CN108642001A - 一种提高牛性控冻精体外受精能力的方法 - Google Patents

一种提高牛性控冻精体外受精能力的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108642001A
CN108642001A CN201810433980.2A CN201810433980A CN108642001A CN 108642001 A CN108642001 A CN 108642001A CN 201810433980 A CN201810433980 A CN 201810433980A CN 108642001 A CN108642001 A CN 108642001A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sperm
anthocyanidin
essence
control
pyrroloquinoline quinone
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810433980.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108642001B (zh
Inventor
赵学明
朱化彬
郝海生
杜卫华
庞云渭
刘岩
赵亚涵
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Animal Science of CAAS
Original Assignee
Institute of Animal Science of CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Animal Science of CAAS filed Critical Institute of Animal Science of CAAS
Priority to CN201810433980.2A priority Critical patent/CN108642001B/zh
Publication of CN108642001A publication Critical patent/CN108642001A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108642001B publication Critical patent/CN108642001B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0608—Germ cells
    • C12N5/061—Sperm cells, spermatogonia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61D—VETERINARY INSTRUMENTS, IMPLEMENTS, TOOLS, OR METHODS
    • A61D19/00—Instruments or methods for reproduction or fertilisation
    • A61D19/02—Instruments or methods for reproduction or fertilisation for artificial insemination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

本发明提出了花青素和吡咯喹啉醌在提高性控冻精体外受精能力方面的用途，并提出了添加花青素和吡咯喹啉醌的洗精液和受精液。本发明在牛性控冻精解冻、获能过程中，向洗精液和受精液中分别都加入花青素和吡咯喹啉醌，来处理牛性控冻精，而后进行体外受精。结果表明，牛性控精液的卵裂率、囊胚率得到显著性提高，并显著超过了同头公牛未分离冻精的体外受精效率，具有广泛的应用前景，值得推广。

Description

一种提高牛性控冻精体外受精能力的方法
技术领域
本发明涉及人工体外受精领域，具体涉及一种提高性控冻精体外受精能力的方法。
背景技术
在养殖业中，性别控制技术能够使人们获得预期性别的后代，进而提高养殖业效益和育种进度，因此该技术具有十分重要的意义。Johnson等在1989年开发的精子流式细胞仪分离技术，已经被成功用于奶牛X、Y精子的分离。目前，在奶牛人工授精过程中采用性控冻精，可控制母牛出生率在90％以上(Mikkola M,Andersson M,Taponen J.Transfer ofcattle embryos produced with sex-sorted semen results in impaired pregnancyrate and increased male calf mortality[J].Theriogenology,2015,84(7):1118-22.)。然而，青年牛采用奶牛性控冻精人工授精后受胎率约为40％，远低于常规冻精(70％左右)(郝海生,赵明礼,朱化彬等.性控冷冻精液人工授精对青年奶牛繁殖性能的影响[J].畜牧与兽医,2016,48(8):52-54.)。同时，奶牛性控冻精用于体外受精时，卵裂率通常为40％、囊胚率为10％左右，而常规冻精体外受精后卵裂率通常在80％、30％以上(Zhao X M,Ren J J,Zhao S J,et al.Apoptosis-like events and in vitro fertilizationcapacity of sex-sorted bovine sperm[J].Reprod Domest Anim,2014,49(4):543-549.)。
研究表明，在性控精子分离过程中，需要经过稀释、染色、激光照射、冷冻等步骤，导致性控精子受精能力降低。因此，如何提高性控冻精活力和受精能力，已经成为该领域的研究热点。
发明内容
本发明针对现有技术中性控冻精受精能力降低的问题，提供一种在性控冻精解冻、获能过程中的保护措施，以保护性冻精免受ROS的影响，进而提高牛性控冻精活力和体外受精的方法。本发明的一个目的是提供花青素和吡咯喹啉醌在提高性控冻精体外受精能力的用途。
本发明的另一个目的是提供一种受精液，该受精液溶液中还含有花青素和吡咯喹啉醌。
本发明的另一个目的是提供一种洗精液，该洗精精液溶液中还含有花青素和吡咯喹啉醌。
最后，本发明还提供一种利用含有花青素和吡咯喹啉醌的洗精液和受精液处理性控冻精，从而提高性控冻精体外受精能力的方法。
具体的说，本发明所述的性控冻精是牛性控冻精。
进一步的，本发明所述的洗精液可采用本领域常用的各种洗精液加入花青素和吡咯喹啉醌。其中花青素的浓度为10-5M-10-1M，所述吡咯喹啉醌的浓度为50μM-5mM；
优选的，所述花青素的浓度为10-3M，所述吡咯喹啉醌的浓度为500μM。
进一步优选的，所述洗精液是BO液+3.38mg/mL咖啡因，还含有浓度为10-5M-10-1M的花青素，以及浓度为50μM-5mM的吡咯喹啉醌。
更进一步优选的，所述洗精液中花青素的浓度为10-3M，所述吡咯喹啉醌的浓度为500μM。
另外，本发明所述的受精液可采用本领域常用的各种受精液加入花青素和吡咯喹啉醌。其中，花青素的浓度为10-5M-10-1M，所述吡咯喹啉醌的浓度为50μM-5mM；
优选的，所述花青素的浓度为10-3M，所述吡咯喹啉醌的浓度为500μM。
进一步优选的，所述洗精液为：BO液+20mg/mL肝素钠+20mg/mL BSA，还含有浓度为10-5M-10-1M的花青素，以及浓度为50μM-5mM的吡咯喹啉醌；
更进一步优选的，所述受精液中花青素的浓度为10-3M，所述吡咯喹啉醌的浓度为500μM。
本发明还提供一种提高性控冻精体外受精能力的方法，特别的，该方法包括将性控冻精采用含有花青素和吡咯喹啉醌的洗精液和受精液处理的步骤。
具体的说，本发明所述的方法，包括如下步骤：
(1)取性控冻精，解冻；
(2)将步骤(1)中的解冻的性控冻精采用含有花青素和吡咯喹啉醌的洗精液洗涤；
(3)将步骤(2)中得到的洗涤后的性控冻精采用含有花青素和吡咯喹啉醌的受精液处理后备用。
其中，步骤(2)中洗涤次数为2次。
其中，步骤(3)中的处理时间为1.5小时。
一般来说，所述处理是将性控冻精放置在所需溶液中静置即可。
牛性控精液采用洗精洗涤2次，进而在受精液中获能1.5小时，而后进行体外受精。
应用结果表明，牛性控精液的卵裂率、囊胚率得到显著性提高，并显著超过了同头公牛未分离冻精的体外受精效率，具有广泛的应用前景，值得推广。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
1.基础液体配制
(1)卵母细胞洗涤液
3.58g/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)+10％TCM199(10×)+0.22g/L丙酮酸钠+10mg/L肝素+0.168g/L NaHCO3+20mL/L FBS+146mg/L谷氨酰胺。
(2)卵母细胞体外成熟液
TCM199(1×)+0.01IU/mL FSH+10μg/mL肝素钠+40ng/mL IGF+50ng/mL EGF+0.01IU/mL LH+1μg/mL E2+10％FBS。
(3)体外受精液
参照Brackett和Oliphant(1975)描述的方法进行配制。
基础液(BO液)：0.3mg/mL KCl+6.55mg/mL NaCl+0.33mg/mL CaCl2·2H2O+106mg/mL MgCl2·6H2O+99μg/mLNaH2PO4+3.10mg/mL NaHCO3+2.5mg/mL葡萄糖+138μg/mL丙酮酸钠+3mg/mL BSA。
洗精液：BO液+3.38mg/mL咖啡因。
受精液：BO液+20mg/mL肝素钠+20mg/mL BSA。
用0.22μm滤膜对配好的洗精液和受精液进行过滤灭菌后，4℃冰箱保存。
2.精液处理
冻精从液氮中取出后，快速运动使其表面液氮挥发完毕，而后投入37℃温水中解冻。精液先用洗精液1800r/min离心洗涤2次，每次5min。弃掉上清后，精子沉淀再加入受精液重悬，调整精子密度5×106个/mL。吸取20μL精液放入提前预热的80μL受精中。放入恒温培养箱孵育1.5h后用于后续检测。
3.精子ROS水平分析
精子采用10μmol/L 1μL DCFH-DA避光孵育20min，1500r/min离心洗涤5min后，加入100μL PBS重悬沉淀。吸取部分精子悬浮液，压片后置于荧光显微镜下照相。采用图像分析软件Image J分析精子头部ROS水平。
4.精子凋亡检测
按照Annexin V-FITC/PI试剂盒(Roche公司，瑞士)说明书方法检测精子PS外翻。先取处理好的精液，1500r/min离心3min，弃上清，FITC结合液重悬，调整精液密度为2.5×105个/mL。将精液分4组试验：(1)对照组：200μL FITC结合液重悬精液，不染色；(2)AnnexinV-FITC单染组：取195μL结合液重悬的精液，加入5μLAnnexin V-FITC，轻轻混匀，室温(20～25℃)避光孵育10min；(3)PI单染组：190μL结合液重悬精液，加入10μL PI染色液，轻轻混匀，冰浴避光放置；(4)Annexin V-FITC/PI双染组：精液按照Annexin V-FITC单染组处理后，1500r/min离心3min，弃上清，加入190μL结合液重悬精液，按照PI单染组方法处理精子。根据染色结果，按以下方法将精子进行分类：(1)未凋亡精子(AN-/PI-)，(2)早期凋亡精子(AN+/PI)，(3)早期坏死精子(AN+/PI+)，(4)坏死精子(AN-/PI+)。
5.精子MDA含量测定
精子MDA含量测定试剂盒购买自南京建成生物工程研究所，操作步骤按说明书进行。操作步骤为，精液加入试剂盒中试剂1，混匀后加入3ml试剂盒中试剂2、1ml试剂盒中试剂3。混合物混匀后，采用沸水浴反应40min，随后取出流水冷却，4 000r/min离心洗涤10min。而后，取上清利用分光光度计在532nm处，1cm光径，双蒸水调零后，通过测定各管吸光度值计算MDA含量。
6.精子顶体完成性分析
精子采用2mg/mL FITC-PNA避光孵育10min，而后采用1mg/mL PI避光孵育5min，随后1 500r/min离心5min，洗去多余染料。精子沉淀采用PBS重悬压片后，置于荧光显微镜下检测精子顶体完整性。根据染色结果，将精子分为四类：顶体完整的活精子(PI-/PNA-)、顶体不完整的活精子(PI-/PNA+)、顶体完整的死精子(PI+/PNA-)、顶体不完整的死精子(PI+/PNA+)。
7.精子获能检测
精子采用75nM YoPro-1和2μM M540在38.5℃、避光条件下染色15min，而后1500r/min离心5min，洗去多余染料。离心后的精子采用PBS重悬压片后，置于荧光显微镜下观察。根据染色结果，将精子分为四类：未获能的活精子(YoPro-1-/M540-)、获能的活精子(YoPro-1-/M540+)、未获能的死精子(YoPro-1+/M540-)、获能的死精子(YoPro-1+/M540+)。
8.卵母细胞采集和体外成熟
从屠宰场获取的卵巢反复洗净后，采用真空泵吸取卵巢表面直径为2～8mm的卵丘卵母细胞复合体(COCs)。抽卵液充分沉积后，在显微镜下将含有3层或以上卵丘细胞的COCs捡出。COCs在卵母细胞成熟培养液中洗2遍后，移入含有成熟液的4孔板中(750μL/孔，每孔50枚COCs)、在38.5℃、5％CO2和100％湿度的CO2培养箱中培养。体外成熟22～24h后，将COCs放入0.1％的透明质酸酶中消化1～2min脱除卵丘细胞。最后，挑选出具有第一极体和胞质均匀的卵母细胞用于体外受精实验。
9.体外受精
按步骤2精液处理中描述的方法解冻精子，并调整精子浓度至5×106个/ml。吸取20μl精液加入含有20枚卵母细胞的80μl受精液中，在38.5℃、5％CO2条件下进行体外受精。受精18～20h后，置于CR1aa中培养，培养48h后更换培养液(CR1aa+10％FBS)，统计卵裂率。体外培养7d后，获得体外受精囊胚，统计囊胚率。
10.数据统计
采用SAS软件对实验数据进行分析，百分数比较时经反正旋转化后采用方差分析，结果以平均数依标准差表示，P<0.05为差异显著性标准。各处理组至少重复3次以上。
实施例1抗氧化处理对牛性控冻精ROS水平的影响
在牛性控冻精洗精液、受精液中添加花青素(10-1M，10-3M，10-5M)或吡咯喹啉醌(5mM，500μM，50μM)，进而比较不同浓度花青素、吡咯喹啉醌处理对牛性控冻精ROS水平的影响。
筛选花青素、吡咯喹啉醌最佳处理浓度，研究花青素、吡咯喹啉醌最佳浓度单独处理、联合处理对牛性控冻精ROS水平的影响。未处理性控冻精、同头公牛未分离冻精进行相同分析，作为对照组。
如表1所示，在性控冻精洗精液、受精液中添加花青素，处理组性控精液ROS水平均显著低于未处理组性控精液，但均显著高于同头公牛未分离冻精。
如表2所示，在性控冻精洗精液、受精液中添加吡咯喹啉醌，处理组性控精液ROS水平均显著低于未处理组性控精液(P<0.05)，但均显著高于同头公牛未分离冻精。
如表3所示，10-3M花青素+500μM吡咯喹啉醌联合处理组性控冻精ROS水平显著低于未处理组，也显著低于同头公牛未分离冻精(P<0.05)。10-3M花青素处理组、500μM吡咯喹啉醌处理组ROS水平，显著低于未处理组(P<0.05)，但显著高于同头公牛未处理冻精。
表1花青素对性控冻精ROS水平的影响
a,b,c,d,e同列数据上标不同表示差异显著(P<0.05)，下表同。
表2吡咯喹啉醌对性控冻精ROS水平的影响
表3花青素、吡咯喹啉醌最佳浓度处理对性控冻精ROS水平的影响
实施例2抗氧化处理对牛性控冻精凋亡水平的影响
在牛性控冻精洗精液、受精液中添加花青素(10-1M，10-3M，10-5M)或吡咯喹啉醌(5mM，500μM，50μM)，进而比较不同浓度花青素、吡咯喹啉醌处理对牛性控冻精凋亡水平水平的影响。
筛选花青素、吡咯喹啉醌最佳处理浓度，研究花青素、吡咯喹啉醌最佳浓度单独处理、联合处理对牛性控冻精凋亡水平的影响。未处理性控冻精、同头公牛未分离冻精进行相同分析，作为对照组。
如表4所示，在性控冻精洗精液、受精液中添加花青素，10-3M花青素处理组性控精液未凋亡精子比例(68.00±6.14％)比例显著高于未处理组性控精液(57.89±5.61％)，与同头公牛未分离冻精无显著性差异(71.83±6.82％)。同时，10-3M花青素处理组性控精液早期凋亡精子比例(18.86±1.63％)比例显著低于未处理组性控精液(30.28±2.95％)，与同头公牛未分离冻精无显著性差异(17.61％±1.64％)。
如表5所示，在性控冻精洗精液、受精液中添加吡咯喹啉醌，500μM吡咯喹啉醌处理组性控精液未凋亡精子比例(69.43±6.41％)比例显著高于未处理组性控精液(58.33±5.32％)，与同头公牛未分离冻精无显著性差异(72.88±7.05％)。同时，500μM吡咯喹啉醌处理组性控精液早期凋亡精子比例(20.38±1.82％)比例显著低于未处理组性控精液(29.55±2.42％)，与同头公牛未分离冻精无显著性差异(18.64±1.81％)。
如表6所示，10-3M花青素+500μM吡咯喹啉醌联合处理组性控冻精未凋亡精子比例(85.11±7.32％)显著高于未处理组(59.56±5.14％)，也显著高于同头公牛未分离冻精(73.64±7.32％)、10-3M花青素处理组(67.31±5.63％)、500μM吡咯喹啉醌处理组(68.91±5.49％)。同时，10-3M花青素+500μM吡咯喹啉醌处理组性控精液早期凋亡精子(8.51±7.41％)比例显著低于未处理组性控精液(30.15±2.85％)，也显著低于同头公牛未分离冻精(19.38±1.62％)、10-3M花青素处理组(17.31±1.48％)、500μM吡咯喹啉醌处理组(19.10±1.85％)。
表4花青素对性控冻精早期凋亡水平的影响
a,b,c,d,e同列数据上标不同表示差异显著(P<0.05)，下表同。
表5吡咯喹啉醌对性控冻精ROS水平的影响
表6花青素、吡咯喹啉醌最佳浓度处理对性控冻精ROS水平的影响
实施例3抗氧化处理对牛性控冻精MDA水平的影响
在牛性控冻精洗精液、受精液中添加花青素(10-1M，10-3M，10-5M)或吡咯喹啉醌(5mM，500μM，50μM)，进而比较不同浓度花青素、吡咯喹啉醌对牛性控冻精MDA水平的影响。
筛选花青素、吡咯喹啉醌最佳处理浓度，研究花青素、吡咯喹啉醌最佳浓度单独处理、联合处理对牛性控冻精MDA水平的影响。未处理性控冻精、同头公牛未分离冻精进行相同分析，作为对照组。
如表7所示，在性控冻精洗精液、受精液中添加花青素，10-3M和10-5M花青素处理组MDA水平(11.44±1.01nmol/mL、9.41±0.65nmol/mL)均显著低于未处理组性控精液(14.25±1.32nmol/mL)，但均显著高于同头公牛未分离冻精(5.88±0.43nmol/mL)。
如表8所示，在性控冻精洗精液、受精液中添加吡咯喹啉醌，500μM、50μM吡咯喹啉醌处理组MDA水平(12.60±1.01nmol/mL、8.46±0.68nmol/mL)均显著低于未处理组性控精液(15.93±1.42nmol/mL)，但均显著高于同头公牛未分离冻精(5.45±0.51nmol/mL)。
如表9所示，10-3M花青素和500μM吡咯喹啉醌联合处理组性控冻精MDA水平(2.71±0.21nmol/mL)显著低于未处理组(15.19±1.49nmol/mL)，也显著低于同头公牛未分离冻精(5.00±0.42nmol/mL)、10-3M花青素处理组(11.87±1.75nmol/mL)、500μM吡咯喹啉醌处理组MDA水平(12.45±1.21nmol/mL)。
表7花青素对性控冻精MDA水平的影响
表8吡咯喹啉醌对性控冻精MDA水平的影响
表9花青素、吡咯喹啉醌最佳浓度联合处理对性控冻精MDA水平的影响
实施例4抗氧化处理对牛性控冻精顶体完整性的影响
在牛性控冻精洗精液、受精液中添加花青素(10-1M，10-3M，10-5M)或吡咯喹啉醌(5mM，500μM，50μM)，进而比较不同浓度花青素、吡咯喹啉醌处理对牛性控冻精顶体完整性的影响。
筛选花青素、吡咯喹啉醌最佳处理浓度，研究花青素、吡咯喹啉醌最佳浓度单独处理、联合处理对牛性控冻精顶体完整性的影响。未处理性控冻精、同头公牛未分离冻精进行相同分析，作为对照组。
如表10所示，在性控冻精洗精液、受精液中添加花青素，10-3M花青素处理组活精子顶体完整率(50.00±4.38％)均显著高于未处理组性控精液(40.00±4.06％)，但均显著低于同头公牛未分离冻精(61.76±6.03％)。
如表11所示，在性控冻精洗精液、受精液中添加吡咯喹啉醌，500μM吡咯喹啉醌处理组活精子顶体完整率(53.66±4.24％)显著低于未处理组性控精液(43.59±3.84％)，但均显著高于同头公牛未分离冻精(63.83±6.17％)。
如表12所示，10-3M花青素和500μM吡咯喹啉醌联合处理组活精子顶体完整率(76.74±6.41％)显著高于未处理组(44.44±4.15％)，也显著高于同头公牛未分离冻精(65.85±5.86％)、10-3M花青素处理组(55.26±4.64％)、500μM吡咯喹啉醌处理组(53.33±5.28％)。
表10花青素对性控冻精顶体完整性的影响
表11吡咯喹啉醌对性控冻精顶体完整性的影响
表12花青素、吡咯喹啉醌最佳浓度处理对性控冻精顶体完整性的影响
实施例5抗氧化处理对牛性控冻精获能的影响
在牛性控冻精洗精液、受精液中添加花青素(10-1M，10-3M，10-5M)或吡咯喹啉醌(5mM，500μM，50μM)，进而比较不同浓度花青素、吡咯喹啉醌处理对牛性控冻精获能的影响。
筛选花青素、吡咯喹啉醌最佳处理浓度，研究花青素、吡咯喹啉醌最佳浓度单独处理、联合处理对牛性控冻精获能的影响。未处理性控冻精、同头公牛未分离冻精进行相同分析，作为对照组。
如表13所示，在性控冻精洗精液、受精液中添加花青素，10-3M花青素处理组获能活精子比例(52.11±5.03％)均显著高于未处理组性控精液(41.67±3.95％)，但均显著低于同头公牛未分离冻精(64.06±5.39％)。
如表14所示，在性控冻精洗精液、受精液中添加500μM吡咯喹啉醌处理组获能活精子比例(53.70±5.31％)显著低于未处理组性控精液(42.31±3.74％)，但均显著高于同头公牛未分离冻精(62.00±5.61％)。
如表15所示，10-3M花青素和500μM吡咯喹啉醌联合处理组获能活精子比例(75.95±7.15％)显著高于未处理组(42.11±4.03％)，也显著高于同头公牛未分离冻精(63.51±6.12％)、10-3M花青素处理组(54.17±5.03％)、500μM吡咯喹啉醌处理组(52.94±4.74％)。
表13花青素对性控冻精获能的影响
表14吡咯喹啉醌对性控冻精获能的影响
表15花青素、吡咯喹啉醌最佳浓度联合处理对性控冻精获能的影响
实施例6抗氧化处理对牛性控冻精体外受精效率的影响
在牛性控冻精洗精液、受精液中添加花青素(10-1M，10-3M，10-5M)或吡咯喹啉醌(5mM，500μM，50μM)，进而比较不同浓度花青素、吡咯喹啉醌处理对牛性控冻精体外受精效率的影响。
筛选花青素、吡咯喹啉醌最佳处理浓度，研究花青素、吡咯喹啉醌最佳浓度单独处理、联合处理对牛性控冻精体外受精效率的影响。未处理性控冻精、同头公牛未分离冻精进行相同分析，作为对照组。
如表16所示，在性控冻精洗精液、受精液中10-3M花青素，性控冻精IVF卵裂率、囊胚率(65.28±5.76％，25.53±2.43％)显著高于未处理组(52.56±4.98％，17.07±1.58％；P<0.05)，但显著低于同头公牛未分离冻精(75.71±7.13％，32.08±3.08％；P<0.05)。
如表17所示，在性控冻精洗精液、受精液中添加500μM吡咯喹啉醌性控冻精IVF卵裂率、囊胚率(63.53±5.65％，25.93±2.08％)显著高于未处理组(54.95±4.98％，16.00±1.38％；P<0.05)，但显著低于同头公牛未分离冻精(74.42±7.15％，34.38±3.15％；P<0.05)。
如表18所示，10-3M花青素和500μM吡咯喹啉醌联合处理组的性控冻精IVF卵裂率、囊胚率、囊胚细胞数(89.27±7.64％，45.06±3.52％，110.36±10.53)显著高于未处理组(55.12±5.48％，15.24±1.59％，83.65±7.59；P<0.05)，也显著高于同头公牛未分离冻精(75.62±6.18％，32.24±3.12％，98.87±8.52；P<0.05)、10-3M花青素组卵裂率、囊胚率、囊胚细胞数(64.71±5.91％，24.24±2.43％，95.71±8.13)、500μM吡咯喹啉醌组(64.14±5.78％，23.03±2.18％，96.76±9.17)。
表16花青素对性控冻精体外受精能力的影响
表17吡咯喹啉醌对性控冻精体外受精能力的影响
表18花青素、吡咯喹啉醌最佳浓度处理对性控冻精体外受精能力的影响
上述研究结果表明，在性控冻精洗精液、受精液中添加10-3M花青素和500μM吡咯喹啉醌，能够显著降低牛性控冻精ROS水平、MDA水平，进而提高其顶体完整率和获能水平，最终显著提高其体外受精后的卵裂率和囊胚率以及囊胚细胞数，且显著高于同头公牛未分离冻精的效率。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.花青素和吡咯喹啉醌在处理性控冻精，从而提高性控冻精体外受精能力的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述性控冻精是牛性控冻精。
3.一种受精液，其特征在于，所述受精液溶液中还含有花青素和吡咯喹啉醌。
4.如权利要求3所述的受精液，其特征在于，所述花青素的浓度为10-5M-10-1M，所述吡咯喹啉醌的浓度为50μM-5mM；优选的，所述花青素的浓度为10-3M，所述吡咯喹啉醌的浓度为500μM。
5.一种洗精液，其特征在于，所述洗精精液溶液中还含有花青素和吡咯喹啉醌。
6.如权利要求5所述的洗精液，其特征在于，所述花青素的浓度为10-5M-10-1M，所述吡咯喹啉醌的浓度为50μM-5mM；优选的，所述花青素的浓度为10-3M，所述吡咯喹啉醌的浓度为500μM。
7.一种提高性控冻精体外受精能力的方法，其特征在于，包括将性控冻精采用含有花青素和吡咯喹啉醌的洗精液和受精液处理的步骤。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取性控冻精，解冻；
(2)将步骤(1)中的解冻的性控冻精采用权利要求3或4所述的洗精液洗涤；
(3)将步骤(2)中得到的洗涤后的性控冻精采用权利要求5或6所述的受精液处理后备用。
9.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中洗涤次数为2次。
10.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中的处理时间为1.5小时。
CN201810433980.2A 2018-05-08 2018-05-08 一种提高牛性控冻精体外受精能力的方法 Active CN108642001B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810433980.2A CN108642001B (zh) 2018-05-08 2018-05-08 一种提高牛性控冻精体外受精能力的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810433980.2A CN108642001B (zh) 2018-05-08 2018-05-08 一种提高牛性控冻精体外受精能力的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108642001A true CN108642001A (zh) 2018-10-12
CN108642001B CN108642001B (zh) 2022-09-02

Family

ID=63749498

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810433980.2A Active CN108642001B (zh) 2018-05-08 2018-05-08 一种提高牛性控冻精体外受精能力的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108642001B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109182253A (zh) * 2018-10-19 2019-01-11 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种提高卵母细胞体外成熟质量和效率的方法
CN111280163A (zh) * 2020-02-12 2020-06-16 天津博裕力牧科技有限公司 牛活体采卵用的抽卵液及其制备方法和用途
CN114847274A (zh) * 2022-04-22 2022-08-05 中国农业大学 一种卵母细胞冷冻保存试剂及其应用
CN117063919A (zh) * 2023-10-13 2023-11-17 北京市农林科学院 吡咯喹啉醌在提高精液冷冻效果中的用途

Citations (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060154993A1 (en) * 2004-12-17 2006-07-13 Littarru Gian P Method for treating and preventing male infertility
CN101195842A (zh) * 2008-01-07 2008-06-11 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种检测牛x、y精子分离纯度的引物
US20100003663A1 (en) * 2006-09-05 2010-01-07 Kevin Rozeboom Composition For Preserving Reproductive Cells And Method Of Using
AT511776A1 (de) * 2011-07-26 2013-02-15 Gonadosan Gmbh Verwendung von citrullin und ein kombinationspräparat zur verbesserung der männlichen fertilität
US20130059384A1 (en) * 2011-06-29 2013-03-07 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for enhancing bioenergetic status in female germ cells
US20130183656A1 (en) * 2011-06-01 2013-07-18 Inguran, Llc Compositions and methods for improving the quality of processed sperm
CN103445882A (zh) * 2013-08-28 2013-12-18 武汉市畜牧兽医科学研究所 提高牛冷冻精液精子运动性和体外受精率的方法
CN103462724A (zh) * 2013-08-28 2013-12-25 武汉市畜牧兽医科学研究所 使用染料木黄酮提高牛冷冻精液精子运动性及体外受精率的方法
CN105670988A (zh) * 2016-02-02 2016-06-15 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 哺乳动物冲卵液及其配制方法和应用
CN106472484A (zh) * 2016-10-31 2017-03-08 内蒙古赛科星家畜种业与繁育生物技术研究院有限公司 含谷胱甘肽和过氧化氢酶的绵羊冷冻精液制备方法
CN106538511A (zh) * 2016-09-30 2017-03-29 马伟 一种抗氧化的羊冷冻精液稀释液的制作方法
CN107047539A (zh) * 2017-03-28 2017-08-18 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种调控玻璃化冷冻牛卵母细胞中钙离子浓度的方法
CN107174583A (zh) * 2017-06-09 2017-09-19 南京医科大学 吡咯喹啉醌预防和/或治疗雄性生殖功能障碍的新用途
CN107227292A (zh) * 2017-06-02 2017-10-03 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种提高牛类胚胎干细胞形成效率及阳性克隆比例的方法
CN107365738A (zh) * 2017-08-07 2017-11-21 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 一种奶牛与黄牛异种体外受精胚胎的制备方法
CN108114285A (zh) * 2011-07-15 2018-06-05 纽斯尔特科学公司 用于调节代谢途径的组合物和方法
CN108588011A (zh) * 2018-05-08 2018-09-28 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种提高玻璃化冷冻卵母细胞体外受精能力的方法
WO2019089770A1 (en) * 2017-10-31 2019-05-09 Aytu Bioscience, Inc. Methods for treatment of infertility in varicocele patients
WO2019104446A1 (en) * 2017-12-01 2019-06-06 University Of Saskatchewan Protein-free semen cryopreservation
WO2020013086A1 (ja) * 2018-07-12 2020-01-16 国立大学法人広島大学 精子の妊孕力増進剤
CN111849872A (zh) * 2020-07-29 2020-10-30 吉林省农业科学院 一种提高解冻后猪精子体外受精效果的方法
US20200347347A1 (en) * 2017-10-30 2020-11-05 Premium Genetics [UK] Ltd. Compositions and methods for improved gamete viability and function
WO2021067512A1 (en) * 2019-10-01 2021-04-08 Membrane Protective Technologies, Inc. Systems and methods for fertility prediction and increasing culling accuracy and breeding decisions
CN113813261A (zh) * 2021-09-15 2021-12-21 常州市妇幼保健院 吡咯喹啉醌在预防和/或治疗女性生殖功能障碍的用途
CN114007618A (zh) * 2019-06-28 2022-02-01 国立大学法人广岛大学 雌性抗衰老剂
WO2022054778A1 (ja) * 2020-09-08 2022-03-17 ミライラボバイオサイエンス株式会社 精子運動性改善剤及び精子運動性改善方法

Patent Citations (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060154993A1 (en) * 2004-12-17 2006-07-13 Littarru Gian P Method for treating and preventing male infertility
US20100003663A1 (en) * 2006-09-05 2010-01-07 Kevin Rozeboom Composition For Preserving Reproductive Cells And Method Of Using
CN101195842A (zh) * 2008-01-07 2008-06-11 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种检测牛x、y精子分离纯度的引物
US20130183656A1 (en) * 2011-06-01 2013-07-18 Inguran, Llc Compositions and methods for improving the quality of processed sperm
US20130059384A1 (en) * 2011-06-29 2013-03-07 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for enhancing bioenergetic status in female germ cells
CN108261547A (zh) * 2011-07-15 2018-07-10 纽斯尔特科学公司 用于调节代谢途径的组合物和方法
CN108114285A (zh) * 2011-07-15 2018-06-05 纽斯尔特科学公司 用于调节代谢途径的组合物和方法
AT511776A1 (de) * 2011-07-26 2013-02-15 Gonadosan Gmbh Verwendung von citrullin und ein kombinationspräparat zur verbesserung der männlichen fertilität
CN103445882A (zh) * 2013-08-28 2013-12-18 武汉市畜牧兽医科学研究所 提高牛冷冻精液精子运动性和体外受精率的方法
CN103462724A (zh) * 2013-08-28 2013-12-25 武汉市畜牧兽医科学研究所 使用染料木黄酮提高牛冷冻精液精子运动性及体外受精率的方法
CN105670988A (zh) * 2016-02-02 2016-06-15 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 哺乳动物冲卵液及其配制方法和应用
CN106538511A (zh) * 2016-09-30 2017-03-29 马伟 一种抗氧化的羊冷冻精液稀释液的制作方法
CN106472484A (zh) * 2016-10-31 2017-03-08 内蒙古赛科星家畜种业与繁育生物技术研究院有限公司 含谷胱甘肽和过氧化氢酶的绵羊冷冻精液制备方法
CN107047539A (zh) * 2017-03-28 2017-08-18 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种调控玻璃化冷冻牛卵母细胞中钙离子浓度的方法
CN107227292A (zh) * 2017-06-02 2017-10-03 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种提高牛类胚胎干细胞形成效率及阳性克隆比例的方法
CN107174583A (zh) * 2017-06-09 2017-09-19 南京医科大学 吡咯喹啉醌预防和/或治疗雄性生殖功能障碍的新用途
CN107365738A (zh) * 2017-08-07 2017-11-21 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 一种奶牛与黄牛异种体外受精胚胎的制备方法
US20200347347A1 (en) * 2017-10-30 2020-11-05 Premium Genetics [UK] Ltd. Compositions and methods for improved gamete viability and function
WO2019089770A1 (en) * 2017-10-31 2019-05-09 Aytu Bioscience, Inc. Methods for treatment of infertility in varicocele patients
WO2019104446A1 (en) * 2017-12-01 2019-06-06 University Of Saskatchewan Protein-free semen cryopreservation
CN108588011A (zh) * 2018-05-08 2018-09-28 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种提高玻璃化冷冻卵母细胞体外受精能力的方法
WO2020013086A1 (ja) * 2018-07-12 2020-01-16 国立大学法人広島大学 精子の妊孕力増進剤
CN112384217A (zh) * 2018-07-12 2021-02-19 国立大学法人广岛大学 精子生育力增强剂
CN114007618A (zh) * 2019-06-28 2022-02-01 国立大学法人广岛大学 雌性抗衰老剂
WO2021067512A1 (en) * 2019-10-01 2021-04-08 Membrane Protective Technologies, Inc. Systems and methods for fertility prediction and increasing culling accuracy and breeding decisions
CN111849872A (zh) * 2020-07-29 2020-10-30 吉林省农业科学院 一种提高解冻后猪精子体外受精效果的方法
WO2022054778A1 (ja) * 2020-09-08 2022-03-17 ミライラボバイオサイエンス株式会社 精子運動性改善剤及び精子運動性改善方法
CN113813261A (zh) * 2021-09-15 2021-12-21 常州市妇幼保健院 吡咯喹啉醌在预防和/或治疗女性生殖功能障碍的用途

Non-Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FARDIN AMIDI等: "The role of antioxidants in sperm freezing: a review", 《CELL TISSUE BANK》 *
JORDI RIBAS-MAYNOU等: ""Role of exogenous antioxidants on the performance and function of pig sperm after preservation in liquid and frozen states: A systematic review"", 《THERIOGENOLOGY》 *
L. S. CASTRO等: "Sperm cryodamage occurs after rapid freezing phase: flow cytometry approach and antioxidant enzymes activity atdifferent stages of cryopreservation", 《JOURNAL OF ANIMAL SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY》 *
孙艳青: ""葡萄籽原花青素、褪黑激素和大枣多糖对猪精子冷冻保存效果的影响"", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士) 农业科技辑》 *
孙艳青等: ""葡萄籽原花青素对猪精液冷冻保存效果的研究"", 《家畜生态学报》 *
张柳明等: ""茶多酚和花青素在湖羊精液常温保存中的应用效果"", 《黑龙江畜牧兽医》 *
李崇阳等: "抗氧化物质对提高家畜冻精受精能力的研究进展", 《中国畜牧杂志》 *
王捷等: ""芝麻酚对猪精液冷冻保存效果的影响"", 《家畜生态学报》 *
程蕾等: "不同组合活性物质对奶牛冻精质量的影响", 《中国奶牛》 *
黄自强等: "表没食子儿茶素没食子酸酯对牛冷冻精液品质及受精能力的影响", 《畜牧兽医学报》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109182253A (zh) * 2018-10-19 2019-01-11 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 一种提高卵母细胞体外成熟质量和效率的方法
CN111280163A (zh) * 2020-02-12 2020-06-16 天津博裕力牧科技有限公司 牛活体采卵用的抽卵液及其制备方法和用途
CN111280163B (zh) * 2020-02-12 2021-11-09 天津博裕力牧科技有限公司 牛活体采卵用的抽卵液及其制备方法和用途
CN114847274A (zh) * 2022-04-22 2022-08-05 中国农业大学 一种卵母细胞冷冻保存试剂及其应用
CN117063919A (zh) * 2023-10-13 2023-11-17 北京市农林科学院 吡咯喹啉醌在提高精液冷冻效果中的用途
CN117063919B (zh) * 2023-10-13 2024-01-30 北京市农林科学院 吡咯喹啉醌在提高精液冷冻效果中的用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN108642001B (zh) 2022-09-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108642001A (zh) 一种提高牛性控冻精体外受精能力的方法
Gardner et al. Analysis of oocyte physiology to improve cryopreservation procedures
Massip Cryopreservation of bovine oocytes: current status and recent developments
Yurchuk et al. Science of cryopreservation in reproductive medicine–Embryos and oocytes as exemplars
CN107047539B (zh) 一种调控玻璃化冷冻牛卵母细胞中钙离子浓度的方法
Luciano et al. Effect of different cryopreservation protocols on cytoskeleton and gap junction mediated communication integrity in feline germinal vesicle stage oocytes
Choi et al. Improved low-CPA vitrification of mouse oocytes using quartz microcapillary
Mastromonaco et al. Reproductive technologies for the conservation of wildlife and endangered species
Tavukcuoglu et al. Is vitrification standard method of cryopreservation
An et al. Efficient cryopreservation of mouse embryos by modified droplet vitrification (MDV)
Gupta et al. Effect of cryopreservation technique and season on the survival of in vitro produced cattle embryos
Dhali et al. Effect of droplet vitrification on development competence, actin cytoskeletal integrity and gene expression in in vitro cultured mouse embryos
Griveau et al. Interest of pentoxifylline in ICSI with frozen–thawed testicular spermatozoa from patients with non-obstructive azoospermia
Martinez et al. High pre-freezing sperm dilution improves monospermy without affecting the penetration rate in porcine IVF
KR100666595B1 (ko) 사람 난자의 체외성숙 및 체외수정을 위한연속합성배양액의 조성물 및 이를 이용한 배양방법
Kouamo et al. A comparative study of parthenogenetic activation and in vitro fertilization of in vitro matured caprine oocytes
Li et al. Safety, efficacy and efficiency of laser-assisted IVF in subfertile mutant mouse strains
Gautam et al. Effect of slow freezing on morphology and developmental competence of buffalo (Bubalus bubalis) immature oocytes
Higaki et al. Successful vitrification of whole juvenile testis in the critically endangered cyprinid honmoroko (Gnathopogon caerulescens)
Kim et al. Chapter 4 role of antioxidants and antifreeze proteins in cryopreservation/vitrification
Fryc et al. Morphokinetic changes in vitrified and non-vitrified in vitro-derived ovine embryos
Roozbehi Mouse oocytes and embryos cryotop-vitrification using low concentrated solutions: Effects on meiotic spindle, genetic material array and developmental ability
Yamanaka et al. Cryopreservation and in vitro maturation of germinal vesicle stage oocytes of animals for application in assisted reproductive technology
Ruiz et al. In vitro developmental competence of alpaca (Vicugna pacos) and llama (Lama glama) oocytes after parthenogenetic activation
Pérez-Camps et al. Definition of three somatic adult cell nuclear transplant methods in zebrafish (Danio rerio): before, during and after egg activation by sperm fertilization

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant