CN102988986B - 一种中华鳖胚胎期雄性性别诱导方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及到一种中华鳖胚胎期雄性性别诱导方法，其特征在于包括将芳香化酶抑制剂和辅助剂溶于纯度为92-98%的酒精中，得到芳香化酶抑制剂浓度为50～150μg/μl、辅助剂浓度为50～150μg/μl诱导剂；所述辅助剂选自睾酮，甲睾酮或丙酸睾酮。本发明所提供的诱导方法选择在胚胎发育中性别决定关键时间点仅喷洒2次诱导剂，即可使雄性诱导率在95%以上，同时保证了中华鳖性腺的正常发育以及低药物残留；操作简便，成本低，经济效益显著，是目前中华鳖养殖中值得推广的性别控制技术。

Description

一种中华鳖胚胎期雄性性别诱导方法

技术领域

本发明涉及到水产品养殖领域，具体指一种中华鳖胚胎期雄性性别诱导方法。

背景技术

鳖是我国传统高档滋补水产品，也是百姓喜爱的名贵水产品和水产养殖的重要品种，在我国养殖业中有举足轻重的作用。在长期的鳖养殖实践中发现，雌、雄个体间存在着很大的生长差异。雄性中华鳖的生长明显快于雌鳖，据试验，中华鳖养殖至平均体重300g的群体，雄鳖比雌鳖生长快12.7%～17.0%，随着养殖期的延长，雌、雄鳖的生长差异还会进一步增大，雄性中华鳖肌肉中脂肪少，裙边宽厚，内脏小，具有更高的营养价值和经济价值，并且消费者喜食雄鳖，雄鳖不但畅销，而且同比单价雄性比雌性高25%。目前全国中华鳖年产量约在22～25万吨，其中浙江省中华鳖养殖年产量达10～12万吨，约占全国总产量的一半，产值达50亿元，是浙江省第一大水产养殖产业。因此，如果能人为控制中华鳖的雄鳖苗比例，将大大提高中华鳖养殖的产量、产值和效益。作为产业可持续发展的重要技术，业内也对中华鳖性别控制开展积极的技术探索。

公告号为CN102487883A的中国发明专利申请公开了《一种中华鳖性别控制方法》，其是在23℃～35℃的孵化温度下，向中华鳖卵的动物极每天滴加20～30微克的甲基睾丸素，直至幼鳖出壳。此技术存在以下两个缺陷：①虽然甲基睾丸素能诱导中华鳖外部性征，但是由于雌性本体中存在的芳香化酶能将睾丸素转变成雌激素，因此单独的甲基睾丸素处理时很难达到彻底的性逆转的效果，无法使全部个体雄性化。②此法需每天滴加药物，操作繁琐，且高剂量的甲基睾丸素极易导致胚胎发育以及日后性腺发育的不正常。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的现状提供一种性别控制效果好且不会影响中华鳖性腺发育的中华鳖胚胎期雄性性别诱导剂。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种性别控制效果好且不会影响中华鳖性腺发育的中华鳖胚胎期雄性性别诱导方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该中华鳖胚胎期雄性性别诱导剂，其特征在于包括将芳香化酶抑制剂和辅助剂溶于纯度为92-98%的酒精中，得到芳香化酶抑制剂浓度为50～150μg/μl、辅助剂浓度为50～150μg/μl诱导剂；

其中，所述辅助剂选自睾酮，甲睾酮或丙酸睾酮。

为了尽量避免诱导剂的残留，较好的，所述芳香化酶抑制剂的浓度为50μg/μl，所述辅助剂的浓度为50μg/μl。该浓度的诱导剂其性别转换率可达到95%或以上。

使用上述中华鳖胚胎期雄性性别诱导剂进行中华鳖胚胎期雄性性别诱导方法，其特征在于包括下述步骤：

①挑选受精鳖卵，在温度为31℃±3℃、相对湿度为75～85%的孵化条件下孵化至第15期，通过照蛋器确定胚胎的位置，然后在正对胚胎的卵壳上施加所述的诱导剂5～10μl；

②按相同的条件继续孵化至第16期，采用同样方法和同样剂量在正对胚胎的卵壳上施加所述的诱导剂5～10μl；

③在相同的条件继续孵化至稚鳖出壳。

上述施加方法可以为注射、喷洒或涂抹。

上述孵化过程可以使用现有技术中的任意一种孵化器，较好的，可以使用下述孵化器，在该孵化器中进行完全裸孵，可获得较好的孵化率，并可自动控制，节省人力。该孵化器包括：

孵化箱，具有箱体和箱门，

孵化板，设置在所述箱体内，有多块，这些孵化板在箱体的高度方向上间隔设置；

收集盒，设置在所述箱体内，用于收集刚孵化出的稚鳖；

其特征在于该孵化器还包括：

孵化箱，具有箱体和箱门，

孵化板，设置在所述箱体内，有多块，这些孵化板在箱体的高度方向上间隔设置；

收集盒，设置在所述箱体内，用于收集刚孵化出的稚鳖；

其特征在于该孵化器还包括：

温度传感器，设置在所述箱体内，用于实时检测箱体内的温度；温度传感器的输出端连接控制模块；

湿度传感器，设置在所述箱体内，用于实时检测箱体内的湿度；湿度传感器的输出端连接控制模块；

温控装置，连接控制模块的输出端，用于对箱体的内环境进行加热升温或制冷降温，以提供鳖卵孵化所需要的温度；

加湿管，设置在所述箱体内，连通超声波加湿装置的排汽管道，用于向所述箱体内提供雾化颗粒水滴，以提供鳖卵孵化所需要的湿度；所述超声波加湿装置连接所述控制模块的输出端；

通风装置，包括设置在所述箱体上部和下部的壳壁上的上通气孔和下通气孔以及设置在所述箱体内的风扇，在所述风扇的吹动作用下，使所述箱体内的空气与所述箱体外的空气形成循环流动；

各所述孵化板上间隔设有多个用于限位待孵化的定位孔，并且各定位孔的周围间隔设有多个透气孔。

所述孵化板采用塑料或不锈钢制备，所述定位孔为直径为12～18mm的圆孔，所述透气孔的直径为5～8mm，并且相邻的定位孔与透气孔之间的间距为5～10mm。

各所述透气孔与各所述定位孔交错排列。

相对于所述透气孔，各所述定位孔位于正方形的中心位置，与该定位孔相邻的透气孔则位于该正方形的四个角的位置上；

同样，相对于所述的定位孔，各所述透气孔位于正方形的中心位置，而该透气孔所相邻的定位孔则位于该正方形的四个角的位置上。

所述加湿管为不锈钢管或PVC塑料管，所述加湿管的管壁上间隔设有多个透气微孔，并且各所述微孔的直径为1～3mm。

与现有技术相比，本发明采用独特的诱导剂对中华鳖在胚胎期进行雄性性别的诱导和控制，通过性腺切片组织学染色也证实了本发明能够彻底将其雄性化的效果，避免了现有技术中长时间、高剂量地使用甲基睾丸素极易导致的稚鳖性腺发育的不正常，出现生殖器外翻等现象；本发明所提供的诱导方法选择在胚胎发育中性别决定关键时间点仅喷洒2次诱导剂，即可使雄性诱导率在95%以上，同时保证了中华鳖性腺的正常发育以及低药物残留；操作简便，成本低，经济效益显著，是目前中华鳖养殖中值得推广的性别控制技术。而优选方案中所使用的孵化器，采用超声波加湿器提供鳖卵孵化所需要的湿度，超声波加湿器能够产生粒径为1～3微米的雾化状超微粒子，水雾通过加湿管道均匀扩散到箱体内，极易使空气吸收而湿润，并伴生丰富的负氧离子，能同时清新箱内空气，有利于蛋内胚胎发育，能持续稳定供湿与控湿，湿度精度可控制在±1%，且不会形成水滴滴落在鳖卵上，既克服了传统喷淋加湿或纱布加湿、水蒸气加湿等保湿方法容易在鳖卵表面形成水珠导致鳖卵发霉、滋生细菌的缺点，又克服了加湿不均匀、湿度控制不稳定、介质流通不畅的缺点，孵化率高，稚鳖的质量好；并且该孵化器单位体积孵化量大，每立方米可孵化12000～15000枚鳖卵；箱体内环境可自动控制，孵化期间无需人工管理，可全自动孵化，节约了人力物力，且孵化清洁、操作安全、环保节能，省时省力；克服了传统孵化方法利用介质吸湿、需人工间隙式喷水加湿的技术缺陷，真正实现了中华鳖的裸孵，且无需任何介质辅助的全自动控制的孵化方法，孵化率高。

附图说明

图1为本发明实施例中孵化器的立体结构示意图；

图2为本发明实施例中孵化板的立体结构示意图；

图3为本发明实施例中收集盒的立体结构示意图；

图4中的A是雌性出壳稚鳖的性腺切片组织学H&E染色照片；

图4中的B为雄性出壳稚鳖的性腺切片组织学H&E染色照片；

图4中的C为雌性出壳稚鳖的性腺切片Sox9免疫组织化学染色示意图；

图4中的D为雄性出壳稚鳖的性腺切片Sox9免疫组织化学染色示意图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

如图1至图3所示，下述实施例中所使用的孵化器包括：

孵化箱1，为前开门的柜式结构，由箱体11和箱门12组成。

孵化板2，有多块，相互平行地水平地设置在箱体11内。箱体的侧壁上设有搁板13，各孵化板2可拆卸地搁置在对应的搁板13上。各所述孵化板上均布有多个用于限位待孵化的定位孔21，并且各定位孔的周围间隔设有多个透气孔22。本实施例中的孵化板采用塑料或不锈钢制备，透气孔与各所述定位孔交错排列，定位孔21与透气孔22的位置关系为：以定位孔所在位置为正方形的中心位置时，其相邻的透气孔则位于该正方形的四个角的位置上；以透气孔所在位置为正方形的中心位置时，其相邻的定位孔则位于该正方形的四个角的位置上。各定位孔的直径为15mm，透气孔的直径为6mm，相邻定位孔与透气孔之间的间距为8mm。

收集盒3，用于收集刚孵化出的稚鳖。根据孵化量的多少，可以在箱体的底面上设置一个收集盒，也可以在每块孵化板或几块孵化板设置一个收集盒。本实施例中收集盒通过每块孵化板或几块靠近箱门12的一侧均可拆卸地设置有收集盒3。

温度传感器4，设置在箱体11内，用于实时检测箱体内的温度；温度传感器的输出端连接控制模块（图中未示出）；

湿度传感器5，设置在箱体11内，用于实时检测箱体内的湿度；湿度传感器的输出端连接控制模块；

加热装置6，设置在箱体的后壁内，用于对箱体的内环境进行加热，以提供鳖卵孵化所需要的温度；加热装置6连接控制模块的输出端，根据控制模块的指令工作。

加湿管7，设置在箱体11内，连通超声波加湿装置8的排汽管道81，用于向箱体内提供雾化水汽，以提供鳖卵孵化所需要的湿度。本实施例中加湿管7采用不锈钢管或PVC塑料管制备，管径可在20～40mm中选择，沿箱体的高度方向竖直设置，所述加湿管的管壁上间隔设有多个透气微孔71，各所述微孔的直径为2mm，保证相邻孵化板之间的空隙中至少有1～2个透气微孔。

超声波加湿装置8连接控制模块的输出端，由控制模块控制其工作。本实施例中采用功率为30W、加湿量为300ml/h的市售超声波加湿器。

通风装置，包括设置在所述箱体顶部的风扇9和设置在箱体顶面和底面上的上、下通气孔（图中未示出），通气孔还可以设置在箱体的后壁上。本实施例采用功率为20W的风扇。通过风扇的吹动，使外界空气从通气孔内进入箱体内，经由隔板上的透气孔循环至下通气孔送出箱体，以实现空气在箱体内的循环以及空气在箱体内和箱体外的循环，从而将箱体内的代谢气体排出，将外界的新鲜空气引入，以保证鳖卵孵化所需要的氧气。

实施例1

1、诱导剂配制：

将芳香化酶抑制剂和辅助剂溶于酒精中，混合均匀得到不同浓度的诱导剂。各诱导剂的具体情况如表1所示。

表1

使用上述孵化器进行中华鳖胚胎期雄性性别的诱导方法如下：

采集种甲鱼产卵后12小时之内受精卵，将鳖卵直接裸立于孵化板的定位孔中，装入箱体内，设定孵化温度为31℃，开启电源，控制模块控制加热装置、超声波加湿器和风扇工作。湿度控制在75%～85%。孵化1天后，剔除未受精胚胎，受精的鳖卵继续孵化。

2、药物处理：

选七个孵化箱，设置温度为31℃，湿度为75%，每个孵化箱放入250枚鳖卵。孵化1天后挑出没有明显受精斑的鳖卵，同时将每个孵化箱中的受精鳖卵调整至200枚，按动物极朝上，植物极朝下放置在孵化盘的卵固定孔中。孵化至第15天时，即其孵化积温为10860～11460（小时*℃）时，到达中华鳖胚胎孵化的第15期，用照蛋器确定中华鳖胚胎的位置，同时用小型喷壶在正对胚胎的卵壳位置上喷洒8μl药物。

其中对第一孵化器内的鳖卵不做任何药物处理；第二孵化器中的鳖卵喷洒8μl纯度为95%的酒精，第三至第七孵化器中的鳖卵分别喷洒8μl的C、D、E、F和G。

喷洒药物后，继续孵化至第17天，即其孵化积温为12350～12950（℃·小时）时，到达中华鳖胚胎孵化的第16期，重复上述喷洒步骤。

然后继续在31±1℃、湿度75%～85%下孵化至45～65天、孵化积温达到36000（℃·小时）时，将收集盒悬挂于箱门内侧面上，收集盒内盛有深度为1～2cm的水，破壳的稚鳖会进入到收集盒中，每天收集后取出。如孵化中发现小甲鱼破壳困难，可以采取人工辅助方法，将蛋表面轻轻敲破，便于小甲鱼出壳。

收集出壳的稚鳖，统计孵化率和平均体重，然后宰杀取性腺，用于组织学性别鉴定。具体的性别鉴定采用性腺组织学H&E染色和雄性特异性蛋白Sox9免疫组化染色，如图4所示。

图4中，β-catenin为β-连环蛋白；Sox9为SYR相关高度可动族基因9，在脊椎动物睾丸中特异性表达，是睾丸发育的主要诱导者。

药物处理与中华鳖性别的关系见表2所示。

表2

从表2中可以看出，鳖卵经过药物处理后，孵化率没有受到影响，稚鳖生长正常。其中使用了D、E、F和G处理的第三至第七孵化箱内孵化出的中华鳖雄性比例显著增加，其中经过D、E、F和G处理后，雄性比例可高达96.9%以上，但是单独滴加辅助剂C处理的第三孵化箱并不能显著增加雄性比例，同时，只采用芳香化酶抑制剂的D虽然雄性比例明显增加，但是没有芳香化酶抑制剂与辅助剂联合使用的E、F和G效果显著。

实施例2

1、诱导剂配置

将芳香化酶抑制剂和辅助剂溶于酒精中，混合均匀得到不同浓度的诱导剂。各诱导剂的具体情况如表3所示。

表3

孵化方法以及诱导剂的施加方法与实施例1相同。

2、药物处理：

使用上述A1至F1诱导剂对胚胎期鳖卵进行诱导以及中后期的孵化方法均与实施例1的相同。

收集出壳的稚鳖，统计孵化率和平均体重，然后宰杀取性腺，用于组织学性别鉴定。孵化率以及性别鉴定等结果如表4所示。

表4

从表4中可知，鳖卵经过不同浓度的芳香化酶抑制剂和辅助剂联合处理后，孵化率、平均体重没有变化。雄性子代比例随着雄性诱导剂浓度的增加而升高，其中高浓度的芳香化酶抑制剂和辅助剂（如E1中芳香化酶抑制剂150μg/μl，辅助剂150μg/μl）可使子代雄性比例达到100%。

Claims (8)

1.一种中华鳖胚胎期雄性性别诱导方法，其特征在于包括将芳香化酶抑制剂和辅助剂溶于纯度为92-98%的酒精中，得到芳香化酶抑制剂浓度为50～150μg/μl、辅助剂浓度为50～150μg/μl诱导剂；

所述辅助剂选自睾酮，甲睾酮或丙酸睾酮；

使用上述中华鳖胚胎期雄性性别诱导剂进行中华鳖胚胎期雄性性别诱导方法，包括下述步骤：

①挑选受精鳖卵，在温度为31℃±3℃、相对湿度为75～85%的孵化条件下孵化至第15期时，通过照蛋器确定胚胎的位置，然后在正对胚胎的卵壳上施加所述的诱导剂5～10μl；

②按相同的条件继续孵化至第16期时，采用同样方法和同样剂量在正对胚胎的卵壳上施加所述的诱导剂5～10μl；

③在相同的条件继续孵化至稚鳖出壳。

2.根据权利要求1所述的中华鳖胚胎期雄性性别诱导方法，其特征在于所述芳香化酶抑制剂的浓度为50μg/μl，所述辅助剂的浓度为50μg/μl。

3.根据权利要求1所述的中华鳖胚胎期雄性性别诱导方法，其特征在于所述施加为注射、喷洒或涂抹。

4.根据权利要求1所述的中华鳖胚胎期雄性性别诱导方法，其特征在于所述孵化是在孵化器中进行的，所述的孵化器包括：

孵化箱，具有箱体和箱门，

孵化板，设置在所述箱体内，有多块，这些孵化板在箱体的高度方向上间隔设置；

收集盒，设置在所述箱体内，用于收集刚孵化出的稚鳖；

其特征在于该孵化器还包括：

温度传感器，设置在所述箱体内，用于实时检测箱体内的温度；温度传感器的输出端连接控制模块；

湿度传感器，设置在所述箱体内，用于实时检测箱体内的湿度；湿度传感器的输出端连接控制模块；

温控装置，连接控制模块的输出端，用于对箱体的内环境进行加热升温或制冷降温，以提供鳖卵孵化所需要的温度；

加湿管，设置在所述箱体内，连通超声波加湿装置的排汽管道，用于向所述箱体内提供雾化颗粒水滴，以提供鳖卵孵化所需要的湿度；所述超声波加湿装置连接所述控制模块的输出端；

通风装置，包括设置在所述箱体上部和下部的壳壁上的上通气孔和下通气孔以及设置在所述箱体内的风扇，在所述风扇的吹动作用下，使所述箱体内的空气与所述箱体外的空气形成循环流动；

各所述孵化板上间隔设有多个用于限位待孵化鳖卵的定位孔，并且各定位孔的周围间隔设有多个透气孔。

5.根据权利要求4所述的中华鳖胚胎期雄性性别诱导方法，其特征在于所述孵化板采用塑料或不锈钢制备，所述定位孔为直径为12～18mm的圆孔，所述透气孔的直径为5～8mm，并且相邻的定位孔与透气孔之间的间距为5～10mm。

6.根据权利要求5所述的中华鳖胚胎期雄性性别诱导方法，其特征在于各所述透气孔与各所述定位孔交错排列。

7.根据权利要求6所述的中华鳖胚胎期雄性性别诱导方法，其特征在于相对于所述透气孔，各所述定位孔位于正方形的中心位置，与该定位孔相邻的透气孔则位于该正方形的四个角的位置上；

同样，相对于所述的定位孔，各所述透气孔位于正方形的中心位置，而该透气孔所相邻的定位孔则位于该正方形的四个角的位置上。

8.根据权利要求4至7任一权利要求所述的中华鳖胚胎期雄性性别诱导方法，其特征在于所述加湿管为不锈钢管或PVC塑料管，所述加湿管的管壁上间隔设有多个透气微孔，并且各所述微孔的直径为1～3mm。

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