CN108244097A - 一种长期保存过表达bFGF的C17.2的神经干细胞保存液 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种细胞保存液，具体涉及一种长期保存过表达bFGF的C17.2的神经干细胞保存液。所述保存液包括以下组分：白蛋白、维生素、海藻糖、氯化钠、氯化钾、肉苁蓉苷、甘油、碱性成纤维细胞生长因子、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、复方氨基酸和注射用水。该保存液无毒环保、成分明确、安全稳定，便于细胞保存和运输；本发明的长期保存过表达bFGF的C17.2的神经干细胞保存液能提高细胞的保存时间和保存率，能维持细胞的高活力和生物学特性，具有廉价、高效、无毒的优势。

Description

一种长期保存过表达bFGF的C17.2的神经干细胞保存液

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种长期保存过表达bFGF的C17.2的神经干细胞保存液。

背景技术

缺血性脑卒中是因脑血栓形成或脑栓塞所致脑供血障碍而引起的局部脑组织缺血、缺氧，进而引起脑组织软化、死亡。干细胞移植能够改善缺血性脑卒中造成的神经功能缺陷，很多不同类型的干细胞如胚胎干细胞(ES)、骨髓间充质干细胞(BMSC)、诱导多功能干细胞(iPS)和神经干细胞(NSC)都被用来治疗缺血性脑中风，并且移植这些细胞能够减轻神经性损伤。C17.2神经干细胞系是经过v-myc基因改造后得到的永生化的细胞，最早是从新生小鼠的小脑中分离的到的。移植C17.2神经干细胞系被广泛的用于研究中枢神经系统失调疾病，例如帕金森病、亨廷顿病、颅脑损伤、缺血缺氧脑损伤、成年大鼠皮层选择性神经退化、脊髓损伤等。C17.2神经干细胞系是一种很好的治疗缺血性脑卒中的细胞来源。但是由于缺血性脑卒中造成的脑内恶劣的微环境使得移植细胞的存活率并不高。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是由155个氨基酸组成的18kD多肽，主要分布于垂体、脑和神经组织及视网膜、肾上腺、胎盘等组织，可促进来源于中胚层和神经外胚层的多种类型细胞增殖、分化，具有广泛的生物学效应。bFGF在成年哺乳动物脑组织中呈低水平表达，主要由星形胶质细胞产生，但在脑组织损伤后bFGF表达显著上调。bFGF促进血管生成、轴突再生、神经保护、组织修复、动员内源性神经干细胞，在中枢神经系统发育与损伤修复中具有重要作用。在局灶性脑缺血损伤大鼠模型中，bFGF抑制神经细胞凋亡，增加脑缺血区血液供应，显著缩小脑梗塞面积，改善神经功能障碍。但是bFGF体内半衰期短，静脉给药后迅速降解，难以保持其生物活性；bFGF是生物大分子，难以透过血脑屏障；FGF受体体内分布广泛，存在于全身许多组织器官，经静脉全身给药副作用大。因此，将干细胞移植和bFGF两者联合起来，将bFGF基因序列利用基因转染技术插入到干细胞中，得到高表达bFGF蛋白的C17.2神经干细胞系，然后将得到的C17.2神经干细胞通过静脉注射的方式给药。干细胞表达的bFGF蛋白一方面可以提高移植的干细胞在缺血性微环境下的生存能力，又可以作为蛋白治疗药物去改善神经功能。而干细胞一方面作为表达bFGF蛋白的载体，避免了bFGF蛋白作为蛋白药物半衰期段、难以透过血脑屏障、全身反应等缺陷，另一方面也使得移植干细胞本身的存活率升高，同时bFGF蛋白的促分化的功能可以促进干细胞的分化，能够更好的改善缺血性脑卒中后的神经功能缺陷。

