CN110511904A - 高质量多能干细胞的培养基、培养方法及其应用 - Google Patents

高质量多能干细胞的培养基、培养方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及干细胞技术领域，具体涉及高质量多能干细胞的培养基、培养方法及其应用。本发明提供一种新的干细胞培养基(简称AIC培养基)，其为在基础培养基的基础上添加重组人活化素A、IWP2和CHIR99021。该培养基具有成分明确，无血清、无异源动物成分的优势。该培养基支持人多能干细胞通过单细胞传代在Feeder或Matrigel上进行稳定的贴壁培养，以及在低吸附材料上进行高效的悬浮扩增。与其他培养基相比，该培养基培养的人多能干细胞具有更高的单细胞存活率和建系效率，更快的增殖速度、更少的自发分化、更好的均质性和稳定性。AIC培养基具有现有培养体系无法比拟的优势，拥有广阔的应用前景和较高的商业价值。

Description

高质量多能干细胞的培养基、培养方法及其应用
技术领域
本发明涉及干细胞技术领域，具体涉及高质量多能干细胞的培养基、利用该培养基培养多能干细胞的方法及其应用。
背景技术
人多能干细胞(human pluripotent stem cells，hPSCs)包括人胚胎干细胞(human embryonic stem cells，hESCs)和人诱导多能干细胞(human inducedpluripotent stem cells，hiPSCs)，在体外具有无限增殖和自我更新能力，表达Oct4、Sox2和Nanog等核心转录因子，将其注射到免疫缺陷小鼠体内能够形成具有三胚层结构的畸胎瘤，在体外可以分化为特定组织的细胞类型或自我组装生成特定的类器官。理论上，hPSCs在体内和体外都具有分化为所有成体功能细胞的潜能。因此，hPSCs的研究不仅具有重要的理论意义，而且在疾病模型和机制研究、药物筛选、基因修复、细胞治疗(包括细胞分泌物治疗)和人造器官等领域具有广阔的应用前景。对于hPSCs的临床转化研究，截止2018年3月，已有32项临床试验正在开展(Guhr等，Stem Cell Reports，11:485-496,2018)。当前，hPSCs的研究依然处于蓬勃发展阶段，并在未来的医药大健康领域将会具有广阔的应用前景。
然而，目前限制hPSCs进行临床转化和药物筛选等相关应用的一个关键的障碍是缺乏稳定的、可大量扩增的技术，因此，对于广泛的研究应用和病患需求，现有技术条件无法满足短时间内生产出足够数量的高质量hPSCs。截至目前，世界范围内主流的hPSCs的培养基有五种，但都存在着各自的缺陷，从而制约了hPSCs的应用推广和临床转化进度，上述五种培养基及其缺陷如下：
1.在KSR/bFGF基础上发展起来的传统培养基：包括KSR/bFGF，mTeSR(Stem CellTechnologies)，E8(Thermo Fisher Scientific)和PSGro(StemRD)等，这些培养基都是在1998年Thomson实验室建立的培养体系(Thomson等,Science,282:1145-1147,1998)基础上衍生而来，这些培养基培养的hPSCs拥有相似的细胞特性，是当前hPSCs培养使用最为广泛的一类培养基。对于应用而言，这类培养基具有以下缺陷：(1)单细胞活力低(Gafni等,Nature，504:282-286,2013)，通常采用团块传代，传代时难以稳定控制团块的大小，影响细胞的均质性，培养获得的hPSCs的质量和数量都具有较大的波动，稳定性差，增加细胞培养的操作难度，不利于对细胞进行基因编辑和工业化生产(尽管使用Rock/Rho的抑制剂可以提高hPSCs的单细胞存活率，但该抑制剂的使用容易诱发hPSCs发生分化，不利于多能性的稳定维持)；(2)悬浮培养是hPSCs进行规模化扩增的最好方法，但hPSCs在传统的悬浮培养条件下增殖速度慢，单位时间内的细胞产量低(Lipsitz等,Proc Natl Acad Sci U S A,115:6369-6374,2018)，不利于短时间内获得足够的细胞数量；(3)存在普遍的自发分化(Kurek等,Stem Cell Reports,4:114-128,2015)，不能获得均质的未分化细胞，细胞质量无法保证。因此，这些缺陷严重限制了传统培养体系下的hPSCs的应用和临床转化。
2.NHSM培养基(Gafni等,Nature,504:282-286,2013)是2013年Hanna实验室建立的一种hPSCs的新培养基，该培养基的缺陷如下：不能支持hPSCs长期进行悬浮培养(Lipsitz等,Proc Natl Acad Sci U S A,115:6369-6374，2018)，无法规模化生产出均质的细胞；依赖Feeder(饲养层细胞)/Matrix(基质胶，含异源动物成分)进行贴壁培养，无法达到临床治疗标准。因此NHSM培养基制约了hPSCs的应用并且不适合用于临床转化。
3.培养基：2014年，Jaenisch实验室和Smith实验室先后建立了5i/LA培养基(Theunissen等,Cell Stem Cell,15:471-487,2014)和培养基(Takashima等,Cell,158:1254-1269,2014)，两种不同体系下培养的hPSCs表现出相似的细胞特性，都依赖Feeder/Matrigel(含异源动物成分)进行贴壁培养，细胞活力差并存在普遍的印记基因异常和核型畸变。因此，这两个体系下培养的hPSCs都存在严重的缺陷，不适合用于临床转化。
4.3i/L体系(Chan等,Cell Stem Cell,13:663-675，2013)是2013年Ng实验室建立的一种hPSCs的新培养体系，该体系依赖Feeder(含异源动物成分)进行贴壁培养，无法达到临床治疗标准。因此不适合用于临床转化。
