CN112004820A - 具有增强的人胰腺向性的新型重组腺相关病毒衣壳 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及变体AAV衣壳多肽，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽在人胰腺组织或人胰岛中表现出增加的转导和/或向性。

Description

具有增强的人胰腺向性的新型重组腺相关病毒衣壳
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年3月30日提交的美国临时申请第62/651,010号以及于2018年10月12日提交的美国临时申请第62/745,226号的优先权，所述两个美国临时申请通过引用以其整体特此并入。
联邦资助的研究或开发中的发明权利声明
本发明是在美国政府的支持下进行的，授权号为U01DK089569。美国政府享有本发明的一定权利。
技术领域
本发明涉及变体AAV衣壳多肽，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，变体AAV衣壳多肽在人胰腺组织或人胰岛中表现出增加的转导和/或向性。
背景技术
由合乎期望的基因的缺失或缺陷(功能丧失)或不合期望的或有缺陷的基因的表达(功能获得)引起的遗传性病症会导致各种疾病。目前，腺相关病毒(AAV)载体被认为是治疗性应用的首选基因转移载体，因为所述载体对于体内基因递送具有最佳的安全(复制缺陷性、低整合率和最低免疫应答)和功效性质。AAV载体是小型无包膜非致病性辅助病毒依赖型ssDNA病毒，并且所述载体具有多种有不同的组织向性和转导效率的血清型。在迄今为止分离的AAV血清型中，AAV2和AAV8已被用于靶向受严重血友病B影响的患者的肝。这两种载体均高效地发挥作用，并且在AAV8的情况下，记载了治疗性转基因的长期表达。来自人类的最新数据表明，用AAV载体靶向肝实现了FIX转基因在治疗水平上的长期表达。另外，已经报道了使用AAV血清型1、2和/或嵌合体2.5的若干1期和2期临床试验以用于治疗囊性纤维化、血友病、卡纳万病(Canavan's disease)、杜氏肌营养不良(Duchenne musculardystrophy)(DMD)和α-1抗胰蛋白酶缺乏症(M.Hildinger和A.Auricchio.《欧洲人类遗传学杂志(Eur J Hum Genet)》,12,263-271(2004)；C.Li、D.E.Bowles、T.V.Dyke和R.J.Samulski,《癌症基因疗法(Cancer Gene Ther.)》,12(12):913-926(2005)；D.E.Bowles、S.WJ McPhee、C.Li、S.J.Gray、J.J.Samulski、A.S.Camp、J.Li、B.Wang、P.E.Monahan、J.E.Rabinowitz、J.C.Grieger、La.Govindasamy、M.Agbandje-McKenna、X.Xiao和R.J.Samulski,《分子疗法(Molecular Therapy)》,20,443-455(2012)；M.L.Brantly、J.D.Chulay、L.Wang、C.Mueller、M.Humphries、L.T.Spencer、F.Rouhani、T.J.Conlon、R.Calcedo、M.R.Betts、C.Spencer、B.J.Byrne、J.M.Wilson、T.R.Flotte,在rAAV1-AAT基因疗法的临床试验中，尽管存在T淋巴细胞应答，转基因仍持续表达(Sustained transgene expression despite T lymphocyte responses in a clinicaltrial of rAAV1-AAT gene therapy)《美国国家科学院院刊(Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America)》106,16363-16368(2009)；T.R.Flotte、M.L.Brantly、L.T.Spencer、B.J.Byrne、C.T.Spencer、D.J.Baker、M.Humphries、Phase I trial，向缺乏AAT的成年人肌内注射重组腺相关病毒α1-抗胰蛋白酶(rAAV2-CB-hAAT)基因载体的I期试验(Phase I trial of intramuscular injectionof a recombinant adeno-associated virus alpha 1-antitrypsin(rAAV2-CB-hAAT)gene vector to AAT-deficient adults)《人类基因疗法(Human gene