表現，該些蛋白質為Ki-67、巢蛋白(Nestin)、β-微管蛋白(β-tubulin)、微管相關蛋白2(microtubule-associated protein 2，MAP2)和膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)。首先，以PBS緩衝液沖洗細胞負載水膠並固定於4%甲醛(formaldehyde)溶液中10分鐘，再以1%胎牛血清(BSA)作為封閉(blocking)液反應1小時，並在4℃以Ki67(GeneTex公司，美國，編號GTX16667)、Nestin(GeneTex公司，美國，編號GTX26142)、β-微管蛋白(Proteintech公司，美國，編號10068-1-AP)、MAP2(BioLegend公司，美國，編號B206152)以及GFAP(BioLegend公司，美國，編號644702)進行染色至隔天。在室溫下將該細胞以PBS緩衝液清洗並以goat anti-mouset IgG或anti-rabbit IgG二級抗體(Life technologies公司，美國)處理1小時。將該樣本封片並在螢光顯微鏡下觀察。
首先，本發明經由Ki67測定法確認細胞增殖，如圖6A及圖6B所示，Ki67蛋白的表達與細胞活力測定相同。這些數據表明，本發明之原位轉殖的方法以及利用綠光激發的神經幹細胞(CS-HEBR+G)的增殖率高於其他組。
其他神經相關蛋白的免疫螢光染色圖像顯示在圖7A中。10天後，標記蛋白巢蛋白(Nestin)(呈現紅色)、β-微管蛋白(β-tubulin)(呈現紅色)、微管相關蛋白2(MAP2)(呈現綠色)以及GFAP(呈現紅色)基因表現量在Polyfect轉殖方法以及本發明之原位轉殖方法中，與其他組相比，對綠色光刺激的神經幹細胞會高度表現。CS-HEBR組、TCPS-HEBR組和TCPS-HEBR+G組的神經幹細胞之GFAP表現呈陽性；然而，對於CS-HEBR+G組中的細胞是陰性的。值得注意的是，僅在CS-HEBR+G組中觀察到神經幹細胞的神經突(neurite)延伸，在神經突生長是神經元分化和再生過程的第一步，進而導致突觸極化。因此，
經由本發明原位轉殖的方法使用HEBR轉殖的神經幹細胞可以在綠色光刺激後形成神經元間功能網絡(inter-neuronal functional networks)。
在獲得細胞負載水膠10天時，利用Trizol®試劑(Invitrogen公司，美國)自細胞負載水膠萃取總RNA，接著將RNA第一次反轉錄為cDNA並經由RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒(First Strand cDNA Synthesis Kit)(MBI Fermentas，德國)進行擴增反應。再利用DyNAmo Flash SYBR Green qPCR試劑盒(Finnzymes，芬蘭)以即時定量PCR儀器(購自Applied Biosystems®公司，美國)進行即時反轉錄聚合酶連鎖反應，並以GAPDH基因(家務基因)標準化該些基因的表現量。所有測試經由三次獨立實驗重複，在每個獨立實驗中，每組中的樣本數為四個。
外源HEBR對神經幹細胞分化的影響，如圖7B所示，CS-HEBR+G組以及TCPS-HEBR+G組的神經幹細胞之巢蛋白(Nestin)、β-微管蛋白(β-tubulin)以及微管相關蛋白2(MAP2)基因表現量均明顯高於其他組。此外，CS-HEBR+G組中的神經幹細胞的Nestin、β-tubulin及MAP2的基因表現量比TCPS-HEBR+G組更高。然而，GFAP的基因表現量在其他組中沒有顯著改變。基因表現量顯示，無論使用本發明之原位轉殖的方法或Polyfect轉殖方法，HEBR可以促進神經再生(neurogenesis)並維持綠色光刺激後神經前驅細胞會自我更新。此外，經由Polyfect轉殖方法的神經幹細胞顯示較高的GFAP基因表現量，表示其可分化為膠質細胞。
斑馬魚(Danio rerio)已經成為神經科學領域強大的脊椎動物模型。本發明使用野生型斑馬魚(AB系)胚胎，購買自美國斑馬魚國際資源中心並在標準條件下飼養及配對。將斑馬魚胚胎在含有E3胚胎培養基(5mM NaCl，0.17mM KCl，0.33mM CaCl2和0.33mM MgSO4)的培養皿中在33℃溫育。胚胎根據受精後的時間(hpf)進行分期。本研究將斑馬魚胚胎分為五組，第一組為以正常培養基培養的斑馬魚胚胎作為空白組(以WT表示)；其他組以含有2%乙醇(以EtOH表示)的E3胚胎培養基培養2個小時以引起神經系統缺陷的斑馬魚作為實驗組，之後更換為正常的培養基，再對胚胎進行各種治療，包含將第二組為注射包埋在CS水膠中的神經幹細胞(約1×102細胞數)至胚胎(以CS-NSC表示)、第三組為注射本發明之細胞負載水膠至胚胎(以CS-NSC-HEBR表示)、第四組注射本發明之細胞負載水膠至胚胎，7小時後在每4小時暴露於綠光10分鐘共46小時以激發HEBR表現(以CS-NSC-HEBR+G表示)及第五組為僅以乙醇處理作為未處理的控制組(以EtOH表示)，除CS-NSC-HEBR+G外，其他組皆未暴露於綠光下。所有測試均以多個樣品(n=30)進行，並經由三次獨立實驗重複。
孵化率(hatching rate)是評估從EtOH誘導的神經受損之斑馬魚胚胎恢復的最重要的指標。以60hpf評估胚胎的孵化率，將該數值與空白對照的值進行比較，以了解神經功能恢復情形。本發明進行轉殖細胞追蹤，神經幹細胞(細胞濃度為1×107細胞數/mL)以紅色螢光細胞追蹤劑PKH26(Sigma-Aldrich公司，美國)標記，在受精後(hpf)60小時以螢光顯微鏡觀察斑馬魚之胚胎孵化率。為進行斑馬魚胚胎的組織免疫染色，以5% goat血清及anti-Flag作為封閉液，使用螢光共軛抗體Alexa Fluor goat anti-mouset IgG(Invitrogen公司，美國)檢測一級抗體。用Vectashield mounting培養基(Vector Laboratories,Inc.公司，美國)將胚胎封片。
如圖8A所示，野生型胚胎(WT)具有79%的孵化率；未經治療的受損組織(EtOH)的孵化率為18%；CS-NSC-HEBR+G組蛋白孵化率最高(約58%)，CS-NSC以及CS-NSC-HEBR組孵化率僅略有改善，為38至42%。TCPS-NSC、TCPS-NSC-HEBR以及TCPS-NSC-HEBR+G組未發現神經幹細胞損傷斑馬魚的功能恢復情形。這些結果表示使用綠光刺激的本發明之含有HEBR質體的原位轉殖神經幹細胞具有治療神經系統受損的功能。
在圖8B中，顯示在60hpf的斑馬魚胚胎中PKH26標記(紅色螢光)以及HEBR標記(綠色螢光)的神經幹細胞的位置的影像；其中mb表示中腦；hb表示後腦；fb表示腦。使用綠光刺激接受本發明之含有HEBR質體的原位轉殖神經幹細胞的斑馬魚，具有比接受非轉殖細胞以及未經綠光刺激的本發明之含有HEBR質體的原位轉殖神經幹細胞的斑馬魚胚胎在腦區域中細胞總面積變大。同時，接受Polyfect轉殖方法的含有HEBR質體的神經幹細胞，無論細胞是否用綠光刺激，神經幹細胞很少，只有隨機分佈在大腦中。
在本發明中，在經由Polyfect轉殖的HEBR質體時，將NSCs接種在傳統組織培養基(TCPS約為100kPa)上，隨後這些細胞可能趨向於分化成膠質細胞。在本發明之原位轉殖HEBR質體的方法中，將NSCs接種到1.2kPa模量的幾丁質水膠中，這可能是其優先分化為神經元的原因。由於人腦組織的硬度為0.5至1kPa，經由實驗結果可能幾丁質水膠的環境與人腦組織的環境更為吻合。因此，HEBR質體對斑馬魚腦組織中轉殖的外源基因的生理功能的正向影響與所用轉殖過程高度相關。因此，本案進一步調節在轉殖中使用的水膠的硬度。此外，具有適當硬度的3D基材可增加光遺傳學在不同組織中的臨床適用性；或為了促進光線照射，高透明度的水膠例如是幾丁質水膠是一個很方便的選擇。