5.扩展多能干细胞(Expanded potential stem cells)培养体系，主要包括两个体系：分别为2017年Deng’s实验室建立的LCDM(Yang等,Cell,169:243-257,2017)和2019年Liu’s实验室建立的另一种培养体系(Gao等,Nature cell biology,21:687-699,2019)，这两个体系培养的hPSCs同时具有胚外和胚内细胞谱系分化的潜能，但它们都依赖Feeder(含异源动物成分)进行贴壁培养，无法达到临床治疗标准。因此不适合用于临床转化。
综上所述，最近开发的hPSCs培养体系都依赖Feeder/Matrix进行二维的贴壁培养，导致异源动物成分引入且不易进行规模化扩增，不适合用于临床转化。因此，当前有关hPSCs临床转化的研究，都是基于传统的培养体系，但传统培养体系存在诸多缺陷，无法满足多能干细胞研究和应用对于细胞数量和质量的要求。因此，亟需开发能够高效建立和扩增、并获得高质量多能干细胞的培养基。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种能够高效建立和扩增高质量的多能干细胞的培养基，以及利用该培养基进行多能干细胞的建系、贴壁培养和悬浮扩增的方法及其应用。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供一种干细胞培养基，包含基础培养基、重组人活化素A(Activin-A)、Wnt信号通路抑制剂和糖原合酶激酶-3(GSK3)抑制剂。
优选地，所述Wnt信号通路抑制剂包括小分子化合物IWP2，所述糖原合酶激酶-3(GSK3)抑制剂包括小分子化合物CHIR99021。
本发明发现在用于干细胞培养的基础培养基的基础上加入Activin-A、IWP2和CHIR99021能够显著提高干细胞的单细胞克隆率(存活率)和增殖速度，同时有效抑制干细胞的自发分化并减少其异质性，保证干细胞多能性的稳定维持。
本发明中，所述干细胞优选为多能干细胞。更优选为人多能干细胞或非人灵长类多能干细胞。
优选地，所述干细胞培养基中，所述重组人活化素A的浓度为2～30ng/mL；所述IWP2的浓度为0.5～5μM；所述CHIR99021的浓度为0.2～3μM。
更优选地，所述干细胞培养基中，所述重组人活化素A的浓度为5～20ng/mL；所述IWP2的浓度为2～5μM；所述CHIR99021的浓度为0.2～2μM。本发明发现，以上述浓度添加Activin-A、IWP2和CHIR99021能够更好地促进干细胞的单细胞克隆率和增殖速度的提高，更有效地维持干细胞的多能性。
优选地，所述基础培养基包含选自DMEM/F12、Neurobasal中的一种或两种以及N2添加剂和B27添加剂。
更优选地，所述基础培养基还包含谷氨酰胺或其衍生物、非必需氨基酸和抗氧化剂。
所述谷氨酰胺衍生物包括但不限于GlutaMAX。
所述抗氧化剂为选自β-巯基乙醇、维生素C或其盐中的一种或多种。
优选地，所述干细胞培养基中，Neurobasal和DMEM/F12的体积比为(0～1):1。
更优选地，所述干细胞培养基中，N2添加剂的体积百分含量为0.25～1％，B27添加剂的体积百分含量为0.5～2％。
更优选地，所述干细胞培养基中，谷氨酰胺或其衍生物的摩尔浓度为0.1～5mM，非必需氨基酸的体积百分含量为0.5～1％，β-巯基乙醇的浓度为0.01～0.2mM，维生素C或其盐的浓度为1～200μg/mL。
作为本发明的优选方案，所述干细胞培养基包含如下组分：体积比为1：(0.2～1)的DMEM/F12和Neurobasal，N2添加剂0.25～1％，B27添加剂0.5～2％，GlutaMAX 1～2mM，非必需氨基酸0.5～1％，β-巯基乙醇0.05～0.1mM，左旋抗坏血酸-2-磷酸镁盐20～100μg/mL，重组人活化素A5～20ng/mL，IWP2 2～5μM，CHIR99021 0.2～2μM。
本发明中，所述非必需氨基酸优选包含L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-丝氨酸。
优选地，所述非必需氨基酸中，L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-丝氨酸的浓度均为10mM。
作为本发明的更优选方案，所述干细胞培养基包含如下组分：体积比为1：1的DMEM/F12和Neurobasal，N2添加剂0.5～1％，B27添加剂1～2％，GlutaMAX 1-2mM，非必需氨基酸0.5～1％，β-巯基乙醇0.05～0.1mM，左旋抗坏血酸-2-磷酸镁盐20～100μg/mL，重组人活化素A 10～20ng/mL，IWP2 2～5μM，CHIR99021 0.3～0.6μM。
本发明所述的干细胞培养基还可进一步含有ROCK1抑制剂；所述ROCK1抑制剂包括但不限于Y27632。所述Y27632的浓度优选为1～10μM。
本发明所述的干细胞培养基不包含血清成分和异源动物成分。
本发明还提供所述干细胞培养基在干细胞培养或建系中的应用。
上述应用可采用在Feeder或Matrigel上进行干细胞的贴壁培养或在低吸附材料上进行悬浮培养。
本发明中，所述干细胞优选为多能干细胞。更优选为人多能干细胞或非人灵长类多能干细胞。
上述建系可通过体细胞重编程或直接通过囊胚建系的方式进行。
本发明还提供一种干细胞的培养方法，其为利用所述干细胞培养基进行干细胞的培养。
优选地，所述培养为将干细胞接种于含Feeder或Matrigel的体系中进行贴壁培养，或者将干细胞接种于低吸附材料上进行悬浮培养。
本发明提供的干细胞培养基能够实现：(1)干细胞在Feeder上贴壁培养进行高效的建系和单细胞传代扩增；(2)干细胞在Matrigel上贴壁培养进行高效的建系和单细胞传代扩增；(3)干细胞在低吸附材料上通过单细胞传代进行高效的悬浮扩增。
上述干细胞优选为多能干细胞。更优选为人多能干细胞或非人灵长类多能干细胞。
上述低吸附材料包括但不限于低吸附多孔培养板。
本发明的有益效果至少包括：
本发明提供了一种新的干细胞培养基(AIC培养基)，与现有的多能干细胞培养基相比，该培养基至少具有如下优势：
1、成分明确、不含血清、无异源动物成分，成本低廉；
2、能够支持多能干细胞在Feeder/Matrigel上进行高效的单细胞传代扩增，具有更高的单细胞克隆率：在Feeder上培养时，当不添加Y27632时，hPSCs具有超过60％的单细胞克隆(存活)率(而传统的KSR/bFGF体系只有5％左右)；当添加10μM Y27632时，hPSCs具有超过80％的单细胞克隆(存活)率(而传统的KSR/bFGF体系只有20％左右)；高的单细胞克隆(存活)率能够有效促进多能干细胞进行基因编辑，这不仅有利于特定细胞模型的制备和药物筛选，而且也能通过基因修复推动hPSCs的临床转化；
3、更适合直接通过着床前囊胚建立临床级的胚胎干细胞系，具有更高的建系成功率：在无feeder条件下，利用该培养基的建系成功率高达60％，而利用传统的KSR/bFGF体系，即使在feeder上的建系成功率也只有10％；
4、更适合通过体细胞重编程建立临床级的诱导多能干细胞：在Feeder/Matrigel上，与传统的KSR/bFGF体系相比，AIC培养基具有更高的重编程效率和更快的重编程速度；
5、能够支持通过单细胞传代进行悬浮扩增：与团块传代相比，单细胞传代的操作更为简单，易于工业化生产；悬浮培养有利于实现规模化扩增，能够在短时间内提供大量高质量的多能干细胞用于临床治疗技术的开发、药物的筛选以及疾病机制的研究，也支持通过纯化hPSCs产生的分泌因子和外泌体等，应用于疾病治疗和美容等领域；
6、具有更快的增殖速度：利用该培养基，hPSCs能够在4天扩增20-25倍，是E8或mTeSR培养基的7倍左右(Lipsitz et al.，Proc Natl Acad Sci U S A，115:6369-6374,2018)；利用该培养基可以在更短的时间内获得更多的细胞；
7、能够获得更均质的高质量的多能干细胞：与传统的KSR/bFGF体系相比，AIC培养基培养的hPSCs的分化相关基因显著下调，自发分化被有效抑制，这有利于hPSCs的多能性的稳定维持。
该培养基的上述优势将有利于扩大多能干细胞的应用范围并推进其临床转化。
附图说明
图1为本发明实验例1中将传统培养基培养的hPSCs直接转到实施例1的培养基中培养的hPSCs细胞明场图；其中，标尺长度为500μm。
图2为本发明实验例1中不同培养基对hPSCs的多能性维持、单细胞克隆率和增殖速度的影响分析；其中，A为对不同培养基培养的hPSCs进行OCT4、GATA6和T染色的检测结果，AIC代表实施例1的培养基，w/o CHIR代表对比例2的培养基，p5 D3代表第5代的第3天，w/o IWP2代表对比例3的培养基，p0 D4代表第0代的第4天，w/o Activin-A代表对比例4的培养基，p3 D3代表第3代的第3天；B为对对比例4的培养基培养的hPSCs进行NANOG、SOX2、SOX1和PAX6染色的检测结果；C为单细胞克隆实验拍照；D为单细胞克隆实验统计结果；所有的标尺长度为100μm。
图3为本发明实验例2和实验例4中实施例1的培养基支持hPSCs在Feeder上进行高效的克隆扩增和建系；其中，A为对Feeder上的hPSCs进行多能性标记物NANOG、SOX2、OCT4、E-Cadherin、SSEA-4和TRA-1-60的免疫荧光染色；B为分别对传统培养基和实施例1的培养基培养的三株hPSCs进行单细胞克隆率分析；C为在实施例1的培养基的培养条件下，将人的成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞的的形态变化；D为在实施例1的培养基的培养条件下获得的诱导多能干细胞表达正常的多能性标记物NANOG和OCT4；E和F为碱性磷酸酶染色分析重编程效率的结果，Conventional代表传统培养基，AIC代表实施例1的培养基；所有的标尺长度为100μm。
图4为本发明实验例3、实验例4和实验例5中实施例1的培养基支持AIC培养体系支持hPSCs在Matrigel上进行高效的单细胞传代扩增和建系；其中，A为在实施例1的培养基中，将培养在Feeder上的hPSCs转到Matrigel上培养的细胞明场图；B为在实施例1的培养基的培养条件下，对Matrigel上培养的hPSCs进行多能性标记物NANOG、SOX2、OCT4、E-Cadherin、SSEA-4和TRA-1-60的免疫荧光染色；C为在实施例1的培养基的培养条件下，三株hPSCs在Matrigel上培养的生长曲线；D为在实施例1的培养基的培养条件下，将人的成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞的形态变化；E和F为碱性磷酸酶染色检测重编程效率的结果，Conventional代表传统培养基，AIC代表实施例1的培养基；G和H为实施例1的培养基与传统培养基的培养条件下，通过囊胚进行人胚胎干细胞系的建系过程及其效率比较；所有的标尺长度为100μm。
图5为本发明实验例6中实施例1的培养基支持hPSCs在悬浮条件下进行单细胞传代扩增；其中，A为在实施例1的培养基的培养条件下，将Feeder或Matrigel上贴壁培养的hPSCs转到悬浮培养的示意图及其悬浮培养过程中不同天数的细胞球的明场图；B为传代后第1天至第4天的细胞球的直径的测量和统计；C为悬浮培养的三株hPSCs在显示代次的细胞活率的统计；D为悬浮培养的三株hPSCs的生长曲线；E为收集悬浮培养的hPSCs球进行标记物NANOG、SOX2、OCT4、E-Cadherin、SSEA-4和TRA-1-60冰冻切片染色；F为将悬浮培养的hPSCs球消化为单细胞并进行标记物OCT4、NANOG、TRA-1-60和SSEA-4的流式分析；所有的标尺长度为100μm。
图6为本发明实验例2～6中对实施例1的培养基的培养条件下培养的hPSCs和建立的hPSCs系进行多能性鉴定的结果；其中，A为畸胎瘤实验结果，在实施例1的培养基的培养条件下，培养在饲养层(AIC-F)、基质胶(AIC-M)和悬浮条件下(AIC-S)的hPSCs都具有体内分化为成熟三胚层的能力；B为核型(G-带)分析结果，在实施例1的培养基的培养条件下，培养在饲养层(AIC-F)、基质胶(AIC-M)和悬浮条件下(AIC-S)的hPSCs和新建的hPSCs(AIC-M-Bla)都具有正常的核型；C为在实施例1的培养基的培养条件下，在基质胶上直接重编程获得的人诱导多能干细胞表达正常的多能性标记物NANOG和OCT4；D为在实施例1的培养基的培养条件下，在基质胶上直接从人囊胚建立的人胚胎干细胞表达正常的多能性标记物NANOG、SOX2、OCT4、E-Cadherin、SSEA-4和TRA-1-60；所有的标尺长度为100μm。
图7为本发明实验例7中实施例1的培养基培养的hPSCs的基因表达谱；A为PCA分析结果；B为对实施例1的培养基与传统培养基培养的hPSCs进行差异基因分析；C和D为与传统培养基(Conventional)相比，实施例1的培养基在饲养层(AIC Feeder)，基质胶(AICMatrigel)和悬浮培养(AIC Suspension)条件下培养的hPSCs的上调和下调的基因；E为不同培养条件(饲养层，基质胶和悬浮)，高代和低代，以及从传统培养基转化而来的hPSCs与胚胎直接建系而来的hESCs的相关性分析结果，S代表悬浮培养，M代表基质胶培养，F代表Feeder培养，MH代表基质胶培养的高代次细胞，ML代表基质胶培养的低代次细胞，SL代表悬浮培养的低代次细胞，SH代表悬浮培养的高代次细胞；h1、h2、h3、H1、S4、H9分别代表不同细胞系的名称：其中h1、h2、h3是在AIC培养基里直接通过着床前囊胚建立的3株人的胚胎干细胞系；H1和H9是培养在传统的KSR/bFGF条件下的2株人的胚胎干细胞系，后转到AIC培养基里进行培养；S4是培养在传统的KSR/bFGF条件下的1株人的诱导多能干细胞系，后转到AIC培养基里进行培养。
图8为本发明实验例7中实施例1的培养基培养的hPSCs的细胞特性；其中，A为实施例1的培养基在饲养层(AIC-F)、基质胶(AIC-M)和悬浮条件下(AIC-S)培养的hPSCs和传统培养基(Conventional)培养的hPSCs的多能性标记物TFCP2L1/KLF17和分化标记物NESTIN/GATA6/GATA3/T的染色结果；B和C为对实施例1的培养基和传统培养基培养的hPSCs进行KEGG通路分析；D为对实施例1的培养基和传统培养基培养的hPSCs进行GO分析。
图9为本发明实验例7中对实施例1的培养基培养的hPSCs进行三胚层谱系定向分化实验分析的结果；其中，A为神经外胚层分化第8天(Day 8)和第15天(Day 15)的形态观察结果以及标记物SOX2、ZO-1和SOX1的免疫荧光染色结果；B为中胚层分化过程中标记物CD144、CD31的免疫荧光染色结果，以及血管样结构形成的(Tube formation)形态观察图；C为内胚层分化过程中标记物GATA6和SOX17的免疫荧光染色结果；所有的标尺长度为200μm。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下各实施例中，非必需氨基酸的配方如下：10mM L-甘氨酸、10mM L-丙氨酸、10mM L-天冬酰胺、10mM L-天冬氨酸、10mM L-谷氨酸、10mM L-脯氨酸和10mM L-丝氨酸。
实施例1多能干细胞培养基(1)
本实施例提供一种多能干细胞培养基(AIC)，其组分如下：
基础培养基：体积比为1：1的DMEM/F12和Neurobasal，N2添加剂1％，B27添加剂2％，GlutaMAX 2mM，非必需氨基酸1％，β-巯基乙醇0.1mM，左旋抗坏血酸-2-磷酸镁盐50μg/ml；
Activin-A 10ng/mL，IWP2 2μM，CHIR99021 0.6μM。
实施例2多能干细胞培养基(2)
本实施例提供一种多能干细胞培养基，其组分如下：
基础培养基：体积比为1：1的DMEM/F12和Neurobasal，N2添加剂1％，B27添加剂2％，GlutaMAX 2mM，非必需氨基酸1％，β-巯基乙醇0.1mM，左旋抗坏血酸-2-磷酸镁盐50μg/ml；
Activin-A 20ng/mL，IWP2 2μM，CHIR99021 0.3μM。
实施例3多能干细胞培养基(3)
本实施例提供一种多能干细胞培养基，其组分如下：
基础培养基：体积比为1：1的DMEM/F12和Neurobasal，N2添加剂1％，B27添加剂2％，GlutaMAX 2mM，非必需氨基酸1％，β-巯基乙醇0.1mM，左旋抗坏血酸-2-磷酸镁盐50μg/ml；
Activin-A 10ng/mL，IWP2 5μM，CHIR99021 0.3μM。
实施例4多能干细胞培养基(4)
本实施例提供一种多能干细胞培养基，其组分如下：
基础培养基：体积比为1：1的DMEM/F12和Neurobasal，N2添加剂1％，B27添加剂2％，GlutaMAX 2mM，非必需氨基酸1％，β-巯基乙醇0.1mM，左旋抗坏血酸-2-磷酸镁盐50μg/ml；
Activin-A 20ng/mL，IWP2 5μM，CHIR99021 0.6μM。
对比例1
本对比例提供一种多能干细胞培养基，其组分如下：
基础培养基：同实施例1。
对比例2
本对比例提供一种多能干细胞培养基，其组分如下：
基础培养基：同实施例1；
Activin-A 10ng/mL，IWP2 2μM。
对比例3
本对比例提供一种多能干细胞培养基，其组分如下：
基础培养基：同实施例1；
Activin-A 10ng/mL，CHIR99021 0.6μM。
对比例4
本对比例提供一种多能干细胞培养基，其组分如下：
基础培养基：同实施例1；
IWP2 2μM，CHIR99021 0.6μM。
对比例5
本对比例提供一种多能干细胞培养基，其组分如下：
基础培养基：同实施例1；
Activin-A 50ng/mL，IWP2 1μM，CHIR99021 0.3μM。
对比例6
本对比例提供一种多能干细胞培养基，其组分如下：
基础培养基：同实施例1；
Activin-A 10ng/mL，IWP2 0.5μM，CHIR99021 1μM。
对比例7
本对比例提供一种多能干细胞培养基，其组分如下：
基础培养基：同实施例1；
Activin-A 10ng/mL，IWP2 1μM，CHIR99021 3μM。
实验例1多能干细胞培养基对hPSCs的多能性维持、单细胞克隆率和增殖速度的影响分析
分别利用实施例1～4和对比例1～7的多能干细胞培养基将hPSCs在Feeder上培养，通过免疫荧光染色法检测相关多能性标记物和分化标记物OCT4、GATA6和T的表达情况，具体如下：
采用50％TrypLE将传统的KSR/bFGF培养基(在基础培养基DMEM/F12的基础上，添加15％血清替代品KSR、1％非必须氨基酸、0.1mMβ-巯基乙醇和5ng/ml碱性成纤维生长因子bFGF)培养的hPSCs消化为单细胞，离心去上清后，分别利用添加了5μM Y27632的实施例1～4和对比例1～7的多能干细胞培养基重悬细胞，并以96孔板每个孔1500个细胞的细胞密度接种至MEF Feeder上，48小时后，吸去旧培养基，换液新鲜的实施例1的多能干细胞培养基。于第4天(或96小时)后进行免疫荧光染色法检测，结果如表1所示。将传统培养基培养的hPSCs直接转到AIC培养体系的细胞形态如图1所示。利用实施例1与对比例2、3和4的培养基培养的hPSCs的免疫荧光染色法检测结果(OCT4、GATA6和T)如图2的A所示。
表1多能性标记物和分化标记物的表达检测
注：对于所有显示的标记物，“-”表示几乎没有，“+”表示小于5％；对于标记物OCT4，“++”表示50-80％,“+++”表示95-98％，“++++”表示接近于100％。对于标记物GATA6，“++”表示20-50％，“+++”表示超过95％。
上述结果表明，与实施例1的培养基相比，对比例2的培养基对于OCT4的表达没有明显影响，对比例3的培养基导致OCT4的表达快速消失以及GATA6/T阳性的分化细胞快速产生，对比例4的培养基造成OCT4阳性的细胞缓慢减少。
进一步采用免疫荧光染色法检测利用实施例1、对比例2～4的培养基培养的hPSCs的NANOG、SOX2、SOX1和PAX6的表达情况，分析不同培养基对hPSCs往神经命运分化的影响。结果如图2的B所示，结果显示，多能干细胞集落的部分细胞不再表达多能性标记物NANOG，但所有细胞一致地高表达SOX2，表明多能干细胞往神经方向分化，SOX1和PAX6的染色进一步证实了神经分化的发生。结果表明，与实施例1的培养基相比，对比例4的培养基诱导hPSCs往神经命运分化。
进一步针对利用实施例1、对比例2～4的培养基培养的hPSCs进行单细胞克隆实验，结果如图2的C和D所示，实施例1的培养基培养的hPSCs具有较高的单细胞克隆率和细胞集落平均面积，而不添加CHIR99021的对比例2导致单细胞克隆率显著降低，同时细胞集落的平均面积显著减少。
实验例2在Feeder上贴壁培养hPSCs
利用实施例1的多能干细胞培养在Feeder上进行hPSCs的贴壁培养，以传统的KSR/bFGF培养基作为对照：
1、细胞培养：采用50％TrypLE将传统的KSR/bFGF培养基培养的hPSCs消化为单细胞，离心去上清后，用添加了5μM Y27632的实施例1的多能干细胞培养基重悬细胞，并以3.5×103个细胞/cm2的细胞密度接种至Feeder上，24小时后，吸去旧培养基，换液新鲜的实施例1的多能干细胞培养基。培养3～4天后，采用50％TrypLE消化hPSCs，1:5-1:10传代至新的Feeder。后续传代培养过程中，例行地，每2天换液一次，每3～4天传代一次。
2、细胞冻存：将消化为单细胞的hPSCs重悬到预冷的冻存液中，将细胞悬液加入至冻存管，500μl/管，每管包含1×105-1×107个细胞。然后将含有细胞悬液的冻存管放入程序降温盒，-80℃冰箱过夜后，转入液氮长期保存。
冻存液配方如下：45％FBS+45％实施例1的多能干细胞培养基+10％DMSO+10μMY27632，现用现配，使用前在2-8℃冰箱预冷10分钟。冻存管规格：2ml。
利用免疫荧光染色法检测培养得到的hPSCs的多能性标记物，结果如图3的A所示，培养在feeder上的hPSCs一致地表达正常的多能性标记物NANOG、SOX2、OCT4、E-Cadherin、SSEA-4和TRA-1-60；并且维持正常的核型(图6的B)。
分别对传统培养基和实施例1的培养基培养的三株hPSCs进行单细胞克隆率分析，单细胞克隆率统计结果如图3的B所示，实施例1的培养基培养得到的hPSCs能够保持很高的单细胞克隆率(存活率)，单细胞克隆率与传统培养基相比显著提高：当不添加Y27632时，单细胞克隆率不低于60％(传统培养基只有5％左右)；当添加10μM Y27632时，单细胞克隆率不低于80％(传统培养基只有20％左右)。结果表明，实施例1的培养基能高效地支持hPSCs在feeder上进行单细胞传代扩增。
小鼠畸胎瘤实验结果如图6的A所示，将培养得到的hPSCs注射到免疫缺陷小鼠皮下后能够形成具有典型三胚层结构的畸胎瘤。
实验例3在Matrigel上贴壁培养hPSCs
hPSCs的培养和扩增过程中，摆脱对feeder的依赖一直是其临床转化的关键。当前5种常用的培养基中，传统培养基中的KSR/bFGF，3i/L，和EPS体系培养hPSCs的过程中都依赖于feeder。
利用实施例1的多能干细胞培养基在Matrigel上进行hPSCs的贴壁培养，以传统的KSR/bFGF培养基作为对照：
1、细胞培养：采用50％TrypLE将传统的KSR/bFGF培养基培养的hPSCs消化为单细胞，离心去上清后，用添加了5μM Y27632的实施例1的多能干细胞培养基重悬细胞，并以3.5×103个细胞/cm2的细胞密度接种至Matrigel上，24小时后，吸去旧培养基，换液新鲜的实施例1的多能干细胞培养基。培养3～4天后，采用50％TrypLE消化hPSCs，1:5-1:10传代至新的Matrigel上。后续传代培养过程中，例行地，每2天换液一次，每3～4天传代一次。
2、细胞冻存：将消化为单细胞的hPSCs重悬到预冷的冻存液中，将细胞悬液加入冻存管，500μl/管，每管包含1×105-1×107个细胞。然后将含有细胞悬液的冻存管放入程序降温盒，-80℃冰箱过夜后，转入液氮长期保存。
冻存液配方：45％FBS+45％实施例1的多能干细胞培养基+10％DMSO+10μMY27632，现用现配，使用前在2-8℃冰箱预冷10分钟。冻存管规格：2ml。
将培养在Feeder上的hPSCs转到Matrigel上培养的细胞形态如图4的A所示。
利用免疫荧光染色法检测培养得到的hPSCs的多能性标记物，结果如图4的B所示，培养在feeder上的hPSCs一致地表达正常的多能性标记物NANOG、SOX2、OCT4、E-Cadherin、SSEA-4和TRA-1-60，维持正常的核型(图6的B)。
小鼠畸胎瘤实验结果如图6的A所示，将培养得到的hPSCs注射到免疫缺陷小鼠皮下后能够形成具有典型三胚层结构的畸胎瘤，表明利用实施例1的培养基可以不依赖feeder维持hPSCs的多能性。
三株hPSCs(胚胎干细胞H9、hES1和诱导多能干细胞S4)在Matrigel上培养的细胞生长曲线如图4的C所示，结果表明，三株hPSCs均具有较高的增殖速度(4天能够扩增16倍)。
实验例4在Feeder或Matrigel上将体细胞重编程为诱导多能干细胞
利用实施例1的多能干细胞培养基分别在Feeder或Matrigel上将人成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞，以传统的KSR/bFGF培养基作为对照。
利用实施例1的培养基培养，在Feeder上将人成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞的细胞形态变化如图3的C所示。诱导多能干细胞的多能性标记物NANOG和OCT4的免疫荧光检测结果如图3的D所示，结果表明，诱导多能干细胞一致地表达正常的多能性标记物NANOG和OCT4，维持正常的核型(图6的B)。碱性磷酸酶染色分析结果表明(图3的E和F)，在诱导多能干细胞的诱导过程中，实施例1的培养基比传统培养基具有更高的重编程效率。
利用实施例1的培养基培养，在Matrigel上将人成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞的细胞形态变化如图4的D所示。诱导多能干细胞的多能性标记物NANOG和OCT4的免疫荧光检测结果如图6的C所示，结果表明，诱导多能干细胞一致地表达正常的多能性标记物NANOG和OCT4。碱性磷酸酶染色分析结果表明(图4的E和F)，在诱导多能干细胞的诱导过程中，实施例1的培养基比传统培养基具有更高的重编程效率。
实验例5直接通过囊胚在Matrigel上建立新的人胚胎干细胞系
利用实施例1的多能干细胞培养基直接通过囊胚在Matrigel上建立新的人胚胎干细胞系，以传统的KSR/bFGF培养基作为对照：
1、人胚胎干细胞建系：将实施例1的多能干细胞培养基至少提前1小时放入37℃、21％O2和5％CO2的饱和湿度的细胞培养箱进行预平衡。解冻着床前囊胚(受精后5-6天)，采用0.5％Protease快速去除透明带，然后接种至Matrigel铺板的96孔板，每孔加入150μl实施例1的多能干细胞培养基，添加10μM Y27632。
接种后48h，胚胎完全贴壁，此时在显微镜下观察会有两种情况：(1)能够观察到明显的hESC样的细胞集落；(2)不能观察到明显的hESC样的细胞集落。对于前者，用特制的玻璃针轻轻的将hESC样的细胞集落从整个胚胎中挑出来，进行50％TrypLE消化；对于后者，直接用50％TrypLE对整个胚胎进行消化。上述两种情况均在培养箱中消化5-10分钟，然后将消化的hESC样细胞集落或者整个胚胎转移到实施例1的多能干细胞培养基液滴里，用玻璃针轻轻的在显微镜下来回吸吹，将其吹为小的细胞团块，每个小团块含5-10个细胞。最后，将消化的小细胞团块接种至新的Matrigel铺板的96孔板，每孔加入150μl实施例1的多能干细胞培养基，添加10μM Y27632。每2天换液一次。消化后2～4天，增殖的hESC集落变得明显，然后继续培养到5～7天，可以对其进行消化传代。自此，新的人胚胎干细胞系建系成功，例行地，在Matrigel上培养，每3-4天传代一次，传代比例为1:5～1:10。
2、细胞冻存：将消化为单细胞的hPSCs重悬到预冷的冻存液中，将细胞悬液加入冻存管，500μl/管，每管包含1×105-1×107个细胞。然后将含有细胞悬液的冻存管放入程序降温盒，-80℃冰箱过夜后，转入液氮长期保存。
冻存液配方：45％FBS+45％实施例1的多能干细胞培养基+10％DMSO+10μMY27632，现用现配，使用前在2-8℃冰箱预冷10分钟。冻存管规格：2ml。
直接通过囊胚在Matrigel上建立新的人胚胎干细胞系的建系效率统计结果如图4的G和H所示，结果表明，与传统培养基相比，实施例1的培养基具有更高的建系效率。
利用免疫荧光染色法检测培养得到的hPSCs的多能性标记物，结果如图6的D所示，新建的人胚胎干细胞系表达正常的多能性标记物NANOG,SOX2,OCT4,E-Cadherin,SSEA-4和TRA-1-60，并且维持正常的核型(图6的B)。
实验例4和5的结果表明，在实施例1的培养基培养条件下，无论通过体细胞重编程进行诱导多能干细胞建系还是直接通过人的囊胚进行人胚胎干细胞建系，都能高效地建立新的人多能干细胞系，建系成功率显著高于传统培养基。新建立的细胞系一致地表达正常的多能性标记物并能维持正常的核型。利用本发明提供的多能干细胞培养基可以从源头上摆脱对Feeder的依赖，进而建立临床级的人多能干细胞系，为人多能干细胞的临床治疗奠定基础。
实验例6在低吸附材料上悬浮培养hPSCs
利用实施例1的多能干细胞培养基在低吸附材料上进行hPSCs的悬浮培养：
1、细胞培养：利用实施例1的多能干细胞培养基在Feeder或Matrigel上培养hPSCs，采用50％TrypLE将hPSCs消化为单细胞，离心去上清后，用添加了10μM Y27632的实施例1的多能干细胞培养基重悬细胞，并以1×105个细胞/孔的细胞密度接种至超低吸附的6孔板。培养48小时后，将细胞聚集物收集转移到15ml离心管，100×g的离心力离心2分钟，去上清，用添加了5μM Y27632的实施例1的多能干细胞培养基重悬细胞聚集物，并重新接种至超低吸附的6孔板。培养96小时后，将细胞聚集物再次收集转移到15ml离心管，100×g的离心力离心2分钟，采用50％TrypLE将细胞聚集物消化为单细胞，离心去上清后，用添加了10μM Y27632的实施例1的多能干细胞培养基重悬细胞，并以1×105个细胞/孔的细胞密度接种至超低吸附的6孔板进行传代培养。后续传代培养过程中，例行地，每2天换液一次，每4天传代一次。培养流程示意图如图5的A所示。
在悬浮培养过程中，根据不同的hPSCs细胞系对Y27632的依赖程度不同，决定在换液和传代过程中是否需要添加Y27632。
2、细胞冻存：将消化为单细胞的hPSCs重悬到预冷的冻存液中，将细胞悬液加入冻存管，500μl/管，每管包含1×105-1×107个细胞。然后将含有细胞悬液的冻存管放入程序降温盒，-80℃冰箱过夜后，转入液氮长期保存。冻存液配方：45％FBS+45％实施例1的多能干细胞培养基+10％DMSO+10μM Y27632，现用现配，使用前在2-8℃冰箱预冷10分钟。冻存管规格：2ml。
实验结果显示，将培养在Feeder或Matrigel上的hPSCs消化为单细胞后接种至低吸附材料上，利用实施例1的培养基，细胞能够进行长期、高效的悬浮扩增。
悬浮培养过程中不同天数的细胞球的明场图如图5的A所示。传代后第1天至第4天的细胞球的直径的测量和统计如图5的B和表2所示，单细胞传代扩增过程中，hPSCs能够形成均质的聚集物，聚集物紧凑致密，边缘光滑透亮。
表2悬浮培养的人多能干细胞球体的直径测量
细胞活率统计结果如图5的C所示，悬浮培养的三株hPSCs保持较高的细胞活率(97％左右)。
悬浮培养的三株hPSCs的生长曲线如图5的D所示，悬浮培养的hPSCs具有很高的增殖速度(4天能够扩增25倍左右)，是传统培养基的7倍左右(Lipsitz et al.,Proc NatlAcad Sci U S A,115:6369-6374,2018)。
收集悬浮培养的hPSCs球进行NANOG,SOX2,OCT4,E-Cadherin，SSEA-4和TRA-1-60标记物的冰冻切片染色，结果如图5的E所示，结果表明，悬浮培养的hPSCs一致地表达正常的多能性标记物；并且维持正常的核型(图6的B)。
将悬浮培养的hPSCs球消化为单细胞并进行标记物OCT4，NANOG，TRA-1-60和SSEA-4的流式分析，结果如图5的F所示，低代次(p5)和高代次(p30)的hPSCs都表达高比例的多能性标记物OCT4，NANOG，TRA-1-60和SSEA-4，表明AIC培养基能够长期稳定维持hPSCs的多能性。
将悬浮培养的hPSCs注射到免疫缺陷小鼠皮下后能够形成具有典型三胚层结构的畸胎瘤(图6的A)。
实验例7培养获得的hPSCs的基因表达谱和细胞特性分析
对实验例2、3和6中培养获得的多种hPSCs的基因表达谱和细胞特性进行分析。
全基因组表达谱分析结果显示(图7和图8)，与其他几种培养体系相比，利用实施例1的培养基培养的hPSCs的代谢相关基因和氧化磷酸化水平都处于更活跃的状态(图7的B、C和D)，这与前述实验结果中利用实施例1的培养基培养的hPSCs具有更快的增殖速度以及悬浮培养条件下AIC-M的细胞产量是传统培养条件的7倍左右的实验结果相一致。另外，PCA分析显示，与其他几种培养体系相比，利用实施例1的培养基培养的hPSCs与传统的KSR/bFGF培养基培养的hPSCs具有相似的基因表达谱(图7的A)。对利用实施例1的培养基培养的hPSCs和传统体系下培养的hPSCs进行KEGG通路分析和GO分析(图8的B、C和D)。
相关性分析结果显示(图7的E)，不同培养条件(饲养层，基质胶和悬浮)，高代和低代，以及从传统培养基转化而来的hPSCs与胚胎直接建系而来的hESCs都保持较高的相关性，表明实施例1的培养基能够很好地支持hPSCs稳定维持其多能性。
体外分化实验表明，实施例1的培养基与传统体系下培养的hPSCs响应相似的信号诱导(图9)，表明针对传统的hPSCs开发的一系列定向分化的操作方法都可以适用于实施例1的培养基培养的hPSCs。但是，与传统体系培养的hPSCs相比，实施例1的培养基培养的hPSCs的分化相关基因显著下调(图7的B、C和D)；与传统培养体系相比，实施例1的培养基培养的hPSCs不是 hPSCs，没有自发分化，具有更均质的多能状态(图8的A)。因此，实施例1的培养基更易于获得均质的高质量的hPSCs，这解决了hPSCs领域长期未能解决的细胞质控问题。
本发明针对多株hPSCs细胞系均进行了实验例1～7中的实验验证，实验结果表明不同的hPSCs细胞系均获得类似的实验结果，证明了本发明实施例1提供的干细胞培养基对于不同的hPSCs细胞系具有普遍适用性；基于此，在说明书附图中，除少数附图列举了胚胎干细胞H9、hES1和诱导多能干细胞S4等多株hPSCs细胞系的实验结果外(说明书附图中均有相应标注)，绝大部分实验结果仅提供了胚胎干细胞H9的实验结果图。
此外，本发明也就实施例2～4的多能干细胞培养基进行了实验例1～7中的实验验证，实施例2～4的多能干细胞培养基均能获得与实施例1的多能干细胞培养基类似的技术效果。
根据上述结果，不管是基础研究还是临床转化，本发明提供的新的多能干细胞培养基对于细胞增殖速度的提高和分化基因下调的优势，将会极大地推动hPSCs的应用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种干细胞培养基，其特征在于，包含基础培养基、重组人活化素A、Wnt信号通路抑制剂和糖原合酶激酶-3抑制剂。
2.根据权利要求1所述的干细胞培养基，其特征在于，所述Wnt信号通路抑制剂包括小分子化合物IWP2，所述糖原合酶激酶-3抑制剂包括小分子化合物CHIR99021。
3.根据权利要求1或2所述的干细胞培养基，其特征在于，所述干细胞培养基中，所述重组人活化素A的浓度为2～30ng/mL；和/或，所述IWP2的浓度为0.5～5μM；和/或，所述CHIR99021的浓度为0.2～3μM；
优选地，所述干细胞培养基中，所述重组人活化素A的浓度为5～20ng/mL；所述IWP2的浓度为2～5μM；所述CHIR99021的浓度为0.2～2μM。
4.根据权利要求1～3任一项所述的干细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基包含选自DMEM/F12、Neurobasal中的一种或两种以及N2添加剂和B27添加剂；
优选地，所述基础培养基还包含谷氨酰胺或其衍生物、非必需氨基酸和抗氧化剂。
5.根据权利要求4所述的干细胞培养基，其特征在于，所述抗氧化剂为选自β-巯基乙醇、维生素C或其盐中的一种或多种。
6.根据权利要求1～5任一项所述的干细胞培养基，其特征在于，所述干细胞培养基中，Neurobasal和DMEM/F12的体积比为(0～1):1。
7.根据权利要求1～6任一项所述的干细胞培养基，其特征在于，所述干细胞培养基中，N2添加剂的体积百分含量为0.25～1％，B27添加剂的体积百分含量为0.5～2％；
优选地，所述干细胞培养基中，谷氨酰胺或其衍生物的摩尔浓度为0.1-5mM，非必需氨基酸的体积百分含量为0.5～1％，β-巯基乙醇的浓度为0.01～0.2mM，维生素C或其盐的浓度为1～200μg/mL。
8.根据权利要求1～7任一项所述的干细胞培养基，其特征在于，所述干细胞培养基包含如下组分：体积比为1：(0.2～1)的DMEM/F12和Neurobasal，N2添加剂0.25～1％，B27添加剂0.5～2％，GlutaMAX1～2mM，非必需氨基酸0.5～1％，β-巯基乙醇0.05～0.1mM，左旋抗坏血酸-2-磷酸镁盐20～100μg/mL，重组人活化素A5～20ng/mL，IWP22～5μM，CHIR99021 0.2～2μM；
优选地，所述非必需氨基酸包含L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-丝氨酸；
更优选地，所述非必需氨基酸中，L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-丝氨酸的浓度均为10mM。
9.权利要求1～8任一项所述的干细胞培养基在干细胞培养或建系中的应用；
优选地，所述干细胞为多能干细胞；更优选为人多能干细胞或非人灵长类多能干细胞。
10.一种干细胞的培养方法，其特征在于，利用权利要求1～8任一项所述的干细胞培养基进行干细胞的培养；
优选地，所述培养为将干细胞接种于含饲养层细胞或基质胶的体系中进行贴壁培养，或者将干细胞接种于低吸附材料上进行悬浮培养；
更优选地，所述干细胞为多能干细胞。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN111269878A (zh) * 2020-01-19 2020-06-12 武汉大学 一种人多能干细胞转化为扩展多能干细胞的专用培养基及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105849253A (zh) * 2013-09-20 2016-08-10 修复股份有限公司 一种多能干细胞定向分化为功能性心肌的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105849253A (zh) * 2013-09-20 2016-08-10 修复股份有限公司 一种多能干细胞定向分化为功能性心肌的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TOMOYUKI SUMI等: "Epiblast Ground State Is Controlled by Canonical Wnt/bCatenin Signaling in the Postimplantation Mouse Embryo and Epiblast Stem Cells", 《PLOS ONE》 *
TOMOYUKI TSUKIYAMA等: "A Modified EpiSC Culture Condition Containing a GSK3 Inhibitor Can Support Germline-Competent Pluripotency in Mice", 《PLOS ONE》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111269878A (zh) * 2020-01-19 2020-06-12 武汉大学 一种人多能干细胞转化为扩展多能干细胞的专用培养基及其应用
CN111269878B (zh) * 2020-01-19 2022-02-11 深圳市北科生物科技有限公司 一种人多能干细胞转化为扩展多能干细胞的专用培养基及其应用

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