therapy)》15,93-128(2004)；T.R.Flotte、B.C.Trapnell、M.Humphries、B.Carey、R.Calcedo、F.Rouhani、M.Campbell-Thompson、A.T.Yachnis、R.A.Sandhaus、N.G.McElvaney、C.Mueller、L.M.Messina、J.M.Wilson、M.Brantly、D.R.Knop、G.J.Ye、J.D.Chulay，表达α1-抗胰蛋白酶的重组腺相关病毒载体的2期临床试验：中期结果(Phase 2clinical trial of arecombinant adeno-associated viral vector expressing alpha1-antitrypsin:interim results)《人类基因疗法》22,1239-1247(2011)；C.Mueller、J.D.Chulay、B.C.Trapnell、M.Humphries、B.Carey、R.A.Sandhaus、N.G.McElvaney、L.Messina、Q.Tang、F.N.Rouhani、M.Campbell-Thompson、A.D.Fu、A.Yachnis、D.R.Knop、G.J.Ye、M.Brantly、R.Calcedo、S.Somanathan、L.P.Richman、R.H.Vonderheide、M.A.Hulme、T.M.Brusko、J.M.Wilson、T.R.Flotte，人Treg应答允许重组腺相关病毒介导的转基因表达持续(HumanTreg responses allow sustained recombinant adeno-associated virus-mediatedtransgene expression)《临床研究杂志(Journal of Clinical Investigation)》123,5310-5318(2013))。
作为细小病毒家族的成员，腺相关病毒(AAV)是单链线性DNA基因组为4.7千碱基(kb)的小型无包膜二十面体病毒。AAV被归为依赖病毒属，因为所述病毒是作为纯化的腺病毒原种中的污染物而被发现的(D.M.Knipe、P.M.Howley,《菲尔德病毒学(Field'sVirology)》,费城利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lippincott Williams&Wilkins),第六版,2013)。在AAV的野生型状态下，AAV依赖于辅助病毒，通常是腺病毒来提供复制所需的蛋白质因子，因为AAV具有天然的复制缺陷。AAV的4.7-kb基因组的两侧是两个折叠成对复制具有重要性的发夹形状的反向末端重复序列(ITR)。具有天然的复制缺陷并且能够转导人体中几乎每种细胞类型，AAV表示用于基因疗法或疫苗递送的治疗性用途的理想载体。在AAV的野生型状态下，AAV的生命周期包含：潜伏期，在所述潜伏期期间，AAV基因组在感染后被位点特异性地整合到宿主染色体中；以及感染期，在所述感染期期间，整合的基因组在腺病毒或单纯性疱疹病毒感染之后随后恢复、复制并包装成感染性病毒。当矢量化时，AAV的病毒Rep和Cap基因被去除并在病毒产生期间以反式提供，从而使ITR成为保留的唯一病毒DNA(A.Vasileva、R.Jessberger,《自然微生物学综述(Naturereviews.Microbiology)》,3,837-847(2005))。然后，将Rep和Cap替换为一系列可能的转移载体构型，以执行基因添加或基因靶向。这些矢量化的重组AAV(rAAV)可以转导分裂细胞和非分裂细胞两者并且在诸如胰腺组织等静止组织中示出强健的稳定表达。随着基于rAAV的疗法的日益普遍，已经完成或正在进行以治疗各种遗传性或后天性疾病的rAAV基因疗法临床试验的数量急剧增加。类似地，在临床疫苗领域，有许多最近的临床前研究和一项正在进行的临床试验使用rAAV作为载体，以被动疫苗方法针对人/猿免疫缺陷病毒(HIV/SIV)、流感病毒、亨尼帕病毒(henipavirus)、人乳头瘤病毒(HPV)递送抗体表达盒。(参见P.R.Johnson、B.C.Schnepp、J.Zhang、M.J.Connell、S.M.Greene、E.Yuste、R.C.Desrosiers、K.R.Clark,《自然医学(Nature medicine)》15,901-906(2009)；A.B.Balazs、J.Chen、C.M.Hong、D.S.Rao、L.Yang、D.Baltimore,《自然(Nature)》481,81-84(2012)；A.B.Balazs、Y.Ouyang、C.M.Hong、J.Chen、S.M.Nguyen、D.S.Rao、D.S.An、D.Baltimore,《自然医学》20,296-300(2014)；A.B.Balazs、J.D.Bloom、C.M.Hong、D.S.Rao、D.Baltimore,《自然生物技术(Nature biotechnology)》31,647-652(2013)；M.P.Limberis、V.S.Adam、G.Wong、J.Gren、D.Kobasa、T.M.Ross、G.P.Kobinger、A.Tretiakova、J.M.,《科学转化医学(Science