本發明另以含有叉頭框(forkhead box，FOX)D3基因之質體轉殖至成體細胞的類神經脊幹細胞，使細胞重新編程到較原始的類神經脊幹細胞，在神經脊相關表現、幹細胞、神經相關表現都較未轉殖的細胞高。利用即時反轉錄聚合酶連鎖反應(real-time RT-PCR)分析神經脊基因(包含FOXD3、SOX10)、幹細胞相關基因(包含OCT4、SOX2以及NANOG)、類神經前驅細胞之相關基因(巢蛋白(Nestin)、βIII-微管蛋白(βIII-tubulin)以及GFAP)的表現量，以證實細胞轉殖FOXD3質體後會向上調節上述基因的表現量。
本發明參照Pan G,Li J,Zhou Y,Zheng H,Pei D.A negative feedback loop of transcription factors that controls stem cell pluripotency and self-renewal.FASEB J.2006；20(10)：1730-2之方法，將含叉頭框(forkhead box，FOX)D3之質體係藉由從反轉錄聚合酶連鎖反應(reverse transcription PCR，RT-PCR)獲得之FOXD3序列插入至質體之EcoRV切割位置並皆有Flag標籤序列(tag)的pCR3.1載體中。
人類纖維母細胞係從包皮外科手術後之成人包皮獲得，在本發明中該方法因涉及人體組織，本發明遵照人體醫學研究的倫理準則並由中華民國三軍總醫院倫理審查委員會批准。本發明利用已知的方法進行人類纖維母細胞的分離及增生，首先，以膠原蛋白酶(collagenase)分解包皮組織，將細胞懸浮液離心，之後以含有10%胎牛血清(購自Gibco公司)與1%青黴素/鏈黴素(購自Invitrogen公司)的高葡萄糖達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)(購自Gibco公司)再懸浮，將細胞培養在37℃、5% CO2的培養
箱中，當細胞達到有80%的融合時，利用0.25%胰蛋白酶/EDTA溶液(購自Gibco公司)將纖維母細胞繼代培養(subculture)，每三天更換一次培養液，培養第3代至第8代的纖維母細胞可供之後實驗使用。
本發明使用溫感水膠進行FOXD3質體轉殖的類神經脊幹細胞，並依據實施例1.1所述製備溫感水膠的方法，分別使用分子量為2000g/mol或1500g/mol的聚乳酸二元醇(poly-DL-lactic acid diol，PDLLA diol)形成至聚胺酯1500(以PU 1500表示)及聚胺酯2000(以PU 2000表示)的溫感水膠。此外，本發明進行聚胺酯1500以及聚胺酯2000溫感水膠在37℃下之流變特性，如圖9中A以及B所示，並比較聚胺酯1500以及聚胺酯2000溫感水膠的儲能模量(storage modulus)以及損失模量(loss molulus)，證實兩個溫感水膠在37℃下皆能形成凝膠狀；並比較兩者的動態複合模量(dynamic complex modulus)(如圖9中C)、動態複合黏度(dynamic complex viscosity)(如圖9中D)以及穩態黏度(steady state viscosity)(如圖9中E)以及其他特性(如表1所示)。
本發明分別使用聚胺酯1500以及聚胺酯2000兩種水膠，經由如圖3所示本發明之原位轉殖的方法將FOXD3質體轉殖至人類真皮纖維母細胞成為類神經脊幹細胞，在37℃下共擠出(co-extrusion)具有質體和細胞的水膠。
為了驗證FOXD3質體是否可以轉殖到人類真皮纖維母細胞內，轉殖後通過經由免疫螢光染色來檢測細胞。如圖10所示，本發明之原位轉殖方法獲得的含有FOXD3質體以及人類真皮纖維母細胞的PU1500及PU2000水膠，螢光訊號大於未經擠出的PU1500及PU2000水膠。
將該轉殖細胞培養12天後，本發明利用即時反轉錄聚合酶連鎖反應(real-time RT-PCR)分析神經脊基因(包含FOXD3及SOX10)、幹細胞相關基因(包含OCT4、SOX2以及NANOG)、類神經前驅細胞之相關基因(巢蛋白(Nestin)、βIII-微管蛋白(βIII-tubulin)以及GFAP)的表現量，以常規Polyfect轉殖試劑(Qiagen，美國)的方法將FOXD3質體轉殖人類真皮纖維母細胞的該些基因表現量進行比較，實驗方法如實施例3所示。並以GAPDH基因(家務基因)標準化該些基因的表現量。
