CN108018259B

CN108018259B - 一种维持人胚胎干细胞自我更新状态的培养方法

Info

Publication number: CN108018259B
Application number: CN201711223223.4A
Authority: CN
Inventors: 叶守东; 尤宇
Original assignee: Anhui University
Current assignee: Anhui University
Priority date: 2017-11-29
Filing date: 2017-11-29
Publication date: 2019-11-22
Anticipated expiration: 2037-11-29
Also published as: CN108018259A

Abstract

本发明公开了一种维持人胚胎干细胞自我更新状态的培养方法，包括人的胚胎干细胞在本发明培养条件下的传代和培养，以及对本发明条件下培养的人的胚胎干细胞自我更新状态进行观察与检测。本发明方法通过添加Wnt/β‑catenin信号通路的抑制剂解决了目前传统培养条件下人胚胎干细胞状态易分化、传代操作复杂、培养条件成本高和不利于后续机制研究等问题，具有效果稳定、经济高效、操作简单、便于研究等优点，同时也为改善和建立其他种类和物种的多能干细胞的培养条件提供线索，对于未来干细胞基础与应用研究的顺利开展具有积极的推动作用。

Description

一种维持人胚胎干细胞自我更新状态的培养方法

技术领域

本发明涉及人的胚胎干细胞的培养条件，尤其是涉及一种维持人胚胎干细胞自我更新状态的培养方法。

背景技术

干细胞是一种具有自我更新的多潜能细胞，它从早期胚胎中分离，并且能在体外培养条件下能存活且具有无限增殖(自我更新)的能力，同时还保持着分化为机体各种类型细胞的潜能(分化)，现已成为研究基因功能、筛选药物和制造疾病动物模型的强有力工具之一，在再生医学领域具有巨大的应用前景。小鼠胚胎干细胞(mouse Embryonic StemCells，mESCs)，这是第一株在体外成功建立的干细胞系。其后在1998年，“干细胞之父”Thomson首次建成人类的ESC系。小鼠与人ESCs虽然拥有一些共同的特征，但二者的生物学特性却有诸多不同之处。小鼠的ESC体外培养可以在体外直接使用含胎牛血清(FBS)和白血病抑制因子(LIF)的培养基进行培养，人的ESCs因为不能直接使用小鼠的培养条件，所以一般接种于饲养层细胞上，培养加含血清替代物(KSR)以及细胞因子Activin A和bFGF的培养基中，其中饲养层细胞可以用基质胶Matrigel代替，传代时需要手动切割，以团块的形式进行培养。这种条件培养的人胚胎干细胞的方法不仅耗时、费力，且传代后的细胞存活力低、容易分化很不稳定，经常在传时易凋亡、易分化，易污染，对操作人员的要求较高，不利于目前人胚胎干细胞的基础研究，同时也阻碍了应用研究对于人胚胎干细胞数量的要求，故改善人的胚胎干细胞在体外的培养条件目前成为亟待解决的问题之一，也成为一个研究热点，具有重要的科研价值与学术意义，相关成果有助于未来对于干细胞的安全应用。

虽然传统的Activin A+bFGF培养条件可以维持人的ESCs的生长与自我更新状态，但由于经过多次传代之后，细胞易分化，自我更新能力减弱，不利于后续对于细胞内相关信号通路与分子机制的深入探究以及应用研究。为了优化人的胚胎干细胞的培养条件，安徽大学干细胞与转化医学研究中心的叶守东博士利用CTK消化液实现了人胚胎干细胞的快速消化传代，同时通过一个小分子化合物库，筛选出Wnt/β-catenin信号通路的多种小分子抑制剂(IWR1，XAV939,JW55和53AH)均能够有效地提高人胚胎干细胞的自我更新能力。最终，人胚胎干细胞可被快速进行消化处理，存活能力显著提高，克隆形态均一，生长状况良好，多次传代后仍维持在均一的未分化状态。

因此，本发明在基于Activin A+bFGF培养条件础上，通过添加小分子化合物IWR1，进一步改进与优化了人胚胎干细胞的生长条件，优化后的条件使用三种小分子即可在体外长期稳定地维持人胚胎干细胞的自我更新状态，具有省时、省力、省钱，利于人胚胎干细胞后续的基础和应用研究。

发明内容

为了解决传统培养条件中出现的人胚胎干细胞状态不稳定、传代操作不方便以及现有培养条件成本高和不利于后续探究等问题，本发明提供了一种维持人胚胎干细胞自我更新状态的培养方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种维持人胚胎干细胞自我更新状态的培养方法，包括以下步骤：

(1)人的胚胎干细胞HES2或H9(Human Embryonic Stem Cell,hESCs)的获取；实验中所使用的人的胚胎干细胞由美国南加州大学应其龙教授提供；

(2)人的胚胎干细胞在Activin A+bFGF+IWR1条件下的传代和培养：

a、取一个6孔细胞培养板，每孔用1.8-2.1ml DMEM+8-12μl Matrigel包板，置于35-38℃、4.5-5.5％CO₂浓度的细胞培养箱内，包被3.8-4.2小时；

b、取生长至70-80％密度的人的胚胎干细胞，弃培养液，用PBS洗涤细胞1次，以除去细胞表面残留的培养液；

c、加入0.9-1.1ml CTK消化胚胎干细胞，6.5-7.5min，细胞边缘浮起，弃CTK，加1.6-2.4ml含9-12％FBS的常规细胞培养液，用移液器吹打，将细胞从培养板上吹打下来，然后转移至15ml无菌离心管中；

d、转速1100-1300rpm，离心3.5-4.5min后，吸去上清；

e、加1.8-2.2ml含9.6-10.2％KSR的N2B27重悬细胞；

其中，5ml N2B27含1.875ml DMEM/F12,0.25ml N2,1.875ml Neurobasal medium,0.5ml B27,2mM L-glutamine,0.1mMβ-mercaptoethanol；

f、在显微镜下利用血球计数板对悬液中的细胞进行计数，并以此计算出细胞的密度；

g、取步骤a已包被好的培养皿，弃包板溶液，向培养板每孔内加入1.8-2.2mlN2B27+KSR培养基；

h、向培养基中加入3.8×10⁴-4.1×10⁴个细胞，水平十字形晃动，使细胞均匀分布；

i、依次添加3.9-4.2μM IWR1、4.9-5.2ng Activin A和4.9-5.2ng bFGF，水平十字形晃动，使其混合均匀，为实验组；

同时设置两组培养条件作为对照：对照组A只加等量Activin A和bFGF；对照组B不加外源性因子；

j、将细胞培养皿置于35-38℃、4-6％CO₂浓度的细胞培养箱内培养，即可。

其中，所述CTK消化胚胎干细胞含0.09-0.12％Collagenase IV+0.24-0.26％Trypsin+19-21％KSR+0.9-1.1mM CaCl₂的PBS。

其中，人胚胎干细胞自我更新与细胞特性检测方法如下：

(1)形态观察：使用Leica DMIL倒置相差显微镜对Activin A+bFGF+IWR1条件下、不同培养天数的人的胚胎干细胞进行观察，以细胞形态特征进行检测，发现细胞逐渐形成扁平的单层或多层形态，细胞之间堆积紧密，集落边界清晰，符合自我更新的形态特征；

将细胞多次传代后，观察不同代数细胞的培养形态：实验组人胚胎干细胞保持自我更新的特征；对照组A细胞出现部分分化；对照组B细胞全部分化。

(2)AP染色检测细胞自我更新情况，具体方法如下：

在实验组、对照组A与对照组B细胞传代培养5代后进行AP染色；

a、首先配置染色剂，将一个8523R胶囊(SIGMA-ALDRICH)溶入48ml的水中放在3-5℃避光保存，取适量，将其与SLBJ6060V(SIGMA-ALDRICH)按25:1的比例充分混合成染色剂；

b、将不同培养条件下培养好的干细胞，弃培养液，加PBS洗一遍，加0.9-1.2ml的3.8-4.2％多聚甲醛固定细胞1.5-2.5分钟；

c、弃多聚甲醛，加PBS洗两遍，把多聚甲醛残留洗掉，每个培养孔2ml的染色剂，避光静置38-43分钟；

d、弃染色液，用PBS洗两遍，加适量PBS后放在Leica DMIL倒置相差显微镜观察拍照，观察的着色状态，判断细胞的自我更新状态；

观察的着色状态，可以观察到对照组B细胞无色，说明已经分化，实验组细胞和对照组A细胞被染成红色，符合自我更新的特征。

(3)免疫荧光染色检测自我更新标志蛋白TRA-1-81和Oct4的表达，具体方法如下：

a、将实验组与对照组A、B细胞传代培养5代后，弃培养液，用PBS漂洗细胞1次，加入3.8-4.2％浓度的多聚甲醛，室温固定18-22min；

b、弃多聚甲醛，用PBS漂洗细胞1次，分别加入含4.5-5.5％浓度牛血清白蛋白、0.15-0.22％浓度Triton X-100的PBS封闭液、含4.5-5.5％浓度牛血清白蛋白的PBS封闭液，用于分别检测Oct4、TRA-81基因表达情况，将细胞置于36-38℃温箱，孵育0.9-1.2h；

c、弃封闭液，用PBS漂洗细胞1次，而后分别加入含有TRA-81(1:200,Santa Cruz)一抗的稀释液、含有Oct4(1:200,Santa Cruz)一抗的稀释液，3-5℃过夜；

d、次日，弃一抗，用PBS漂洗细胞3次，每4.5-5.5min洗一次，而后分别加入携带有488荧光基团的二抗(1:1000，碧云天)以及Hoechs(1：5000，Invitrogen)染料的稀释液，用锡箔纸包住培养板，36-38℃避光孵育0.9-1.2h；

e、弃二抗稀释液，用PBS漂洗细胞3次，每2.5-3.5min洗一次，而后在LeicaDMI3000B型倒置荧光显微镜下观察并拍照，检测细胞的自我更新状态；

其中，Oct4蛋白一抗为鼠来源，TRA-81蛋白一抗为鼠来源，二抗均为带488荧光基团的羊抗鼠抗体，在荧光显微镜下观察时呈现绿色荧光；同时Hoechst染料可以对细胞核进行染色，荧光显微镜下呈现蓝色荧光；

免疫荧光结果显示，添加细胞外源性因子的实验组细胞、对照组A细胞均高表达TRA-1-81和Oct4，说明细胞处于自我更新的状态，而对照组B细胞已经分化；

其中，所述(3)步骤c中，稀释液是指含4.8-5.3％浓度牛血清白蛋白、0.18-0.22％浓度Triton X-100、0.9-1.1％浓度N₃Na的PBS。

其中，所述(3)步骤d中，稀释液是指含4.5-5.5％浓度牛血清白蛋白的PBS。

(4)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测自我更新标志基因Nanog、Oct4和Prdm14以及细胞分化标志基因Mixl1、Gata6和Gata4的表达水平，具体方法如下：

取生长至70-80％密度的实验组与对照组A、B细胞，采用Trizol法抽提细胞总RNA，具体方法如下：

弃培养液，用PBS洗涤细胞2次，加入500μl Trizol裂解细胞，用移液器反复吹打2min后，转移至1.5ml离心管中；

向离心管中加入100μl三氯甲烷，用力摇晃15s，静置2min后4℃离心10min，12000rpm；

将上清吸取到另一个干净的离心管中，注意不要吸到中间层；按1:1的比例向上清中加入异丙醇，轻摇使之混匀，静置10min后4℃离心10min；

离心后可在管底看到少量白色沉淀，弃上清，向离心管中加入1ml 75％浓度的乙醇，上下倒转、摇晃、轻弹；

4℃离心5min，弃上清，加入1ml 75％浓度的乙醇，4℃离心5min后，弃上清，将离心管倒立于干净的吸水纸上，待管底的白色沉淀变透明后，加入40-50μl ddH2O，置于4℃或-20℃保存；

获得待测细胞的总RNA后，利用TransScript All-in-One First-Strand cDNASynthesis SuperMix for qPCR(TransGen Biotech,China)试剂盒，完成人胚胎干细胞cDNA的合成；

以合成好的cDNA为模板，参照TransStart Tip Green qPCR SuperMix(TransGenBiotech,China)试剂盒，在Thermo PikoReal 96实时荧光定量PCR仪上进行基因表达水平的检测：

以GAPDH为内参基因，各引物序列如下：

qRT-PCR结果显示，与对照组A、B相比，实验组条件Activin A+bFGF+IWR1培养的人胚胎干细胞相较于对照组A、B条件(即Activin A+bFGF和不添加细胞因子组)培养的细胞相比，实验组培养的细胞表达的Nanog、Oct4以及Prdm14明显高于对照组，而Mixl1、Gata6和Gata4三种基因表达量明显低于对照组，说明在转录水平上，实验组细胞处于更稳定的自我更新状态。

本发明具有如下优点：

(1)本发明采用Matrigel包板，在培养基N2B27+KSR中加入Activin A+bFGF+IWR1三种小分子化合物来培养人胚胎干细胞，在此种培养条件下，细胞生长情况良好，能够维持自我更新的状态，经过多次传代，均未出现分化现象。

(2)与现有的Activin A+bFGF培养条件相比，本发明能更长久保持干细胞的自我更新能力，使干细胞能在体外长时间培养，有利于人胚胎干细胞未来的基础和应用研究。

(3)本发明多摸索出来的培养条件，比传统培养条件(饲养层细胞培养)，更经济省时，易于操作。

(4)本发明所摸索出的培养条件，为改善目前人的胚胎干细胞以及其他种类和物种的多能性干细胞的培养条件提供线索。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中，ActivinA+bFGF+IWR1条件下培养的细胞，记为ABI；Activin A+bFGF条件下培养的细胞，记为AB；不添加外源性因子的细胞，记为None；

图1为三种条件下培养5代以后的HES2人胚胎干细胞在相差显微镜下的形态图；其中ABI细胞处于自我更新状态，AB细胞符合自我更新状态的特征，None细胞处于分化状态；

图2为三种条件下培养5代后的人胚胎干细胞AP染色图；其中未被分化的细胞染成红色，而分化的细胞不着色；

图3为三种条件下培养5代后的人胚胎干细胞免疫荧光染色图；在荧光显微镜下观察时，Oct4与TRA-1-81蛋白呈现绿色荧光，Hoechst染料用来显示细胞核的位置，呈现蓝色荧光；

