CN109022358A - 促进人脂肪干细胞增殖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了促进人脂肪干细胞增殖的方法，包括：取新鲜的人脂肪组织，PBS缓冲液冲洗，除去脂肪组织膜和血管后剪成碎块，消化，消化结束后加入完全培养基，200目滤网过滤去除未消化的纤维结缔组织，离心、弃上清去除悬浮的脂肪细胞及脂滴，细胞沉淀重悬于完全培养基，加入红细胞裂解液，混匀后常温解育，离心、去上清；细胞沉淀重悬于完全培养基，接种于培养瓶中，培养24h后换培养液除去未贴壁细胞，之后每3天换液，细胞融合后消化，传代；取传代细胞，消化制成细胞悬液，接种于培养瓶中，培养于完全培养基中培养24h后，更换为含罗汉柏烯酮的完全培养基继续培养。

Description

促进人脂肪干细胞增殖的方法

技术领域

本发明属于生物干细胞领域，涉及一种促进人脂肪干细胞增殖的方法。

背景技术

脂肪干细胞是脂肪组织中一类多能干细胞，其在体内外特定的条件下，可分化形成多种细胞类型，如脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、神经细胞、肌肉细胞等。目前，脂肪干细胞辅助自体脂肪游离移植已被证实可以有效提高移植脂肪的存活率。相对于骨髓基质来源干细胞，脂肪干细胞被认为是作为细胞辅助脂肪移植的最佳选择，因为通过抽脂术就可以获得大量的脂肪干细胞。脂肪干细胞作为脂肪组织的一种前体细胞，参与各种脂肪组织重建，包括生长发育、病理性肥胖、损伤后或缺氧后的修复，以及机械力诱导的组织扩张。

在细胞移植组织重建的过程中，需要为新组织的形成提供足够的细胞来源。但是，多数情况下，移植的细胞不能很好地存活和增殖，因此，找到合适的药物或生长因子等来促进移植的干细胞增殖对于提高干细胞移植治疗的效果至关重要。

茅术醇和沉香螺环醇为一对同分异构体，仅个别碳原子的手性不同；罗汉柏烯酮是一种具有烯酮结构的倍半萜类化合物，其化学结构如下。

目前尚未见茅术醇、沉香螺环醇和罗汉柏烯酮可以促进脂肪干细胞增殖的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种促进人脂肪干细胞增殖的方法。

本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：

一种促进人脂肪干细胞增殖的方法，包括如下步骤：

取新鲜的人脂肪组织，PBS缓冲液冲洗，除去脂肪组织膜和血管后剪成碎块，0.1％Ⅰ型胶原酶和0.25％胰酶37℃消化，期间反复震荡，消化结束后加入完全培养基，200目滤网过滤去除未消化的纤维结缔组织，1200×g离心5min，弃上清去除悬浮的脂肪细胞及脂滴，细胞沉淀重悬于完全培养基，加入6倍体积的红细胞裂解液，混匀后常温解育6min，1200×g离心5min，去上清；细胞沉淀重悬于完全培养基，接种于培养瓶中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养，24h后换培养液除去未贴壁细胞，之后每3天换液，细胞融合后用0.25％胰酶和1mmol/L EDTA37℃消化3～5min，完全培养基终止消化，传代；

取传代细胞，消化制成细胞悬液，接种于培养瓶中，培养于完全培养基中，37℃，5％CO₂培养24h后，更换为含药完全培养基继续培养；

所述含药完全培养基含有有效浓度的罗汉柏烯酮。

优选地，所述完全培养基为含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基。

优选地，按1:2的比例传代。

罗汉柏烯酮在制备促进人脂肪干细胞增殖的培养基中的应用。

本发明发现，罗汉柏烯酮可以有效促进人脂肪干细胞的增殖，且不会影响其多向分化能力，罗汉柏烯酮可以用作添加剂制备促进人脂肪干细胞增殖的培养基。

附图说明

图1为各组450nm测定吸光度；

图2为油红O染色结果，其中：A为对照组染色结果，B为茅术醇组染色结果，C为沉香螺环醇组染色结果，D为罗汉柏烯酮组染色结果；

图3为茜素红染色结果，其中：A为对照组染色结果，B为茅术醇组染色结果，C为沉香螺环醇组染色结果，D为罗汉柏烯酮组染色结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。

一、实验材料

新鲜的人脂肪组织取自腹部脂肪抽脂术者，无传染病及内分泌疾病。

高糖DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司。茅术醇、沉香螺环醇和罗汉柏烯酮自制或购买，纯度大于98％。

细胞计数试剂盒(CCK-8)购自日本株式会社同仁化学研究所。

二、实验方法

1、脂肪干细胞的分离与培养

取新鲜的人脂肪组织，PBS缓冲液冲洗2～3次，除去脂肪组织膜和血管后剪成1mm³大小的碎块，0.1％Ⅰ型胶原酶和0.25％胰酶37℃消化30min，期间反复震荡3次，消化结束后加入完全培养基(含10％胎牛血清的高糖DMEM)，200目滤网过滤去除未消化的纤维结缔组织，1200×g离心5min，弃上清去除悬浮的脂肪细胞及脂滴，细胞沉淀重悬于完全培养基，加入6倍体积的红细胞裂解液，混匀后常温解育6min，1200×g离心5min，去上清；细胞沉淀重悬于完全培养基，接种于培养瓶中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养，24h后换培养液除去未贴壁细胞，之后每3天换液，细胞融合后用0.25％胰酶和1mmol/L EDTA 37℃消化3～5min，完全培养基终止消化，按1:2的比例传代，取第5代细胞进行后续实验。

2、分组及干预

取第5代人脂肪干细胞，按如下组别进行分组干预：

对照组：使用完全培养基培养；

茅术醇组：使用含有10μM茅术醇的完全培养基培养；

沉香螺环醇组：使用含有10μM沉香螺环醇的完全培养基培养；

罗汉柏烯酮组：使用含有10μM罗汉柏烯酮的完全培养基培养。

3、细胞增殖活力测定

取第5代人脂肪干细胞，消化制成细胞悬液，以5×10³/孔接种于96孔培养板上，培养于完全培养基中，37℃，5％CO₂培养24h后，按照上述分组及干预方法更换培养基继续培养24h；培养结束后，每孔加入细胞计数试剂盒中的CCK-8溶液10μL，在细胞培养箱内继续孵育2h后，分别用酶标仪在450nm测定吸光度，每组实验重复3次。

4、诱导验证人脂肪干细胞成骨成脂分化能力

取第5代人脂肪干细胞，消化制成细胞悬液，以2×10⁵个/cm²细胞数接种于培养瓶中，培养于完全培养基中，37℃，5％CO₂培养24h后，按照上述分组及干预方法更换培养基继续培养24h；培养结束后，弃培养基洗涤，消化制成细胞悬液，以5×10³个/cm²细胞数种植于12孔板；分别添加成脂和成骨分化诱导液，每3d换液，分别培养16d和20d后利用油红O染色和茜素红染色。具体步骤为：将人脂肪干细胞漂洗后，4℃、40g/L多聚甲醛固定10min；去离子水漂洗，用1mL的油红O或茜素红室温下染色30min，彻底清洗后显微镜下观察拍照。

成脂分化诱导液为含10％胎牛血清、0.1μM地塞米松、10μM胰岛素、200μM吲哚美辛、0.5mM异丁甲基黄嘌呤的高糖DMEM；成骨分化诱导液为含10％胎牛血清、0.1μM地塞米松、10mMβ-甘油磷酸钠、50μM抗坏血酸的DMEM。

5、数据处理

采用均数±标准差表示，用SPSS17.0统计软件包进行t检验，P＜0.05为有显著性差异。

三、实验结果

1、茅术醇、沉香螺环醇和罗汉柏烯酮对人脂肪干细胞增殖能力的影响

实验结果如表1和图1所示，结果可见，茅术醇、沉香螺环醇和罗汉柏烯酮可以显著促进人脂肪干细胞的增殖，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

表1各组450nm测定吸光度(OD450)

2、茅术醇、沉香螺环醇和罗汉柏烯酮对人脂肪干细胞分化能力的影响

实验结果如图2、3所示，结果可见，各组人脂肪干细胞均具有优异的成脂成骨分化能力，茅术醇、沉香螺环醇和罗汉柏烯酮不会影响人脂肪干细胞的分化能力。

综上可见，茅术醇、沉香螺环醇和罗汉柏烯酮可以有效促进人脂肪干细胞的增殖，且不会影响其多向分化能力，茅术醇、沉香螺环醇和罗汉柏烯酮可以用作添加剂制备促进人脂肪干细胞增殖的培养基。

上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

Claims (4)

1.一种促进人脂肪干细胞增殖的方法，包括如下步骤：

取新鲜的人脂肪组织，PBS缓冲液冲洗，除去脂肪组织膜和血管后剪成碎块，0.1％Ⅰ型胶原酶和0.25％胰酶37℃消化，期间反复震荡，消化结束后加入完全培养基，200目滤网过滤去除未消化的纤维结缔组织，1200×g离心5min，弃上清去除悬浮的脂肪细胞及脂滴，细胞沉淀重悬于完全培养基，加入6倍体积的红细胞裂解液，混匀后常温解育6min，1200×g离心5min，去上清；细胞沉淀重悬于完全培养基，接种于培养瓶中，于37℃、5％CO₂培养箱中培养，24h后换培养液除去未贴壁细胞，之后每3天换液，细胞融合后用0.25％胰酶和1mmol/LEDTA37℃消化3～5min，完全培养基终止消化，传代；

取传代细胞，消化制成细胞悬液，接种于培养瓶中，培养于完全培养基中，37℃，5％CO₂培养24h后，更换为含药完全培养基继续培养；

其特征在于：所述含药完全培养基含有有效浓度的罗汉柏烯酮。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述完全培养基为含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：按1:2的比例传代。

4.罗汉柏烯酮在制备促进人脂肪干细胞增殖的培养基中的应用。