CN107227292A - 一种提高牛类胚胎干细胞形成效率及阳性克隆比例的方法 - Google Patents
一种提高牛类胚胎干细胞形成效率及阳性克隆比例的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107227292A CN107227292A CN201710412108.5A CN201710412108A CN107227292A CN 107227292 A CN107227292 A CN 107227292A CN 201710412108 A CN201710412108 A CN 201710412108A CN 107227292 A CN107227292 A CN 107227292A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- stem cell
- liquid
- escs
- nutrient solution
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
- C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供一种提高牛类胚胎干细胞形成效率及阳性克隆比例的方法,其是在牛体外受精胚胎培养液、干细胞培养液中添加10‑11~10‑7M(优选10‑9M)的褪黑素。该方法能够显著提高牛类ESCs克隆生成效率及第10代类ESCs克隆碱性磷酸酶(AP)染色阳性率和表面标记(OCT4和NANOG、SOX2)阳性率,并能够降低第10代类ESCs克隆中OCT4、NANOG、SOX2基因甲基化水平并提高其mRNA表达水平。采用本发明方法可以有效提高牛类ESCs的形成效率及阳性克隆水平。本方法操作简单、成本低,将在牛ESCs研究领域发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及胚胎干细胞体外培养技术,具体地说,涉及一种提高牛类胚胎干细胞形成效率及阳性克隆比例的方法。
背景技术
ESCs是来源于附植前胚胎内细胞团(Inner cell mass,ICM),保持未分化状态并能自我增殖的多能性细胞。ESCs具有分化为机体所有细胞的潜力,可用于早期胚胎发育的研究。自从M.J.Evans等1981年建立了第1个小鼠ESCs,陆续获得了猕猴、人和大鼠的ESCs。在牛上,经过研究人员大量努力,仍无法获得公认的牛ESCs,只获得了牛类 ESCs。其中一个重要的原因就是牛ICM体外培养效率低,获得的类 ESCs克隆假阳性率高。
在小鼠诱导干细胞(iPSCs)研究领域,人们不断发现小分子物质及抗氧化剂在提高iPSCs的形成效率方面有着重要作用。褪黑素 (MT)是一种公认的抗氧化剂,在提高哺乳动物卵母细胞体外成熟、胚胎体外生产效率和成熟过程中发挥越来越重要的作用。目前,关于 MT对牛类ESCs形成效率及阳性克隆比例等方面还缺乏深入细致的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高牛类胚胎干细胞形成效率及阳性克隆比例的方法。
为了实现本发明目的,本发明提供褪黑素在提高牛类胚胎干细胞形成效率及阳性克隆比例中的应用。所述牛类胚胎干细胞来自于牛体外受精胚胎干细胞。
本发明提供的提高牛类胚胎干细胞形成效率及阳性克隆比例的方法,其是在牛体外受精胚胎培养液以及干细胞培养液中全程添加 10-11-10-7M(优选10-9M)褪黑素,进而提高牛类ESCs形成效率及阳性克隆比例。
本发明所述牛体外受精胚胎培养液为含10%FBS的CR1a培养液,所述干细胞培养液为2i/LIF培养液。其它种类的用于牛类胚胎干细胞体外培养技术的牛体外受精胚胎培养液及干细胞培养液,均落入本发明保护范围。
在本发明的一个具体实施方式中,提高牛类胚胎干细胞形成效率及阳性克隆比例的方法包括以下步骤:
1)卵母细胞的收集和体外成熟
从牛卵巢采集直径2-8mm卵泡中卵丘-卵母细胞复合体COCs,选择含有3层及以上颗粒细胞的COCs,用成熟液洗涤3遍后,按50枚 COCs/每孔/500μL成熟培养液放入预平衡2h的四孔板中,于培养箱内在38.5℃、5%CO2和饱和湿度的条件下培养。
其中,所述成熟液配方:TCM199+10μg·mL-1卵泡刺激素+10 μg·mL-1·黄体生成素·+10μg·mL-1雌二醇+10%FBS。
2)体外受精胚胎的生产
COCs体外培养22~24h后,用含有0.1%透明质酸酶的TCM199消化2~3min去除颗粒细胞,挑选具有第一极体且胞质均匀的卵母细胞进行体外受精;将牛冷冻细管精液于37℃水浴解冻后,用7ml洗精液、 500g离心两次,每次5min,精子沉淀用受精液调整精子密度为5×106个/ml;吸取20μl精液加入含有20枚卵母细胞的80μl受精液小滴中(精子终密度为1×106个/ml),于38.5℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中受精18-20h;将受精后的卵母细胞移入含有褪黑素的牛体外受精胚胎培养液的培养小滴中培养,间隔48h半量换液,受精卵体外培养7d后发育到囊胚阶段。
其中,所述洗精液为含有2.5mM咖啡因的BO液;所述受精液配方:BO液+20mg/mlBSA+20μg/ml肝素钠+100IU/ml青霉素钾 +100μg/ml链霉素;所述含有褪黑素的牛体外受精胚胎培养液配方: CR1a培养液+10%FBS+10-11~10-7M褪黑素。
3)囊胚的接种
提前0.5h将培养小滴更换为含有褪黑素的干细胞培养液,然后将培养7d的囊胚接种到饲养层上;置于培养箱内,在38.5℃、5%CO2和饱和湿度的条件下培养,隔天半量更换培养液,待贴壁后可全量换液。
其中,使用的饲养层为经10μg·mL-1丝裂霉素C处理2~3h的第2 代小鼠胎儿成纤维细胞;所述含有褪黑素的干细胞培养液配方:2i/LIF 培养液+10-11~10-7M褪黑素。
4)胚胎内细胞团ICM的分离与传代培养
囊胚培养7~10d后用机械分离法进行第1次传代,具体用注射器的针头(优选1mL注射器的针头)将ICM形成的细胞团块挑出,并分离成较小的细胞团块,转移至新的含有褪黑素的干细胞培养液中;每隔5~7d进行传代,传至第10代。
5)进行AP染色,并在显微镜下观察牛类胚胎干细胞阳性克隆数。
本发明通过在牛体外受精胚胎培养液、ESCs培养液中全程添加 10-9M MT,采用全胚接种结合机械传代法将牛类ESCs体外传至第10 代。MT处理组第10代类ESCs克隆形成效率和AP染色阳性率(7.05个 /囊胚,90.20%)显著高于对照组(3.52个/囊胚,70.59%),MT处理组牛类ESCs中OCT4、NANOG、SOX2的阳性率(93.33%,97.06%, 91.18%)要显著高于对照组(70.97%,71.88%,74.19%);MT处理组牛类ESCs中OCT4、NANOG和SOX2甲基化位点甲基化水平 (8.00%,10.48%,2.08%)要显著低于对照组(20.00%,19.05%, 9.86%),而MT处理组牛类ESCs中OCT4、NANOG、SOX2基因mRNA 水平要显著性高于对照组(P<0.05)。
本发明具有操作简单,成本低等优点,能有效提高牛类ESCs形成效率及阳性克隆比例,对于促进牛ESCs的研究进展,具有重要的理论和实际意义。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中牛体外受精囊胚接种体外培养获得的第10代牛类ESCs显微镜下观察结果;其中,A~F分别为接种后3天的囊胚,接种后4天扩展中的细胞克隆,接种后7天扩展中的细胞克隆,接种后14天的第1代细胞克隆,接种后39天的第5代细胞克隆,接种后 80天的第10代细胞克隆。
图2为本发明较佳实施例中牛第10代ESCs的AP染色结果。
图3为本发明较佳实施例中牛第10代ESCs OCT4、NANOG、SOX2 染色图。
图4为本发明较佳实施例中MT对牛第10代类ESCs OCT4、 NANOG和SOX2mRNA水平的影响。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。若未特别指明,实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段,所用原料均为市售商品。
实施例1提高牛类胚胎干细胞形成效率及阳性克隆比例的方法
1、卵母细胞的收集和体外成熟
从牛卵巢(采自河北大厂)上采集直径2-8mm卵泡中卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus-Oocyte-complexes,COCs),选择含有3层及以上颗粒细胞COCs用成熟液(TCM199+10μg·mL-1FSH+10 μg·mL-1·LH·+10μg·mL-1E2+10%FBS)洗涤3遍后,按50枚COCs/每孔/500μL成熟培养液放入预平衡2h的四孔板中,于二氧化碳培养箱 38.5℃、5%CO2和饱和湿度培养。
2、体外受精胚胎的生产
牛体外受精生产胚胎参照Nedambale等(2004)的方法,略有改动。COCs体外培养22~24h后,用0.1%透明质酸酶TCM199消化2~3min 去除颗粒细胞,挑选具有第一极体且胞质均匀的卵母细胞进行体外受精。奶牛冷冻细管精液(牛号:11101930,北京市奶牛中心)于37℃水浴解冻后,用7ml洗精液(BO液+2.5mM Caffeine)、500g离心两次,每次5min,精子沉淀用受精液(BO液+20mg/ml BSA+20μg/ml肝素钠+100IU/ml青霉素钾+100μg/ml链霉素)调整精子密度为5×106个 /ml。吸取20μl精液加入含有20枚卵母细胞的80μl受精液小滴中(精子终密度为1×106个/ml),38.5℃、5%CO2、饱和湿度二氧化碳培养箱中受精18-20h。将受精后的卵母细胞移入100μl牛体外受精胚胎培养液(CR1a+10%FBS+10-9M褪黑素)培养小滴中培养,间隔48h半量换液,受精卵体外培养7d后统计发育到囊胚阶段。
3、囊胚的接种
饲养层为经10μg·mL-1丝裂霉素C处理2~3h的第2代小鼠胎儿成纤维细胞。提前0.5h将培养小滴更换为含有10-9M MT的ESCs培养液 (2i/LIF),然后将培养7d的IVF囊胚接种到饲养层上。置于培养箱 (38.5℃、5%CO2、饱和湿度)中培养,隔天半量更换培养液,待贴壁后可全量换液。
4、ICM的分离与传代培养
接种7~10d后用机械分离法进行第1次传代,方法是用1mL注射器的针头将ICM形成的细胞团块挑出,并分离为较小的细胞团块,转移至新的饲养层上培养。然后每隔5~7d进行传代,传至第10代。
5、AP染色
利用ES细胞鉴定试剂盒(Millipore,USA﹠Canada)进行AP染色。第10代牛类ESCs采用4%多聚甲醛固定1~2min;弃固定液,1×Rinse buffer冲洗;染色剂(Fast Red VioletSolution:Naphthol:Water=2:1:1) 在室温、黑暗环境下培养ICM克隆15min;弃染色剂,1×Rinse buffer 冲洗;加入1×PBS后在显微镜下观察阳性克隆数。
6、MT对牛类ESCs中OCT4、SOX2、NANOG基因甲基化水平和 mRNA表达水平的影响
(1)甲基化检测:将MT组、对照组第10代牛类ESCs,提取DNA 进行亚硫酸盐处理,检测OCT4(NM_174580.2)、SOX2 (NM_001105463.2)、NANOG(NM_001025344.1)基因甲基化水平。根据Millar et al.(2002)的方法,对提取的DNA采用亚硫酸盐处理。根据OCT4、SOX2、NANOG外显子区域设计PCR引物(表1),PCR产物克隆至pMD 18-T载体后转入TOP10细胞。采用ABI PRISM-77测序仪对每个PCR产物的15个克隆进行测序,进而统计甲基化位点的甲基化情况。
表1OCT4、NANOG、SOX2外显子区域PCR扩增引物
(2)mRNA表达水平检测:采集MT组、对照组牛类ESCs进行 qRT-PCR,检测OCT4、SOX2、NANOG基因mRNA表达水平。采用 PureLinkTM RNA Micro试剂盒(Invitrogen)来提取RNA,具体方法参照操作手册。提取出RNA后进行逆转录。然后进行荧光定量PCR扩增(引物见表2),用β-actin作内参基因。
PCR反应体系为25μL:17.3μL超纯水+2.5μL 10×buffer+2.0 μL镁离子(25mmol·L-1)+0.2μL dNTPs(25mmol·L-1)+0.5μL上游引物(10μmol·L-1)+0.5μL SYBR(20X)+0.5μL下游引物(10μmol·L-1) +0.3μL Taq酶(5U·μL-1)+1.2μL模板(除模板外,均为Invitrogen公司产品)。
PCR反应条件为:95℃预变性2min;95℃变性10s,60℃退火30s,45个循环。每个样品重复3次,荧光定量结果采用2-ΔΔCt (Schmittgen和Livak,2008)法进行分析。
表2OCT4、NANOG、SOX2mRNA检测引物
7、实验设计
实验分为两组,(1)MT组:牛受精卵体外培养液(CR1a+ 10%FBS)及干细胞培养液(2i/LIF)中均添加10-7M、10-9M、10-11 M MT;(2)对照组:牛受精卵体外培养液(CR1a+10%FBS)及干细胞培养液(2i/LIF)中均不添加MT。比较两组牛类ESCs在克隆形成效率、AP和表面标记(OCT4、NANOG、SOX2)阳性率、多能性基因(OCT4、NANOG、SOX2)甲基化及其mRNA表达水平的影响。
8、数据统计
采用SAS软件对实验数据进行分析,百分数比较时经反正旋转化后采用方差分析,结果以平均数依标准差表示,P<0.05为差异显著性标准。各处理组至少重复3次以上。
9、实验结果
(1)MT对牛类ESCs形成效率的影响
牛体外受精囊胚接种及接种后牛类ESCs传代情况见图1和表3。如表3所示,10-9MMT处理组第10代类ESCs克隆形成效率(7.05个/ 囊胚)显著高于对照组(3.52个/囊胚)、10- 7M MT处理组(5.07个/ 囊胚)、10-11M MT处理组(5.48个/囊胚;P<0.05)。
表3MT对牛类ESCs形成效率的影响
a,b,c:不同的上标表示纵列上数值差异显著(P<0.05),以下表格同。
(2)MT对牛类ESCs AP染色结果的影响
对牛第10代类ESCs进行AP染色,阳性克隆呈紫红色(图2)。如表4所示,在牛受精卵、ESCs培养液中添加10-9M MT,能够显著提高第10代类ESCs中AP染色阳性率(90.20%)显著高于10-7M MT处理组(79.73%)、10-11M MT处理组(78.48%)和对照组(70.59%;P<0.05)。
表4MT对牛第10代类ESCs AP染色结果的影响
(3)MT对牛类ESCs OCT4、NANOG、SOX2染色结果的影响
牛第10代类ESCs OCT4、NANOG、SOX2染色图如图3和表5所示。如表5所示,10-9M MT处理组牛类ESCs中OCT4、NANOG、SOX2的阳性率(93.33%、97.06%、91.18%)要显著高于对照组(70.97%、 71.88%、74.19%)、10-7M MT处理组(80.65%、87.88%、81.25%)、 10-11MMT处理组(82.76%、88.57%、84.38%;P<0.05)。
表5MT对牛第10代类ESCs OCT4、NANOG、SOX2染色结果的影响
(4)MT对牛类ESCs中OCT4、NANOG和SOX2基因甲基化及 mRNA表达水平的影响
如表6所示,10-9M MT处理组牛类ESCs中OCT4、NANOG和 SOX2甲基化位点甲基化水平(8.00%、10.48%、2.08%)要显著低于对照组(20.00%、19.05%、9.86%)、10-7M MT处理组(12.97%、14.76%、 7.22%)、10-11M MT处理组(13.94%、15.24%、5.56%;P<0.05)。
如图4所示,10-9M MT处理组牛类ESCs中OCT4、NANOG、SOX2 基因mRNA水平要显著性高于对照组、10-7M MT和10-11M MT处理组 (P<0.05)。
表6MT对牛类OCT4、NANOG和SOX2甲基化位点甲基化水平的影响
由以上实验结果可以得出,与对照组相比,在牛受精卵培养液、干细胞培养液中添加10-9M MT,能够显著性提高牛类ESCs形成效率及AP和表面标记(OCT4、NANOG、SOX2)染色阳性率,并能够降低OCT4、NANOG、SOX2基因甲基化水平及提高其mRNA表达水平。该研究成果将极大促进牛ESCs的研究进展。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之做一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 一种提高牛类胚胎干细胞形成效率及阳性克隆比例的方法
<130> KHP171113423.3
<160> 20
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gagggagagaggtgttgagtagtt 24
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
acgaccccactccaaccta 19
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gatttgtgtggagggatggttta 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
attcccacctaactccaactcaa 23
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aagaagggattgaaggttatttgtt 25
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccatctctaacacaccttaaataaaca 27
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gcgttttgtagttaagtgtattttagt 27
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
accgaccaaacccgaactaa 20
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gtttggtttgattttagttttgga 24
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gtaactcaataaaactatcccactaa 26