图4为三种条件下培养5代后人胚胎干细胞中自我更新标志基因以及特性基因相对表达量的直方图；

图5为实施例1培养的HES2人胚胎干细胞在相差显微镜下的形态图；

图6为实施例1实验组与对照组B培养人胚胎干细胞免疫荧光染色图；

图7为实施例1实验组与对照组B培养人胚胎干细胞中自我更新标志基因以及特性基因相对表达量的直方图。

具体实施方式

实施例1

(1)HES2人胚胎干细胞(Human Embryonic Stem Cell,hESCs)由美国南加州大学应其龙教授提供；

(2)HES2人胚胎干细胞在Activin A+BFGF+IWR1条件下的传代和培养：

a、取一个6孔细胞培养板，每孔用2ml DMEM+10μl Matrigel包板，置于37℃、5％CO₂浓度的细胞培养箱内，包被4小时；

c、加入1ml CTK，消化胚胎干细胞，7min左右，细胞边缘浮起，弃CTK,加2ml含10％FBS的常规细胞培养液，用移液器吹打，将细胞从培养板上吹打下来，然后转移至15ml无菌离心管中；

d、1200rpm，离心4min后，吸去上清；

e、加2ml含10％KSR的N2B27培养液重悬细胞；

j、取步骤a已包被好的培养皿，弃包板溶液，向培养板每孔内加入2ml N2B27/KSR培养基；

h、向培养基中加入5×10⁴个细胞，水平十字形晃动，使细胞均匀分布，为实验组；

同时设置对照组B不加外源性因子；

i、依次添加4μM IWR1、5ng Activin A和5ng bFGF，水平十字形晃动，使其混合均匀。

j、将细胞培养皿置于37℃、5％CO₂浓度的细胞培养箱内培养。

(3)自我更新与细胞特性检测

1)形态观察：使用Leica DMIL倒置相差显微镜对Activin A+bFGF+IWR1条件下、传代5代后的人胚胎干细胞进行观察，发现细胞逐渐形成扁平的单层形态，细胞之间堆积紧密，集落边界清晰，符合自我更新的形态特征，如附图5所示。

2)免疫荧光染色检测:

将实验组与对照组B细胞传代培养5代后，弃培养液，用PBS漂洗细胞1次，加入4％浓度的多聚甲醛，室温固定20min；

b、弃多聚甲醛，用PBS漂洗细胞1次，加入含5％浓度牛血清白蛋白、0.2％浓度Triton X-100的PBS封闭液，将细胞置于37℃温箱，孵育1h；

c、弃封闭液，用PBS漂洗细胞1次，而后分别加入含有TRA-81(1:200,Santa Cruz)一抗的稀释液、含有Oct4(1:200,Santa Cruz)一抗的稀释液，4℃过夜；

d、次日，弃一抗，用PBS漂洗细胞3次，每5min洗一次，而后分别加入携带有488荧光基团的二抗(1:1000，碧云天)以及Hoechst(1：5000,Invitrogen)染料的稀释液，用锡箔纸包住培养板，37℃避光孵育1h；

e、弃二抗稀释液，用PBS漂洗细胞3次，在Leica DMI3000B型倒置荧光显微镜下观察并拍照，结果如附图6所示。

3)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)：

利用Primer3Plus网站设计Nanog、Oct4、Prdm14、Mixl1、Gata6、Gata4及GAPDH七种基因的引物序列，其中，Nanog、Oct4和Prdm14为自我更新标志基因，Mixl1、Gata6和Gata4为细胞分化标志基因，GAPDH作为内参基因；引物设计完成后交由上海生工公司进行合成；

待实验组与对照组B细胞生长到80％覆盖密度后，采用Trizol法分别抽提每组细胞的总RNA；

以每组细胞的总RNA为模板，利用TransScript All-in-One First-Strand cDNASynthesis SuperMix for qPCR(TransGen Biotech)试剂盒，将总RNA逆转录成cDNA；分别将cDNA与各引物稀释到所需浓度，依照TransStart Tip Green qPCR SuperMix(TransGenBiotech)试剂盒说明书提供的反应体系与扩增程序，在Thermo PikoReal 96实时荧光定量PCR仪上进行相关操作；

反应完成后，利用与荧光定量PCR仪配套的Piko Real Software 2.2软件，查看并导出熔解曲线、Ct值等关键参数；

以对照组细胞中相应基因的表达量为参照值“1”，根据Ct值等参数信息、利用GraphPad Prism 5绘图软件绘制各基因相对表达量的直方图，如附图7所示。qRT-PCR结果显示，与对照组B相比，实验组中Nanog、Oct4以及Prdm14三种自我更新标志基因表达水平更高，实验组Mixl1、Gata6和Gata4三种分化标志基因表达水平更低，说明在转录水平上，Activin A+bFGF+IWR1条件下培养5代后人的胚胎干细胞处于更稳定的未分化状态。