結果如圖11所示，雖Polyfect轉殖方法產生的轉殖細胞水膠(PU1500)的FOXD3、SOX2、Nestin以及βIII-tubulin的基因表現量較高；但含有FOXD3質體轉殖人類真皮纖維母細胞的PU1500水膠的SOX10、OCT4以及GFAP基因表現量，皆比含有FOXD3質體轉殖人類真皮纖維母細胞的PU2000水膠以及Polyfect轉殖方法高。基因表現量顯示，無論使用本發明之原位轉殖的方法或Polyfect轉殖方法，將FOXD3質體轉殖至人類真皮纖維母細胞的類神經脊幹細胞，皆可使細胞重新編程到較原始的類神經脊幹細胞。然而，同樣使用溫感水膠的情況下，含有FOXD3質體轉殖人類真皮纖維母細胞的PU2000水膠
在該些基因表現量皆差，其表示非所有的溫感水膠皆適用於本發明之原位轉殖方法。
GATA4為適合哺乳動物心臟發育的轉錄因子。先將pTracer CMV/Bsd-GFP載體以EcoR1/EcoRV酵素處理，接著與掛好EcoR1/EcoRV連接序列的GATA4基因片段進行接合反應，來製成pCMV-GATA4/Bsd-GFP質體，轉殖於勝任細胞中，以抗生素篩選，並經PCR及核酸序列分析確認。
MEF2C為促進心臟型態發生以及血管發育因子。先將pTracer CMV/Bsd-GFP載體以Not1酵素處理，接著與掛好Not1連接序列的MEF2C基因片段進行接合反應，來製成pCMV-MEF2C/Bsd-GFP質體，轉殖於勝任細胞中，以抗生素篩選，並經PCR及核酸序列分析確認。
TBX5為促進心臟發育因子。先將pTracer CMV/Bsd-GFP載體以EcoR1/Not1酵素處理，接著與掛好EcoR1/Not1連接序列的TBX5基因片段進行接合反應，來製成pCMV-TBX5/Bsd-GFP質體，轉殖於勝任細胞中，以抗生素篩選，並經PCR及核酸序列分析確認。
將人臍血間充質幹細胞(購自訊聯生物科技)以高葡萄糖達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM)(購自Gibco公司)培養在37℃、5% CO2的培養箱中0.5天後，以含有10%胎牛血清的DMEM
培養基培養在37℃、5% CO2的培養箱中2.5天後，加入5-氮雜胞嘧啶核苷(5-azacytidine)誘發心臟細胞損傷，以含有10%胎牛血清的DMEM培養基培養在37℃、5% CO2的培養箱中3天後，再繼續以含有10%胎牛血清的DMEM培養基培養在37℃、5% CO2的培養箱中10天。
本發明使用溫感水膠進行GATA4質體、MEF2C質體及TBX5質體(簡稱為GMT質體)轉殖的類心肌幹細胞，並依據實施例1.1所述製備溫感水膠的方法，分別使用分子量為2000g/mol或1500g/mol的聚乳酸二元醇(poly-DL-lactic acid diol，PDLLA diol)形成至聚胺酯1500(以PUG 1表示)及聚胺酯2000(以PUG2表示)的溫感水膠。
分別使用聚胺酯1500以及聚胺酯2000兩種水膠，經由如圖12A所示本發明之原位轉殖的方法將GATA4質體、MEF2C質體及TBX5質體至人臍血間充質幹細胞，使人臍血間充質幹細胞轉殖為類心肌幹細胞，經由32號針頭共擠出(co-extrusion)具有質體和細胞的水膠(如圖12B所示)。
以紅色螢光細胞追蹤劑PKH26(Sigma-Aldrich公司，美國)標記以本發明之方法獲得的類心肌幹細胞(包含使用PUG1以及PUG2)來檢測細胞型態，結果如圖13A所示，本發明之方法獲得的細胞負載水膠(包含使用PUG1以及PUG2)皆會使細胞形成球狀，不會為突出狀或囊泡。
本發明利用進行細胞存活檢測(MTT cell viability assay)(Sigma，美國)，並以培養在傳統組織培養盤(TCP)上的人臍血間充質幹細胞的細胞存活率進行比較。結果如圖13B所示，三天後本發明之方法獲得的PUG1水膠之類心肌幹細胞具有約500%的存活率，PUG2水膠之類心肌幹細胞具有約250%的存活