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gcgtgtggtgtgatttgttgtt 22
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
actctcttctctaccttaacaactcct 27
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
aaggagaagctggagccgaa 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gcaaagcctcaaaacggcag 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cacatgtcccagcactacca 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
agcgtaccgggtttttctcc 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ccagctgtgtgtgctcaatg 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gctattcctcggccagttgt 20
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tcctgggcatggaatcctg 19
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ggcgcgatgatcttgatct 19
Claims (10)
1.褪黑素在提高牛类胚胎干细胞形成效率及阳性克隆比例中的应用。
2.一种提高牛类胚胎干细胞形成效率及阳性克隆比例的方法,其特征在于,在牛体外受精胚胎培养液以及干细胞培养液中添加10-11-10-7M褪黑素。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,在牛体外受精胚胎培养液以及干细胞培养液中添加10-9M褪黑素。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,所述牛体外受精胚胎培养液为含10%FBS的CR1a培养液,所述干细胞培养液为2i/LIF培养液。
5.根据权利要求2-4任一项所述的方法,其特征在于,包括以下步骤:
1)卵母细胞的收集和体外成熟
从牛卵巢采集直径2-8mm卵泡中卵丘-卵母细胞复合体COCs,选择含有3层及以上颗粒细胞的COCs,用成熟液洗涤3遍后,按50枚COCs/每孔/500μL成熟培养液放入预平衡2h的四孔板中,于培养箱内在38.5℃、5%CO2和饱和湿度的条件下培养;
其中,所述成熟液配方:TCM199+10μg·mL-1卵泡刺激素+10μg·mL-1·黄体生成素·+10μg·mL-1雌二醇+10%FBS;
2)体外受精胚胎的生产
COCs体外培养22~24h后,用含有0.1%透明质酸酶的TCM199消化2~3min去除颗粒细胞,挑选具有第一极体且胞质均匀的卵母细胞进行体外受精;将牛冷冻细管精液于37℃水浴解冻后,用7ml洗精液、500g离心两次,每次5min,精子沉淀用受精液调整精子密度为5×106个/ml;吸取20μl精液加入含有20枚卵母细胞的80μl受精液小滴中,于38.5℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中受精18-20h;将受精后的卵母细胞移入含有褪黑素的牛体外受精胚胎培养液的培养小滴中培养,间隔48h半量换液,受精卵体外培养7d后发育到囊胚阶段;
其中,所述洗精液为含有2.5mM咖啡因的BO液;所述受精液配方:BO液+20mg/ml BSA +20μg/ml肝素钠+100IU/ml青霉素钾+100μg/ml链霉素;所述含有褪黑素的牛体外受精胚胎培养液配方:CR1a培养液+10%FBS+10-11~10-7M褪黑素;
3)囊胚的接种
提前0.5h将培养小滴更换为含有褪黑素的干细胞培养液,然后将培养7d的囊胚接种到饲养层上;置于培养箱内,在38.5℃、5%CO2和饱和湿度的条件下培养,隔天半量更换培养液,待贴壁后可全量换液;
其中,使用的饲养层为经10μg·mL-1丝裂霉素C处理2~3h的第2代小鼠胎儿成纤维细胞;所述含有褪黑素的干细胞培养液配方:2i/LIF培养液+10-11~10-7M褪黑素;
4)胚胎内细胞团ICM的分离与传代培养
囊胚培养7~10d后用机械分离法进行第1次传代,具体用注射器的针头将ICM形成的细胞团块挑出,并分离成较小的细胞团块,转移至新的含有褪黑素的干细胞培养液中培养;然后每隔5~7d进行传代,传至第10代;
5)进行AP染色,并在显微镜下观察牛类胚胎干细胞阳性克隆数。
6.一种牛体外受精胚胎培养液,其特征在于,所述培养液中含有10-11~10-7M的褪黑素。
7.根据权利要求6所述的培养液,其特征在于,所述培养液配方为:CR1a培养液+10%FBS+10-11~10-7M褪黑素;优选CR1a培养液+10%FBS+10-9M褪黑素。
8.一种牛类胚胎干细胞培养液,其特征在于,所述培养液中含有10-11~10-7M的褪黑素。
9.根据权利要求8所述的培养液,其特征在于,所述培养液配方为:2i/LIF培养液+10-11~10-7M褪黑素;优选2i/LIF培养液+10-9M褪黑素。
10.含有权利要求6-9任一项所述培养液的用于提高牛类胚胎干细胞形成效率及阳性克隆比例的试剂盒。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710412108.5A CN107227292A (zh) | 2017-06-02 | 2017-06-02 | 一种提高牛类胚胎干细胞形成效率及阳性克隆比例的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710412108.5A CN107227292A (zh) | 2017-06-02 | 2017-06-02 | 一种提高牛类胚胎干细胞形成效率及阳性克隆比例的方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN107227292A true CN107227292A (zh) | 2017-10-03 |
Family
ID=59934702
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201710412108.5A Pending CN107227292A (zh) | 2017-06-02 | 2017-06-02 | 一种提高牛类胚胎干细胞形成效率及阳性克隆比例的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN107227292A (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108642001A (zh) * | 2018-05-08 | 2018-10-12 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种提高牛性控冻精体外受精能力的方法 |
CN109182253A (zh) * | 2018-10-19 | 2019-01-11 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种提高卵母细胞体外成熟质量和效率的方法 |
CN109294978A (zh) * | 2018-11-10 | 2019-02-01 | 四川农业大学 | 一种提高玻璃化冷冻成熟卵母细胞孤雌发育潜力的方法 |
CN111183955A (zh) * | 2020-01-03 | 2020-05-22 | 中国农业大学 | 通过口服褪黑素来提高妊娠后哺乳动物繁殖性能的方法 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102140435A (zh) * | 2010-11-22 | 2011-08-03 | 广西大学 | 一种提高水牛体外胚胎生产效率的方法 |
CN104312971A (zh) * | 2014-11-04 | 2015-01-28 | 广西大学 | 促进水牛卵母细胞体外成熟的方法 |
-
2017
- 2017-06-02 CN CN201710412108.5A patent/CN107227292A/zh active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102140435A (zh) * | 2010-11-22 | 2011-08-03 | 广西大学 | 一种提高水牛体外胚胎生产效率的方法 |
CN104312971A (zh) * | 2014-11-04 | 2015-01-28 | 广西大学 | 促进水牛卵母细胞体外成熟的方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
GAMAL M. K. MEHAISENM, ET AL: "Antioxidant Capacity of Melatonin on Preimplantation Development of Fresh and Vitrified Rabbit Embryos: Morphological and Molecular Aspects", 《PLOS ONE》 * |