虽然细胞治疗的临床应用前景已经得到了广泛认可，但是在实际应用仍有许多问题需要解决。细胞治疗大多采用静脉注射的方式进行，将体外培养好的细胞注射到不同规格的氯化钠注射液中，部分情况下加入血清或人血白蛋白制成悬液回输给患者。然而，将氯化钠注射液或含有血清/人血白蛋白的混合液作为细胞保存液，几个小时后细胞存活率和生物学效力会很大程度的降低，不利于细胞较长时间的保存和远距离运输。目前，中国专利CN104928248A公开了一种用于制备神经干细胞的试剂盒及制备神经干细胞的方法，其中神经组织保存液为含有链霉素50～250ug/ml、青霉素50～250ug/ml的RPMI-1640、DMEM、α-MEM、DMEM/F12中的一种或两种以上混合的培养基。中国专利CN107156108A公开了一种外周血干细胞保存液及制备方法，其中外周血干细胞保存液的包括以下组分：人血白蛋白3-8份、海藻糖2-4份、羟乙基淀粉1-3份、营养素5-15份、右旋糖酐1-3份、二甲基亚砜1-3份和适量水。中国专利CN102948413B公开了一种肝干细胞保存液及其应用，该保存液是将0.1-1g有效剂量的人血白蛋白、2.60-4.97g氯化钠、2.48-4.74g葡萄糖酸钠、1.82-3.40g醋酸钠、0.18-0.35g氯化钾、0.15-0.28g氯化镁和0.4-0.7mL肝素钙注射液用水定容至100mL得到的。

虽然，对于干细胞保存液的组成和制备有一定的研究，但是针对不同种类的干细胞的保存液组分有很大的差别，但大都含有培养基或人血白蛋白，而且保存液中加入血清或人血白蛋白，其来源一般是牛血清或人AB血清，因其成分不明，可能会引起血清污染或者未知病毒污染等问题。除此之外，目前国内大部分细胞培养基均是仅供科研使用，不作为临床应用的常规试剂；其安全性和可靠性不确定；而且针对神经干细胞保存液的研究较少，不同类型的细胞保存时所需的酸碱环境、渗透压、营养物质等都有一定的差异，如果保存不当，可能会出现细胞脱分化、活力下降、死亡等现象，而且目前并没有针对长期保存过表达bFGF的C17.2的神经干细胞保存液的研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述缺陷，提供一种长期保存过表达bFGF的C17.2的神经干细胞保存液，该保存液能提高细胞的保存时间和保存率，能维持细胞的高活力和生物学特性，具有廉价、高效、无毒的优势。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种长期保存过表达bFGF的C17.2的神经干细胞保存液，其特征在于，所述保存液包括以下组分：白蛋白、维生素、海藻糖、氯化钠、氯化钾、肉苁蓉苷、甘油、碱性成纤维细胞生长因子、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、硫酸软骨素、复方氨基酸和注射用水。

肉苁蓉是我国著名中药，现代药理研究表明，肉苁蓉具有抗衰老、调整内分泌、促进代谢、提高学习记忆能力、抗老年痴呆症、通便等多方面的功效，而肉苁蓉苷是肉苁蓉主要成分的提取物，还具有促进神经干细胞增殖的作用。本发明中加入少量肉苁蓉苷起到延缓衰老、维持细胞代谢、维持神经干细胞的多能性、保持细胞活性的作用。

碱性成纤维细胞生长因子是一种多效能的细胞生长因子，具有促进血管生成，创伤愈合与组织修复，促进骨、软骨的生长，神经再生作用，在细胞分化和机体发育过程中发挥重要作用。本发明中加入少量碱性成纤维细胞生长因子具有促进细胞损伤的修复，细胞形态的重建，调节细胞膜表面各种整合素的表达，促进内皮细胞的黏附生长，刺激内皮细胞的增殖等作用，能够减少保存过程中细胞的凋亡、维持细胞形态和活性的作用。

硫酸软骨素是一种糖胺聚糖，广泛分布于东大购物组织的细胞外基质和细胞表面，糖链由交替的葡萄糖醛酸和N-乙酰半乳糖胺二糖单位组成，生物活性广泛如神经保护、免疫调节、抗氧化和抗肝纤维化、软骨保护、抗动脉粥样硬化等。在本发明中加入硫酸软骨素可以提高细胞的稳定性。

进一步，每100mL保存液中包括以下组分：白蛋白1-5g、维生素1.0-1.5g、葡萄糖0.2-0.4g、氯化钠0.5-0.8g、氯化钾0.025-0.030g、肉苁蓉苷0.03-0.06g、甘油1.5-2.0g、碱性成纤维细胞生长因子0.03-0.06g、磷酸氢二钠0.15-0.17g、磷酸氢二钾0.04-0.05g、硫酸软骨素0.1-0.15g、复方氨基酸0.10-0.15g，其余为注射用水。

更进一步，每100mL保存液中包括以下组分：白蛋白3-5g、维生素1.2-1.4g、葡萄糖0.25-0.3g、氯化钠0.6-0.8g、氯化钾0.025-0.027g、肉苁蓉苷0.05-0.06g、甘油1.5-1.8g、碱性成纤维细胞生长因子0.04-0.05g、磷酸氢二钠0.16-0.17g、磷酸氢二钾0.04-0.05g、硫酸软骨素0.12-0.14g、复方氨基酸0.11-0.13g，其余为注射用水。

进一步，所述维生素选自维生素B、维生素C、维生素E和维生素K中的一种或多种。

优选地，所述维生素为维生素E。

维生素E是一种脂溶性维生素，是最重要的抗氧化剂之一，具有较强的抗氧化活性，能清除自由基对细胞的毒性作用，具有延缓细胞衰老和缓慢增殖，减少神经细胞的凋亡，保持细胞活性的作用。

进一步，所述复方氨基酸由甘氨酸、精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸组成。

更进一步，所述复方氨基酸由以下质量分数的原料组成：甘氨酸5％、精氨酸5％、亮氨酸15％、异亮氨酸25％、苏氨酸30％和甲硫氨酸20％组成。

氨基酸是构成动物营养所需蛋白质的基本物质，能在一定程度上促进神经干细胞的增殖，复方氨基酸能够给细胞提供更多元的营养。

本发明提供一种长期保存过表达bFGF的C17.2的神经干细胞的方法，将细胞加入如上所述的保存液中，置于0-5℃条件下保存。

本发明提供一种长期保存过表达bFGF的C17.2的神经干细胞保存液的制备方法，包括以下步骤：A)将维生素、海藻糖、氯化钠、氯化钾、硫酸软骨素、复方氨基酸加入50mL注射用水，搅拌溶解，得溶液A；

B)将白蛋白、肉苁蓉苷、甘油、碱性成纤维细胞生长因子加入到10mL注射用水中，搅拌均匀，得溶液B；

C)将溶液B缓慢加入溶液A中，边加入边搅拌，混合均匀后，边搅拌边加入磷酸氢二钠和磷酸氢二钾，之后搅拌30min，注射用水定容至100mL，即得。

本发明提供一种如上所述的保存液在保存细胞中的应用。

优选地，所述细胞为神经干细胞；优选地，所述神经干细胞为C17.2神经干细胞；更优选过表达bFGF的C17.2的神经干细胞。

本发明的有益效果：

本发明的长期保存过表达bFGF的C17.2的神经干细胞保存液成分稳定、营养物质多元、溶液渗透体系缓冲力强，并且无毒环保、成分明确、安全稳定，便于细胞保存和运输；同时还能提高细胞的保存时间和保存率，能维持细胞的高活力和生物学特性，具有廉价、高效、无毒的优势。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步阐述。这些实施例仅是出于解释说明的目的，而不限制本发明的范围和实质。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件进行。

过表达bFGF(GI:122745)的C17.2神经干细胞的构建，其中，C17.2神经干细胞购自天津赛尔生物技术有限公司，货号C0151。

(一)过表达bFGF慢病毒载体构建

1.1扩增IRES-hrGFP-polyA片段

其中，引物IRES/GFP/PAR/F为通用引物。

反应过程：首先95℃，5min，接着98℃15s、60℃15s、72℃2min进行35个循环，再接着72℃20min，最后4℃保存。

1.2提取pShuttle/5HRE-CMVmp-bFGF质粒：

将pShuttle/5HRE-CMVmp-bFGF质粒的细菌转接到5mLLB培养基中，在37℃、200rp/min摇床上扩增过夜，然后提取质粒。提取质粒过程按照质粒提取试剂盒(invotrigen)的说明书进行。

1.在室温下吸取4mL含有质粒大肠杆菌菌液，离心转速为10000g，1min，弃去上清液(用滤纸充分吸干)；

2.加入250μL的Solution/RNAseA摇晃使之悬浮(震荡器震荡混匀)；

3.加入250μL的Solution II轻轻混匀，从加液开始约3.5min后加入SolutionIII；

4.加入350μL的Solution III快速混匀，会出现白色沉淀；

5.在室温下离心转速为130000g·10min；

6.将离心后的上清液转至DNA结合柱(不要将沉淀倒入)，室温下离心转速为10000g·1min；

7.弃去滤液，加入500μL的HB Buffer，室温下离心转速为10000g·1min；

8.弃去滤液加入700μL的DNAwash Buffer，室温下离心转速为10000g·1min，重复一次；

9.弃去滤液，空柱，室温下离心转速为13000g·2min；

10.将DNA结合柱置于1.5mL灭菌微量离心管上，加入50μL预热的灭菌去离子水放置2min，室温下离心转速为13000g·1min；

11.将提取的质粒电泳鉴定并置于4℃冰箱保存。

1.3质粒和PCR产物酶切鉴定；

使用SalI限制性内切酶进行鉴定，反应体系如下：

37℃酶切2h，电泳。

1.4 SalI酶切产物纯化

纯化步骤按照DNA纯化试剂盒(invotrigen)说明书进行：

1.将bFGF PCR产物加入5倍体积的Buffer cp，震摇完全混合；

2.离心后将样本加入DNA结合柱，室温下离心转速为10000g，1min；

3.弃去滤液，加入700μL的DNAwash Buffer，室温下离心转速为10000g，1min；

4.弃去滤液，重复步骤3；

5.弃去滤液，将空柱室温下离心转速为13000g，2min；

6.将DNA结合柱置于1.5mL灭菌微量离心管上，加入30μL的无菌水，静置2min，室温下离心转速为13000g，2min；

7.将得到的纯化DNA电泳鉴定并4℃保存。

1.5酶切产物连接；

反应体系

16℃连接过夜。

1.6连接产物转化铺板；

1、取出-80℃保存的感受态在冰上进行解冻；

2、加2μL的DNA(连接产物)，轻弹混匀；

3、放于冰上30min；

4、42℃水浴热激90s；

5、取出置冰上2min；

6、加入800μL预热的培养基(37℃)；

7、37℃摇床1h；

8、取100μL培养液放入不同含有氨苄抗生素的培养平板中；

9、转化液保存在4℃中；

10、转化的平板倒置于37℃培养箱过夜培养。

1.7挑选单菌落扩增

将平板上的但菌落挑至含有5mLLB/Kan培养基的试管中进行扩增，条件：37℃、200rp/min。

1.8质粒提取电泳酶切鉴定

质粒提取过程如上，酶切体系如下：

16℃过夜，电泳。

1.9扩增bFGF-IRES-hrGFP基因

以连接鉴定好的pShuttle-5HRE-bFGF-IRES-hrGFP质粒为模板,扩增bFGF-IRES-hrGFP基因。反应体系和反应条件同扩增IRES-hrGFP-polyA基因。

1.10 bFGF-IRES-hrGFPPCR产物与pENTER/D-TOPO质粒连接

反应体系如下：

室温孵育10min。

bFGF-IRES-hrGFP PCR产物与pENTER/D-TOPO质粒连接产物转化，扩增，提取质粒(步骤如上)。

1.11质粒双酶切鉴定；

反应体系：

37℃孵育1h，电泳。

1.12重组pLenti6.4/R4R2/D5-CMV-bFGF-IRES-hrGFP质粒

反应体系如下：

25℃反应16h，之后加入1μL蛋白酶K终止反应，转化铺板，步骤如上，但是孵育时使用SOC培养基。

1.13挑选单克隆扩增，提取质粒单酶切鉴定

反应体系如下：

37℃酶切2h，电泳。

(二)病毒包装

第一天：

铺板：使T25培养瓶转染时细胞数目达2×106(90％-95％融合)，5mL不含抗生素含血清培养基过夜培养。

第二天：

1.A、在1.5mL EP管中加入4.5μg(浓度为1ug/μL，加入4.5μL)的virapowerpackaging mix和1.5μg(浓度为450ng/μL，7μL)的中提质粒到700μL的DMEM不含血清培养基中，移液枪上下轻柔抽吸混匀；

B、在另一个1.5mL EP管加入12μL lipofectamine2000到700μL的DMEM不含血清培养基，移液枪上下轻柔抽吸混匀，室温孵育5分钟；

C、孵育结束后，将A和B混合，移液枪上下轻柔抽吸混匀；

D、室温孵育20min。(在6小时内转染)。

2.弃去培养基，加入5mL不含抗生素的完全培养基。

3.将前面孵育好的转染混合物加入到293T细胞的培养基中，前后方向轻柔摇晃培养瓶混匀，培养箱中过夜。

第三天：

1.移除培养基，加入5mL不含抗生素的完全培养基；

2.再孵育48-72h。

第五或六天：

1.将培养基转移到15mL离心管中；

2.4℃离心2000g 15min；

3.将上清液等分成1mL转移到五个1.5离心管中，其中取一管(1mL)再等分为200μL分五管；-80℃保存。

(三)细胞感染

第一天24孔板铺板1·104个/孔，过夜培养。

第二天加入200μL病毒液至24孔板中，37℃培养箱孵育6小时，吸弃培养基更换新的培养基。

第三天更换在培养基中加入杀稻瘟菌素(2μg/mL)。

其后每隔两天更换一次含有杀稻瘟菌素的培养基至14天。收集细胞，得到过表达bFGF的C17.2神经干细胞。

实施例1

一种长期保存过表达bFGF的C17.2的神经干细胞保存液，每100mL保存液中包括以下组分：

白蛋白3g、维生素E1.2g、葡萄糖0.25g、氯化钠0.6g、氯化钾0.025g、肉苁蓉苷0.05g、甘油1.5g、碱性成纤维细胞生长因子0.04g、磷酸氢二钠0.16g、磷酸氢二钾0.04g、硫酸软骨素0.12g、复方氨基酸0.11g，其余为注射用水。其中，复方氨基酸由以下质量分数的原料组成：甘氨酸5％、精氨酸5％、亮氨酸15％、异亮氨酸25％、苏氨酸30％和甲硫氨酸20％组成。

制备方法：

A)将维生素、海藻糖、氯化钠、氯化钾、硫酸软骨素、复方氨基酸加入50mL注射用水，搅拌溶解，得溶液A；

B)将白蛋白、肉苁蓉苷、甘油、碱性成纤维细胞生长因子加入到10mL注射用水中，搅拌均匀，得溶液B；

C)将溶液B缓慢加入溶液A中，边加入边搅拌，混合均匀后，边搅拌边加入磷酸氢二钠和磷酸氢二钾，之后搅拌30min，注射用水定容至100mL，即得。

实施例2

一种长期保存过表达bFGF的C17.2的神经干细胞保存液，每100mL保存液中包括以下组分：

白蛋白5g、维生素B1.4g、葡萄糖0.3g、氯化钠0.8g、氯化钾0.027g、肉苁蓉苷0.06g、甘油1.8g、碱性成纤维细胞生长因子0.05g、磷酸氢二钠0.17g、磷酸氢二钾0.05g、硫酸软骨素0.14g、复方氨基酸0.13g，其余为注射用水。其中，复方氨基酸由以下质量分数的原料组成：甘氨酸5％、精氨酸5％、亮氨酸15％、异亮氨酸25％、苏氨酸30％和甲硫氨酸20％组成。

制备方法参照实施例1。

实施例3

一种长期保存过表达bFGF的C17.2的神经干细胞保存液，每100mL保存液中包括以下组分：

白蛋白5g、维生素C1.5g、葡萄糖0.4g、氯化钠0.8g、氯化钾0.03g、肉苁蓉苷0.06g、甘油2.0g、碱性成纤维细胞生长因子0.06g、磷酸氢二钠0.17g、磷酸氢二钾0.05g、硫酸软骨素0.15g、复方氨基酸0.15g，其余为注射用水。其中，复方氨基酸由以下质量分数的原料组成：甘氨酸5％、精氨酸5％、亮氨酸15％、异亮氨酸25％、苏氨酸30％和甲硫氨酸20％组成。

制备方法参照实施例1。

实施例4

一种长期保存过表达bFGF的C17.2的神经干细胞保存液，每100mL保存液中包括以下组分：

白蛋白1g、维生素K1.0g、葡萄糖0.2g、氯化钠0.5g、氯化钾0.025g、肉苁蓉苷0.03g、甘油1.5g、碱性成纤维细胞生长因子0.03g、磷酸氢二钠0.15g、磷酸氢二钾0.04g、硫酸软骨素0.1g、复方氨基酸0.10g，其余为注射用水。其中，复方氨基酸由以下质量分数的原料组成：甘氨酸5％、精氨酸5％、亮氨酸15％、异亮氨酸25％、苏氨酸30％和甲硫氨酸20％组成。

制备方法参照实施例1。

对比例1

一种细胞保存液，每100mL保存液中包括以下组分：

白蛋白3g、维生素E1.2g、葡萄糖0.25g、氯化钠0.6g、氯化钾0.025g、甘油1.5g、碱性成纤维细胞生长因子0.04g、磷酸氢二钠0.16g、磷酸氢二钾0.04g、硫酸软骨素0.12g、复方氨基酸0.11g，其余为注射用水。其中，复方氨基酸由以下质量分数的原料组成：甘氨酸5％、精氨酸5％、亮氨酸15％、异亮氨酸25％、苏氨酸30％和甲硫氨酸20％组成。

制备方法：

A)将维生素、海藻糖、氯化钠、氯化钾、硫酸软骨素、复方氨基酸加入50mL注射用水，搅拌溶解，得溶液A；

B)将白蛋白、甘油、碱性成纤维细胞生长因子加入到10mL注射用水中，搅拌均匀，得溶液B；

C)将溶液B缓慢加入溶液A中，边加入边搅拌，混合均匀后，边搅拌边加入磷酸氢二钠和磷酸氢二钾，之后搅拌30min，注射用水定容至100mL，即得。

对比例2

一种细胞保存液，每100mL保存液中包括以下组分：

白蛋白3g、维生素E1.2g、葡萄糖0.25g、氯化钠0.6g、氯化钾0.025g、肉苁蓉苷0.05g、甘油1.5g、磷酸氢二钠0.16g、磷酸氢二钾0.04g、硫酸软骨素0.12g、复方氨基酸0.11g，其余为注射用水。其中，复方氨基酸由以下质量分数的原料组成：甘氨酸5％、精氨酸5％、亮氨酸15％、异亮氨酸25％、苏氨酸30％和甲硫氨酸20％组成。

制备方法：

A)将维生素、海藻糖、氯化钠、氯化钾、硫酸软骨素、复方氨基酸加入50mL注射用水，搅拌溶解，得溶液A；

B)将白蛋白、肉苁蓉苷、甘油加入到10mL注射用水中，搅拌均匀，得溶液B；

C)将溶液B缓慢加入溶液A中，边加入边搅拌，混合均匀后，边搅拌边加入磷酸氢二钠和磷酸氢二钾，之后搅拌30min，注射用水定容至100mL，即得。

对比例3

一种细胞保存液，每100mL保存液中包括以下组分：

白蛋白3g、维生素E1.2g、葡萄糖0.25g、氯化钠0.6g、氯化钾0.025g、甘油1.5g、磷酸氢二钠0.16g、磷酸氢二钾0.04g、硫酸软骨素0.12g、复方氨基酸0.11g，其余为注射用水。其中，复方氨基酸由以下质量分数的原料组成：甘氨酸5％、精氨酸5％、亮氨酸15％、异亮氨酸25％、苏氨酸30％和甲硫氨酸20％组成。

制备方法：

A)将维生素、海藻糖、氯化钠、氯化钾、硫酸软骨素、复方氨基酸加入50mL注射用水，搅拌溶解，得溶液A；

B)将白蛋白、甘油加入到10mL注射用水中，搅拌均匀，得溶液B；

C)将溶液B缓慢加入溶液A中，边加入边搅拌，混合均匀后，边搅拌边加入磷酸氢二钠和磷酸氢二钾，之后搅拌30min，注射用水定容至100mL，即得。

实施例5

将过表达bFGF的C17.2的神经干细胞的细胞浓度调节为1×10⁶cell/mL，与保存液配置成0.5％的细胞悬液。

在0-5℃保存0.5d、1d、7d、14d、28d、35d，取样进行台盼蓝(Trypan Blue)染色，计数活细胞和死细胞数，计算细胞活率，细胞活率＝活细胞数目/(活细胞数目+死细胞数目)，结果如表1所示。

表1过表达bFGF的C17.2的神经干细胞的细胞活率的实验结果

由表1可以看出本发明制备的过表达bFGF的C17.2的神经干细胞的保存液在保存过表达bFGF的C17.2的神经干细胞的过程中细胞活率很高。

实施例6

将过表达bFGF的C17.2的神经干细胞的细胞浓度调节为1×10⁶cell/mL，与保存液配置成0.5％的细胞悬液。

在0-5℃保存0.5d、1d、7d、14d、28d、35d，分别取不同保存时间点的细胞悬液1mL，按照细胞悬液：0.4％台盼蓝(v:v)＝5:1混匀，取20μL细胞混匀液加入细胞计数板中，用Countstar细胞计数器进行细胞结团率的检测，结果见表2。

表2过表达bFGF的C17.2的神经干细胞的细胞结团率的实验结果

由表2可知，本发明制备的过表达bFGF的C17.2的神经干细胞的保存液在保存过表达bFGF的C17.2的神经干细胞的过程中结团率低。

本发明的保存液，明显优于对比例，说明本发明保存液各个组分搭配合理，缺一不可，这种特定的组合构成的保存液，产生了明显的协同增效作用。本发明的长期保存过表达bFGF的C17.2的神经干细胞保存液成分稳定、营养物质多元、溶液渗透体系缓冲力强，并且无毒环保、成分明确、安全稳定，便于细胞保存和运输；同时还能提高细胞的保存时间和保存率，能维持细胞的高活力和生物学特性，具有廉价、高效、无毒的优势。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书所作的等效变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种长期保存过表达bFGF的C17.2的神经干细胞保存液，其特征在于，所述保存液包括以下组分：白蛋白、维生素、海藻糖、氯化钠、氯化钾、肉苁蓉苷、甘油、碱性成纤维细胞生长因子、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、硫酸软骨素、复方氨基酸和注射用水。

2.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，每100mL保存液中包括以下组分：白蛋白1-5g、维生素1.0-1.5g、葡萄糖0.2-0.4g、氯化钠0.5-0.8g、氯化钾0.025-0.030g、肉苁蓉苷0.03-0.06g、甘油1.5-2.0g、碱性成纤维细胞生长因子0.03-0.06g、磷酸氢二钠0.15-0.17g、磷酸氢二钾0.04-0.05g、硫酸软骨素0.1-0.15g、复方氨基酸0.10-0.15g，其余为注射用水。

3.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，每100mL保存液中包括以下组分：白蛋白3-5g、维生素1.2-1.4g、葡萄糖0.25-0.3g、氯化钠0.6-0.8g、氯化钾0.025-0.027g、肉苁蓉苷0.05-0.06g、甘油1.5-1.8g、碱性成纤维细胞生长因子0.04-0.05g、磷酸氢二钠0.16-0.17g、磷酸氢二钾0.04-0.05g、硫酸软骨素0.12-0.14g、复方氨基酸0.11-0.13g，其余为注射用水。

4.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，所述维生素选自维生素B、维生素C、维生素E和维生素K中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述的保存液，其特征在于，所述维生素为维生素E。

6.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，所述复方氨基酸由甘氨酸、精氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸组成。

7.根据权利要求6所述的保存液，其特征在于，所述复方氨基酸由以下质量分数的原料组成：甘氨酸5％、精氨酸5％、亮氨酸15％、异亮氨酸25％、苏氨酸30％和甲硫氨酸20％组成。

8.一种长期保存过表达bFGF的C17.2的神经干细胞的方法，其特征在于，将细胞加入如权利要求1-7任一项所述的保存液中，置于0-5℃条件下保存。

9.一种长期保存过表达bFGF的C17.2的神经干细胞保存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

A)将维生素、海藻糖、氯化钠、氯化钾、硫酸软骨素、复方氨基酸加入50mL注射用水，搅拌溶解，得溶液A；

B)将白蛋白、肉苁蓉苷、甘油、碱性成纤维细胞生长因子加入到10mL注射用水中，搅拌均匀，得溶液B；

C)将溶液B缓慢加入溶液A中，边加入边搅拌，混合均匀后，边搅拌边加入磷酸氢二钠和磷酸氢二钾，之后搅拌30min，注射用水定容至100mL，即得。

10.如权利要求1至7任一项所述的保存液在保存细胞中的应用。