率；而培養在傳統組織培養盤(TCP)之人臍血間充質幹細胞具有約200%的存活率。
本發明比較未轉殖的人臍血間充質幹細胞分別培養在TCPS培養基、PUG1以及PUG2水膠中的人臍血間充質幹細胞的心臟相關基因(GATA4、MEF2C以及TBX5)表現。結果如圖14所示，培養在PUG1以及PUG2水膠中的心臟相關基因(GATA4、MEF2C以及TBX5)表現量以GAPDH基因表現標準化後約為0.7，培養在TCPS的心臟相關基因(GATA4、MEF2C以及TBX5)表現量以GAPDH基因表現標準化後約為0.3。
經本發明之方法原位轉殖GATA4質體或GMT質體的人臍血間充質幹細胞的心臟相關基因(GATA4、MEF2C以及TBX5)表現。結果如圖14所示，PUG1水膠的人臍血間充質幹細胞的心臟相關基因(GATA4、MEF2C以及TBX5)表現量以GAPDH基因表現標準化後約為1.8，PUG2水膠的人臍血間充質幹細胞的心臟相關基因(GATA4、MEF2C以及TBX5)表現量以GAPDH基因表現標準化後約為1.2；未轉殖的人臍血間充質幹細胞的心臟相關基因(GATA4、MEF2C以及TBX5)表現量以GAPDH基因表現標準化後約為0.7。結果表示PUG1水膠在心臟相關基因的表現量皆優於PUG2水膠。
本發明比較經5-氮雜胞嘧啶核苷(5-azacytidine)誘導心臟損傷未轉殖的人臍血間充質幹細胞分別培養在TCPS培養基、PUG1以及PUG2水膠中的心臟相關基因(GATA4、MEF2C、TBX5、NKX2.5、MYH6以及TNNT2)表現。結果如圖15所示，無論是培養在PUG1、PUG2水膠或TCPS培養基中的人臍血間充質幹細胞的心臟相關基因(GATA4、MEF2C、TBX5、NKX2.5、MYH6以及TNNT2)表現量以GAPDH基因表現標準化後皆低。
經本發明之方法原位轉殖的GATA4質體或GMT質體的細胞負載水膠，轉殖15天後心臟相關基因(GATA4、MEF2C、TBX5、NKX2.5、MYH6以及TNNT2)表現。結果如圖16所示，經本發明之方法原位轉殖GMT質體的細胞負載水膠的心臟相關基因表現量皆比經本發明之方法原位轉殖GATA4質體的細胞負載水膠略高，表示原位轉殖GMT質體的細胞負載水膠具有較佳的治療心臟效果。而PUG1水膠的細胞負載水膠的心臟相關基因GATA4、MEF2C、TBX5、NKX2.5、MYH6以及TNNT2)表現量皆比PUG2水膠的細胞負載水膠以及培養在TCPS培養基的細胞負載水膠明顯高很多；特別是，經本發明之方法原位轉殖GATA4質體或GMT質體的細胞負載水膠的NKX2.5及MYH6(約為800至1300)基因表現量高於其他基因。
本發明使用如實施例2所述之方法，分析經本發明之方法原位轉殖GATA4質體或GMT質體的細胞負載水膠轉殖15天後的心臟相關蛋白質(GATA4、NKX2.5以及MYH6以及ZO-1)表現。結果如圖17A所示，在PUG1及PUG2細胞負載水膠的心臟相關蛋白質表現皆呈陽性反應；對於PUG2細胞負載水膠以及培養在TCP培養基的人臍血間充質幹細胞的螢光訊號較弱。未轉殖的人臍血間充質幹細胞未有GATA4、NKX2.5以及MYH6以及ZO-1的蛋白質表現。
將免疫螢光染色進行半定量分析，如圖17B所示，經本發明之方法原位轉殖GMT質體的細胞負載水膠的心臟相關蛋白質表現量皆比經本發明之方法原位轉殖GATA4質體的細胞負載水膠略高，及培養在TCP培養基轉殖的GMT或GATA4質體的人臍血間充質幹細胞的蛋白質表現量皆低(約40%)
斑馬魚的心跳算法為將魚置於冰上且固定於載具中，再將身體剖開，計算心跳的次數(2分鐘)。爾後將魚犧牲，取出心臟，進行組織學分析。實驗步驟為將心臟組織脫水進行石蠟包埋，接著再進行切片染色(H&E stain)，觀察其心臟型態。結果如圖18A所示未轉殖的人臍血間充質幹細胞的心跳率約為2分鐘內每分鐘20下。結果如圖18B所示，PUG1水膠的組織型態學接近於正常細胞。