崔莉莎 等: "牛囊胚ICM 克隆多能性标记基因与表面标记的研究", 《畜牧兽医学报》 * |
朱化彬: "奶牛体外胚胎生产技术的研究", 《中国博士学位论文全文数据库,农业科学辑》 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108642001A (zh) * | 2018-05-08 | 2018-10-12 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种提高牛性控冻精体外受精能力的方法 |
CN109182253A (zh) * | 2018-10-19 | 2019-01-11 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 一种提高卵母细胞体外成熟质量和效率的方法 |
CN109294978A (zh) * | 2018-11-10 | 2019-02-01 | 四川农业大学 | 一种提高玻璃化冷冻成熟卵母细胞孤雌发育潜力的方法 |
CN111183955A (zh) * | 2020-01-03 | 2020-05-22 | 中国农业大学 | 通过口服褪黑素来提高妊娠后哺乳动物繁殖性能的方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107227292A (zh) | 一种提高牛类胚胎干细胞形成效率及阳性克隆比例的方法 | |
CN101665781B (zh) | 高滴度猪圆环病毒2型培养细胞、制备方法及其用法 | |
CN103667349B (zh) | 一种高效获取猪诱导性多能干细胞的方法 | |
CN106047800B (zh) | 猪多能干细胞定向诱导分化为雄性生殖细胞的方法及专用培养基 | |
CN108795850A (zh) | 一种精原干细胞体外无饲养层长期培养方法 | |
CN106867961A (zh) | 一种诱导多能干细胞形成中胚层细胞的诱导培养基及诱导方法 | |
CN107227298A (zh) | 一种克隆胚胎处理液及其使用方法以及该处理液的用途 | |
CN105754935B (zh) | 一种诱导成纤维细胞转分化为脂肪细胞的诱导培养基及其应用 | |
Zhong et al. | Efficient generation of gene-modified mice by haploid embryonic stem cell-mediated semi-cloned technology | |
CN108018259B (zh) | 一种维持人胚胎干细胞自我更新状态的培养方法 | |
CN103820383B (zh) | 一种巴马小型猪精原干细胞诱导精子细胞的方法 | |
CN103114075B (zh) | 一种牛滋养层干细胞建系方法 | |
CN112961822A (zh) | 一种睾丸类器官及其构建方法与应用 | |
CN103074297A (zh) | 家畜精原干细胞培养液 | |
CN106399308A (zh) | zfy基因的RNA干扰片段、表达载体及其应用 | |
CN104313164B (zh) | 鉴别棉花D genome和D sub-genome全套染色体的方法 | |
CN102206609A (zh) | 一种卵巢来源雌性生殖干细胞的分离培养方法 | |
CN108715829A (zh) | 一种提高人类体外受精胚胎发育率的方法 | |
CN102174577A (zh) | 一种利用慢病毒载体生产转基因水牛的方法 | |
CN101712985A (zh) | 一种中华鳖dna指纹鉴定方法 | |
CN113652393A (zh) | 一种提高牛胚胎干细胞多能性的方法 | |
CN104855321A (zh) | 一种适用于菲律宾蛤仔的三倍体化学诱导方法 | |
Pligina et al. | Method of cytogenetic assay of mouse oocytes | |
CN109182253A (zh) | 一种提高卵母细胞体外成熟质量和效率的方法 | |
CN108251377A (zh) | 利用携带Xist Tale抑制性转录因子R6的R6-MEF制备饲养层细胞的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20171003 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |