CN113355364A - 利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及动物克隆与胚胎工程技术领域，尤其涉及胚胎早期发育技术领域，具体涉及利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法。本发明利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法包括以下步骤：利用显微注射技术，向动物成熟卵母细胞中导入外源RNA；制备重构胚；体外培养所得的重构胚过程中，瞬时表达目的蛋白。本发明的方法能在早期胚胎发育过程中有效表达外源蛋白，又可避免原核注射DNA造成外源基因在供体细胞核基因组上的整合，为研究早期重构胚发育关键基因功能提供一种技术路径。
Description
技术领域
本发明涉及动物克隆与胚胎工程技术领域，尤其涉及胚胎早期发育技术领域，具体涉及利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法。
背景技术
动物克隆是一种通过动物胚胎或体细胞核移植过程进行无性繁殖的技术。尤其自1996年通过体细胞核移植技术克隆出“多莉”羊以来，科研人员已制备了20多个物种的克隆动物，这为濒危动物资源保存、家养动物优异个体扩繁以及生物医学工程应用提供了广泛应用方向。猪是最为重要的农业动物之一，也是非常有价值的生物医学材料和人类疾病研究模型，使得克隆猪在农业、生物医学方向应用极为广泛前景。2005年，我国第一头自主完成的克隆猪在河北省三河市诞生，我国因此成为第7个拥有自主克隆猪能力的国家。
体细胞克隆技术已发展了20多年，主流的克隆胚重构技术包括传统克隆和手工克隆，传统克隆通常是指利用显微操作的方法，将供体细胞核注入预先去核的成熟卵母细胞内，经融合激活发育成新的重构胚；手工克隆技术是在体视显微镜下用特制的刀具将两个受体成熟卵母细胞核直接切除，再将供体细胞与其融合，经激活后发育成新的重构胚。手工克隆技术凭借其更低的成本和更高的效率得以快速、批量生产克隆动物，具备更广阔的产业化前景。尽管动物克隆在多个领域里取得一定的成果，但克隆产业化仍然受制于某些技术的瓶颈。例如，体细胞克隆猪，克隆胚胎移植到代孕母体后，仅有1％左右的重构胚会发育到个体。而影响了克隆成功率的重要因素之一便是重构胚发育成为囊胚效率和囊胚质量低下。所以，克服囊胚率低下在克隆产业中尤为关键。目前研究并未指出影响囊胚率低下的关键基因。现有技术采用显微注射法直接在克隆胚胎形成重构胚胎后，或者在受精卵中注射mRNA，该法可以产生瞬时表达目的蛋白，但是胚胎成活率很低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法。
根据本发明具体实施方式的利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法，包括以下步骤：
(1)利用显微注射技术，向动物成熟卵母细胞中导入外源RNA；
(2)制备重构胚；
(3)体外培养步骤(2)所得的重构胚过程中，瞬时表达目的蛋白。
根据本发明具体实施方式的利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法，步骤(1)，包括以下步骤：
(1-1)从动物的卵巢中分离获取未成熟的卵母细胞；
(1-2)成熟培养卵母细胞；
(1-3)将培养好的卵母细胞收集到含有透明质酸酶消化液中，去掉卵丘层细胞，在体视显微镜下挑选胞质均匀、排出第一极体的成熟卵母细胞置于含有细胞松他素B的显微注射液液滴中，每个液滴为20μL，放置成熟卵母细胞10-20枚/滴，且覆盖石蜡油；
(1-4)将外源RNA注入卵母细胞中。
其中，可提供卵母细胞的动物包括猪、羊、牛、猫、狗、鼠、猴等。
在用常规制作表达目的蛋白的胚胎技术中，特别是利用手工克隆方法制作克隆胚胎时，常用受精卵或核移植后形成重构胚再进行显微注射，注射后胚胎容易直接死亡，发明人通过研究发现，由于没有透明带的保护，注射物质导致胚胎受损，从而发生死亡。在注意到上述缺陷后，发明人提出了本发明的方法，向动物成熟卵母细胞中导入外源RNA，提高胚胎成活率，并成功在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白。
根据本发明具体实施方式的利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法，步骤(1-2)中，将未成熟的卵母细胞分配在预平衡好卵母细胞成熟液的四孔板中，于饱和湿度、5％CO2、5％O2的二气培养箱中，培养42-46小时，得到成熟的卵母细胞。
根据本发明具体实施方式的利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法，步骤(1-4)中，导入的外源RNA为mRNA，mRNA重悬于去RNA酶的无菌水中，mRNA工作浓度为100ng/μL，注射量为8-10pL mRNA/卵母细胞。
mRNA分子由体外转录获得，本发明中向成熟卵母细胞的胞质中注射的RNA分子，包括但不限于mRNA分子，还包括siRNA、miRNA和lncRNA等RNA分子。
根据本发明具体实施方式的利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法，显微注射技术使用的注射针参数为P＝200,HEAT＝530,PULL＝60,VEL＝100,TIME＝200。
根据本发明具体实施方式的利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法，步骤(1)中，显微注射RNA时，固定针固定卵母细胞时，极体方向位于7点或11点方向。
根据本发明具体实施方式的利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法，制备重构胚的步骤包括：
(2-1)制备克隆供体细胞；
(2-2)卵母细胞去核；
(2-3)将两个卵母细胞与一个供体细胞进行两次胞质电融合，得到重构胚。
根据本发明具体实施方式的利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法，步骤(3)中，将重构胚放置于37℃预热平衡的、添加细胞松弛素B和放线菌酮的胚胎培养液中，在饱和湿度、5％O2、5％CO2浓度的三气培养箱中放置4-6h，清洗2-3遍后，放置饱和湿度、5％O2、5％CO2浓度的三气培养箱中培养2-6天。
具体的，本发明的在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法，包括以下步骤：
1.猪卵母细胞收集及成熟培养
1.1 于当地生猪屠宰场采集新鲜母猪卵巢，于2小时内运送至胚胎实验室。
1.2 用切割法将直径大于3mm卵泡刺破，待所需卵巢全部切割完成后收集卵泡液于原地离心管中静止5min。
1.3 将静止后的卵泡液沉淀用洗卵液稀释3-5倍后于体式显微镜下用自制口吸管挑选收集3层卵丘层细胞以上且胞质均匀的卵母细胞,直至挑选完全部所需卵母细胞。
1.4 将1.3步骤收集后的卵母细胞放置经预热平衡好的体外成熟液中，放置37℃、5％CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养24-26小时。
2.成熟卵母细胞EGFP-mRNA注射
2.1 固定针及注射针制备
固定针在酒精灯上徒手拉制至细管内外径经50-80um大小，用煅针仪进行熔断，并对断口煅烤光滑且断口内经烤缩至大概30-50um大小。注射针用水平拉针仪进行拉制；
设定参数为:P＝200,HEAT＝530,PULL＝60,VEL＝100,TIME＝200。
2.2 EGFP-mRNA制备
调整注射浓度为100ng/ul，吸取1uL EGFP-mRNA注射液到注射针。
2.3 卵母细胞注射
轻轻旋转显微注射仪操作手臂调整注射压力，同时快速水平穿透卵母细胞透明带到细胞质，目测细胞质稍有膨胀即可快速抽出注射针，注射EGFP-mRNA浓度为100ng/μL，将注射好的受精卵放在胚胎培养箱放置5分钟，观察卵子注射后存活状况，并统计注射后成活率。
3.注射后卵母细胞去核融核
将注射EGFP-mRNA后的卵母细胞用自制口吸管统一移放到含有去核液滴中5-10s，以极体定位法用小刀片在体式显微镜下徒手切除与极体相邻的1/3胞质，然后将去核后的两个卵母细胞和一个供体细胞进行两次胞质电融合，融合后形成一个克隆重构胚。
4.克隆重构陪激活培养
4.1 将二次胞质融合后克隆重构胚放置预热平衡好的添加好细胞松弛素B和放线菌酮的胚胎培养液中，在饱和湿度、5％O2、5％CO2浓度的三气培养箱中放置4-6h，用口吸管取出清洗2-3遍后放置饱和湿度、5％O2、5％CO2浓度的三气培养箱中培养2-6天，观察重构胚发育率及蛋白表达情况。
5.克隆重构胚胎瞬间表达目的蛋白检测
5.1 将第6天的囊胚用口吸管吸出，在PBS液中清洗2遍，放置荧光显微镜中，分别以白光和绿色荧光激发态观察荧光激发状态。
本发明的有益效果：
本发明提供一种在克隆胚中瞬时表达目的蛋白的方法，利用显微注射技术在成熟卵母细胞去核前，向成熟卵母细胞的胞质中注射mRNA，然后结合克隆技术利用两个卵母胞质与体细胞融合，获得重构胚，经体外培养获得早期发育阶段过表达目的蛋白的克隆胚，本发明在供、受体细胞融合前进行显微注射操作，可避免或减低克隆形成重构胚后胚胎注射造成的胚胎发育损伤而直接死亡的现象发生，此外，通过胞质注射RNA既能在早期胚胎发育过程中有效表达外源蛋白，又可避免原核注射DNA造成外源基因在供体细胞核基因组上的整合，提高得到表达目的蛋白胚胎的效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1显示卵巢卵母细胞切割、卵子采集；
图2显示去颗粒细胞后的成熟卵母细胞；
图3显示显微注射及注射后mRNA后的去核成熟卵母细胞；
图4显示二次胞质融合后的克隆重构胚；
图5显示瞬间表达目的蛋白的克隆重构胚。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
本发明实施例使用试剂：DPBS(Sigma)、DMEM基础培养基(Gibco)、胎牛血清(Gibco)、卵泡液(自制)、Lipo2000(Invitrogen)、Medium199(Sigma)、T7 EndonucleaseI(NEB)、体外转录试剂盒(Invitrogen)、Premix TaqTM(TaKaRa)。
本发明实施例使用设备：二氧化碳培养箱(Eppendorf)、三气培养箱(Eppendorf)、拉针仪(SUTTER INSTEUMNT CO.)、煅针仪(NARISHIGE)、体式显微镜(OLYMPUS)、水浴锅(常州亿能)、显微注射仪(eppendorf)、电转染仪(Lonza)、显微镜(Leica)、PCR扩增仪(Bio-Rad)。
涉及的生物材料：母猪卵巢(来自当地屠宰场)
实施例1猪卵母细胞收集及成熟培养
1.1 于当地生猪屠宰场采集新鲜母猪卵巢，于2小时内运送至胚胎实验室。
1.2 用预热好37℃的无菌生理盐水清洗2-3遍。将洗净的卵巢上置于新的无菌培养皿，放在预热好37℃热台上，用切割法将直径大于3mm卵泡刺破，待所需卵巢全部切割完成后，收集卵泡液于原地离心管中静止5min。
1.3 将静止后的卵泡液沉淀用洗卵液稀释3-5倍后，于体式显微镜下用自制口吸管挑选收集3层卵丘层细胞以上且胞质均匀的卵母细胞,直至挑选完全部所需卵母细胞。
1.4 将1.3步骤收集后的卵母细胞放置经预热平衡好的体外成熟液中，放置37℃、5％CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养24-46小时。
实施例2成熟卵母细胞EGFP-mRNA注射
2.1 固定针及注射针制备
固定针在酒精灯上徒手拉制至细管内外径经50-80um大小，用煅针仪进行熔断，并对断口煅烤光滑且断口内经烤缩至大概30-50um大小。注射针用水平拉针仪进行拉制；
设定参数为:P＝200,HEAT＝530,PULL＝60,VEL＝100,TIME＝200。
2.2 EGFP-mRNA制备
将合成的T7-EGFP片段与Invitrogen体外转录试剂盒(AM1344)成分按表1所示体系混合，进行体外转录。
表1 体外转录体系
| 组份 | 加样量(μL) |
| 2X NTP/CAP | 10 |
| 10X Reaction Buffer | 2 |
| linear template DNA | 5 |
| GTP | 1 |
| Enzyme Mix | 2 |
| Total | 20 |
以上体系配制好后涡旋震荡仪混匀，桌面微型离心机短暂离心，放置在PCR仪中，37℃孵育3h。之后取出，向反应体系中加入1μL TURBO DNase，枪头吹打混匀，37℃孵育15min，除去未反应完的DNA。孵育完成后，转录产物用epicentre公司的Poly(A)PolymeraseTailing Kit(PAP5104H)进行加尾,反应体系如下表2所示。
表2 RNA加Poly(A)体系
| 组份 | 加样量(μL) |
| 10X reaction buffer | 2 |
| 10mM ATP | 2 |
| RNase inhibitor | 1 |
| Poly(A)polymerase | 0.5 |
| mRNA | 10 |
| DEPC Water | 4.5 |
| Total | 20 |
加尾后产物加入30uL LiCL，-20℃放置沉淀过夜。次日，4℃，14000rpm，30min高速离心。去掉上清，1mL 75％乙醇清洗沉淀2遍，4℃，14000rpm，3min高速离心，去上清，放置2min以彻底晾干沉淀。最后，加入20uL DEPC水溶解沉淀，Nanodorp测浓度后用Depc水稀释成100ng/μL，分装后-80℃保存备用。
吸取1μL EGFP-mRNA注射液到注射针。
2.3 卵母细胞注射
将培养好的卵母细胞统一收集到含有透明质酸酶消化液中，用移液枪进行来回吹吸消化90s去掉卵丘层细胞，在体视显微镜下挑选胞质均匀、排出第一极体的成熟卵母细胞置于含有细胞松他素B的显微注射液液滴中，每个液滴为20μL，放置成熟卵母细胞10-20枚/滴，且覆盖石蜡油，置于显微注射仪中备用。
卵母细胞质粒/mRNA显微注射：安装好胚胎固定针和注射针后，用固定针轻轻吸住卵母细胞，以摆动固定针时卵母细胞不掉为准；预先将RNA注射液吸入注射针，轻轻移动针头靠近于固定针吸住的卵母细胞，卵细胞细胞极体位于7点或10点钟方向，注射针水平快速插入卵母细胞胞质中，注入5-10pL注射液(可观察到胞质稍有膨胀)。
注射后结果见图3、表3。
表3 克隆重构胚注射与卵母细胞注射获得成活胚胎对比
如表1所示，注射卵母细胞成活率为88％，显著高于形成重构胚后再注射的胚胎成活率(78％)。
实施例3注射后卵母细胞去核融核
克隆供体细胞制备：将生态状态良好的体细胞消化后，用细胞培养液离心洗涤2-3遍，取适量到1.5mL离心管中备用。
卵母细胞去核：将已显微注射有mRNA的卵母细胞放置含细胞松弛素B的切割液滴中，以极体定位法徒手用小刀片在体式显微镜下去除1/3卵母细胞胞质，直至将所需去核卵母细胞全部切割去核完成。
融合：用自制口吸管将去核完全且经挑选胞质均匀、致密的卵母细胞与备好的供体体细胞进行轻轻接触以沾连有供体细胞，经电融合后，在38.5℃静置40min-60min；进行两次胞质电融合，融合后形成一个克隆重构胚。
克隆重构胚胎去核融核后如图4所示，重构胚胞质均匀致密，重构胚构成状态良好，重构胚形成率100％，说明本发明方法可有效地避免因注射物质导致重构胚死亡，进而减少损失。
实施例4克隆重构陪激活培养
4.1 将二次胞质融合后克隆重构胚放置预热平衡好的添加好细胞松弛素B和放线菌酮的胚胎培养液中，在饱和湿度、5％O2、5％CO2浓度的三气培养箱中放置4-6h，用口吸管取出清洗2-3遍后放置饱和湿度、5％O2、5％CO2浓度的三气培养箱中培养，第二天观察重构胚分裂率100％，第六天观察囊胚形成率30％，囊胚发出绿色荧光，EGFP-mRNA蛋白均有表达。
实施例5克隆重构胚胎瞬间表达目的蛋白检测
5.1 将第6天的囊胚用口吸管吸出，在PBS液中清洗2遍，放置荧光显微镜中，分别以白光和绿色荧光激发态观察荧光激发状态。
5.2 检测结果如图5所示。图5-1为白光状态，图5-2为激光激发状态，如图所示，重构胚胚胎绿色荧光激发率100％，说明利用本发明方法制作瞬时表达目的蛋白胚胎高效可行。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (8)
1.利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)利用显微注射技术，向动物成熟卵母细胞中导入外源RNA；
(2)制备重构胚；
(3)体外培养步骤(2)所得的重构胚过程中，瞬时表达目的蛋白。
2.根据权利要求1所述的利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)，包括以下步骤：
(1-1)从动物的卵巢中分离获取未成熟的卵母细胞；
(1-2)成熟培养卵母细胞；
(1-3)将培养好的卵母细胞收集到含有透明质酸酶消化液中，去掉卵丘层细胞，在体视显微镜下挑选胞质均匀、排出第一极体的成熟卵母细胞置于含有细胞松他素B的显微注射液液滴中，每个液滴为20μL，放置成熟卵母细胞10-20枚/滴，且覆盖石蜡油；
(1-4)将外源RNA注入卵母细胞中。
3.根据权利要求2所述的利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法，其特征在于，步骤(1-2)中，将未成熟的卵母细胞分配在预平衡好卵母细胞成熟液的四孔板中，于饱和湿度、5％CO2、5％O2的二气培养箱中，培养42-46小时，得到成熟的卵母细胞。
4.根据权利要求2所述的利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法，其特征在于，步骤(1-4)中，导入的外源RNA为mRNA，mRNA重悬于去RNA酶的无菌水中，mRNA工作浓度为100ng/μL，注射量为8-10pL mRNA/卵母细胞。
5.根据权利要求1所述的利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法，其特征在于，显微注射技术使用的注射针参数为P＝200,HEAT＝530,PULL＝60,VEL＝100,TIME＝200。
6.根据权利要求1所述的利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)中，显微注射RNA时，固定针固定卵母细胞时，极体方向位于7点或11点方向。
7.根据权利要求1所述的利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法，其特征在于，制备重构胚的步骤包括：
(2-1)制备克隆供体细胞；
(2-2)卵母细胞去核；
(2-3)将两个卵母细胞与一个供体细胞进行两次胞质电融合，得到重构胚。
8.根据权利要求1所述的利用显微注射技术在克隆胚早期发育阶段中瞬时表达目的蛋白的方法，其特征在于，步骤(3)中，将重构胚放置于37℃预热平衡的、添加细胞松弛素B和放线菌酮的胚胎培养液中，在饱和湿度、5％O2、5％CO2浓度的三气培养箱中放置4-6h，清洗2-3遍后，放置饱和湿度、5％O2、5％CO2浓度的三气培养箱中培养2-6天。
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