CN104542576A - 一种神经干细胞的冻存液及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种神经干细胞冻存液及其使用方法。该冻存液是在Neurobasal-A medium中含有B-27 Supplement without retinoic acid，L-Glutamine，EGF，FGF，维生素E。该冻存液不仅成低，而且关键是解决了现有的神经干细胞冻存后复苏率低的问题，提高神经干细胞的冻存复苏率。

Description

一种神经干细胞的冻存液及其使用方法

技术领域

本发明属于细胞生物学、神经生物学的技术领域，具体涉及一种神经干细胞冻存液及其使用方法。

背景技术

神经干细胞是一类具有增殖、自我更新能力和多方向分化潜能的细胞群，可分化出神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等神经组织的各类细胞。神经干细胞在体外能分化为中枢神经系统不同类型的细胞，这为研究中枢神经系统的发育提供了良好的模型，另外，移植神经干细胞治疗急、慢性脊髓损伤以及多种神经系统疾病如多发性硬化症，阿尔兹海默病、帕金森病、缺血性脑损伤等具有广阔的临床应用前景。由于神经干细胞低温保存效果的优劣直接影响着神经干细胞的质和量，因此经低温保存后的神经干细胞是否能存活并保持其生物学特性将成为决定移植成功与否的重要因素之。

细胞冻存的过程会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，同时伴随生物性损伤的危险。影响冻存效率的因素主要有：细胞浓度、冷冻速率以及冻存液。细胞悬液通常在加入5％-15％细胞保护剂二甲基亚枫(DMSO)后进行冷冻。常用到的细胞保护剂还有羟乙基淀粉(HES)、聚乙二醇(PEG)等。但是，DMSO会对细胞产生毒性作用，对冻存的干细胞造成不可逆的损伤。为获得来源方便的神经干细胞,开展有效的神经干细胞移植及建立神经干细胞库，改进神经干细胞冻存复苏技术，建立一种长期低温保存神经干细胞的方法对于促进神经干细胞的研究和应用具有重大意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种神经干细胞冻存液及其使用方法，解决现有的神经干细胞冻存后复苏率低的问题，提高神经干细胞的冻存复苏率。

一种神经干细胞冻存液，是在Neurobasal-A medium中含有

所述的神经干细胞冻存液，优选是在Neurobasal-A medium中含有

所述的神经干细胞冻存液的使用方法，是取培养7-10d生长良好的细胞，用吸管在原代培养瓶中轻轻吹打，使沉聚于瓶底的细胞球浮起。然后将原代培养形成的神经球悬液移至离心管，离心弃上清后，用木瓜蛋白酶对收集到的神经干细胞进行消化，用本发明神经干细胞冻存液冻存获得的细胞，按冻存细胞数所需浓度为5×10⁶个细胞/ml冻存液，定量加入预冷的本发明神经干细胞冻存液，充分混匀后，将此细胞悬液转移到冷冻管中，每管1mL，封口，标记冻存日期。分级冷冻细胞：4℃，40min；-20℃，30min；-80℃，过夜；次日缓降至液氮表面直至投入液氮保存。

上述所使用的木瓜蛋白酶消化为2mg/ml木瓜蛋白酶37℃消化10分钟。

本发明用一种成本较低，不含动物血清和DMSO的神经干细胞冻存液，由B27，EGF，bFGF，维生素E等主要成分组成，维生素E是脂溶性维生素，具有较强的抗氧化活性，能有效清除体内自由基对细胞的毒性作用，从而起到保护生物膜的结构和功能的作用，利用该冻存液冻存的神经干细胞复苏率高，不影响细胞的生长特性，复苏后细胞仍能保持神经干细胞多能性等特点。

附图说明

图1为使用不同神经干细胞冻存液冻存的细胞复苏后细胞的生长状态。

图2为使用本发明神经干细胞冻存液冻存的细胞复苏后倒置显微镜下观察神经干细胞分化潜能。

图3为使用本发明神经干细胞冻存液冻存的细胞复苏后免疫荧光染色观察神经干细胞的多向分化潜能。

具体实施方式

以下结合具体实施方式旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

1)本发明神经干细胞冻存液的配制：

10ml神经干细胞冻存液中含有以下组分：

先配好母液，-20度保存，然后每次配制的时候再加到终浓度。

2)神经干细胞的冻存

取培养7-10d生长良好的细胞，在收集细胞24小时前换液一次。先用吸管在原代培养瓶中轻轻吹打，使沉聚于瓶底的细胞球浮起。然后将原代培养形成的神经球悬液移至离心管，800rpm/min，离心3min。弃上清，用本发明神经干细胞冻存液冻存获得的细胞，按冻存细胞数所需浓度为5×10⁶个细胞/ml冻存液，定量加入预冷的本发明神经干细胞冻存液，吹吸均匀。将细胞悬液分装到冻存管，每管lml，封口，标记冻存日期。分级冷冻细胞：4℃，40min；-20℃，30min；-80℃，过夜；次日缓降至液氮表面直至投入液氮保存。

3)神经干细胞完全培养基的配制：

100ml Neurobasal-A medium神经干细胞专用培养基中含有以下组分：

先配好母液，-20度保存，然后每次配制的时候再加到终浓度。

4)神经干细胞复苏

将冻存细胞管迅速从液氮转入到37℃恒温水浴箱中，冷冻管的顶部保持在水面以上以避免污染。1min内快速复温。融化后立即移入离心管，加入5ml 4℃预冷神经干细胞完全培养液吹吸均匀。

5)神经干细胞计数

取0.5ml细胞悬浮液与0.5ml台盼蓝液等体积混合均匀于1.5ml小离心管。然后取少许混合液(约0.5ml)自血球计数板上方凹槽加入，盖上盖玻片，于倒置显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色。计数四个大方格之细胞总数，再除以4，乘以稀释倍数2(应与台盼蓝液等体积混合)，最后乘以10⁴，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。即4大格细胞总数×2×10⁴/4＝细胞数/ml，每一大格的体积＝0.1cm×0.1cm×0.01cm＝10^-4ml。根据公式：细胞复苏率(％)＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100％,计算出细胞复苏率。

6)计数后，调整细胞密度为5×10⁵/ml。将细胞悬液加入到25cm²培养瓶中，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。隔天半量换培养液1次，37℃、5％CO₂条件下分化培养5-7天，并随时观察神经干细胞分化状态、生长状况及细胞形态。

7)复苏后神经干细胞体外分化功能的验证：将无菌盖玻片放置进24孔板，并用Matrigel包被30min以上，每孔200μl。晾干备用。用吸管在原代培养瓶中轻轻吹打，使沉聚于瓶底的细胞球浮起起。将原代培养形成的神经干细胞球悬液移至离心管，800rpm/min，离心3min.弃上清，加入2ml木瓜蛋白酶，混匀，37℃消化20min。1000r/min离心5min。弃上清，加入0.5ml神经干细胞分化培养液，用吸管反复吹打60～70次。计数后，调整细胞密度为5×10⁵个细胞/ml，接种至预先放置Matrigel包被的无菌盖玻片的24孔板，每孔0.5ml，隔天半量换培养液1次，37℃、5％CO₂条件下分化培养5-7天，并随时观察神经干细胞分化状态、生长状况及细胞形态。分化贴壁培养7～14d取出盖玻片，对分化后的细胞进行免疫荧光染色。0.01mol/L PBS漂洗3次，每次5min。4％多聚甲醛固定20min，PBS漂洗3次，每次5min。0.2％Triton X-100通透细胞20min，PBS液漂洗3次，每次5min。用含有5％驴血清的PBS预孵育2h。吸弃血清，加一抗，分别为小鼠抗β-III-Tubulin(1:200)和兔抗GFAP(1:500)，放入湿盒内，4℃冰 箱过夜。次日，PBS漂洗3次，每次5min，与Alexa Fluor 594偶联驴抗小鼠和Alexa Fluor 488偶联驴抗兔IgG(1:200)共孵育2h。Bisbenzimide(Hoechst 33258，1:50,000)对染。50％缓冲甘油(PBS配制)封片。阴性对照不加一抗以0.01mol/L PBS代替，其余步骤相同。OLYMPUS BX60荧光显微镜下观察，Nikon DXM 1200c 5.30成像系统拍照。

结果：

a.使用本发明神经干细胞冻存液冻存的细胞复苏率明显高于传统冻存液(胎牛血清10％，DMSO 10％，DMEM/F12)的冻存复苏率，活细胞数量增多，能更好的维持细胞的活性，形成神经球的能力更强。图1A、图1C分别为传统冻存液复苏后细胞的生长状态以及3天后的神经球形成情况；图1B、图1D则为使用本发明神经干细胞冻存液冻存的细胞复苏后的生长状态及3天后的神经球形成情况。

b.复苏后的神经干细胞仍能保持其多向分化潜能，能体外分化成神经元与神经胶质细胞等。图2为倒置显微镜下观察细胞沿着突起的方向逐渐从神经球向四周迁移出来，并伸出许多突起，其突起向四周呈放射状延伸。图3为体外诱导分化7d后，固定细胞并进行免疫细胞化学染色，证明了所培养的细胞具有多向分化潜能，可分化为神经元和胶质细胞，从而证实本发明的神经干细胞冻存液具有良好的应用效果。

本发明冻存液成分的部分探索过程见下表1：每种成分都做了单因素试验，以确定最优的浓度范围。

表1

由上表1可知冻存液组分为DMEM/F12+2％B27+2mM谷氨酰胺时，复苏率仅为40.43±3.34％。然后就把DMEM/F12换成了neurobasal-A medium(神经干细胞专用培养基)，即neurobasal-A medium+2％B27+2mM谷氨酰胺，发现细胞复苏后活细胞数上升，但是复苏率仍然只有42.58±2.85％。接着换成Neurobasal-A medium+2％B27+50ng/ml EGF+2mM谷氨酰胺，细胞复苏率提高到56.42±3.65％。随后将50ng/ml EGF换成了50ng/ml bFGF，复苏率相差无几，为57.51±2.84％。再将50ng/ml EGF以及50ng/ml bFGF同时加入neurobasal-Amedium+2％B27+2mM谷氨酰胺，发现复苏率提高到72.32±2.73％。最后在前面的基础上加入了1μM维生素E，复苏率显著提高到80.59±3.08％。维生素E浓度达到10μM时，复苏率提高到86.66±4.32％。

Claims (4)

1.一种神经干细胞冻存液，其特征在于，是在Neurobasal-A medium中含有

2.根据权利要求1所述的神经干细胞冻存液，其特征在于，是在Neurobasal-Amedium中含有

3.权利要求1所述的神经干细胞冻存液，其特征在于，取培养7-10d生长良好的细胞，用吸管在原代培养瓶中轻轻吹打，使沉聚于瓶底的细胞球浮起；然后将原代培养形成的神经球悬液移至离心管，离心弃上清后，用木瓜蛋白酶对收集到的神经干细胞进行消化，用本发明神经干细胞冻存液冻存获得的细胞，按冻存细胞数所需浓度为5×10⁶个细胞/ml冻存液，定量加入预冷的本发明神经干细胞冻存液，充分混匀后，将此细胞悬液转移到冷冻管中，每管1mL，封口，标记冻存日期；分级冷冻细胞：4℃，40min；-20℃，30min；-80℃，过夜；次日缓降至液氮表面直至投入液氮保存。

4.根据权利要求3所述的神经干细胞冻存液的使用方法，其特征在于，所使用的木瓜蛋白酶消化为2mg/ml木瓜蛋白酶37℃消化10分钟。