translational medicine)》5,187ra172(2013)；M.P.Limberis、T.Racine、D.Kobasa、Y.Li、G.F.Gao、G.Kobinger、J.M.Wilson,广泛中和抗体FI6在小鼠气道中的矢量化表达提供了针对新的A型禽流感病毒H7N9的部分保护(Vectored expression of the broadly neutralizing antibody FI6 in mouse airwayprovides partial protection against a new avian influenza A virus,H7N9)《临床与疫苗免疫学：CVI(Clinical and vaccine immunology:CVI)》20,1836-1837(2013)；J.Lin、R.Calcedo、L.H.Vandenberghe、P.Bell、S.Somanathan、J.M.Wilson,《病毒学杂志(Journal of virology)》83,12738-12750(2009)；I.Sipo、M.Knauf、H.Fechner、W.Poller、O.Planz、R.Kurth、S.Norley,《疫苗(Vaccine)》29,1690-1699(2011)；A.Ploquin、J.Szecsi、C.Mathieu、V.Guillaume、V.Barateau、K.C.Ong、K.T.Wong、F.L.Cosset、B.Horvat、A.Salvetti,《感染性疾病杂志(The Journal of infectious diseases)》207,469-478(2013)；D.Kuck、T.Lau、B.Leuchs、A.Kern、M.Muller、L.Gissmann、J.A.Kleinschmidt,《病毒学杂志》80,2621-2630(2006)；K.Nieto、A.Kern、B.Leuchs、L.Gissmann、M.Muller、J.A.Kleinschmidt,《抗病毒疗法(Antiviral therapy)》14,1125-1137(2009)；K.Nieto、C.Stahl-Hennig、B.Leuchs、M.Muller、L.Gissmann、J.A.Kleinschmidt,《人类基因疗法》23,733-741(2012)；以及L.Zhou、T.Zhu、X.Ye、L.Yang、B.Wang、X.Liang、L.Lu、Y.P.Tsao、S.L.Chen、J.Li、X.Xiao,《人类基因疗法》21,109-119(2010)。)非致病性、广泛的宿主感染性范围(包含非分裂细胞)和潜在的位点特异性染色体整合的特性使AAV成为有吸引力的基因转移工具。
第一个在西方国家获得批准的基于rAAV的基因疗法(用于脂蛋白脂肪酶缺乏症的
Figure BDA0002714660000000041
于2012年在欧盟批准使用)刺激了基因疗法界、投资者和监管者将rAAV疗法引入全球临床的真正可能性。然而，尽管rAAV具有出色的转导多种组织和细胞类型的能力，但是几个缺点限制了其在临床应用中的用途，如其混杂性、有限的转基因包装大小以及在普通人群中预先存在的中和抗体的高流行率。出于基因疗法的目的，转导既要高效又要具有高度细胞类型特异性。胰腺组织历来是以高水平进行转导的最具挑战性的组织之一，所述高水平足以提供治疗水平的递送转基因产物的表达。
最近围绕可能使用rAAV作为针对病原性病毒(特别是HIV和流感病毒)提供被动免疫保护的疫苗的递送载体的令人兴奋的事件重新唤起了人们对用于这种独特的疫苗接种方法的能够进行高效胰腺递送的rAAV衣壳的迫切需求。鉴于使用现有rAAV血清型进行有效的人胰腺转导的局限性，因此能够以足以表达用于疫苗策略的治疗水平的广谱抗体或胰腺病症所必需的基因的水平有效地转导人胰腺组织或人胰岛的临床rAAV载体候选物的生物工程是人们所追求的。
多种已出版的美国申请描述了AAV载体和病毒体，包含美国出版物第2015/0176027号、第2015/0023924号、第2014/0348794号、第2014/0242031号和第2012/0164106号；所有所述出版物通过引用以其整体并入本文。
然而，胰腺基因疗法试验需要高水平的转导，因为在单次腹膜内注射中可以递送多少AAV是有物理限制的，所述物理限制因注射需要确保注射的载体明确地和有效地靶向患病的胰腺组织或胰岛细胞这一事实而更加复杂。如果AAV具有优越的人胰腺转导能力，则可能需要更低的剂量和更少的注射剂来实现治疗相关性。类似地，对于用作疫苗递送工具，需要高效的转导和稳定性以实现在AAV内进行编码的抗体的强健分泌，从而达到血液中循环抗体的治疗水平。
因此，本领域仍然需要具有改善的人胰腺组织转导的AAV载体。本发明通过提供变体AAV衣壳多肽来满足此需求，所述变体AAV衣壳多肽在转导人胰腺组织和/或胰岛细胞方面表现出比非变体亲本衣壳多肽显著改善的人胰腺组织转导。本发明利用定向进化通过DNA基因改组和重新编程策略来表征和筛选此类变体AAV衣壳多肽，所述变体AAV衣壳多肽具有高于最佳亲本(即，LK03，主要是α细胞特异性)的人胰岛细胞转导效率，并且具有高细胞类型特异性转导(例如，α或β细胞特异性)。
发明内容
本发明提供了变体腺相关病毒(AAV)衣壳多肽。与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽在人胰腺组织或人胰岛中表现出增加的转导和/或向性。
在一些实施例中，与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽在人胰腺组织或人胰岛中表现出增加的转导和/或向性。
在一些实施例中，所述变体AAV衣壳多肽转导解离的或完整的人胰岛。
在一些实施例中，与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽表现出增加的转导。
在一些实施例中，与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽表现出增加的向性。
在一些实施例中，与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽在人胰岛内的一种或多种类型的细胞中进一步表现出增加的转导或向性。
在一些实施例中，与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽在体内表现出增加的人胰腺组织或人胰岛的转导。
在一些实施例中，与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽在体外表现出增加的人胰腺组织或人胰岛的转导。
在一些实施例中，与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽离体表现出增加的人胰腺组织或人胰岛的转导。
在一些实施例中，与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽表现出增强的中和性质。
在一些实施例中，与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽对汇集的人免疫球蛋白表现出增强的中和性质。
在一些实施例中，所述表现出增强的中和性质的变体AAV衣壳多肽选自由AAV-10A1(SEQ ID NO:1)和AAV-10A3(SEQ ID NO:2)组成的组。在一些实施例中，所述表现出增强的中和性质的变体AAV衣壳多肽是AAV-10A1(SEQ ID NO:1)。在一些实施例中，所述表现出增强的中和性质的变体AAV衣壳多肽是AAV-10A3(SEQ ID NO:2)。
在一些实施例中，所述变体AAV衣壳多肽是功能性AAV衣壳的一部分，其中功能性AAV衣壳包装核酸序列，所述核酸序列选自由非编码RNA、蛋白质编码序列、表达盒、多表达盒、同源重组序列、基因组基因靶向盒和治疗性表达盒组成的组。
在一些实施例中，所述核酸序列包含在AAV载体中。
在一些实施例中，所述表达盒是CRISPR/CAS表达系统。
在一些实施例中，所述治疗性表达盒对治疗性蛋白或抗体进行编码。
在一些实施例中，所述变体AAV衣壳多肽选自由以下组成的组：AAV-10A1(SEQ IDNO:1)、AAV-10A3(SEQ ID NO:2)、AAV-10A4(SEQ ID NO:3)、AAV-10A5(SEQ ID NO:4)、AAV-18A1(SEQ ID NO:5)、AAV-10B1(SEQ ID NO:6)、AAV-10B3(SEQ ID NO:7)、AAV-10B5(SEQ IDNO:8)、AAV-10B6(SEQ ID NO:9)、AAV-10B7(SEQ ID NO:10)、AAV-18B2(SEQ ID NO:12),以及AAV-18B3(SEQ ID NO:13)。
在一些实施例中，所述变体AAV衣壳多肽选自由以下组成的组：AAV-10A1(SEQ IDNO:1)、AAV-10A3(SEQ ID NO:2)和AAV-18A1(SEQ ID NO:5)。
本发明还提供了在治疗性治疗方案或疫苗中使用本发明的变体AAV衣壳多肽的方法。
在一些实施例中，所述方法在内分泌病症的治疗性治疗中使用如上所述的变体AAV衣壳多肽。
在一些实施例中，所述方法在糖尿病的治疗性治疗中使用如上所述的变体AAV衣壳多肽，所述糖尿病包含I型糖尿病和II型糖尿病。
本发明还提供了使用本发明的变体AAV衣壳多肽来减少向受试者施用的核酸总量的方法，其中所述方法包括：当使用变体AAV衣壳多肽转导所述核酸时，与使用非变体亲本衣壳多肽转导所述核酸以获得类似的治疗效果时施用于所述受试者的核酸量相比，向所述受试者施用更少的核酸总量。
本发明还提供了包含对变体AAV衣壳多肽进行编码的核酸序列的AAV载体，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽在人胰腺组织或人胰岛中表现出增加的转导或向性。
在一些实施例中，与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽表现出增加的转导。
