CN1294902A - 一种体细胞克隆哺乳动物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种获得用于克隆哺乳动物的重构卵的方法,包括步骤:提供去核供质卵母细胞和供核体细胞;用显微注射法,将供核体细胞直接注入去核供质卵母细胞,形成重构卵;和对重构卵进行激活处理,形成激活的重构卵。本发明还提供了一种用所述重构卵产生体细胞克隆哺乳动物的方法。本发明方法省去了细胞融合和去除体细胞的细胞质步骤,因此更加简易,效率更高。
Description
本发明涉及对哺乳动物进行克隆的方法，更具体地，涉及用体细胞来克隆哺乳动物的方法。本发明还涉及制备用于哺乳动物克隆的重构卵的方法。
哺乳动物细胞核移植，不仅在胚胎生物学研究中是一种很重要的工具，而且对“优良”胚胎(家畜)的扩繁也是一种较好的方法。
在哺乳动物中，已应用早期的胚胎分裂球或胚胎来源的培养细胞(胚胎干细胞，简称为“ES细胞”)来提供细胞核，获得了相应的克隆动物：绵羊(使用8-16细胞)[Willadsen S.M.,et al,Nature,1986]；兔(使用8-细胞)[Stice S.L.,et al,Bio.Reprod.,1989]；猪(使用2-8细胞)[Prather R.S.,et al.Biol.Reprod.,1989]；牛(使用2-32细胞)[Prather R.S.,et al.J.Anim.Sci.,1987，]；山羊(使用8-细胞)[张涌，“国外畜牧-草食家畜分册”，1993]；小鼠(使用ES-细胞)[Tsunda Y.,et al.Journal ofReproduction and Fertility.,1993]。
近年来，使用体细胞来提供细胞核，也已在一些哺乳动物中成功获得了克隆动物。1997年，Willmult等人应用乳腺上皮细胞进行核移植产生了绵羊多利[Willmut I.,et al.,Nature.1997]。随后，又获得了不同类型的体细胞克隆动物：(1)胎儿成纤维细胞核移植绵羊[Schnieke A.E.,et al.,Science,1997]，(2)胎儿成纤维细胞核移植牛[Gibelli J.B.,et al.IBID,1998]，(3)输卵管上皮细胞核移植牛等。以上核移植动物均是应用细胞融合的方法制备的。
此外，1988年Wakayama T等人利用小鼠的另一种体细胞-即卵丘细胞，先将该体细胞的细胞质去除，然后将细胞核直接注射到去核的鼠卵细胞细胞胞质内，产生了核移植小鼠[Wakayama T.,et al.,Nature,1988]。
然而，所述产生体细胞克隆动物的方法所涉及到的步骤仍很繁多，因此本领域迫切需要步骤更少、效率更高的克隆动物的方法。
本发明的目的就是提供一种步骤更少，效率更高的用体细胞克隆哺乳动物的方法。在该方法中，不对体细胞进行去除细胞质的处理，而是将体细胞直接注射到去核的卵母细胞中，并省去了细胞融合步骤。
本发明的另一目的是提供一种新的获得用于制备体细胞克隆哺乳动物的重构卵的方法。在该方法中，不对体细胞进行去除细胞质的处理，而是将体细胞直接注射到去核的卵母细胞中，并省去了细胞融合步骤。
在本发明的第一方面，提供了一种体细胞克隆哺乳动物的制备方法，该方法包括以下步骤：
提供去核的哺乳动物供质卵母细胞和用于供核的哺乳动物体细胞；
用显微注射法，将用于供核的哺乳动物体细胞直接注射入所述的去核供质卵母细胞，形成重构卵；
对所述的重构卵进行激活处理，形成激活的重构卵；
将所述的激活的重构卵移植到寄母动物的输卵管中，或者将所述的激活的重构卵在体外或体内进行培养，形成重构胚，然后再将重构胚移植到寄母动物的子宫内；
饲养所述的寄母动物，产生体细胞克隆的哺乳动物。
在本发明的另一方面，提供了一种获得用于制备体细胞克隆哺乳动物的重构卵的方法，该方法包括以下步骤：
提供去核的哺乳动物供质卵母细胞和用于供核的哺乳动物体细胞；
用显微注射法，将用于供核的哺乳动物体细胞直接注射入所述的去核供质卵母细胞，形成重构卵；
对所述的重构卵进行激活处理，形成激活的重构卵。
本发明的方法与现有技术相比，其发明点在于：省去了对体细胞去除细胞质的处理步骤，而是将体细胞直接注射到去核的卵母细胞中，并省去了细胞融合步骤。由于省去了这些步骤，因此导致克隆哺乳动物的方法或产生重构卵的方法更加简易，效率更高。
在说明书附图中，
图1显示了现有技术中产生体细胞克隆哺乳动物的方法。
图2显示了本发明的产生体细胞克隆哺乳动物的方法。
图3显示了在本发明方法中通过手术冲卵而获得哺乳动物卵母细胞。
图4显示了在本发明方法中进行显微操作的照片。
图5A-D显示了对哺乳动物(羊)卵母细胞进行去核操作，以及将体细胞显微注射到去核卵母细胞。其中，图5A是在去核前的卵母细胞；图5B是去核过程中的卵母细胞；图5C是将体细胞注射到去核卵母细胞之前(移核之前)；图5D是将体细胞注射到去核卵母细胞之后(移核之后)。
图6显示了由体细胞克隆发育而成早期胚胎。
图7A和7B分别了显示了贴壁生长的羊乳腺上皮细胞(放大200倍)和悬浮的乳腺上皮细胞(放大200倍)。
图8显示了本发明一实例中产生体细胞克隆羊的流程图。
现参见图1，图中显示了现有技术中产生体细胞克隆哺乳动物的方法。该方法包括以下步骤：
(1)获得提供细胞质的卵母细胞(简称为“供质卵母细胞”)。
一般地，获得供质卵母细胞可由以下两种方法获得。一是从卵巢卵泡上取出未成熟卵母细胞，并在体外成熟；一是供细胞质的哺乳动物经超数排卵诱导后，从其输卵管内冲出中Ⅱ期卵母细胞。这些获得供质卵母细胞的方法都是本领域的常规技术。
(2)获得供核细胞(即提供细胞核的细胞)
一般地，获得供核细胞可采用成年动物的体组织(如皮肤)、未期体细胞(如颗粒细胞)等，将有关组织剪碎和消化后，分散成单个体细胞，然后在体外培养，形成细胞系。也可直接消化成单个体细胞。
(3)卵母细胞的去核
一般，将卵母细胞的核遗传物质在显微镜下应用去核针机械去除，从而获得去核的卵母细胞。
(4)移核
现有技术中的移核过程通常有两种方式。第一种是将含细胞质的体细胞移入卵周隙中，然后将注入卵周隙的体细胞和卵母细胞在融合液内通过电刺激而发生融合，形成融合式的移核卵(重构卵)。第二种是先将体细胞的细胞质去除，再把体细胞核(不含或含少量胞质)直接注入去核卵母细胞的胞质内，形成注射式的移核卵(重构卵)。
(5)激活
对步骤(4)中形成的重构卵，通过电刺激法或化学法加以激活，形成被激活的重构卵。
(6)体内或体外培养，或者直接移植
为了观察重构胚的发育情况，对于步骤(5)中形成的被激活的重构卵，可以将其移入输卵管而在体内进行短暂培养，或者利用饲养细胞(feeder cell)(例如输卵管上皮细胞)进行体外培养。然后，将发育的胚胎移入寄母动物(受体)的子宫中。
此外，对于步骤(5)中形成的被激活的重构卵，也可将其直接移入寄母动物(受体)的输卵管内，待其妊娠产仔。
(7)饲养妊娠的寄母动物
对妊娠的寄母动物小心饲养，以产生体细胞克隆动物。对生出的动物通过DNA指纹分析来验证。
现参见图2，图中显示了本发明的产生体细胞克隆哺乳动物的方法。本发明方法包括以下步骤
(1)获得供质卵母细胞
该步骤可与上述的现有技术的步骤(1)相同。较佳地，供质卵母细胞是通过母畜的超数排卵而获得的。本领域常规的制备供质卵母细胞的方法都可适用于本发明。
(2)获得供核体细胞
该步骤可与上述的现有技术的步骤(2)相同。本领域常规的制备供核体细胞的方法都可适用于本发明。
(3)卵母细胞的去核
该步骤可与上述的现有技术的步骤(2)相同。本领域常规的去核方法都可适用于本发明。
(4)移核
在该步骤中，将步骤(2)中的供核体细胞直接用显微注射法而注入去核的卵母细胞中，形成重构卵。即在本发明方法中，不必对体细胞去除胞质，也不必先将体细胞移入卵周隙中再进行融合处理。
(5)激活
对步骤(4)中形成的重构卵，通过电刺激法或化学法加以激活，形成被激活的重构卵。本领域中的常规的激活处理方法都可用于本发明。通常，对重构卵的激活处理可用电刺激和/或化学刺激法进行。较佳地，在本发明中对重构卵的激活处理选自下组：(ⅰ)重构卵在0.2-0.4M甘露醇，3-5mg／ml的胎牛血清，0.08-0.12mM MgSO4的激活液中，进行1-3次电刺激，电压为600-800V/cm，每次电刺激持续20-80μs；(ⅱ)重构卵在0.2-0.4M甘露醇，3-5mg／ml的胎牛血清，0.08-0.12mM MgSO4的激活液中，进行1-3次电刺激，电压为600-800V/cm，每次电刺激持续20-80μs，然后再如下进行化学法激活：即在5-20μM离子霉素中激活5分钟，并在1-5μM 6-DMAP(6-dimethylaminopurine，即6-二甲基氨基嘌呤)激活1-6小时。
(6)体内或体外培养，或者直接移植
该步骤可与上述的现有技术的步骤(6)相同。本领域常规的对重构卵进行体内或体外培养，或者直接移植的方法，都可适用于本发明。
(7)饲养妊娠的寄母动物
该步骤可与上述的现有技术的步骤(7)相同。本领域常规的饲养妊娠寄母动物的方法以及检验体细胞克隆动物的方法，都可适用于本发明。
通过上述的比较可以看出，本发明的方法与现有技术相比，省去了对体细胞去除细胞质的处理步骤，而是将体细胞直接注射到去核的卵母细胞中，并省去了细胞融合步骤。由于省去了这些步骤，因此导致克隆哺乳动物的方法或产生重构卵的方法更加简易，效率更高。
本发明方法可适用于各种哺乳动物，较佳地该哺乳动物是非人的哺乳动物。可用于本发明方法的哺乳动物的例子包括(但并不限于)：羊、牛、猪、马、狗、猫、老虎、猴、兔、小鼠和大鼠。此外，人也可作为一种适用于本发明方法的哺乳动物。
适用于本发明方法的体细胞包括各种已分化的体细胞，例如来自各种组织(如皮肤、乳腺、输卵管、肌肉等)和器官(如耳、卵巢等)的细胞。可用于本发明方法的体细胞的例子包括(但并不限于)：皮肤细胞、乳腺细胞、输卵管细胞、耳细胞、卵巢细胞、上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、卵丘细胞、肌肉细胞、神经细胞、成骨细胞。
本领域中各种获得卵母细胞的方法以及对卵母细胞进行去核处理的方法都可用于本发明。在本发明的一个实例中，去核的哺乳动物供质卵母细胞是这样获得的：通过超数排卵法获得处于中Ⅱ期卵母细胞，然后进行去核处理获得去核的哺乳动物供质卵母细胞。
在本发明方法中，在体细胞被直接注射之前，可对其进行预处理，以使其充分分散成单个细胞。例如，在如下条件下进行处理：将培养的体细胞用0.1-0.5％的胰蛋白酶消化以后，再应用1-10mg/L蛋白酶E，36-39℃，3-8％CO2中消化1-20min，然后用于直接注射。
在本发明方法中，体细胞和卵母细胞可以来自同一动物，也可来自同种动物或异种动物。
在本发明中，对于被激活的重构卵，可以被直接移入寄母动物(受体)的输卵管内，待其妊娠产仔。或者可以将其移入输卵管而在体内进行短暂培养，或者利用饲养细胞(feeder cell)(例如输卵管上皮细胞)进行体外培养，形成重构胚，以便观察重构胚的发育情况。然后回收该重构胚，将其移植到寄母动物的子宫内，待其妊娠产仔。
在本发明方法中，还包括验证步骤：即对重构胚或出生的动物进行DNA指纹分析，以验证是否是克隆动物。也可根据克隆动物的表型(例如毛的颜色和斑纹)来验证是否是克隆动物。
下面结合实施例进一步详细地描述本发明，应理解，这些实施例仅用于阐述目的而不用于限制本发明范围。
实施例
A、方法
供质母畜超数排卵技术(提供卵母细胞)：
超数排卵是指采用制剂诱导动物一次排出正常排卵数若干倍的方法。进行一次超排所耗费用还比受体同步要多得多。通过激素[孕马血清促性激素(PMSG)；促卵泡激素(FSH)、促卵泡激素释放因子(LRH)]处理，使母畜呈非季节性排卵，并且在一次排卵中，能排出较多的卵子。对激素处理过的、使用过的动物，仍可以再重复超排使用3-4次，是在时间间隔、激素用量等方面有所不同，这样充分地利用了试验动物。有多种超数排卵技术可供使用。
在本发明中采用的具体方法是：每只动物肌注氯前列烯醇(PG，上海计划生育研究所)0.06-0.1mg/次，间隔10-14天后注射第二次，在第二次注射PG 10-14天后开始超排，即首先肌肉注射FSH(宁波激素制品厂)，用量按7-12IU/kg计(不同种动物用量不尽相同)，分6次，2次/日，每次间隔8-12小时。间隔24小时发情时注射LRH(上海东风制药厂)，25ug/次，注射LRH后28-30小时回收卵母细胞。
受体母畜的激素处理(受体同步)：
为与提供卵母细胞胞质的供质母羊同步，受体母羊间隔10-14天分两次肌肉注射PG，在供质母羊超排注射PG前24小时，受体也同时注射PG，受体注射LRH的时间及剂量与供体相同。
哺乳动物体细胞系的建立
在哺乳动物体细胞克隆过程中，动物体细胞的体外培养及细胞系的建立亦是很重要。根据所需克隆动物的种类和要求，选择组织或器官建立细胞系。其方法为：将组织、器官或末分化细胞用胰酶消化成单个细胞，用M199或RM1640等常规培养液(加10％胎牛血清)培养，传代，遗传分析，冷冻保存或作供核用。
卵母细胞的收集
供质卵母细胞供体母畜在注射LRH后26-30小时，进行卵母细胞的收集。收集是通过手术的方法，在母畜的腹部作一切口，将母畜的输卵管与卵巢暴露在体外，用冲卵液(F10培养液+5％BSA)从输卵管中冲出卵母细胞(见图3)，将收集的卵母细胞培养在CZB培养液中。
卵母细胞去核
将卵母细胞移入手术液中，在显微镜下，用持卵针固定卵母细胞，卵母细胞排出的极体处于钟表3点位，去核针正对着或稍偏离极体去除极体与一部分胞质(见图5A和5B)。
体细胞注射
培养的体细胞经0.25％的胰蛋白酶消化以后，移入手术液中。再应用蛋白酶E(1-10mg/L)，37℃，5％CO2中消化1-10分钟。洗涤以后，移入手术液中，再将细胞注射进去核的卵母细胞中(图5C和5D)，形成重构卵。
重构卵的激活
重构卵采用两种方法激活：一是将重构卵在激活液(0.3M甘露醇，4mg／ml胎牛血清，0.1mM MgSO4)中进行电刺激(电压600-800V/cm，每次持续40μs)后，再用化学方法激活(10μM离子霉素5分钟+2μM 6-DMAP 2-6小时)。激活后重构卵移入正常的CZB培养液中培养。反应温度通常为37℃±2℃范围内。
重构卵体内培养
应用手术的方法，将激活的重构卵吸入移卵管，将移卵管从输卵管喇叭口处插入，将卵移入输卵管内，随后在输卵管与子宫连拉部用缝线结扎。在体内培养6天后，剪下输卵管，用培养液冲出胚胎(即重构胚)，观察胚胎发育情况。
胚胎移植
将发育的重构胚移入与胚胎发育同步的寄母动物(受体)子宫内。1个月后B超检查是否妊娠，精心饲养，待其产仔。
克隆动物验证
将出生的动物、提供供核细胞的动物与受体羊的DNA进行指纹分析，验证是否克隆动物。
B、材料
在本发明中所用的M199培养基、RMl640培养基、F10培养基和CZB培养基等都是本领域中常规的培养基(培养液)。其中，CZB培养液的配方如下：表1、CZB培养液
| 成分 | 分子量 | mM | 克/升 | 克/100ml |
| NaCl | 58.44 | 81.62 | 4.7698 | 0.47698 |
| KCl | 74.55 | 4.83 | 0.3601 | 0.03601 |
| KH2PO4 | 136.09 | 1.18 | 0.1606 | 0.01606 |
| MgSO4 | 120.4 | 1.18 | 0.1421 | 0.01421 |
| NaHCO3 | 84.01 | 25.12 | 2.1103 | 0.21103 |
| CaCl2·2H2O | 147.0 | 1.70 | 0.2499 | 0.02499 |
| 乳酸钠 | 112.1 | 31.30 | 3.5087 | 0.35087 |
| 丙酮酸钠 | 110.0 | 0.27 | 0.0297 | 0.00297 |
| EDTA(二钠盐) | 372.24 | 0.11 | 0.0409 | 0.00409 |
| 谷氨酰胺 | 146.1 | 1.00 | 0.1461 | 0.01461 |
| BSA(mg/ml) | 5.00 | 5.0000 | 0.50000 | |
| 青霉素G(IU/ml) | 1580IU/mg | 100.0 | 0.0630 | 0.00630 |
| 链霉素(mg/ml) | 0.70 | 0.7000 | 0.07000 |
实施例1
用来自莎能奶山羊的乳腺上皮细胞来克隆莎能奶山羊
在该实施例中，所用的具体技术路线如图8所示。具体而言，包括以下步骤：
1、乳腺上皮细胞获得与培养
用手术方法，无菌地取约1cm2的乳腺组织，在超净台内用PBS洗涤、剪碎、0.125％胰酶消化0.5-3小时，灭菌纱布过滤后离心，沉淀用M199培养液(含10％FBS)悬浮，于四孔板培养。待细胞长满后，传代、冷冻或用于供核。
2、山羊超排与受体羊的同步：
山羊超排：每只动物肌注PG，0.06-0.1mg／次，间隔10-14天后注射第二次，在第二次注射PG 10-14天后开始超排，即首先肌肉注射FSH，用量按7-12IU/Kg计(不同种动物用量不尽相同)，分6次，2次/日，每次间隔8-12小时。间隔24小时，发情时注射LRH，25ug/次，根据羊的体重作适当调整。
受体羊的同步：为与提供卵母细胞胞质的供质母羊同步，受体母羊间隔10-14天分两次肌肉注射PG，在供质母羊超排注射PG前24小时，受体也同时注射PG，受体注射LRH的时间及剂量同供体。
3、卵母细胞的回收：
山羊注射LRH后28-30小时后，通过手术回收卵母细胞(图3)。按手术常规剪毛、消毒、打开腹腔、拉出子宫与输卵管，用10ml针筒7号针头，冲卵液为F10培养液+5％BSA。被冲出输卵管内的卵子接于园杯内。在体视解剖镜下，将检出的卵母细胞置于CZB培养液中，在37℃，5％二氧化碳培养箱中培养。
4、供质卵母细胞的去核与注射供核体细胞
将卵母细胞移于含7.5ug/ml细胞松弛素B的CZB培养液(表一)中20分钟，再移至含20mM HEPES的CZB培养液中。同时将已消化成球形的乳腺上皮细胞亦移至该液中。将卵母细胞去核(图5A和5B)。去核后再将乳腺上皮细胞直接注入卵母细胞的胞质内，形成的细胞称之为重构卵(图5C和5D)。重构卵置于CZB液中培养30分钟，然后进行激活处理。
5、激活与包埋：
将重构卵置于含细胞松弛素B(7.5ug/ml)+离子霉素(10μM)中的CZB培养液中，37℃培养5分钟。然后，移至含细胞松弛素B(7.5ug／ml)+6-DMAP(2μM)的CZB中，于37℃，液滴法培养2-6小时。激活后的重构卵移至CZB培养液中，进行包埋。
包埋采用双层包埋。所用的包埋液是0.8％与1.0％琼脂糖(低熔点)溶液。该包埋液是这样制备的：在10ml锥形玻璃离心管内将适量的琼脂糖与生理盐水混合煮沸，至完全溶解后置于41℃，水浴待用。
包埋时，在一塑料平皿中加入含Ca2+、Mg2+的PBS液，在PBS液底部用吸管加入胎牛血清，将待包埋的卵母细胞移入血清层，使其自然下沉，待位于底壁，吸出。然后移入另一含刚倒出的0.8％琼脂糖的小平皿中，将卵母细胞的位置移动2-4次(起到洗涤作用)，再均匀吸卵(卵与卵之间有一定的距离，但相靠不是太远)，移至PBS中。让其自然凝固，再分割，换一口径稍大的吸管，按相同方法进行第二层包埋，不同点在于：包埋液的琼脂糖浓度为1.0％。
6、重构卵的体内培养与回收
应用手术的方法，将包埋后的重构卵吸入移卵管，将移卵管从输卵管喇叭口处插入，将重构卵移进输卵管内，随后在输卵管与子宫连接部用缝线结扎。在体内培养6天后，剪下输卵管，用培养液冲出胚胎(重构胚)，观察胚胎发育情况。
7、重构胚的移植
将发育的重构胚移入与胚胎发育同步的受体子宫内。1个月后B超检查是否妊娠，精心饲养，待其产仔。
8、克隆动物验证
将出生的动物、提供供核体细胞的动物与寄母羊的DNA进行指纹分析，验证是否克隆动物。
结果如下：
(一)超数排卵：
| 超排山羊总数 | 卵巢发育(直径) | 排卵点数 | 回收卵数 | |||
| ＞2cm | ＞1.5cm | ＞1cm | 未发育 | |||
| 10 | 4 | 2 | 3 | 1 | 102 | 86 |
超排效果：
卵巢发育率(以卵巢直径＞1cm计)：90％(9/10)
平均每只山羊排卵数：10.2枚(102枚/10)
平均每只山羊回收卵数：8.6(86/10)
回收卵效率：84％(86/102)
由以上结果可以看出，山羊卵巢发育好，回收卵效率高，但平均每只山羊排卵数稍低。
(二)受体同步发情：通过PG处理后，羊的同步率为78％(12/16)。
(三)体细胞培养：已建立了莎能奶山羊乳腺上皮细胞系、输卵管上皮细胞与颗粒细胞系。在代供过程中进行了染色体数分析。观察了100个分裂相，2倍染色体占70％以上。
本试验所用的乳腺上皮细胞为原代细胞(见图7A和7B)，亦未进行冷冻与饥饿处理。
(四)去核与体细胞注射：
去核总卵数：75枚，其中成活73枚，成活率：97％(73/75)
体细胞注射后成活卵数：68枚
重构卵存活率：93％(68/73)
(五)激活与体内短暂培养：
重构卵的激活采用化学激活法，激活后的胚胎移入普通山羊输卵管内培养6天后，手术回收，观察重构胚发育情况。
(六)胚发育与移植
1、重构胚早期发育情况表
| 移植卵数 | 回收卵数 | 重构卵发育率(％) | |||
| 2-4细胞 | 32-64细胞 | 桑椹 | 早期+晚期囊胚 | ||
| 68 | 46 | 6 | 12 | 5 | 10 |
2、移植：将发育至32细胞以上的胚胎移植至受体子宫内。每只受体移入4枚。
(七)对胚胎的验证
对上述处于桑椹阶段和早期/晚期囊胚阶段的胚胎，取少量细胞进行PCR扩增(DNA指纹分析)，结果表明指纹与莎能奶山羊的相同。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1．一种体细胞克隆哺乳动物的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
提供去核的哺乳动物供质卵母细胞和用于供核的哺乳动物体细胞；
用显微注射法，将用于供核的哺乳动物体细胞直接注射入所述的去核供质卵母细胞，形成重构卵；
对所述的重构卵进行激活处理，形成激活的重构卵；
将所述的激活的重构卵移植到寄母动物的输卵管中，或者将所述的激活的重构卵在体外或体内进行培养，形成重构胚，然后再将重构胚移植到寄母动物的子宫内；
饲养所述的寄母动物，产生体细胞克隆的哺乳动物。
2．如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的激活的重构卵被移植到哺乳动物输卵管内作体内培养，形成重构胚，然后回收该重构胚，将其移植到寄母动物的子宫内。
3．如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物体细胞选自下组的细胞：皮肤细胞、乳腺细胞、输卵管细胞、耳细胞、卵巢细胞、上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、卵丘细胞、肌肉细胞、神经细胞、成骨细胞。
4．如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述体细胞在直接注射之前，在如下条件下进行处理：将培养的体细胞用0.1-0.5％的胰蛋白酶消化以后，再应用1-10mg/L蛋白酶E，36-39℃，3-8％CO2中消化1-20min，然后用于直接注射。
5．如权利要求l所述的方法，其特征在于，对重构卵的激活处理选自下组：(ⅰ)重构卵在0.2-0.4M甘露醇，3-5mg/ml的胎牛血清，0.08-0.12mM MgSO4的激活液中，进行1-3次电刺激，电压为600-800V/cm，每次电刺激持续20-80μs；(ⅱ)重构卵在0.2-0.4M甘露醇，3-5mg／ml的胎牛血清，0.08-0.12mM MgSO4的激活液中，进行1-3次电刺激，电压为600-800V/cm，每次电刺激持续20-80μs，然后再如下进行化学法激活：即在5-20μM离子霉素中激活5分钟，并在1-5μM 6-DMAP激活1-6小时。
6．如权利要求1所述的方法，其特征在于，该哺乳动物选自：羊、牛、猪、马、狗、猫、老虎、猴、兔、小鼠和大鼠。
7．如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括验证步骤：
对重构胚或出生的动物进行DNA指纹分析，以验证是否是克隆动物。
8．如权利要求1所述的方法，其特征在于，提供去核的哺乳动物供质卵母细胞是这样获得的：通过超数排卵法获得处于中Ⅱ期卵母细胞，然后进行去核处理获得去核的哺乳动物供质卵母细胞。
9．一种获得用于制备体细胞克隆哺乳动物的重构卵的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
提供去核的哺乳动物供质卵母细胞和用于供核的哺乳动物体细胞；
用显微注射法，将用于供核的哺乳动物体细胞直接注射入所述的去核供质卵母细胞，形成重构卵；
对所述的重构卵进行激活处理，形成激活的重构卵。
10．如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物体细胞选自下组的细胞：皮肤细胞、乳腺细胞、输卵管细胞、耳细胞、卵巢细胞、上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、卵丘细胞、肌肉细胞、神经细胞、成骨细胞；
所述体细胞在直接注射之前，在如下条件下进行处理：将培养的体细胞用0.1-0.5％的胰蛋白酶消化以后，再应用1-10mg/L蛋白酶E，36-39℃，3-8％CO2中消化1-20min，然后用于直接注射；
而且，对重构卵的激活处理选自下组：(ⅰ)重构卵在0.2-0.4M甘露醇，3-5mg／ml的胎牛血清，0.08-0.12mM MgSO4的激活液中，进行1-3次电刺激，电压为600-800V/cm，每次电刺激持续20-80μs；(ⅱ)重构卵在0.2-0.4M甘露醇，3-5mg/ml的胎牛血清，0.08-0.12mM MgSO4的激活液中，进行1-3次电刺激，电压为600-800V/cm，每次电刺激持续20-80μs，然后再如下进行化学法激活：即在5-20μM离子霉素中激活5分钟，并在1-5μM 6-DMAP激活1-6小时。
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Cited By (3)
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| CN106755112A (zh) * | 2016-12-27 | 2017-05-31 | 云南农业大学 | 一种利用体细胞克隆技术培育地方优良家畜品种的方法 |
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1999
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