CN101892155B - 一种羊水/绒毛膜细胞原位培养专用培养装置及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种羊水/绒毛膜细胞原位培养专用培养装置，由培养槽、玻片和培养盖组成，在培养槽中设置加液孔，方便加液和换液操作，不会影响已贴壁细胞的生长，在培养槽底部设置2个支撑条，既起到了抗震的作用，又方便取用。本发明实现了直接将羊水/绒毛膜细胞接种在玻片上，一张玻片可形成多个克隆，后续分析也是直接在克隆原位置进行。有效地解决了以往培养瓶方法集中收获细胞而不能区分开嵌合体来源于哪个克隆细胞群的问题，由于每个克隆的细胞各自分开，可计数有几个克隆有异常染色体，几个克隆是正常染色体，从而能排除离体培养中个别细胞的染色体变异并能准确地计算嵌合比例，解决了嵌合体难判断的难题。

Description

一种羊水/绒毛膜细胞原位培养专用培养装置及应用

技术领域

本发明属细胞培养技术领域，涉及羊水/绒毛膜细胞原位培养皿，具体涉及一种用于产前诊断中为羊水/绒毛膜细胞培养提供无菌环境的培养装置。

背景技术

羊水/绒毛膜细胞培养及染色体制备分析是产前诊断胎儿先天畸形、遗传性疾病最常用的方法，是染色体病产前诊断的主要手段。羊水内的细胞大部分为羊膜上皮及胎儿脱落上皮，后者来自胎儿的皮肤(包括汗腺及皮脂腺)、口腔粘膜、部分消化道、尿道和生殖道，此外也有来自喉头及气管的内胚层上皮。这些细胞脱落在羊水内后，根据有活力细胞的比例决定能否培养生长。由于羊水细胞培养一直存在技术要求高、难度大、培养时间长、易污染、分裂相较少等问题，许多单位仍未能开展羊水产前诊断工作。近10年来，世界各地对羊水细胞的培养及其在染色体制片上虽不断有所改进，但羊水细胞培养与制片仍有一定难度。

发明内容

本发明的目的是提供一种羊水/绒毛膜细胞原位培养专用培养装置，该培养装置由培养槽、玻片和培养盖组成，其中，在培养槽中设置了加液孔，方便加液和换液操作，不会影响已贴壁细胞的生长，在培养槽底部设置了2个支撑条，既起到了抗震的作用，又方便取用。

其中玻片表面经常规处理处理(如硅化处理、多聚赖氨酸处理、胶原蛋白处理等常规处理)，适合细胞黏附生长。整个装置用塑封包装后经钴60灭菌处理以达到无菌。

本装置室温保存。

本发明的另一个目的是提供所述装置在羊水/绒毛膜细胞原位培养中应用。

本发明羊水/绒毛膜细胞原位培养皿使用方法：

细胞原位培养程序：

1.接种：取1ml含培养基的羊水/绒毛膜细胞悬液轻轻滴到培养槽内的玻片上。

2.放37℃，含5％二氧化碳气体浓度的培养箱中培养，避免机械性的不平衡。3.6-12小时后添加入4ml新鲜的培养基。

4.换液：接种后第6天，吸弃培养槽内的培养液，加5ml新鲜的培养基。

5.第7或第8天在倒置显微镜下视细胞生长情况加秋水仙素或秋水仙胺终止培养。

6.放37℃，含5％二氧化碳气体浓度的培养箱中继续培养60-90分钟。

染色体制片程序：

1.完全吸弃培养槽内的培养液。

2.低渗处理：加6ml低渗液，在室温下放置10分钟。

3.预固定：在培养槽中加入2ml新鲜配制的固定液(甲醇∶醋酸＝3∶1体积)，室温下放置2-3分钟。

4.固定：吸弃培养槽内的液体，加入6ml固定液，室温下放置5分钟。

5.重复步骤2次。

6.取出玻片，快速过火10-15次。

7.玻片放80℃烤箱1.5～2小时，G显带(18秒-20秒)、染色(3-5分)。

8.显微镜下核型分析。

本培养皿细胞培养技术的基本原理：直接将羊水/绒毛膜细胞接种在玻片上，等细胞贴壁生长成多个克隆，而后在玻片上加秋水仙素，低渗，固定及分带染色，最后直接在显微镜下进行核型分析。

本发明的有益之处是：实现了直接将羊水/绒毛膜细胞接种在玻片上，一张玻片可形成多个克隆，后续分析可直接在克隆原位置进行；有效地解决了以往培养瓶方法集中收获细胞而不能区分开嵌合体来源于哪个克隆细胞群的问题；由于每个克隆的细胞各自分开，可以计数有几个克隆有异常染色体，几个克隆是正常染色体，从而能排除离体培养中个别细胞的染色体变异并能准确地计算嵌合比例，解决了嵌合体难判断的难题。本发明装置设计合理，操作简便，是一种无菌环境的培养装置，实现了直接在玻片上进行羊水/绒毛膜细胞原位培养和核型分析的方法。

附图说明

图1为本发明的结构示意图。

图2是21三体患者核型谱图。

图3是13三体患者核型谱图。

图4是特纳氏综合征患者核型谱图。

图5是正常人核型谱图。

具体实施方式

本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。

实施例1

参见图1，该培养装置由培养盖1、培养槽2和玻片3组成，其中，在培养槽2中设置了加液孔2a，方便加液和换液操作，不会影响已贴壁细胞的生长，在培养槽2底部设置了2个支撑条4a和4b，既起到了抗震的作用，又方便取用。

其中玻片3经表面处理(硅化处理是通过在玻片上形成硅氧共价键，增加细胞在玻片上的黏附性，胶原蛋白或多聚赖氨酸等处理的原理是通过在玻片表面涂染这类物质后利于羊水细胞等贴壁，阻止细胞随意游动)，适合细胞黏附生长。整个装置用塑封包装后经钴60灭菌处理以达到无菌。

本装置室温保存。

实施例2

应用本培养装置对2000余例羊水/绒毛膜标本进行细胞培养及核型分析。累计检测出唐氏综合症(21三体)胎儿1例，Patau综合症(13三体)胎儿1例，特纳氏综合征(X，0)胎儿1例。唐氏综合症、Patau综合症、特纳综合征及正常胎儿的核型分析图谱结果分别参见图2、3、4、5。

试剂材料：实施例所描述细胞原位培养皿；

标本：浙江省妇幼保健院产前门诊的羊水/绒毛膜标本；

检测方法：

细胞培养

1.羊水标本(约15-20ml)等分到2个离心管，1000转/分钟速度离心10分钟。

2.弃上清液，每个离心管保留细胞悬液约0.5ml，依据沉淀大小估计补加入培养基后混匀(每个离心管可加不同厂家培养基)。

3.准备几个培养皿，编号后备用。将细胞悬液平分到几个培养皿中(1ml/培养皿)；将培养皿放入37℃二氧化碳培养箱静置培养。

4.第二天在每个培养皿中各加入4ml培养基，放37℃二氧化碳培养箱继续静置培养。

5.4～5天后，观察细胞贴壁生长状况(有大小克隆5-6片即可换液)，先吸弃培养皿内的培养液，再加入5ml预热到37℃的培养基。

6.1天后视细胞的生长状况(细胞克隆数多于5个，每个克隆群的细胞数量大于50个)，往培养皿中加入秋水仙素收获细胞。

染色体制备

1.吸弃培养皿内的培养液。

2.每个培养皿加6ml低渗液，室温放置10分钟。

3.加2ml固定液预固定，室温放置2-3分钟。

4.弃去培养皿内的液体，加6ml固定液固定，室温放置10分钟。

5.重复固定2次。

6.弃固定液，用尖头镊子从培养皿中取出玻片，快速过火10-15次；

7.在玻片上标记姓名、病例编号，80度烤玻片1.5～2小时，G显带(18秒-20秒)、染色(3-5分)、阅片

本发明是结合羊水/绒毛膜细胞原位培养皿进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (2)

1.一种羊水/绒毛膜细胞原位培养专用培养装置，由培养盖（1）、培养槽（2）和玻片（3）组成，其中，在培养槽（2）中设置加液孔（2a），在培养槽（2）底部设置左支撑条（4a）和右支撑条（4b）；所述玻片（3）表面经硅化处理、多聚赖氨酸处理或胶原蛋白处理；整个装置用塑封包装后经钴60灭菌处理。

2.根据权利要求1所述的一种羊水/绒毛膜细胞原位培养专用培养装置在原位培养羊水/绒毛膜细胞中的应用。

Images