在一些实施例中，与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽表现出增加的向性。
在一些实施例中，与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽在体内表现出增加的人胰腺组织或人胰岛的转导。
在一些实施例中，与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽在体外表现出增加的人胰腺组织或人胰岛的转导。
在一些实施例中，与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽离体表现出增加的人胰腺组织或人胰岛的转导。
在一些实施例中，所述AAV载体进一步包括核酸序列，所述核酸序列选自由非编码RNA、编码序列、表达盒、多表达盒、同源重组序列、基因组基因靶向盒和治疗性表达盒组成的组。
在一些实施例中，所述变体AAV衣壳多肽允许以类似于非变体亲本衣壳多肽的方式进行核酸表达。
在一些实施例中，所述表达盒是CRISPR/CAS表达系统。
在一些实施例中，所述治疗性表达盒对治疗性蛋白或抗体进行编码。
在一些实施例中，所述变体AAV衣壳多肽序列选自由以下组成的组：AAV-10A1(SEQID NO:1)、AAV-10A3(SEQ ID NO:2)、AAV-10A4(SEQ ID NO:3)、AAV-10A5(SEQ ID NO:4)、AAV-18A1(SEQ ID NO:5)、AAV-10B1(SEQ ID NO:6)、AAV-10B3(SEQ ID NO:7)、AAV-10B5(SEQ ID NO:8)、AAV-10B6(SEQ ID NO:9)、AAV-10B7(SEQ ID NO:10)、AAV-18B2(SEQ IDNO:12),以及AAV-18B3(SEQ ID NO:13)。
在一些实施例中，所述变体AAV衣壳多肽序列选自由以下组成的组：AAV-10A1(SEQID NO:1)、AAV-10A3(SEQ ID NO:2)和AAV-18A1(SEQ ID NO:5)。
本发明还提供了在治疗性治疗方案或疫苗中使用本发明的AAV载体的方法。
在一些实施例中，所述方法在内分泌病症的治疗性治疗中使用如上所述的AAV载体。
在一些实施例中，所述方法在糖尿病的治疗性治疗中使用如上所述的AAV载体，所述糖尿病包含I型糖尿病和II型糖尿病。
本发明进一步提供了使用本发明的变体AAV衣壳多肽来减少向受试者施用的AAV载体总量的方法，其中所述方法包括：当通过变体AAV衣壳多肽转导所述AAV载体时，与通过非变体亲本衣壳多肽转导所述AAV载体以获得类似的治疗效果时施用于所述受试者的AAV载体量相比，向所述受试者施用更少的AAV载体总量。
在一些实施例中，本发明提供了一种用于产生变体AAV衣壳多肽的方法，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽在人胰腺组织或人胰岛中表现出增加的转导或向性，所述方法包括：
a)生成变体AAV衣壳多肽基因的文库，其中所述变体AAV衣壳多肽基因包含多个包括来自多于一种非变体亲本衣壳多肽的序列的变体AAV衣壳多肽基因；
b)通过将所述变体AAV衣壳多肽基因文库克隆到AAV载体中来生成AAV载体文库，其中所述AAV载体是有复制能力的AAV载体；
c)从b)中筛选所述AAV载体文库，其中所述AAV载体文库对与非变体亲本衣壳多肽相比在人胰腺组织或人胰岛中具有增加的转导或向性的变体AAV衣壳多肽进行编码；以及
d)从c)中选择所述变体AAV衣壳多肽。
在一些实施例中，所述方法进一步包括：e)确定来自d)的所述变体AAV衣壳多肽的序列。
在一些实施例中，与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽表现出增加的转导。
在一些实施例中，与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽表现出增加的向性。
在一些实施例中，与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽进一步表现出增强的中和性质。在一些实施例中，与非变体亲本衣壳多肽相比，本发明的所述变体AAV衣壳多肽对汇集的人免疫球蛋白进一步表现出增强的中和性质。
在一些实施例中，所述进一步表现出增强的中和性质的变体AAV衣壳多肽选自由AAV-10A1(SEQ ID NO:1)和AAV-10A3(SEQ ID NO:2)组成的组。在一些实施例中，所述进一步表现出增强的中和性质的变体AAV衣壳多肽是AAV-10A1(SEQ ID NO:1)。在一些实施例中，所述进一步表现出增强的中和性质的变体AAV衣壳多肽是AAV-10A3(SEQ ID NO:2)。
在一些实施例中，与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽在一种或多种非肌肉人体组织中进一步表现出增加的转导或向性。
在一些实施例中，与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽在体内表现出增加的人胰腺组织或人胰岛的转导。
在一些实施例中，与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽在体外表现出增加的人胰腺组织或人胰岛的转导。
在一些实施例中，与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽离体表现出增加的人胰腺组织或人胰岛的转导。
根据下面的详细描述，本发明的其它目的、优点和实施例将变得显而易见。
附图说明
图1.定向分子进化的图示。
图2.用于改组亲本衣壳氨基酸序列的系统发育关系。用于改组亲本衣壳序列之间的系统发育距离。示出了氨基酸序列的多样性范围。
图3.带条形码的经过衣壳改组的AAV文库的生成。文库生成工作流程：首先，生成AAV载体条形码文库，所述文库用作克隆经过改组的衣壳序列的主链。
图4.在质粒和AAV水平上随机选择的10亲本文库克隆中衣壳氨基酸序列的交叉分析。亲本贡献按以下顺序示出(从上到下)：po2、AAV1、AAV6、AAV3B、LK03、AAV8、rh10、AAV9hu14、AAV2、DJ。
图5.按氨基酸位置列出的10亲本文库中的亲本贡献。衣壳序列从质粒文库(上图)以及AAV文库(下图)扩增，并通过PacBio高通量测序进行分析。(A)与10个亲本相比，在质粒水平和AAV水平通过随机10亲本文库克隆的氨基酸位置进行的保守性分析。(B)在质粒水平(顶部)和AAV水平(底部)对10亲本文库衣壳进行的PacBio高通量测序，示出了整个衣壳序列中的亲本贡献。
图6. 18亲本文库(质粒水平)。
图7. 18亲本混合物的产生。
图8.完整的和解离的胰岛上的经过改组的文库以及带条形码的亲本AAV混合物的传代方案：屏幕A.人胰岛上的亲本混合物以及带条形码的经过改组的AAV文库的传代方案。
图9.AAV文库和18亲本混合物的复制。
图10. 18亲本对照混合物(左)的组成和传代过程中亲本cap AAV的富集(右)。右图仅示出了最富集的亲本AAV。(A)通过NGS BC测序确定的18亲本池的组分。(B)通过对完整胰岛和解离的胰岛上的18亲本混合物进行三次连续传代的亲本AAV的富集。
图11. 10亲本(左)和18亲本(右)文库的传代过程中的经过改组的AAV cap变体的富集。只有最富集的AAV变体以不同的颜色显示，其它所有则以灰色显示。选择用于进一步分析的变体按名称指示。通过对完整胰岛和解离的胰岛上的两个文库进行三轮选择的衣壳序列的富集。每次传代后，使用MiSeq通过NGS分析BC序列。彩色部分表示富集的AAV种群。指示了表型改善最多的变体(KP1，KP2，KP3)。
图12.完整胰岛上的经过改组的文库的传代方案：屏幕B。
图13. 10亲本文库的传代过程中的经过改组的AAV cap变体的富集。只有最富集的AAV变体以不同的颜色显示，其它所有则以灰色显示。选择用于进一步分析的变体按名称指示。红色的名称表示在两个独立的屏幕中富集的变体。
图14. 18亲本文库的传代过程中的经过改组的AAV cap变体的富集(上图)，第1轮为10个不含Ad5的亲本文库(下图)。只有最富集的AAV变体以不同的颜色显示，其它所有则以灰色显示。选择用于进一步分析的变体按名称指示。红色的名称表示在两个独立的屏幕中富集的变体。
图15.解离的人胰岛与AAV载体的转导。
图16.用于基因疗法的重组AAV。
图17.PacBio测序显示良好的cap-BC连接。
图18.表达GFP的rAAV的生成。使用BC序列特异性反向引物扩增来自富集的AAV物种的衣壳序列，并通过三质粒转染在293T细胞中产生rAAV。然后，通过qPCR对粗制或Takara试剂盒纯化的rAAV预制品的载体拷贝数进行定量，并用于转导胰岛细胞。
图19.胰岛细胞的转导效率。
图20.转导重复：仅顶部变体，MOI 1K对10K。
图21.最佳衣壳变体的组分(交叉，氨基酸)。文库亲本按照亲本条目的顺序以不同的颜色描绘。大点表示100％的亲本匹配(即，所讨论的位置仅匹配一个亲本)，而小点表示每个位置处的多于一个亲本匹配(即，所述位置匹配多个一个亲本)。每个嵌合体的实线表示在交叉之间的序列内鉴定的文库亲本。交叉之间的一组细水平平行线表示多个亲本以相等的概率进行匹配。
图22. 10A1和18A1比LK03能更好地转导β细胞。
图23.Grompe Transduction of islets.在冰上以MOI＝10K转导完整的整个胰岛1-2小时(2％FBS/CMRL)，并在培养物中悬浮3天。FACS：2B4/8G12mAbs。
图24.总胰岛GFP+(HIC1-2B4+种群)的定量。
图25.ALPHA GFP+(2B4+8G12+)细胞的定量。
图26.BETA GFP+(2B4+8G12-/lo)细胞的定量。(lo＝低表达)。
图27.其它GFP+(2B4+8G12int)细胞的定量。(int＝中间表达)。
图28.不同组中的GFP表达型细胞和中值荧光强度的定量。
图29.来自屏幕A中的矢量化衣壳变体。
