CN110499286A - 一种快速从脂肪组织获取间充质干细胞的方法 - Google Patents

一种快速从脂肪组织获取间充质干细胞的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110499286A
CN110499286A CN201910815866.0A CN201910815866A CN110499286A CN 110499286 A CN110499286 A CN 110499286A CN 201910815866 A CN201910815866 A CN 201910815866A CN 110499286 A CN110499286 A CN 110499286A
Authority
CN
China
Prior art keywords
adipose tissue
cell
culture
stem cell
mescenchymal stem
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910815866.0A
Other languages
English (en)
Inventor
吕品雷
李莉
李相鲁
张严冬
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong Panguard Cell Biological Technology Co Ltd
Original Assignee
Guangdong Panguard Cell Biological Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangdong Panguard Cell Biological Technology Co Ltd filed Critical Guangdong Panguard Cell Biological Technology Co Ltd
Priority to CN201910815866.0A priority Critical patent/CN110499286A/zh
Publication of CN110499286A publication Critical patent/CN110499286A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及涉及脂肪间充质干细胞技术领域，具体涉及一种快速从脂肪组织获取间充质干细胞的方法，包括如下步骤：(1)预处理；(2)酶消化；(3)重悬离心；(4)培养；(5)挑选克隆。本发明创造性的使用挑选克隆的方法，将在脂肪组织培养过程中出现的血管基质部分尽可能的使用克隆环挑选出来后培养。此方法可以在较短的时间内获得较多的靠前代次脂肪源间充质干细胞量，有效缩短脂肪源间充质干细胞纯化的时间，避免了多次传代纯化造成的资源浪费。

Description

一种快速从脂肪组织获取间充质干细胞的方法
技术领域
本发明涉及脂肪间充质干细胞技术领域，具体涉及一种快速从脂肪组织获取间充质干细胞的方法。
背景技术
间充质干细胞属于成体干细胞的一种，具有多向分化潜能，在体外合适的诱导培养条件下可以分化为脂肪细胞，成骨细胞，软骨细胞和肌细胞等。间充质干细胞在体内的来源非常多，如骨髓，脐带，脐血，脂肪，胎盘等。相较于骨髓，脂肪组织在人体的来源相当丰富，如腹部、腿部、臀部等，取材时的创面小。有研究表明脂肪源间充质干细胞的提取效率明显高于骨髓源间充质干细胞[Cowan,CM,et al.Nat Biotechnol,2004.22(5):560-7.Levi,B et al.PLoS One,2010.5(6):e11177]。而且在人体中，1克脂肪组织可以获得约2*106细胞，其中10％的细胞被认为是具有自我增殖和多向分化能力的间充质干细胞[Aust,L,etal.Cytotherapy,2004.6(1):7-14,Zhu Y,et al.Cell Biochem Funct,2008.26(6):664-75.]。Kang等人研究发现脂肪源间充质干细胞的分化能力要明显优于骨髓源间充质干细胞[Kang BJ,et al.J Vet Sci,2012,13(3):299-310]，而且脂肪源间充质干细胞的分化能力随着年龄的增长下降的不是很明显[Shi YY,et al.Plast Reconstr Surg,2005.116(6):1686-96.Chen HT,et al.J Cell Mol Med,2012.16(3):582-93.Wu W,et al.PlastReconstr Surg.2013.131(1):27-37]。鉴于脂肪源间充质干细胞的这些优点，近年来备受关注，已成为细胞治疗的热门种子细胞。
目前主流的获得脂肪源间充质干细胞的步骤是脂肪组织的获取，脂肪层的获取，总前脂肪细胞的获取及脂肪间充质干细胞多次传代纯化获取。该类方法具有耗时长，多次传代纯化浪费资源，获得较前代次脂肪源间充质干细胞数量少等明显缺点。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种快速从脂肪组织获取间充质干细胞的方法。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种快速从脂肪组织获取间充质干细胞的方法，包括如下步骤：
(1)预处理：采集脂肪组织，进行冲洗、剪碎；
(2)酶消化：将步骤(1)得到的脂肪组织加入至胶原酶液中，震荡培养，然后加入DMEM培养基终止消化，进行过滤，得到脂肪细胞；
(3)重悬离心：重悬步骤(2)得到的脂肪细胞得到细胞悬浮液，然后进行洗涤、离心去上清，加入红细胞裂解液进行震荡，然后进行离心去上清，得到细胞沉淀；
(4)培养：将所述细胞沉淀加入无血清脂肪源间充质干细胞培养液进行重悬，在一定的条件下进行培养；
(5)挑选克隆：用显微镜每天观察生产状况，对克隆样生长的细胞集落进行标记，当细胞集落中细胞数大于100时，使用克隆环套住细胞集落，吸出培养基，漂洗，加入EDTA-胰蛋白酶液，培养一定时候后置于显微镜下观察，见胞质回缩，克隆脱壁，使用移液枪吸出细胞克隆，加入无血清脂肪源间充质干细胞培养液终止消化，吹散细胞后继续进行培养，至细胞生长至一定融合度后，消化传代。
其中，所述步骤(1)中，采集的脂肪组织为腹部脂肪组织，冲洗采用PBS溶液，脂肪组织剪碎至1mm3。
其中，所述步骤(2)中，胶原酶液中I型胶原酶的浓度为0.5-1.5g/L。
其中，所述步骤(2)中，DMEM培养基为含有5-15vt％新生牛血清的低糖DMEM培养基，DMEM培养基的体积用量为脂肪组织的1.5-2.5倍。
其中，所述步骤(3)的具体操作为：用PBS液重悬步骤(2)得到的脂肪细胞得到细胞悬浮液，洗涤，1500-1700rpm/min离心4-6min后去上清，加入脂肪组织4-6倍体积量的红细胞裂解液震荡8-12min，然后1500-1700rpm/min离心4-6min后去上清，得到细胞沉淀。
其中，所述步骤(4)中，培养条件为在37℃、5％CO2条件下培养，每3天换液1次。
其中，所述步骤(5)中，EDTA-胰蛋白酶液的浓度为0.25％，加入EDTA-胰蛋白酶液后的培养条件为37℃、5％CO2条件下培养3min。
其中，所述步骤(5)中，细胞生长至85-95％融合度后，消化传代。
本发明的有益效果在于：本发明创造性的使用挑选克隆的方法，将在脂肪组织培养过程中出现的血管基质部分尽可能的使用克隆环挑选出来后培养。此方法可以在较短的时间内获得较多的靠前代次脂肪源间充质干细胞量，有效缩短脂肪源间充质干细胞纯化的时间，避免了多次传代纯化造成的资源浪费。
附图说明
图1是实施例1接种第3天后显微镜下的细胞图；
图2是实施例1接种第5天后显微镜下的细胞图；
图3是实施例2在传代培养至第2代时在显微镜下的细胞图；
图4是对比例1在传代培养至第4代时在显微镜下的细胞图.
具体实施方式
为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例及附图1-4对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
实施例1
取腹部脂肪组织，PBS冲洗干净，剪碎至1mm3大小，用1g/L I型胶原酶于37℃恒温水浴箱振荡消化1小时至脂肪组织基本液化，加入2倍体积量的含体积分数为10％新生牛血清的低糖DMEM培养基终止消化，于200目滤网过滤以去除残留的筋膜组织，PBS重悬细胞，洗涤，1600rpm/min离心5min后去上清，5倍量红细胞裂解液轻微振荡裂解红细胞10min，再次1600rpm/min离心5min后去上清，PBS重悬后离心洗涤2次，用无血清脂肪源间充质干细胞培养液重悬细胞，接种于10mm培养皿，在37℃、5％CO2条件下培养，每3天换液1次。
原代血管基质部分在接种后每天都在显微镜下观察生产状况。在接种后第3天、第5天显微镜下观察细胞见图1和图2。
实施例2
对实施例1克隆样生长的细胞集落进行标记。当细胞集落中细胞数大于100时，使用克隆环套住细胞集落，吸出培养基，PBS漂洗1次，加入0.25％EDTA-胰蛋白酶，置于37℃、5％CO2培养箱中3min，将培养瓶置于倒置显微镜下观察，见胞质回缩，克隆脱壁，使用移液枪吸出细胞克隆，加入无血清脂肪源间充质干细胞培养液终止消化，吹散细胞后接种于T75培养瓶进行培养，至细胞生长90％融合时，消化传代。第2代时在显微镜下观察到细胞克隆样消失，细胞表现出均匀生长，细胞形态为长梭形，生长过程中形态基本不变，见图3。
对比例1
实施例1的细胞培养至约90％融合时，吸出培养基，PBS漂洗1次，0.25％EDTA-胰蛋白酶，置于37℃、5％CO2培养箱中3min，将培养瓶置于倒置显微镜下观察，见胞质回缩，加入无血清脂肪源间充质干细胞培养液终止消化，吹散细胞后接种于T75培养瓶进行培养，至细胞生长90％融合时，消化传代。第4代时在显微镜下观察到细胞克隆样消失，细胞表现出均匀生长，细胞形态为长梭形，生长过程中形态基本不变，见图4。
实施例4
取腹部脂肪组织，PBS冲洗干净，剪碎至1mm3大小，用0.5g/L I型胶原酶于37℃恒温水浴箱振荡消化1小时至脂肪组织基本液化，加入1.5倍体积量的含体积分数为5％新生牛血清的低糖DMEM培养基终止消化，于200目滤网过滤以去除残留的筋膜组织，PBS重悬细胞，洗涤，1500rpm/min离心6min后去上清，4倍量红细胞裂解液轻微振荡裂解红细胞12min，再次1500rpm/min离心6min后去上清，PBS重悬后离心洗涤2次，用无血清脂肪源间充质干细胞培养液重悬细胞，接种于10mm培养皿，在37℃、5％CO2条件下培养，每3天换液1次。
原代血管基质部分在接种后每天都在显微镜下观察生产状况。对克隆样生长的细胞集落进行标记。当细胞集落中细胞数大于100时，使用克隆环套住细胞集落，吸出培养基，PBS漂洗1次，加入0.25％EDTA-胰蛋白酶，置于37℃、5％CO2培养箱中3min，将培养瓶置于倒置显微镜下观察，见胞质回缩，克隆脱壁，使用移液枪吸出细胞克隆，加入无血清脂肪源间充质干细胞培养液终止消化，吹散细胞后接种于T75培养瓶进行培养，至细胞生长至85％融合时，消化传代。
实施例5
取腹部脂肪组织，PBS冲洗干净，剪碎至1mm3大小，用1.5g/LI型胶原酶于37℃恒温水浴箱振荡消化1小时至脂肪组织基本液化，加入2.5倍体积量的含体积分数为15％新生牛血清的低糖DMEM培养基终止消化，于200目滤网过滤以去除残留的筋膜组织，PBS重悬细胞，洗涤，1700rpm/min离心4min后去上清，6倍量红细胞裂解液轻微振荡裂解红细胞8min，再次1700rpm/min离心4min后去上清，PBS重悬后离心洗涤2次，用无血清脂肪源间充质干细胞培养液重悬细胞，接种于10mm培养皿，在37℃、5％CO2条件下培养，每3天换液1次。
原代血管基质部分在接种后每天都在显微镜下观察生产状况。对克隆样生长的细胞集落进行标记。当细胞集落中细胞数大于100时，使用克隆环套住细胞集落，吸出培养基，PBS漂洗1次，加入0.25％EDTA-胰蛋白酶，置于37℃、5％CO2培养箱中3min，将培养瓶置于倒置显微镜下观察，见胞质回缩，克隆脱壁，使用移液枪吸出细胞克隆，加入无血清脂肪源间充质干细胞培养液终止消化，吹散细胞后接种于T75培养瓶进行培养，至细胞生长至95％融合时，消化传代。
上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种快速从脂肪组织获取间充质干细胞的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)预处理：采集脂肪组织，进行冲洗、剪碎；
(2)酶消化：将步骤(1)得到的脂肪组织加入至胶原酶液中，震荡培养，然后加入DMEM培养基终止消化，进行过滤，得到脂肪细胞；
(3)重悬离心：重悬步骤(2)得到的脂肪细胞得到细胞悬浮液，然后进行洗涤、离心去上清，加入红细胞裂解液进行震荡，然后进行离心去上清，得到细胞沉淀；
(4)培养：将所述细胞沉淀加入无血清脂肪源间充质干细胞培养液进行重悬，在一定的条件下进行培养；
(5)挑选克隆：用显微镜每天观察生产状况，对克隆样生长的细胞集落进行标记，当细胞集落中细胞数大于100时，使用克隆环套住细胞集落，吸出培养基，漂洗，加入EDTA-胰蛋白酶液，培养一定时候后置于显微镜下观察，见胞质回缩，克隆脱壁，使用移液枪吸出细胞克隆，加入无血清脂肪源间充质干细胞培养液终止消化，吹散细胞后继续进行培养，至细胞生长至一定融合度后，消化传代。
2.根据权利要求1所述的一种快速从脂肪组织获取间充质干细胞的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，采集的脂肪组织为腹部脂肪组织，冲洗采用PBS溶液，脂肪组织剪碎至1mm3。
3.根据权利要求1所述的一种快速从脂肪组织获取间充质干细胞的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，胶原酶液中I型胶原酶的浓度为0.5-1.5g/L。
4.根据权利要求1所述的一种快速从脂肪组织获取间充质干细胞的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，DMEM培养基为含有5-15vt％新生牛血清的低糖DMEM培养基，DMEM培养基的体积用量为脂肪组织的1.5-2.5倍。
5.根据权利要求1所述的一种快速从脂肪组织获取间充质干细胞的方法，其特征在于：所述步骤(3)的具体操作为：用PBS液重悬步骤(2)得到的脂肪细胞得到细胞悬浮液，洗涤，1500-1700rpm/min离心4-6min后去上清，加入脂肪组织4-6倍体积量的红细胞裂解液震荡8-12min，然后1500-1700rpm/min离心4-6min后去上清，得到细胞沉淀。
6.根据权利要求1所述的一种快速从脂肪组织获取间充质干细胞的方法，其特征在于：所述步骤(4)中，培养条件为在37℃、5％CO2条件下培养，每3天换液1次。
7.根据权利要求1所述的一种快速从脂肪组织获取间充质干细胞的方法，其特征在于：所述步骤(5)中，EDTA-胰蛋白酶液的浓度为0.25％，加入EDTA-胰蛋白酶液后的培养条件为37℃、5％CO2条件下培养3min。
8.根据权利要求1所述的一种快速从脂肪组织获取间充质干细胞的方法，其特征在于：所述步骤(5)中，细胞生长至85-95％融合度后，消化传代。
CN201910815866.0A 2019-08-30 2019-08-30 一种快速从脂肪组织获取间充质干细胞的方法 Pending CN110499286A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910815866.0A CN110499286A (zh) 2019-08-30 2019-08-30 一种快速从脂肪组织获取间充质干细胞的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910815866.0A CN110499286A (zh) 2019-08-30 2019-08-30 一种快速从脂肪组织获取间充质干细胞的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110499286A true CN110499286A (zh) 2019-11-26

Family

ID=68590721

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910815866.0A Pending CN110499286A (zh) 2019-08-30 2019-08-30 一种快速从脂肪组织获取间充质干细胞的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110499286A (zh)

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1935985A (zh) * 2006-10-13 2007-03-28 扬州大学 一种获得鸡EPGCs单细胞克隆的方法
CN103074298A (zh) * 2013-01-04 2013-05-01 广州爱菲科生物科技有限公司 一种人脂肪间充质干细胞库及其构建方法
CN103184191A (zh) * 2012-12-04 2013-07-03 东南大学 大鼠大网膜脂肪来源间充质干细胞的提取方法和专用培养基
CN106350483A (zh) * 2016-10-14 2017-01-25 中卫华医（北京）生物科技有限公司 诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的培养方法
CN109022358A (zh) * 2018-10-05 2018-12-18 淮安康宜莱干细胞生物科技有限公司 促进人脂肪干细胞增殖的方法
CN109735490A (zh) * 2019-03-06 2019-05-10 福建省海西细胞生物工程有限公司 一种脂肪干细胞提取方法
CN109797136A (zh) * 2019-03-14 2019-05-24 湖南南华爱世普林生物技术有限公司 一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法
CN109852583A (zh) * 2017-11-30 2019-06-07 北京世纪劲得生物技术有限公司 一种人脂肪干细胞的分离培养方法和干细胞库的构建方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1935985A (zh) * 2006-10-13 2007-03-28 扬州大学 一种获得鸡EPGCs单细胞克隆的方法
CN103184191A (zh) * 2012-12-04 2013-07-03 东南大学 大鼠大网膜脂肪来源间充质干细胞的提取方法和专用培养基
CN103074298A (zh) * 2013-01-04 2013-05-01 广州爱菲科生物科技有限公司 一种人脂肪间充质干细胞库及其构建方法
CN106350483A (zh) * 2016-10-14 2017-01-25 中卫华医（北京）生物科技有限公司 诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的培养方法
CN109852583A (zh) * 2017-11-30 2019-06-07 北京世纪劲得生物技术有限公司 一种人脂肪干细胞的分离培养方法和干细胞库的构建方法
CN109022358A (zh) * 2018-10-05 2018-12-18 淮安康宜莱干细胞生物科技有限公司 促进人脂肪干细胞增殖的方法
CN109735490A (zh) * 2019-03-06 2019-05-10 福建省海西细胞生物工程有限公司 一种脂肪干细胞提取方法
CN109797136A (zh) * 2019-03-14 2019-05-24 湖南南华爱世普林生物技术有限公司 一种人脂肪间充质干细胞的分离培养方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
吕品雷等: "脂肪组织血管基质部分中克隆形成细胞治疗膝骨关节炎的能力", 《中国组织工程研究》 *
王红祥等: "人脂肪组织分离培养基质干细胞的方法及其表型鉴定", 《中国临床康复》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104988117B (zh) 从脐带分离和培养间充质干细胞并向软骨细胞诱导分化的方法
CN106754674B (zh) 从人胎盘羊膜制备羊膜间充质干细胞的方法及其应用
CN101451124B (zh) 人脐带间充质干细胞创面涂抹剂的制备和储存应用方法
CN105062959A (zh) 一种人羊膜间充质干细胞的分离培养方法
CN105288737A (zh) 一种组织工程软骨复合支架及其制备方法
CN1912109B (zh) 一种组织工程化脂肪组织的构建方法与应用
CN107653225A (zh) 一种用于扩增人间充质干细胞的培养基及其扩增方法
CN101922048A (zh) 一种脐带间充质干细胞公共库的建库方法
CN108795855A (zh) 一种间充质干细胞的无血清培养基
CN103223194A (zh) 一种用于软骨损伤修复的软骨移植物及其制备方法
CN108220229A (zh) 一种提高脐带来源间充质干细胞原代细胞产量的制备方法
CN108685948A (zh) 一种新型医用细胞修复剂的制备方法
CN106350482A (zh) 一种培养体系及其应用与培养软骨细胞的方法
CN102335459A (zh) 一种以毛囊干细胞和成纤维细胞为基础的毛囊重建方法
CN103275922A (zh) 一种细毛羊毛囊干细胞分离培养方法
CN100564518C (zh) 胎盘羊膜细胞提取物及其在间充质干细胞诱导分化中的应用
CN108138142A (zh) 繁殖用在移植中的间质干细胞（msc）的方法
CN102373175B (zh) 雷洛昔芬在间充质干细胞体外成骨分化中的应用
CN105907701A (zh) 一种小鼠或大鼠真皮成纤维细胞的分离培养方法
CN109628388A (zh) 用消化酶组合物从胎盘血管分离间充质干细胞
CN103087992A (zh) 一种用于软骨损伤修复的改良脂肪干细胞
CN104232575A (zh) 水牛睾丸间质细胞的分离培养方法
KR101719743B1 (ko) 지방 조직으로부터 지방줄기세포를 수득하는 방법
CN102517250B (zh) 兔软骨下骨成骨细胞体外扩增培养方法及应用
CN110499286A (zh) 一种快速从脂肪组织获取间充质干细胞的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination