CN115466712A - 一种原代大血管内皮细胞的培养体系和应用 - Google Patents

一种原代大血管内皮细胞的培养体系和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种原代大血管内皮细胞的培养体系和应用，按重量百分比计，所述培养体系包括基础培养基78‑86.5％、胎牛血清2‑5％、抗生素1‑5％和添加剂0.5‑2％，所述添加剂包括多种生长因子。本发明还提供该培养体系在培养内皮细胞以及内皮细胞血管生成中的应用。本发明能够实现在低血清条件下长期稳定培养大血管内皮细胞。

Description

一种原代大血管内皮细胞的培养体系和应用
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体地，涉及一种原代大血管内皮细胞的培养体系和应用。
背景技术
内皮细胞是形成血管壁和淋巴管壁的一层特化的上皮细胞，通过观察形态发现内皮细胞是一层扁平细胞，它在心脏-大血管-微血管、主淋巴管-微淋巴管中均有分布，而且微血管及淋巴微管是由单一层的内皮细胞所组成。内皮细胞发挥着多种生物学功能，包括但不限于血管收缩及舒张，血栓形成及纤维蛋白的溶解，血管生成，炎症，血液或淋巴液中物质与周围组织的交换等等。
基于内皮细胞广泛的分布和多种生物学功能，内皮细胞是进行循环系统、凝血、血管炎症等多种研究的重要材料，而体外培养高纯度的内皮细胞是在细胞水平的体外研究的重要工具。现在对于大血管内皮细胞的培养，主要还是依靠基础培养基和胎牛血清的简单组合实现的，最多添加少量的vEGF以促进内皮细胞的生长。
单纯的添加少量的vEGF，不足以支持原代大血管内皮细胞的营养需求，因此常用的培养基中还会添加10-20％比例的胎牛血清以维持大血管内皮细胞增殖的营养需求，但是胎牛血清是非化学成分限定的生物添加剂，即使是相同品牌，同一货号但是不同批次的产品，其中各种生物活性的成分的含量比例都有可能会有较大偏差，更何况很多用户会使用品质较差的胎牛血清，因此对大血管内皮细胞细胞的培养用传统方式不能获得稳定的培养和扩增效果。此外上述情况还是针对直接购买商品化纯度较高的大血管内皮细胞产品，如果是需要自己分离大血管内皮细胞，原代分离后的细胞悬液中不可避免的会含有血管成纤维细胞、血管平滑肌细胞等杂细胞，而此时培养基中10-20％比例的高胎牛血清环境会有效的促进成纤维细胞和平滑肌细胞的快速增长，这样即使培养基中添加的vEGF可以部分促进内皮细胞的增殖，但是其增殖速度相对高血清环境下的成纤维细胞还是相对较慢，因此通常经过1-2次传代后，成纤维细胞会通过生长优势，成为占绝对优势的细胞群体，导致无法获得足够纯度和量的内皮细胞。
经检索，申请号为CN201610113482.0的发明申请，公开了一种内皮培养体系，包括内皮培养基和内皮添加剂；所述内皮添加剂其组成成分及浓度为：重组人表皮细胞生长因子5ng/ml，氢化可的松10ng/ml，重组人血管内皮生长因子10ng/ml，重组人碱性成纤维生长因子5ng/ml，R3胰岛素样生长因子15ng/ml，维生素C50ug/ml，肝素50ug/ml，重组人胰岛素10ug/ml，人全铁转铁蛋白5ug/ml。该培养体系能够在 2％血清的环境下促进大血管内皮细胞的生长活性，也可以部分抑制成纤维和平滑肌细胞的活性，减少杂细胞的污染。但是实际使用中，上述培养体系杂细胞生长速度还有待进一步降低，细胞新形态不是很均一，会有明显大量老化的细胞，而且使用的培养基成本相对较高。
发明内容
为解决现有技术中培养基中针对内皮细胞的营养供应特异性较弱的问题，本发明的目的是提供一种原代大血管内皮细胞的培养体系和应用，以进一步降低杂细胞生长速度，培养得到的细胞新形态均一，不会有明显大量老化的细胞。
根据本发明的第一方面，提供一种原代大血管内皮细胞的培养体系，按重量百分比计，该培养体系包括基础培养基78-86.5％、胎牛血清2-5％、抗生素1-5％和添加剂 0.5-2％，所述添加剂包括多种生长因子。
进一步地，所述基础培养基包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素、嘌呤、嘧啶、缓冲液和pH指示剂。
进一步地，所述添加剂为在4℃保存时容易分解的物质，所述添加剂以工作浓度100 倍的浓度配置成溶液在-20℃长期保存，需要使用时按百分之一的量添加至所述基础培养基中。
进一步地，所述多种生长因子包括重组人表皮细胞生长因子、重组人血管内皮生长因子、重组人碱性成纤维生长因子、R3胰岛素样生长因子1、肝素、重组人胰岛素、人全铁转铁蛋白。
进一步地，所述添加剂还包括氢化可的松。
进一步地，所述添加剂中各组分在培养体系中的浓度为：重组人表皮细胞生长因子 3-10ng/ml、氢化可的松0.15-0.3ug/ml、重组人血管内皮生长因子1-5ng/ml、重组人碱性成纤维生长因子2-10ng/ml、肝素20-80ug/ml、重组人胰岛素5-10ug/ml、人全铁转铁蛋白8-20ug/ml、R3胰岛素样生长因子1浓度为10-20ng/ml。
进一步地，所述抗生素包括青霉素和链霉素。
进一步地，青霉素和链霉素以工作浓度100倍的浓度配置成溶液在-20℃长期保存，需要使用时按百分之一的量添加至所述基础培养基中。
根据本发明的第二方面，提供一种上述的培养体系在培养内皮细胞中的应用。
根据本发明的第三方面，提供一种上述的培养体系在内皮细胞血管生成中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下至少之一的有益效果：
1、本发明添加1-5％抗生素可以极大降低原代培养的污染概率，同时不会对细胞的生长造成影响；胎牛血清添加量仅为2-5％，相较于现有技术中的10-20％有明显的降低；本发明通过优化组分配方，在基础培养基中胎牛血清、抗生素和添加剂的相互配合作用下，可以有效降低血管成纤维细胞、血管平滑肌细胞等杂细胞生长速度，更利于内皮细胞获得增殖速度上的优势，进而获得生长优势，从而更容易获得高纯度的大血管内皮细胞。
2、本发明能够提高内皮细胞原代分离的成功率，降低杂细胞的生长速度，增加内皮细胞传代后维持内皮细胞特性的代数；此外本发明的培养体系也可以作为内皮细胞血管生成实验的刺激培养基，能够比单纯添加vEGF的基础培养基有更好的血管形成效果。
3、相较于现有技术，本发明培养体系中的添加剂，降低了重组人血管内皮生长因子、肝素、胰岛素的浓度，提高了R3胰岛素样生长因子1、转铁蛋白、氢化可的松的浓度，能够大幅降低培养基的成本，同时使生长因子的添加能够更加专注地刺激内皮细胞的生长。而且，在不同阶段重组人血管内皮生长因子采用不同浓度，可以满足形成管状结构对于重组人血管内皮生长因子有较高的浓度需求。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为应用例1中的细胞生长情况；
图2为应用例1中的细胞CD31免疫荧光图；
图3为应用例1中的CD31免疫荧光鉴定结果；
图4为应用例2中的血管形成情况；
图5为应用例2中的血管形成实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明实施例提供一种原代大血管内皮细胞的培养体系，按重量百分比计，该培养体系包括基础培养基78-86.5％、胎牛血清2-5％、抗生素1-5％和添加剂0.5-2％，其中，添加剂包括多种生长因子。
基础培养基包括了在4℃保存时不易分解的成分，在一些实施方式中，基础培养基包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素、嘌呤、嘧啶、缓冲液和pH指示剂。
在上述基础培养基中，氨基酸是组成蛋白质的基本单位，是细胞蛋白质合成的原料，缺少氨基酸时细胞会发生生长不良；其中部分氨基酸机体无法合成被称为必需氨基酸；但是添加的氨基酸包括必需和非必需氨基酸，非必需氨基酸也可以替代细胞生长过程中耗尽的的成分刺激细胞增殖。葡萄糖是用于供能的的碳水化合物。维生素中的很多种是多种酶的活性基团成分，因此是细胞生长和增殖必不可少的，由于单纯的细胞无法产生足够多种类和数量的维生素，因此必须在培养基中进行添加。培养基中添加了多种无机盐成分以维持细胞的正常生理功能和细胞的渗透压，其中Na+、K+和Cl–还参与许多大分子物质的跨膜运输；Mg2+是细胞间质的重要组分和很多酶反应的辅酶；Ca2+能够调节细胞膜功能并参与多项细胞生理活动。脂类在培养基中的添加为细胞提供适当的预成形脂质，减少了细胞对其生物合成的需要。能够促进细胞的新陈代谢，提高细胞分裂速率和代谢水平。细胞的增殖需要细胞不断地分裂，其中伴随着DNA的不断复制，嘌呤和嘧啶是DNA的基本著组成物质，其添加有利于细胞DNA的快速合成，提高细胞增殖速率。缓冲液中HCO3 -主要发挥缓冲作用，降低培养基pH的变化程度。pH指示剂如酚红的主要作用是指示培养基的酸碱度，提示使用者在培养环境变化至不适宜细胞生长前进行换液。
在一优选实施方式中，基础培养基的组成如表1所示。
表1基础培养基的组成
Figure BDA0003865387690000041
Figure BDA0003865387690000051
Figure BDA0003865387690000061
在一些实施方式中，添加剂为在4℃保存时容易分解的物质，添加剂以工作浓度100 倍的浓度配置成溶液在-20℃长期保存，其中工作浓度即在培养体系中的浓度，需要使用时按百分之一的量添加至基础培养基中。
在一些实施方式中，添加剂还包括氢化可的松。多种生长因子包括重组人表皮细胞生长因子(EGF)、重组人血管内皮生长因子(vEGF)、重组人碱性成纤维生长因子(bFGF)、R3胰岛素样生长因子1、肝素、重组人胰岛素、人全铁转铁蛋白。上述添加剂中多种生长因子的组合，能够形成的对胎牛血清依赖的降低，和对内皮细胞有针对性的营养支持，以更长的维持体外培养的内皮细胞的增殖时间和细胞特性。
EGF是人体内分泌的一种重要细胞生长因子，有很强的生理活性，其主要功能是促进细胞的分裂，加快新陈代谢。此添加剂的浓度不宜过高，因为也会促进主要杂细胞成纤维细胞的增殖。vEGF是一种特异性作用于血管内皮细胞的多功能细胞因子，在体内有诱导血管生长、血管形成、内皮细胞增殖迁移。添加在培养基中可以特异性的增强内皮细胞的增殖的迁移，更利于内皮细胞的生长。成纤维细胞生长因子(FGF)家族成员具有广泛的有丝分裂和细胞存活活性，该蛋白亦可作为内皮细胞迁移和增殖的修饰物。 bFGF是重要的促有丝分裂的因子，会促进血管生成，因此对内皮细胞的生长有重要作用。此添加剂的浓度不宜过高，因为也会促进主要杂细胞成纤维细胞的增殖。胰岛素一号增长因子(IGF-1)是一种与胰岛素前体蛋白在结构上类似的蛋白，具有更好的促生长作用，能促进多数细胞的分裂、迁移和分化。与人天然的IGF-I相比，R3胰岛素样生长因子1降低了与人IGF-I结合蛋白的结合能力，游离浓度更高，因而显著提高了生物学活性。肝素是一种天然抗凝血物质，添加其在内皮培养基中是由于肝素结合型的生长因子，如内皮细胞生长因子(ECGF)，重组人酸性成纤维细胞生长因子(FGF-1)，碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)等，在肝素存在的情况下可以增加血管内皮细胞的增殖，肝素通过阻止蛋白分解性降解和诱导FGF分子寡聚化来稳定生长因子的活性，从而与 FGF受体结合形成二聚体并激活。胰岛素可以促进细胞中RNA、蛋白质、脂肪酸的合成，抑制细胞凋亡，维持其一定浓度可以使细胞保持较高的生长速率。转铁蛋白，铁参与DNA的复制和细胞代谢，是一种必需元素，转铁蛋白能够为细胞补充铁元素，维持细胞的正常生长和增殖。通过上述生长因子的共同作用，促进细胞增殖，降低对血清的依赖。氢化可的松作为一种糖皮质激素，在培养中主要起到降低细胞应激反应，维持细胞稳定生长的作用。
在一优选实施方式中，添加剂的组成如表2所示。
表2添加剂的组成
组分名称 工作浓度
重组人表皮细胞生长因子 3-10ng/ml
氢化可的松 0.15-0.3ug/ml
重组人血管内皮生长因子 1-5ng/ml
重组人碱性成纤维生长因子 2-10ng/ml
R<sup>3</sup>胰岛素样生长因子1 10-20ng/ml
肝素 20-80ug/ml
重组人胰岛素 5-10ug/ml
人全铁转铁蛋白 8-20ug/ml
在一些实施方式中，抗生素包括青霉素和链霉素。青霉素和链霉素以工作浓度100倍的浓度配置成溶液在-20℃长期保存，需要使用时按百分之一的量添加至基础培养基中。因为原代分离的细胞由于组织提取的过程中无法做到全程无菌，最后很难避免少量细菌的残留，培养体系中添加青霉素和链霉素两种抗生素可以极大降低原代培养的污染概率，同时不会对细胞的生长造成影响。青霉素和链霉素溶液是以工作浓度100倍的浓度配置成溶液在-20℃长期保存，需要使用时按百分之一的量添加至培养基中，优选地，培养体系中使用50-500U/ml的青霉素和50-500ug/ml的链霉素，此双抗浓度有利于培养原代细胞，根据研究证实，高于此浓度会对部分种类的细胞增殖产生影响，而低于此浓度会更容易使原代分离时附带的极少量微生物污染爆发出来。
胎牛血清是细胞培养中的重要添加成分，还有多种细胞生长所需的生物活性成分，其在培养基中以高浓度存在时(10％-20％)会极大的促进成纤维细胞，间质细胞和平滑肌细胞的增殖速度。在一些实施方式中，胎牛血清的添加量为2％-5％。本发明实施例的培养体系中由于针对内皮细胞的营养需求添加了添加剂中的多种重组蛋白，所以降低了内皮细胞对血清的依赖，培养体系中血清的添加量只需要2％-5％。这种低血清的含量也可以降低原代分离后成纤维细胞、间质细胞和平滑肌细胞这些杂细胞的增殖速度。
本发明实施例通过多种重组蛋白的组合使用，形成对内皮细胞生长和增殖形成充足和有足够特异性的营养支持，同时利用这些多种组蛋白对内皮细胞的营养支持，降低对培养体系中添加血清量的需求，而血清浓度的降低可以有效降低血管成纤维细胞，血管平滑肌细胞等杂细胞生长速度，更利于内皮细胞获得增值速度上的优势，进而获得生长优势，从而更容易的获得高纯度的大血管内皮细胞，实现一种低血清条件下能够长期稳定培养大血管内皮细胞的培养体系，从而解决现有方案难以获得高纯度的内皮细胞，以及无法长期维持内皮细胞特定活性的问题。
本发明实施例中的培养体系，能够提高内皮细胞原代分离的成功率，降低杂细胞的生长速度，增加内皮细胞传代后维持内皮细胞特性的代数，实现在低血清条件下能够长期稳定培养大血管内皮细胞；而且可以作为内皮细胞血管生成实验的刺激培养基，能够比单纯添加vEGF的基础培养基具有更好的血管形成效果。
以具体应用例和对比例对本发明实施例中的原代大血管内皮细胞的培养体系的效果进行进一步说明。
应用例1
本发明实施例提供一种上述的培养体系在培养内皮细胞中的应用；具体地，将培养体系用于培养脐静脉内皮细胞，包括以下步骤：
步骤1、按下述表3的浓度配制基础培养基：
表3基础培养基的组成
Figure BDA0003865387690000081
Figure BDA0003865387690000091
步骤2、按下述表4的浓度配制添加剂、抗生素和血清：
表4基础培养基中添加剂、抗生素(双抗生素)和血清的浓度
Figure BDA0003865387690000092
Figure BDA0003865387690000101
步骤3、按上述列表配制培养基后，依照以下的步骤从脐带中分离脐静脉内皮细胞：
(1)取材：正常分娩胎儿脐带，长15-20cm；
(2)材料预处理：将获取的血管放入含双抗的1×PBS(pH7.4)中反复洗涤，去除脐带外部的血渍，之后用注射器吸取洗涤液反复灌住冲洗脐带静脉血管，至血管内无血渍，洗涤液澄清为止；
(3)消化液：用注射器灌注空气推注入血管中，排出残余洗涤液，在从血管一端开口处注入消化液，当另一开口端有消化液流出即可用止血钳结扎血管，继续灌注消化液，到血管充盈为止，同样用止血钳截流血管，放入含双抗的1×PBS(pH7.4)的烧杯中37℃水浴消化30min；
(4)终止消化：去掉止血钳，让酶液流入预先准备好的培养皿中，按1∶1加入培养液，终止酶反应，用培养基灌注血管清洗3次；
(5)收集重悬细胞：收集终止后的消化液于离心管中，1000rpm离心10min，弃去上清，加入培养液重悬；
(6)培养细胞密度：调整细胞密度以合适的密度接种入培养瓶；
(7)培养：放置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
上述步骤中所用的培养基为通过上述步骤1和2制备得到的原代大血管内皮细胞培养体系，完成分离后一般第二天换液去除未贴壁的死细胞，添加4ml新的原代大血管内皮细胞培养体系继续培养2-5天，期间隔天换液，待瓶中细胞增殖至80-90％铺瓶率即得到足够量的高纯度内皮细胞，经过CD31免疫荧光鉴定纯度一般在85％以上，优化流程后可高于90％。
以专利201610113482.0中的内皮培养基作为对照；两组细胞的生长情况如图 1所示。图1中的一组图片分别为原代分离后用两种不同培养基培养的Day1-Day5 的原代脐静脉内皮细胞；其中，a代表本申请的内皮培养体系培养的原代脐静脉内皮细胞；b代表对照培养基培养的原代脐静脉内皮细胞。
由图1生长图片可以看出，第一天的时候，对照培养基贴壁的细胞较多，但是有老化的倾向，且有少量成纤维样细胞，纯度相对较低。第三天时本申请的内皮培养体系培养的细胞已经明显有更快的生长速度和统一的铺路石形态；而对照培养基培养的细胞出现了内皮细胞形态老化，生长细胞形态不一等问题。第五天时，虽然两种培养基培养的细胞基本均已长满，但是明显本申请的内皮培养体系培养的细胞新形态均一，未有明显大量老化的细胞，对照培养基培养的原代脐静脉内皮细胞有一定比例明显发生老化的细胞存在，并且有不少长梭状的成纤维杂细胞的存在。
对上述培养的细胞进行IF免疫荧光鉴定内皮细胞的特异性表面标记CD31，结果如图2和3所示。从IF的结果可以明显看出本申请的内皮培养体系培养的脐静脉内皮细胞有更高的CD31阳性率，差异明显。
应用例2
本发明实施例提供一种上述的培养体系在内皮细胞血管生成中的应用；具体地，将培养体系用于内皮细胞的血管形成功能检测，包括以下步骤：
步骤1、按下述表5的浓度配制基础培养基：
表5基础培养基的组成
Figure BDA0003865387690000111
Figure BDA0003865387690000121
步骤2、按下述表7的浓度配制添加剂，抗生素和血清：
表7基础培养基中添加剂、抗生素(双抗生素)和血清的浓度
组分名称 工作浓度
重组人表皮细胞生长因子 5ng/ml
氢化可的松 0.2ug/ml
重组人血管内皮生长因子 5ng/ml
重组人碱性成纤维生长因子 2ng/ml
R<sup>3</sup>胰岛素样生长因子1 10ng/ml
肝素 25ug/ml
重组人胰岛素 5ug/ml
人全铁转铁蛋白 10ug/ml
胎牛血清 0.02ml/ml
青霉素 100UI/ml
链霉素 100ug/ml
步骤3、按上述列表配制培养基后，依照以下的步骤进行血管形成实验：
(1)实验前一天，将没稀释的基质胶从-20℃转至4℃，过夜溶解；
(2)将96孔板、100ul吸头放置在4℃冰箱提前预冷后使用；
(3)将基质胶放置在冰上后转移到安全柜中进行操作，96板取出后最好也置于冰盒上保持低温；
(4)用预冷的吸头吸取60ul基质胶加入每个孔中，加液时要小心，避免产生气泡；
(5)基质胶加完后将96孔板置于二氧化碳培养箱中37℃孵育30min，使基质胶凝固；
(6)将要做血管形成检测的细胞消化下来，以20000-30000个细胞/孔的数量用上述配置的原代内皮培养体系重选后接种于孔中，置于二氧化碳培养箱中37℃孵育6h后镜下观察血管形成情况，之后每隔2h拍照一次。
用上述步骤1和2制备得到的原代大血管内皮细胞培养体系进行此检测能够更快形成更多血管的网状结构，更有利于实验的完成和数据的统计。
以专利201610113482.0中的内皮培养基作为对照，同样经过上述流程分离用人脐静脉内皮细胞做血管形成实验作为对照；将细胞铺至基质胶上，6h后两组细胞的血管形成情况如图4所示。
图4中一组图片分别为同样用纯度高于95％原代脐静脉内皮细胞做血管形成实验；其中，a代表本申请内皮培养体系的细胞；b代表对照培养基诱导成管。从图5 可以看出用本申请内皮培养体系培养6h的原代脐静脉内皮细胞的成管数明显更高。
为了说明本申请的上述技术效果，下表6示出了对照培养基中的添加剂的浓度。
表6对照内皮培养基的添加剂的浓度
组分名称(中文) 工作浓度
重组人表皮细胞生长因子 5ng/ml
氢化可的松 10ng/ml
重组人血管内皮生长因子 10ng/ml
重组人碱性成纤维生长因子 5ng/ml
R<sup>3</sup>胰岛素样生长因子1 5ng/ml
肝素 50ug/ml
重组人胰岛素 10ug/ml
人全铁转铁蛋白 5ug/ml
相较于对照培养基的配方，在进行细胞培养时本申请降低了重组人血管内皮生长因子(rh vEGF165)的添加浓度(比如2％)，作为所添加的细胞因子中最为昂贵的一种，适当降低其浓度可以大幅降低培养基的成本。同时，相较于对照培养基的配方，相对的提高了R3胰岛素样生长因子1(R3-IGF-1)和转铁蛋白的添加浓度，并在 2-5％范围内可根据细胞生长状态调整添加血清的浓度。另外，使用本申请的培养体系在进行血管形成诱导时，将重组人血管内皮生长因子(rh vEGF165)的添加浓度增加至 5ng/ml，在相对于对照培养基降低总体添加浓度的同时，在不同阶段rh vEGF165采用不同浓度，可以满足形成管状结构对于rh vEGF165有较高的浓度需求，而血清的添加量则维持2％即可。
此外，本申请大幅提高了氢化可的松的工作浓度，可以很好地抑制原代分离后杂细胞成纤维细胞的生长，因为相较内皮细胞，200ng/ml的氢化可的松对成纤维细胞的生长抑制效果要强很多。除此之外也下调了肝素、胰岛素这些相对比较常规的因子，也是为了降低其广泛的细胞生长促进能力，使生长因子的添加能够更加专注的刺激内皮细胞的生长。相对于现有技术，采用上述各组分及其用量，能降低了细胞生长速度，培养的细胞新形态均一，不会有明显大量老化的细胞，而且降低使用的培养基成本。
以上对本发明的部分具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。上述各优选特征在互不冲突的情况下，可以任意组合使用。

Claims (10)

1.一种原代大血管内皮细胞的培养体系，其特征在于，按重量百分比计，包括基础培养基78-86.5％、胎牛血清2-5％、抗生素1-5％和添加剂0.5-2％，所述添加剂包括多种生长因子。
2.根据权利要求1所述的原代大血管内皮细胞的培养体系，其特征在于，所述基础培养基包括氨基酸、维生素、盐类、脂类、微量元素、嘌呤、嘧啶、缓冲液和pH指示剂。
3.根据权利要求1所述的原代大血管内皮细胞的培养体系，其特征在于，所述添加剂为在4℃保存时容易分解的物质，所述添加剂以工作浓度100倍的浓度配置成溶液在-20℃长期保存，使用时按百分之一的量添加至所述基础培养基中。
4.根据权利要求1所述的原代大血管内皮细胞的培养体系，其特征在于，所述多种生长因子包括重组人表皮细胞生长因子、重组人血管内皮生长因子、重组人碱性成纤维生长因子、R3胰岛素样生长因子1、肝素、重组人胰岛素、人全铁转铁蛋白。
5.根据权利要求4所述的原代大血管内皮细胞的培养体系，其特征在于，所述添加剂还包括氢化可的松。
6.根据权利要求5所述的原代大血管内皮细胞的培养体系，其特征在于，所述添加剂中各组分在培养体系中的浓度为：重组人表皮细胞生长因子3-10ng/ml、氢化可的松0.15-0.3ug/ml、重组人血管内皮生长因子1-5ng/ml、重组人碱性成纤维生长因子2-10ng/ml、肝素20-80ug/ml、重组人胰岛素5-10ug/ml、人全铁转铁蛋白8-20ug/ml、R3胰岛素样生长因子1浓度为10-20ng/ml。
7.根据权利要求1所述的原代大血管内皮细胞的培养体系，其特征在于，所述抗生素包括青霉素和链霉素。
8.根据权利要求7所述的原代大血管内皮细胞的培养体系，其特征在于，所述青霉素和链霉素以工作浓度100倍的浓度配置成溶液在-20℃长期保存，使用时按百分之一的量添加至所述基础培养基中。
9.一种权利要求1-8任一项所述的培养体系在培养内皮细胞中的应用。
10.一种权利要求1-8任一项所述的培养体系在内皮细胞血管生成中的应用。
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