序列表

<110> 安徽大学

<120> 一种维持人胚胎干细胞自我更新状态的培养方法

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 882

<212> DNA

<213> GAPDH

<400> 1

atggtttaca tgttccaata tgattccacc catggcaaat tccatggcac cgtcaaggct 60

gagaacggga agcttgtcat caatggaaat cccatcacca tcttccagga gcgagatccc 120

tccaaaatca agtggggcga tgctggcgct gagtacgtcg tggagtccac tggcgtcttc 180

accaccatgg agaaggctgg ggctcatttg caggggggag ccaaaagggt catcatctct 240

gccccctctg ctgatgcccc catgttcgtc atgggtgtga accatgagaa gtatgacaac 300

agcctcaaga tcatcagcaa tgcctcctgc accaccaact gcttagcacc cctggccaag 360

gtcatccatg acaactttgg tatcgtggaa ggactcatga ccacagtcca tgccatcact 420

gccacccaga agactgtgga tggcccctcc gggaaactgt ggcgtgatgg ccgcggggct 480

ctccagaaca tcatccctgc ctctactggc gctgccaagg ctgtgggcaa ggtcatccct 540

gagctgaacg ggaagctcac tggcatggcc ttccgtgtcc ccactgccaa cgtgtcagtg 600

gtggacctga cctgccgtct agaaaaacct gccaaatatg atgacatcaa gaaggtggtg 660

aagcaggcgt cggagggccc cctcaagggc atcctgggct acactgagca ccaggtggtc 720

tcctctgact tcaacagcga cacccactcc tccacctttg acgctggggc tggcattgcc 780

ctcaacgacc actttgtcaa gctcatttcc tggtatgaca acgaatttgg ctacagcaac 840

agggtggtgg acctcatggc ccacatggcc tccaaggagt aa 882

<210> 2

<211> 292

<212> PRT

<213> GAPDH

<400> 2

Met Val Tyr Met Phe Gln Tyr Asp Ser Thr His Gly Lys Phe His Gly

1 5 10 15

Thr Val Lys Ala Glu Asn Gly Lys Leu Val Ile Asn Gly Asn Pro Ile

20 25 30

Thr Ile Phe Gln Glu Arg Asp Pro Ser Lys Ile Lys Trp Gly Asp Ala

35 40 45

Gly Ala Glu Tyr Val Val Glu Ser Thr Gly Val Phe Thr Thr Met Glu

50 55 60

Lys Ala Gly Ala His Leu Gln Gly Gly Ala Lys Arg Ile Ile Ser Ala

65 70 75 80

Pro Ser Ala Asp Ala Pro Met Phe Val Met Gly Val Asn His Glu Lys

85 90 95

Tyr Asp Asn Ser Leu Lys Ile Ile Ser Asn Ala Ser Cys Thr Thr Asn

100 105 110

Cys Leu Ala Pro Leu Ala Lys Val Ile His Asp Asn Phe Gly Ile Val

115 120 125

Glu Gly Leu Met Thr Thr Val His Ala Ile Thr Ala Thr Gln Lys Thr

130 135 140

Val Asp Gly Pro Ser Gly Lys Leu Trp Arg Asp Gly Arg Gly Ala Leu

145 150 155 160

Gln Asn Ile Ile Pro Ala Ser Thr Gly Ala Ala Lys Ala Val Gly Lys

165 170 175

Val Ile Pro Glu Leu Asn Gly Lys Leu Thr Gly Met Ala Phe Arg Val

180 185 190

Pro Thr Ala Asn Val Ser Val Val Asp Leu Thr Cys Arg Leu Glu Lys

195 200 205

Pro Ala Lys Tyr Asp Asp Ile Lys Lys Val Val Lys Gln Ala Ser Glu

210 215 220

Gly Pro Leu Lys Gly Ile Leu Gly Tyr Thr Glu His Gln Val Val Ser

225 230 235 240

Ser Asp Phe Asn Ser Asp Thr His Ser Ser Thr Phe Asp Ala Gly Ala

245 250 255

Gly Ile Ala Leu Asn Asp His Phe Val Lys Leu Ile Ser Trp Tyr Asp

260 265 270

Asn Glu Phe Gly Tyr Ser Asn Arg Val Val Asp Leu Met Ala His Met

275 280 285

Ala Ser Lys Glu

290

<210> 1

<211> 870

<212> DNA

<213> Nanog

<400> 1

atgagtgtgg atccagcttg tccccaaagc ttgccttgct ttgaagcatc cgactgtaaa 60

gaatcttcac ctatgcctgt gatttgtggg cctgaagaaa actatccatc cttgcaaatg 120

tcttctgctg agatgcctca cacggagact gtctctcctc ttccttcctc catggatctg 180

cttattcagg acagccctga ttcttccacc agtcccaaag gcaaacaacc cacttctgca 240

gagaagagtg tcgcaaaaaa ggaagacaag gtcccggtca agaaacagaa gaccagaact 300

gtgttctctt ccacccagct gtgtgtactc aatgatagat ttcagagaca gaaatacctc 360

agcctccagc agatgcaaga actctccaac atcctgaacc tcagctacaa acaggtgaag 420

acctggttcc agaaccagag aatgaaatct aagaggtggc agaaaaacaa ctggccgaag 480

aatagcaatg gtgtgacgca gggatgcctg gtgaacccga ctgggaacct tccaatgtgg 540

agcaaccaga cctggaacaa ttcaacctgg agcaaccaga cccagaacat ccagtcctgg 600

agcaaccact cctggaacac tcagacctgg tgcacccaat cctggaacaa tcaggcctgg 660

aacagtccct tctataactg tggagaggaa tctctgcagt cctgcatgca gttccagcca 720

aattctcctg ccagtgactt ggaggctgcc ttggaagctg ctggggaagg ccttaatgta 780

atacagcaga ccactaggta ttttagtact ccacaaacca tggatttatt cctaaactac 840

tccatgaaca tgcaacctga agacgtgtga 870

<210> 2

<211> 289

<212> PRT

<213> Nanog

<400> 2

Met Ser Val Asp Pro Ala Cys Pro Gln Ser Leu Pro Cys Phe Glu Ala

1 5 10 15

Ser Asp Cys Lys Glu Ser Ser Pro Met Pro Val Ile Cys Gly Pro Glu

20 25 30

Glu Asn Tyr Pro Ser Leu Gln Met Ser Ser Ala Glu Met Pro His Thr

35 40 45

Glu Thr Val Ser Pro Leu Pro Ser Ser Met Asp Leu Leu Ile Gln Asp

50 55 60

Ser Pro Asp Ser Ser Thr Ser Pro Lys Gly Lys Gln Pro Thr Ser Ala

65 70 75 80

Glu Lys Ser Val Ala Lys Lys Glu Asp Lys Val Pro Val Lys Lys Gln

85 90 95

Lys Thr Arg Thr Val Phe Ser Ser Thr Gln Leu Cys Val Leu Asn Asp

100 105 110

Arg Phe Gln Arg Gln Lys Tyr Leu Ser Leu Gln Gln Met Gln Glu Leu

115 120 125

Ser Asn Ile Leu Asn Leu Ser Tyr Lys Gln Val Lys Thr Trp Phe Gln

130 135 140

Asn Gln Arg Met Lys Ser Lys Arg Trp Gln Lys Asn Asn Trp Pro Lys

145 150 155 160

Asn Ser Asn Gly Val Thr Gln Gly Cys Leu Val Asn Pro Thr Gly Asn

165 170 175

Leu Pro Met Trp Ser Asn Gln Thr Trp Asn Asn Ser Thr Trp Ser Asn

180 185 190

Gln Thr Gln Asn Ile Gln Ser Trp Ser Asn His Ser Trp Asn Thr Gln

195 200 205

Thr Trp Cys Thr Gln Ser Trp Asn Asn Gln Ala Trp Asn Ser Pro Phe

210 215 220

Tyr Asn Cys Gly Glu Glu Ser Leu Gln Ser Cys Met Gln Phe Gln Pro

225 230 235 240

Asn Ser Pro Ala Ser Asp Leu Glu Ala Ala Leu Glu Ala Ala Gly Glu

245 250 255

Gly Leu Asn Val Ile Gln Gln Thr Thr Arg Tyr Phe Ser Thr Pro Gln

260 265 270

Thr Met Asp Leu Phe Leu Asn Tyr Ser Met Asn Met Gln Pro Glu Asp

275 280 285

Val

<210> 1

<211> 573

<212> DNA

<213> Oct4

<400> 1

ctgggggttc tatttgggaa ggtattcagc caaacgacca tctgccgctt tgaggctctg 60

cagcttagct tcaagaacat gtgtaagctg cggcccttgc tgcagaagtg ggtggaggaa 120

gctgacaaca atgaaaatct tcaggagata tgcaaagcag aaaccctcgt gcaggcccga 180

aagagaaagc gaaccagtat cgagaaccga gtgagaggca acctggagaa tttgttcctg 240

cagtgcccga aacccacact gcagcagatc agccacatcg cccagcagct tgggctcgag 300

aaggatgtgg tccgagtgtg gttctgtaac cggcgccaga agggcaagcg atcaagcagc 360

gactatgcac aacgagagga ttttgaggct gctgggtctc ctttctcagg gggaccagtg 420

tcctttcctc tggccccagg gccccatttt ggtaccccag gctatgggag ccctcacttc 480

actgcactgt actcctcggt ccctttccct gagggggaag cctttccccc tgtctccgtc 540

accactctgg gctctcccat gcattcaaac tga 573

<210> 2

<211> 190

<212> PRT

<213> Oct4

<400> 2

Met Gly Val Leu Phe Gly Lys Val Phe Ser Gln Thr Thr Ile Cys Arg

1 5 10 15

Phe Glu Ala Leu Gln Leu Ser Phe Lys Asn Met Cys Lys Leu Arg Pro

20 25 30

Leu Leu Gln Lys Trp Val Glu Glu Ala Asp Asn Asn Glu Asn Leu Gln

35 40 45

Glu Ile Cys Lys Ala Glu Thr Leu Val Gln Ala Arg Lys Arg Lys Arg

50 55 60

Thr Ser Ile Glu Asn Arg Val Arg Gly Asn Leu Glu Asn Leu Phe Leu

65 70 75 80

Gln Cys Pro Lys Pro Thr Leu Gln Gln Ile Ser His Ile Ala Gln Gln

85 90 95

Leu Gly Leu Glu Lys Asp Val Val Arg Val Trp Phe Cys Asn Arg Arg

100 105 110

Gln Lys Gly Lys Arg Ser Ser Ser Asp Tyr Ala Gln Arg Glu Asp Phe

115 120 125

Glu Ala Ala Gly Ser Pro Phe Ser Gly Gly Pro Val Ser Phe Pro Leu

130 135 140

Ala Pro Gly Pro His Phe Gly Thr Pro Gly Tyr Gly Ser Pro His Phe

145 150 155 160

Thr Ala Leu Tyr Ser Ser Val Pro Phe Pro Glu Gly Glu Ala Phe Pro

165 170 175

Pro Val Ser Val Thr Thr Leu Gly Ser Pro Met His Ser Asn

180 185 190

<210> 1

<211> 1716

<212> DNA

<213> Prdm14

<400> 1

atggctctac cccggccaag tgaggccgtg cctcaggaca aggtgtgcta cccgccggag 60

agcagcccgc agaacctggc cgcgtactac acgcctttcc cgtcctatgg acactacaga 120

aacagcctgg ccaccgtgga ggaagacttc caacctttcc ggcagctgga ggccgcagcg 180

tctgctgccc ccgccatgcc ccccttcccc ttccggatgg cgcctccctt gctgagcccg 240

ggtctgggcc tacagaggga gcctctctac gatctgccct ggtacagcaa gctgccaccg 300

tggtacccaa ttccccacgt ccccagggaa gtgccgccct tcctgagcag cagccacgag 360

tacgcgggtg ccagcagtga agatctgggc caccaaatca ttggtggcga caacgagagt 420

ggcccgtgtt gtggacctga cactttaatt ccaccgcccc ctgcggatgc ttctctgtta 480

cctgaggggc tgaggacctc ccagttatta ccttgctcac ccagcaagca gtcagaggat 540

ggtcccaaac cctccaacca agaagggaag tcccctgctc ggttccagtt cacggaggag 600

gacctgcact tcgttctgta cggggtcact cccagcctgg agcacccagc cagcctgcac 660

catgcgattt caggcctcct ggtcccccca gacagctctg gatctgattc tcttcctcaa 720

actctggata aagactccct tcaacttcca gaaggtctat gcctcatgca gacggtgttt 780

ggtgaagtcc cacattttgg tgtgttctgc agtagtttta tcgccaaagg agtcaggttt 840

gggccctttc aaggtaaagt ggtcaatgcc agtgaagtga agacctacgg agacaattct 900

gtgatgtggg agatctttga agatggtcat ttgagccact ttatagatgg aaaaggaggt 960

acggggaact ggatgtccta tgtcaactgt gcccgcttcc ccaaggagca gaacctagtt 1020

gctgtgcagt gtcaagggca tatattttat gagagctgca aagagatcca tcagaaccaa 1080

gagctccttg tgtggtatgg agactgctat gagaaatttc tggatattcc tgtgagcctt 1140

caggtcacag agccggggaa gcagccatct gggccctctg aagagtctgc agaaggctac 1200

agatgtgaaa gatgtgggaa ggtatttacc tacaaatatt acagagataa gcacctcaag 1260

tacaccccct gtgtggacaa gggcgatagg aaatttccct gttctctctg caaacgatcc 1320

tttgagaagc gggaccggct tcggatccac attcttcatg ttcatgagaa gcaccggcct 1380

cacaagtgtt ctacatgtgg gaaatgtttc tctcaatctt ccagcctaaa caaacacatg 1440

cgagtccact ctggagacag accataccag tgtgtgtatt gtactaagag gttcacagcc 1500

tccagcatac tccgcacaca catcaggcag cactccgggg agaagccctt caaatgcaag 1560

tactgtggta aatcttttgc atcccatgct gcccatgaca gccatgtccg gcgttcacac 1620

aaggaggatg atggctgctc atgcagcatc tgtgggaaaa tcttctcaga tcaagaaaca 1680

ttctactccc acatgaagtt tcatgaagac tactag 1716

<210> 2

<211> 571

<212> PRT

<213> Prdm14

<400> 2

Met Ala Leu Pro Arg Pro Ser Glu Ala Val Pro Gln Asp Lys Val Cys

1 5 10 15

Tyr Pro Pro Glu Ser Ser Pro Gln Asn Leu Ala Ala Tyr Tyr Thr Pro

20 25 30

Phe Pro Ser Tyr Gly His Tyr Arg Asn Ser Leu Ala Thr Val Glu Glu

35 40 45

Asp Phe Gln Pro Phe Arg Gln Leu Glu Ala Ala Ala Ser Ala Ala Pro

50 55 60

Ala Met Pro Pro Phe Pro Phe Arg Met Ala Pro Pro Leu Leu Ser Pro

65 70 75 80

Gly Leu Gly Leu Gln Arg Glu Pro Leu Tyr Asp Leu Pro Trp Tyr Ser

85 90 95

Lys Leu Pro Pro Trp Tyr Pro Ile Pro His Val Pro Arg Glu Val Pro

100 105 110

Pro Phe Leu Ser Ser Ser His Glu Tyr Ala Gly Ala Ser Ser Glu Asp

115 120 125

Leu Gly His Gln Ile Ile Gly Gly Asp Asn Glu Ser Gly Pro Cys Cys

130 135 140

Gly Pro Asp Thr Leu Ile Pro Pro Pro Pro Ala Asp Ala Ser Leu Leu

145 150 155 160

Pro Glu Gly Leu Arg Thr Ser Gln Leu Leu Pro Cys Ser Pro Ser Lys

165 170 175

Gln Ser Glu Asp Gly Pro Lys Pro Ser Asn Gln Glu Gly Lys Ser Pro

180 185 190

Ala Arg Phe Gln Phe Thr Glu Glu Asp Leu His Phe Val Leu Tyr Gly

195 200 205

Val Thr Pro Ser Leu Glu His Pro Ala Ser Leu His His Ala Ile Ser

210 215 220

Gly Leu Leu Val Pro Pro Asp Ser Ser Gly Ser Asp Ser Leu Pro Gln

225 230 235 240

Thr Leu Asp Lys Asp Ser Leu Gln Leu Pro Glu Gly Leu Cys Leu Met

245 250 255

Gln Thr Val Phe Gly Glu Val Pro His Phe Gly Val Phe Cys Ser Ser

260 265 270

Phe Ile Ala Lys Gly Val Arg Phe Gly Pro Phe Gln Gly Lys Val Val

275 280 285

Asn Ala Ser Glu Val Lys Thr Tyr Gly Asp Asn Ser Val Met Trp Glu

290 295 300

Ile Phe Glu Asp Gly His Leu Ser His Phe Ile Asp Gly Lys Gly Gly

305 310 315 320

Thr Gly Asn Trp Met Ser Tyr Val Asn Cys Ala Arg Phe Pro Lys Glu

325 330 335

Gln Asn Leu Val Ala Val Gln Cys Gln Gly His Ile Phe Tyr Glu Ser

340 345 350

Cys Lys Glu Ile His Gln Asn Gln Glu Leu Leu Val Trp Tyr Gly Asp

355 360 365

Cys Tyr Glu Lys Phe Leu Asp Ile Pro Val Ser Leu Gln Val Thr Glu

370 375 380

Pro Gly Lys Gln Pro Ser Gly Pro Ser Glu Glu Ser Ala Glu Gly Tyr

385 390 395 400

Arg Cys Glu Arg Cys Gly Lys Val Phe Thr Tyr Lys Tyr Tyr Arg Asp

405 410 415

Lys His Leu Lys Tyr Thr Pro Cys Val Asp Lys Gly Asp Arg Lys Phe

420 425 430

Pro Cys Ser Leu Cys Lys Arg Ser Phe Glu Lys Arg Asp Arg Leu Arg

435 440 445

Ile His Ile Leu His Val His Glu Lys His Arg Pro His Lys Cys Ser

450 455 460

Thr Cys Gly Lys Cys Phe Ser Gln Ser Ser Ser Leu Asn Lys His Met

465 470 475 480

Arg Val His Ser Gly Asp Arg Pro Tyr Gln Cys Val Tyr Cys Thr Lys

485 490 495

Arg Phe Thr Ala Ser Ser Ile Leu Arg Thr His Ile Arg Gln His Ser

500 505 510

Gly Glu Lys Pro Phe Lys Cys Lys Tyr Cys Gly Lys Ser Phe Ala Ser

515 520 525

His Ala Ala His Asp Ser His Val Arg Arg Ser His Lys Glu Asp Asp

530 535 540

Gly Cys Ser Cys Ser Ile Cys Gly Lys Ile Phe Ser Asp Gln Glu Thr

545 550 555 560

Phe Tyr Ser His Met Lys Phe His Glu Asp Tyr

565 570

<210> 1

<211> 723

<212> DNA

<213> Mixl1

<400> 1

atggccacag ccgagtcccg tgcgctccag tttgccgagg gcgccgcgtt tccagcgtac 60

cgggcccccc acgccggcgg ggcgctcctg ccgcccccga gccctgcggc agccctgctc 120

cctgcgccgc ccgcgggccc cggcccagcg acctttgcgg gcttcctcgg ccgggacccc 180

gggccggccc cgccgccccc cgccagcctg ggctcgcctg cgccccccaa aggcgcggcc 240

gccccgtcgg cgtcgcagcg ccgcaagcgc acgtctttca gcgccgaaca gctgcagctg 300

ctggagctcg tcttccgccg gacccggtac cccgacatcc acttgcgcga gcgcctggcc 360

gcgctcaccc tgctccccga gtccaggatc cagcttttat tttctcccct cttccaggta 420

tggttccaga acaggcgtgc caagtctcgg cgtcagagtg ggaaatcctt ccaacctttg 480

gctaggccgg agattatcct caaccactgt gctcctggaa ctgaaacgaa atgtctgaag 540

ccccagctgc ctcttgaggt agatgtgaac tgcctgcccg aaccaaacgg ggttggaggg 600

ggcatctctg actctagctc ccaaggtcag aattttgaaa cctgttcccc tctctctgaa 660

gacattggtt caaagctgga ctcatgggag gaacacatct tttctgcctt tggtaacttt 720

tga 723

<210> 2

<211> 240

<212> PRT

<213> Mixl1

<400> 2

Met Ala Thr Ala Glu Ser Arg Ala Leu Gln Phe Ala Glu Gly Ala Ala

1 5 10 15

Phe Pro Ala Tyr Arg Ala Pro His Ala Gly Gly Ala Leu Leu Pro Pro

20 25 30

Pro Ser Pro Ala Ala Ala Leu Leu Pro Ala Pro Pro Ala Gly Pro Gly

35 40 45

Pro Ala Thr Phe Ala Gly Phe Leu Gly Arg Asp Pro Gly Pro Ala Pro

50 55 60

Pro Pro Pro Ala Ser Leu Gly Ser Pro Ala Pro Pro Lys Gly Ala Ala

65 70 75 80

Ala Pro Ser Ala Ser Gln Arg Arg Lys Arg Thr Ser Phe Ser Ala Glu

85 90 95

Gln Leu Gln Leu Leu Glu Leu Val Phe Arg Arg Thr Arg Tyr Pro Asp

100 105 110

Ile His Leu Arg Glu Arg Leu Ala Ala Leu Thr Leu Leu Pro Glu Ser

115 120 125

Arg Ile Gln Leu Leu Phe Ser Pro Leu Phe Gln Val Trp Phe Gln Asn

130 135 140

Arg Arg Ala Lys Ser Arg Arg Gln Ser Gly Lys Ser Phe Gln Pro Leu

145 150 155 160

Ala Arg Pro Glu Ile Ile Leu Asn His Cys Ala Pro Gly Thr Glu Thr

165 170 175

Lys Cys Leu Lys Pro Gln Leu Pro Leu Glu Val Asp Val Asn Cys Leu

180 185 190

Pro Glu Pro Asn Gly Val Gly Gly Gly Ile Ser Asp Ser Ser Ser Gln

195 200 205

Gly Gln Asn Phe Glu Thr Cys Ser Pro Leu Ser Glu Asp Ile Gly Ser

210 215 220

Lys Leu Asp Ser Trp Glu Glu His Ile Phe Ser Ala Phe Gly Asn Phe

225 230 235 240

<210> 1

<211> 1788

<212> DNA

<213> Gata6

<400> 1

atggccttga ctgacggcgg ctggtgcttg ccgaagcgct tcggggccgc gggtgcggac 60

gccagcgact ccagagcctt tccagcgcgg gagccctcca cgccgccttc ccccatctct 120

tcctcgtcct cctcctgctc ccggggcgga gagcggggcc ccggcggcgc cagcaactgc 180

gggacgcctc agctcgacac ggaggcggcg gccggacccc cggcccgctc gctgctgctc 240

agttcctacg cttcgcatcc cttcggggct ccccacggac cttcggcgcc tggggtcgcg 300

ggccccgggg gcaacctgtc gagctgggag gacttgctgc tgttcactga cctcgaccaa 360

gccgcgaccg ccagcaagct gctgtggtcc agccgcggcg ccaagctgag ccccttcgca 420

cccgagcagc cggaggagat gtaccagacc ctcgccgctc tctccagcca gggtccggcc 480

gcctacgacg gcgcgcccgg cggcttcgtg cactctgcgg ccgcggcggc agcagccgcg 540

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ctaccgtacc acctgcaggg gtcgggcagt gggccagcca accacgcggg cggcgcgggc 660

gcgcaccccg gctggcctca ggcctcggcc gacagccctc catacggcag cggaggcggc 720

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gcgcgcttcc cctactctcc cagcccgccc atggccaacg gcgccgcgcg ggagccggga 840

ggctacgcgg cggcgggcag tgggggcgcg ggaggcgtga gcggcggcgg cagtagcctg 900

gcggccatgg gcggccgcga gccccagtac agctcgctgt cggccgcgcg gccgctgaac 960

gggacgtacc accaccacca ccaccaccac caccaccatc cgagccccta ctcgccctac 1020

gtgggggcgc cactgacgcc tgcctggccc gccggaccct tcgagacccc ggtgctgcac 1080

agcctgcaga gccgcgccgg agccccgctc ccggtgcccc ggggtcccag tgcagacctg 1140

ctggaggacc tgtccgagag ccgcgagtgc gtgaactgcg gctccatcca gacgccgctg 1200

tggcggcggg acggcaccgg ccactacctg tgcaacgcct gcgggctcta cagcaagatg 1260

aacggcctca gccggcccct catcaagccg cagaagcgcg tgccttcatc acggcggctt 1320

ggattgtcct gtgccaactg tcacaccaca actaccacct tatggcgcag aaacgccgag 1380

ggtgaacccg tgtgcaatgc ttgtggactc tacatgaaac tccatggggt gcccagacca 1440

cttgctatga aaaaagaggg aattcaaacc aggaaacgaa aacctaagaa cataaataaa 1500

tcaaagactt gctctggtaa tagcaataat tccattccca tgactccaac ttccacctct 1560

tctaactcag atgattgcag caaaaatact tcccccacaa cacaacctac agcctcaggg 1620

gcgggtgccc cggtgatgac tggtgcggga gagagcacca atcccgagaa cagcgagctc 1680

aagtattcgg gtcaagatgg gctctacata ggcgtcagtc tcgcctcgcc ggccgaagtc 1740

acgtcctccg tgcgaccgga ttcctggtgc gccctggccc tggcctga 1788

<210> 2

<211> 595

<212> PRT

<213> Gata6

<400> 2

Met Ala Leu Thr Asp Gly Gly Trp Cys Leu Pro Lys Arg Phe Gly Ala

1 5 10 15

Ala Gly Ala Asp Ala Ser Asp Ser Arg Ala Phe Pro Ala Arg Glu Pro

20 25 30

Ser Thr Pro Pro Ser Pro Ile Ser Ser Ser Ser Ser Ser Cys Ser Arg

35 40 45

Gly Gly Glu Arg Gly Pro Gly Gly Ala Ser Asn Cys Gly Thr Pro Gln

50 55 60

Leu Asp Thr Glu Ala Ala Ala Gly Pro Pro Ala Arg Ser Leu Leu Leu

65 70 75 80

Ser Ser Tyr Ala Ser His Pro Phe Gly Ala Pro His Gly Pro Ser Ala

85 90 95

Pro Gly Val Ala Gly Pro Gly Gly Asn Leu Ser Ser Trp Glu Asp Leu

100 105 110

Leu Leu Phe Thr Asp Leu Asp Gln Ala Ala Thr Ala Ser Lys Leu Leu

115 120 125

Trp Ser Ser Arg Gly Ala Lys Leu Ser Pro Phe Ala Pro Glu Gln Pro

130 135 140

Glu Glu Met Tyr Gln Thr Leu Ala Ala Leu Ser Ser Gln Gly Pro Ala

145 150 155 160

Ala Tyr Asp Gly Ala Pro Gly Gly Phe Val His Ser Ala Ala Ala Ala

165 170 175

Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Ser Pro Val Tyr Val Pro Thr Thr

180 185 190

Arg Val Gly Ser Met Leu Pro Gly Leu Pro Tyr His Leu Gln Gly Ser

195 200 205

Gly Ser Gly Pro Ala Asn His Ala Gly Gly Ala Gly Ala His Pro Gly

210 215 220

Trp Pro Gln Ala Ser Ala Asp Ser Pro Pro Tyr Gly Ser Gly Gly Gly

225 230 235 240

Ala Ala Gly Gly Gly Ala Ala Gly Pro Gly Gly Ala Gly Ser Ala Ala

245 250 255

Ala His Val Ser Ala Arg Phe Pro Tyr Ser Pro Ser Pro Pro Met Ala

260 265 270

Asn Gly Ala Ala Arg Glu Pro Gly Gly Tyr Ala Ala Ala Gly Ser Gly

275 280 285

Gly Ala Gly Gly Val Ser Gly Gly Gly Ser Ser Leu Ala Ala Met Gly

290 295 300

Gly Arg Glu Pro Gln Tyr Ser Ser Leu Ser Ala Ala Arg Pro Leu Asn

305 310 315 320

Gly Thr Tyr His His His His His His His His His His Pro Ser Pro

325 330 335

Tyr Ser Pro Tyr Val Gly Ala Pro Leu Thr Pro Ala Trp Pro Ala Gly

340 345 350

Pro Phe Glu Thr Pro Val Leu His Ser Leu Gln Ser Arg Ala Gly Ala

355 360 365

Pro Leu Pro Val Pro Arg Gly Pro Ser Ala Asp Leu Leu Glu Asp Leu

370 375 380

Ser Glu Ser Arg Glu Cys Val Asn Cys Gly Ser Ile Gln Thr Pro Leu

385 390 395 400

Trp Arg Arg Asp Gly Thr Gly His Tyr Leu Cys Asn Ala Cys Gly Leu

405 410 415

Tyr Ser Lys Met Asn Gly Leu Ser Arg Pro Leu Ile Lys Pro Gln Lys

420 425 430

Arg Val Pro Ser Ser Arg Arg Leu Gly Leu Ser Cys Ala Asn Cys His

435 440 445

Thr Thr Thr Thr Thr Leu Trp Arg Arg Asn Ala Glu Gly Glu Pro Val

450 455 460

Cys Asn Ala Cys Gly Leu Tyr Met Lys Leu His Gly Val Pro Arg Pro

465 470 475 480

Leu Ala Met Lys Lys Glu Gly Ile Gln Thr Arg Lys Arg Lys Pro Lys

485 490 495

Asn Ile Asn Lys Ser Lys Thr Cys Ser Gly Asn Ser Asn Asn Ser Ile

500 505 510

Pro Met Thr Pro Thr Ser Thr Ser Ser Asn Ser Asp Asp Cys Ser Lys

515 520 525

Asn Thr Ser Pro Thr Thr Gln Pro Thr Ala Ser Gly Ala Gly Ala Pro

530 535 540

Val Met Thr Gly Ala Gly Glu Ser Thr Asn Pro Glu Asn Ser Glu Leu

545 550 555 560

Lys Tyr Ser Gly Gln Asp Gly Leu Tyr Ile Gly Val Ser Leu Ala Ser

565 570 575

Pro Ala Glu Val Thr Ser Ser Val Arg Pro Asp Ser Trp Cys Ala Leu

580 585 590

Ala Leu Ala

595

<210> 1

<211> 1332

<212> DNA

<213> Gata4

<400> 1

atgtatcaga gcttggccat ggccgccaac cacgggccgc cccccggtgc ctacgaggcg 60

ggcggccccg gcgccttcat gcacggcgcg ggcgccgcgt cctcgccagt ctacgtgccc 120

acaccgcggg tgccctcctc cgtgctgggc ctgtcctacc tccagggcgg aggcgcgggc 180

tctgcgtccg gaggcgcctc gggcggcagc tccggtgggg ccgcgtctgg tgcggggccc 240

gggacccagc agggcagccc gggatggagc caggcgggag ccgacggagc cgcttacacc 300

ccgccgccgg tgtcgccgcg cttctccttc ccggggacca ccgggtccct ggcggccgcc 360

gccgccgctg ccgcggcccg ggaagctgcg gcctacagca gtggcggcgg agcggcgggt 420

gcgggcctgg cgggccgcga gcagtacggg cgcgccggct tcgcgggctc ctactccagc 480

ccctacccgg cttacatggc cgacgtgggc gcgtcctggg ccgcagccgc cgccgcctcc 540

gccggcccct tcgacagccc ggtcctgcac agcctgcccg gccgggccaa cccggccgcc 600

cgacacccca atctcgtaga tatgtttgac gacttctcag aaggcagaga gtgtgtcaac 660

tgtggggcta tgtccacccc gctctggagg cgagatggga cgggtcacta tctgtgcaac 720

gcctgcggcc tctaccacaa gatgaacggc atcaaccggc cgctcatcaa gcctcagcgc 780

cggctgtccg cctcccgccg agtgggcctc tcctgtgcca actgccagac caccaccacc 840

acgctgtggc gccgcaatgc ggagggcgag cctgtgtgca atgcctgcgg cctctacatg 900

aagctccacg gggtccccag gcctcttgca atgcggaaag aggggatcca aaccagaaaa 960

cggaagccca agaacctgaa taaatctaag acaccagcag ctccttcagg cagtgagagc 1020

cttcctcccg ccagcggtgc ttccagcaac tccagcaacg ccaccaccag cagcagcgag 1080

gagatgcgtc ccatcaagac ggagcctggc ctgtcatctc actacgggca cagcagctcc 1140

gtgtcccaga cgttctcagt cagtgcgatg tctggccatg ggccctccat ccaccctgtc 1200

ctctcggccc tgaagctctc cccacaaggc tatgcgtctc ccgtcagcca gtctccacag 1260

accagctcca agcaggactc ttggaacagc ctggtcttgg ccgacagtca cggggacata 1320

atcactgcgt aa 1332

<210> 14

<211> 443

<212> PRT

<213> Gata4

<400> 14

Met Tyr Gln Ser Leu Ala Met Ala Ala Asn His Gly Pro Pro Pro Gly

1 5 10 15

Ala Tyr Glu Ala Gly Gly Pro Gly Ala Phe Met His Gly Ala Gly Ala

20 25 30

Ala Ser Ser Pro Val Tyr Val Pro Thr Pro Arg Val Pro Ser Ser Val

35 40 45

Leu Gly Leu Ser Tyr Leu Gln Gly Gly Gly Ala Gly Ser Ala Ser Gly

50 55 60

Gly Ala Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ala Ala Ser Gly Ala Gly Pro

65 70 75 80

Gly Thr Gln Gln Gly Ser Pro Gly Trp Ser Gln Ala Gly Ala Asp Gly

85 90 95

Ala Ala Tyr Thr Pro Pro Pro Val Ser Pro Arg Phe Ser Phe Pro Gly

100 105 110

Thr Thr Gly Ser Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Arg Glu

115 120 125

Ala Ala Ala Tyr Ser Ser Gly Gly Gly Ala Ala Gly Ala Gly Leu Ala

130 135 140

Gly Arg Glu Gln Tyr Gly Arg Ala Gly Phe Ala Gly Ser Tyr Ser Ser

145 150 155 160

Pro Tyr Pro Ala Tyr Met Ala Asp Val Gly Ala Ser Trp Ala Ala Ala

165 170 175

Ala Ala Ala Ser Ala Gly Pro Phe Asp Ser Pro Val Leu His Ser Leu

180 185 190

Pro Gly Arg Ala Asn Pro Ala Ala Arg His Pro Asn Leu Val Asp Met

195 200 205

Phe Asp Asp Phe Ser Glu Gly Arg Glu Cys Val Asn Cys Gly Ala Met

210 215 220

Ser Thr Pro Leu Trp Arg Arg Asp Gly Thr Gly His Tyr Leu Cys Asn

225 230 235 240

Ala Cys Gly Leu Tyr His Lys Met Asn Gly Ile Asn Arg Pro Leu Ile

245 250 255

Lys Pro Gln Arg Arg Leu Ser Ala Ser Arg Arg Val Gly Leu Ser Cys

260 265 270

Ala Asn Cys Gln Thr Thr Thr Thr Thr Leu Trp Arg Arg Asn Ala Glu

275 280 285

Gly Glu Pro Val Cys Asn Ala Cys Gly Leu Tyr Met Lys Leu His Gly

290 295 300

Val Pro Arg Pro Leu Ala Met Arg Lys Glu Gly Ile Gln Thr Arg Lys

305 310 315 320

Arg Lys Pro Lys Asn Leu Asn Lys Ser Lys Thr Pro Ala Ala Pro Ser

325 330 335

Gly Ser Glu Ser Leu Pro Pro Ala Ser Gly Ala Ser Ser Asn Ser Ser

340 345 350

Asn Ala Thr Thr Ser Ser Ser Glu Glu Met Arg Pro Ile Lys Thr Glu

355 360 365

Pro Gly Leu Ser Ser His Tyr Gly His Ser Ser Ser Val Ser Gln Thr

370 375 380

Phe Ser Val Ser Ala Met Ser Gly His Gly Pro Ser Ile His Pro Val

385 390 395 400

Leu Ser Ala Leu Lys Leu Ser Pro Gln Gly Tyr Ala Ser Pro Val Ser

405 410 415

Gln Ser Pro Gln Thr Ser Ser Lys Gln Asp Ser Trp Asn Ser Leu Val

420 425 430

Leu Ala Asp Ser His Gly Asp Ile Ile Thr Ala

435 440

Claims

1.一种维持人胚胎干细胞自我更新状态的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）人的胚胎干细胞HES2或H9的获取；

（2）人的胚胎干细胞HES2或H9在Activin A+bFGF+IWR1条件下的传代和培养：

a、取一个6 孔细胞培养板，每孔用1.8-2.1ml DMEM+8-12µl Matrigel包板，置于35-38℃、4.5-5.5% CO₂浓度的细胞培养箱内，包被3.8-4.2小时；

b、取生长至70-80% 密度的人的胚胎干细胞，弃培养液，用PBS洗涤细胞1次，以除去细胞表面残留的培养液；

c、加入0.9-1.1ml CTK消化胚胎干细胞，6.5-7.5min，细胞边缘浮起，弃CTK，加1.6-2.4ml含9-12%FBS的常规细胞培养液，用移液器吹打，将细胞从培养板上吹打下来，然后转移至15ml无菌离心管中；

d、转速1100-1300 rpm，离心3.5-4.5min后，吸去上清；

e、加1.8-2.2ml含9.6-10.2%KSR的N2B27重悬细胞；

其中，5ml N2B27含1.875ml DMEM/F12,0.25ml N2,1.875ml Neurobasal培养基,0.5ml B27, 2 mM L-谷氨酰胺, 0.1 mM β-巯基乙醇；

g、取步骤a已包被好的培养皿，弃包板溶液，向培养板每孔内加入1.8-2.2 ml N2B27+KSR培养基；

i、依次添加3.9-4.2μM IWR1、4.9-5.2 ng Activin A和4.9-5.2 ng bFGF，水平十字形晃动，使其混合均匀，为实验组；

j、将细胞培养皿置于35-38℃、4-6% CO₂浓度的细胞培养箱内培养，即可。

2.根据权利要求1所述的一种维持人胚胎干细胞自我更新状态的培养方法，其特征在于，所述消化胚胎干细胞的CTK含0.09-0.12% 胶原酶IV+0.24-0.26% 胰蛋白酶+19-21%KSR+0.9-1.1 mM CaCl₂的PBS。