4.11 活體內的心跳率分析及心臟組織學分析本發明之原位轉殖的方法用於治療斑馬魚心臟缺陷的結果，如圖19所示，在具GATA4質體的細胞負載水膠的斑馬魚中，PUG1細胞負載水膠的斑馬魚在30至60分鐘內每分鐘約跳50下；PUG2細胞負載水膠的斑馬魚在30至60分鐘內每分鐘約跳跳38下；以及PBS的斑馬魚在30至60分鐘內每分鐘約跳30下。在具GMT質體的細胞負載水膠的斑馬魚中，PUG1細胞負載水膠的斑馬魚在30至60分鐘內每分鐘約跳58下；PUG2細胞負載水膠的斑馬魚在30至60分鐘內每分鐘約跳跳50下；以及PBS的斑馬魚在30至60分鐘內每分鐘約跳30下。顯示使用PUG1水膠之具GATA4質體的細胞負載水膠的斑馬魚心跳最高。
分別將具GATA4或GMT質體的人臍血間充質幹細胞分別與PBS、PUG1水膠或PUG2水膠經由32號針頭共注射至心室進行治療，以僅注射PBS作為對照組。結果如圖20所示，僅注射PBS組的心臟大小皆小於其他群組；注射具GATA4或GMT質體轉殖的人臍血間充質幹細胞的PBS組以及具GATA4質體的PUG2細胞負載水膠組的心臟腔室大；注射具GATA4或GMT質體的PUG1細胞負載水膠組的心臟接近正常組；注射具GMT質體的PUG2細胞負載水膠組會誘發心臟肥大。
4.12 本發明之方法所使用水膠帶電荷的影響
本發明分析各種水膠(陽離子水膠、陰離子水膠以及PUG1水膠)的顆粒大小及電位，如表2所示。並進行各種水膠的細胞培養，並以培養在TCPS培養基上作為對照組，如圖21A所示，帶負電荷的PU水膠具有較好的細胞存活率；PU水膠的固體含量是約20%，無法形成凝膠狀則不能應用於本發明之原位轉殖的方法。
接著，本發明分別產生各種水膠(陽離子水膠、陰離子水膠以及PUG1水膠)的GATA4質體轉殖的人臍血間充質幹細胞，檢測各水膠的GATA4、MEF2C以及TBX5的基因表現量。結果如圖21B所示，PUG1水膠中的心臟相關基因(GATA4、MEF2C以及TBX5)表現量以GAPDH基因表現標準化後約為1.8，表示帶正電荷的PU相較於PUG1(帶負電荷)較易轉殖。
本發明分別使用18G、23G、27G以及32G針頭與1公分孔徑的微量吸管尖進行本發明之原位轉殖的方法後，進行細胞存活率之分析，結果如圖22A所示，細胞經各種針頭進行本發明之原位轉殖的方法後，細胞存活率皆約90%。本發明分別檢測細胞經各種針頭進行本發明之原位轉殖的方法後的GATA4基因表現量，以GAPDH基因表現標準化後，結果如圖22B所示，使用
32G針頭進行本發明之原位轉殖的方法後的GATA4基因表現量最佳，結果顯示針頭大小雖未影響細胞存活率，但會影響基因轉殖的效果。
該些實驗結果顯示出PUG1水膠具有較佳的轉殖效果、存活率。對於修復斑馬魚心臟缺陷的方面，具GATA4或GMT質體轉殖的人臍血間充質幹細胞的PUG1水膠是最佳治療效果；而PUG2水膠會誘發心臟肥大，因此水膠的電荷、粒徑大小、彈性以及硬度，皆會影響心臟治療的效果。
再者，在本發明之一實施例中，使用綠光照射的本發明之原位轉殖方法獲得的神經幹細胞可以聚集成神經球樣結構，並分化成成熟神經細胞，且這些成熟神經元會形成突觸樣的結構；另一方面，用綠光照射的PolyFect轉殖的神經幹細胞僅會分化成沒有突觸樣結構的神經膠質細胞。
綜上所述，本發明中提供一種新穎的原位轉殖方法，基於注射在含有轉殖基因細胞的水膠，在注射過程中產生25Pa至800Pa的平均剪切力可能促進細胞膜的打開使含基因的質體進入細胞內，以得到含基因質體的轉殖細胞。在HEBR轉殖細胞中，本發明之方法所獲得之神經幹細胞，與傳統的Polyfect轉殖試劑獲得的神經幹細胞相比，本發明之原位轉殖之方法所獲得的神經幹細胞，其HEBR表現量較高，具有更適合神經修復之優異生理功能，更進一步地，當用光啟動時，本發明之原位轉殖之方法所獲得的神經幹細胞，在體外增殖並分化為神經元，並修復斑馬魚中的神經系統損傷之優異效果。此外，本發明之原位轉殖之方法亦產生含有GATA4質體、MEF2C質體及TBX5的質體細胞，有效證實可使心臟缺陷的斑馬魚心跳增加，且心臟組織型態恢復於正常心臟組織之型態。因此，本發明之原位轉殖的方法不會引起細胞毒性，並能有效避免由於免疫反應使轉殖的蛋白質功能喪失，因此，未來能應用於不同組織位點、或同一組織但不同區域(如腦部每個位置的軟硬程度都不同)進行客製化基因治療與組織修復及再生。
Claims (24)
- 一種原位轉殖的方法，包含：經由含有內部直徑為25μm至1200μm的針頭或噴嘴的注射或擠壓裝置將一可注射性水膠、至少一生物性分子以及一細胞以25Pa至800Pa的平均剪切力(shear stress)共擠出至一所需位置，在共擠出時將該生物性分子轉殖至該細胞中，而獲得一含轉殖的生物性分子之細胞的組織修復水膠；其中該生物性分子係為一含質體的DNA、一RNA或一蛋白質；其中該可注射性水膠包含一溫感水膠或一多重反應(multi-responsive)水膠，且該多重反應水膠係為一pH感應水膠或一具自癒能力水膠；其中該可注射性水膠具有一介於0.1kPa至10kPa的硬度。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該蛋白質係為一光敏因子蛋白質。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該含質體的DNA係為一轉錄因子基因或一光敏因子基因。
- 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該轉錄因子基因係為一叉頭框(forkhead box，FOX)D3、一心肌轉錄調節因子(critical transcription factor GATA，GATA)4、一肌细胞增強因子(myocyte enhancer factor，MEF)2C、或一T-box轉錄因子(T-box transcription factor，TBX)5。
- 如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該光敏因子基因係為一細菌視紫紅質(Highly-Expressed Bacteriorhodopsin，HEBR)基因、或一光敏感通道-2(Channelrhodopsin-2)基因。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該細胞係為一纖維母細胞或一幹細胞。
- 如申請專利範圍第6項所述之方法，其中該幹細胞係為一神經幹細胞或一間充質幹細胞。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該溫感水膠係為一聚胺酯水膠。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該具自癒能力水膠係為一幾丁質水膠。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該pH感應水膠係為幾丁質水膠。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該剪切力最佳為100Pa至200Pa。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該注射器的針頭或噴嘴的內部直徑最佳為110μm至410μm。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中當該可注射性水膠為該多重反應水膠、該生物性分子為一細菌視紫紅質(HEBR)基因以及該細胞係為一神經幹細胞時，在共擠出時將該HEBR基因轉殖至該神經幹細胞中，該經轉殖的神經幹細胞會發育為一成熟神經細胞。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中當該可注射性水膠為該溫感水膠、該生物性分子為一叉頭框(forkhead box，FOX)D3基因以及該細胞係為一纖維母細胞時，在共擠出時將該FOXD3基因轉殖至該纖維母細胞中，該經轉殖的纖維母細胞會發育為一類神經脊幹細胞；且該溫感水膠係為以分子量為 1500g/mol製備之聚乳酸二元醇(poly-DL-lactic acid diol，PDLLA diol)之聚胺酯水膠。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中當該可注射性水膠為該溫感水膠、該生物性分子為一心肌轉錄調節因子(critical transcription factor GATA，GATA)4、一肌细胞增強因子(myocyte enhancer factor，MEF)2C以及一T-box轉錄因子(T-box transcription factor，TBX)5基因以及該細胞係為一人臍血間充質幹細胞時，在共擠出時將該GATA4、MEF2C以及TBX5基因轉殖至該人臍血間充質幹細胞中，該經轉殖的人臍血間充質幹細胞會發育為一類心肌幹細胞；且該溫感水膠係為以分子量為1500g/mol製備之聚乳酸二元醇(poly-DL-lactic acid diol，PDLLA diol)之聚胺酯水膠。
- 一種組織修復水膠用於製備促進細胞或幹細胞分化的醫藥組合物之用途，其中該組織修復水膠係為由如申請專利範圍第1項所述之方法獲得。
- 如申請專利範圍第16項所述之用途，其中該組織修復水膠係為神經、心臟或微腦組織修復水膠。
- 一種調控細胞分化方法，包含：經由含有內部直徑為25μm至1200μm的針頭或噴嘴的注射或擠壓裝置將一可注射性水膠、至少一生物性分子以及一細胞以25Pa至800Pa的平均剪切力(shear stress)共擠出至一所需位置，在共擠出時將該生物性分子轉殖至該細胞中，而獲得一含轉殖的生物性分子之細胞的組織修復水膠；以使該細胞或幹細胞往一特定之方向分化；其中該生物性分子係為一含質體的DNA、一RNA或一蛋白質；其中該可注射性水膠包含一溫感水膠或或一多重反應(multi-responsive)水膠，且該多重反應水膠係為一pH感應水膠或一具自癒能力水膠； 其中該可注射性水膠具有一介於0.1kPa至10kPa的硬度。
- 如申請專利範圍第18項所述之方法，其中該細胞為一幹細胞。
- 如申請專利範圍第18項所述之方法，其中該注射器的針頭或噴嘴的內部直徑最佳為110μm至410μm。
- 如申請專利範圍第18項所述之方法，其中該剪切力最佳為100Pa至200Pa。
- 如申請專利範圍第18項所述之方法，其中當該可注射性水膠為該具多重反應水膠、該生物性分子為細菌視紫紅質(HEBR)基因以及該細胞係為神經幹細胞時，在共擠出時將該HEBR基因轉殖至該神經幹細胞中，該經轉殖的神經幹細胞會往一成熟神經細胞之方向分化。
- 如申請專利範圍第18項所述之方法，其中當該可注射性水膠為該溫感水膠、該生物性分子為一叉頭框(forkhead box，FOX)D3基因以及該細胞係為一纖維母細胞時，在共擠出時將該FOXD3基因轉殖至該纖維母細胞中，該經轉殖的纖維母細胞會往一類神經脊幹細胞之方向分化；且該溫感水膠係為以分子量為1500g/mol製備之聚乳酸二元醇(poly-DL-lactic acid diol，PDLLA diol)之聚胺酯水膠。
- 如申請專利範圍第18項所述之方法，其中當該可注射性水膠為該溫感水膠、該生物性分子為一心肌轉錄調節因子(critical transcription factor GATA，GATA)4、一肌细胞增強因子(myocyte enhancer factor，MEF)2C以及一T-box轉錄因子(T-box transcription factor，TBX)5基因以及該細胞係為一人臍血間充質幹細胞時，在共擠出時將該GATA4、MEF2C以及TBX5基因轉殖至該人臍血間充質幹細胞中，該經轉殖的人臍血間充質幹細胞會往一類心肌幹細胞之 方向分化；且該溫感水膠係為以分子量為1500g/mol製備之聚乳酸二元醇(poly-DL-lactic acid diol，PDLLA diol)之聚胺酯水膠。
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