图30.所选衣壳变体对人胰岛细胞的转导效率。试剂盒1E+05解离的胰岛细胞用半纯化或粗制rAAV以1K的MOI转导。48小时后，通过FACS评估转导效率。
图31.所选衣壳变体对人胰岛细胞的转导效率。1E+05解离的胰岛细胞用半纯化rAAV以1K和10K的MOI转导。48小时后，通过FACS评估转导效率。示出了优于最佳亲本LK03的转导改善。
图32.最佳衣壳变体在氨基酸水平上的交叉分析。
图33.以1K的MOI转导1E+05解离的胰岛细胞后GFP表达型细胞的定量。
图34.与LK03相比衣壳变体的性能。
图35.用于转导的cap变体的矢量化和测试。富集变体的验证：(A)使用BC特异性引物扩增来自富集AAV变体的衣壳序列，并将其用于包装具有GFP转基因的sc AAV载体。(B)使用变体的粗制病毒制剂以及最佳亲本之一(LK03)以1,000的MOI转导解离的胰岛细胞。(C)制备CsCl纯化的rAAV以获得最佳变体，并使用两种不同的MOI一式两份地分析胰岛细胞的转导。富集变体的验证：(A)使用BC特异性引物扩增来自富集AAV变体的衣壳序列，并将其用于包装具有GFP转基因的sc AAV载体。(B)使用变体的粗制病毒制剂以及最佳亲本之一(LK03)以1,000的MOI转导解离的胰岛细胞。(C)制备CsCl纯化的rAAV以获得最佳变体，并使用两种不同的MOI一式两份地分析胰岛细胞的转导。
图36.来自两个不同供体的人胰岛的转导(MOI 10,000)。AAV DJ、AAV LK03和新变体中的两个的胰岛亚群特异性转导效率。用GFP表达型rAAV以10,000的MOI对来自两个不同供体(A和B)的完整胰岛进行了转导。两天后，将胰岛解离的成单细胞悬液，并使用表面标志物染色随后进行FACS来分析α细胞或β细胞特异性转导。
图37.胰岛转导和细胞内染色。
图38.最佳衣壳变体的组分(交换，氨基酸)。文库亲本按照亲本条目的顺序以不同的颜色描绘。大点表示100％的亲本匹配(即，所讨论的位置仅匹配一个亲本)，而小点表示每个位置处的多于一个亲本匹配(即，所述位置匹配多个一个亲本)。每个嵌合体的实线表示在交叉之间的序列内鉴定的文库亲本。交叉之间的一组细水平平行线表示多个亲本以相等的概率进行匹配。(A)三个最佳变体的衣壳氨基酸序列的交叉分析。DJ和LK03的序列不作为亲本序列包含在内，因为其是由所示亲本序列组成的嵌合体。(B)使用UCSF CHIMERA将经过改组的变体3D伪色映射到AAV2 VP3的晶体结构上。颜色编码使用(A)中的颜色指示氨基酸贡献。
图39.各种人类和非人类细胞类型的转导效率。
图40.胰岛变体在肌肉细胞上的表现优于最佳NP22变体。
图41.纯化的rAAV制剂的蛋白质印迹结果。
图42.将新的rAAV变体注射到Balb/SCID小鼠中，并在体内测试了每个变体的转导效率。
图43.通过体内荧光素酶成像研究了新的AAV变体的体内转导效率。
图44.新的AAV变体的体内转导效率的定量(第7天和第14天)。
图45.新的AAV变体的体内转导效率的结果(第1周和第2周)。
图46.新的AAV变体的中和性质。新型衣壳变体对通过汇集的人源免疫球蛋白(IVIG)进行的中和的敏感性。将来自两个不同批次的指示浓度的IVIG与体积为100ul的2.2E+07RaAv载体拷贝在37℃下温育1小时，然后用100的MOI一式两份地转导许可的Huh7细胞。在转导后24小时确定了来自细胞裂解物的荧光素酶活性。新型衣壳变体对通过汇集的人源免疫球蛋白(IVIG)进行的中和的敏感性。将来自两个不同批次的指示浓度的IVIG与体积为100ul的2.2E+07RaAv载体拷贝在37℃下温育1小时，然后用100的MOI一式两份地转导许可的Huh7细胞。在转导后24小时确定了来自细胞裂解物的荧光素酶活性。
图47.新的AAV变体的体内肝转导效率(第7天、第14天、第21天和第33天)。新的衣壳变体的体内转导效率。向Balb/C SCID小鼠注射2E+10vg的包装有各种衣壳的AAV荧光素酶载体，并使用Ami成像系统监测肝中的荧光素酶活性数周。每组的平均值以最小值和最大值示出。新的衣壳变体的体内转导效率。向Balb/C SCID小鼠注射2E+10vg的包装有各种衣壳的AAV荧光素酶载体，并使用Ami成像系统监测肝中的荧光素酶活性数周。每组的平均值以最小值和最大值示出。
图48.荧光素酶在各种器官中的表达(离体，第5周)。注射rAAV后34天在各种小鼠器官中测得的荧光素酶活性。将器官在裂解缓冲液中匀浆并测定荧光素酶活性。示出每只个体小鼠的数据，并根据分组进行颜色编码。注射rAAV后34天在各种小鼠器官中测得的荧光素酶活性。将器官在裂解缓冲液中匀浆并测定荧光素酶活性。示出每只个体小鼠的数据，并根据分组进行颜色编码。
图49.各个器官中的载体拷贝数(第5周)。图13：对不同人类和非人类细胞类型的新变体的转导效率的分析。用衣壳序列包装AAV荧光素酶载体，并且以1,000的MOI一式三份地转导细胞，除了一式两份地转导的原代人胰岛。转导后两天确定了细胞裂解物中的荧光素酶活性，作为转导效率的读数。对不同人类和非人类细胞类型的新变体的转导效率的分析。用衣壳序列包装AAV荧光素酶载体，并且以1,000的MOI一式三份地转导细胞，除了一式两份地转导的原代人胰岛。转导后两天确定了细胞裂解物中的荧光素酶活性，作为转导效率的读数。
图50. 10亲本文库和18亲本池中的亲本贡献。(A，B)通过PacBio测序分析在质粒水平(A)或在AAV水平(B)下从10亲本文库获得的嵌合衣壳序列，并为每个氨基酸位置分配了亲本贡献。(C)使用条形码的高通量测序分析的18亲本池中的亲本贡献。(D)使用衣壳序列的PacBio测序分析的18亲本池中的亲本贡献。
图51.在完整的和解离的胰岛上进行的三轮传代期间的18亲本混合物、10亲本文库和18亲本文库的复制。使用20,000的MOI用指示的AAV制剂感染完整胰岛，使用2,000的MOI感染解离的胰岛细胞。4天后，使用腺病毒5复制AAV，并从上清液和细胞中采集病毒。通过rep qPCR确定病毒种类的复制。对于每一轮，示出了用于感染的总病毒基因组拷贝和检索到的总病毒基因组拷贝。
图52.三轮传代过程中的不同衣壳的富集。每次传代后，从病毒基因组扩增条形码序列，并通过高通量测序进行分析。用于传代18亲本混合物的富集的亲本衣壳的颜色编码与图1c中描绘的亲本池的颜色编码相同。指出了改善最多的衣壳(KP1，KP2，KP3)的起源。
图53.富集的衣壳序列的拯救和用于胰岛转导的所选衣壳的评估。(A)正向引物退火到rep基因的3'末端的序列，反向引物对要扩增的变体衣壳的右侧条形码的序列具有特异性。(B)用LK03以及12个新型衣壳序列来包装自补的AAV表达型GFP，并使用1,000的低MOI转导胰岛细胞。48小时后使用FACS对细胞进行分类以表达GFP。(C)用CsCl梯度纯化的scCAG-GFP rAAV制剂转导解离的胰岛细胞，所述制剂由两个最佳亲本衣壳以及新型衣壳产生，所述新型衣壳是预筛选中的顶部转导物。使用三种不同的MOI进行转导。转导效率被描述为GFP阳性细胞的百分比(左图)以及GFP阳性细胞群内的中值荧光强度(右图)。(D)新型变体的α和β细胞特异性转导效率。用新型变体衣壳以及AAV-DJ和AAV-LK03衣壳中的两个衣壳包装的GFP表达型rAAV用于以10,000的MOI转导完整胰岛，并通过表面染色和随后的FACS确定了α和β细胞特异性转导。数据示出为使用来自两个不同供体的胰岛的两个单独实验的平均值和标准偏差，并指示统计学上的显著差异。*:p<0.1，**：p<0.01，***：p<0.001
图54.所选经过改组的AAV衣壳变体的氨基酸序列和结构组分。(A)矢量化经过改组的衣壳中的亲本衣壳片段交叉的氨基酸序列图谱分析。用不同的颜色描绘文库亲本，如左侧所示。大点表示100％的亲本匹配(即，所讨论的位置仅匹配一个亲本)，而小点表示每个位置处的多于一个亲本匹配(即，所述位置匹配多个一个亲本)。每个嵌合体的实线表示在交叉之间的序列内鉴定的文库亲本。交叉之间的一组细水平平行线表示多个亲本以相等的概率进行匹配。数值尖峰指示亲本之间的快速单位置切换。VP1、VP2、VP3和AAP ORF如下所示。(B)矢量化经过改组的衣壳中的亲本AAP片段交叉的氨基酸序列图谱分析。(C)通过基于最大可能性比较来自亲本血清型的序列计算每个嵌合体序列中每个氨基酸位置的富集得分。用不同的颜色描绘文库亲本，如所示出的。(D)将经过改组的变体的VP3序列3D伪色映射到AAV2 VLP的晶体结构上。颜色编码使用(A)和(B)中的颜色指示亲本氨基酸贡献。(E)将不同于经过改组的变体AAV3B的残基3D伪色映射到AAV6 VP3的晶体结构上。浅灰色残基对应于AAV3B氨基酸，而彩色残基则指示衍生自其它血清型的表面暴露氨基酸。除了AAV3B，颜色编码如(A)和(B)中所示。
图55.使用萤火虫荧光素酶表达型rAAV的体外转导实验。(A)新型衣壳以及AAV-DJ和AAV-LK03衣壳对多种人类和非人类衍生型细胞类型的转导效率。用含有包装萤火虫荧光素酶表达盒的rAAV的不同衣壳1,000的MOI一式三份地转导细胞(胰岛细胞除外)，并且转导后48小时在荧光素酶活性测定中分析细胞裂解物。使用重组萤火虫荧光素酶的两倍稀释液来制备标准曲线，并基于所述标准曲线将原始发光单位计算为荧光素酶分子。(B)使用两个不同批次的汇集的人免疫球蛋白(IVIG)的稀释液对包装有不同衣壳的rAAV进行中和测定。用表达rAAV的萤火虫荧光素酶以100的MOI在生物复制品中转导Huh-7细胞，所述rAAV已经在37℃下用不同浓度的IVIG预温育1小时。转导后24小时测量了细胞裂解物中的荧光素酶活性。示出了每个样品的平均值和标准偏差。曲线图下方的图例仅指示了统计学上的显著差异。***：p<0.001，****：p<0.0001。
图56.包装有新型衣壳以及AAV8和DJ衣壳的rAAV的体内转导效率。通过尾静脉向Balb/C SCID小鼠注射2E10 vg的表达rAAV的每种萤火虫荧光素酶，并在腹腔注射荧光素底物后使用实时成像监测肝中的荧光素酶表达数周。除包含3只动物的AAV8组外，每组注射四只动物。示出了指示出标准偏差的每个时间点的每组平均腹部辐射的平均值。由于底物注射失败，AAV8组中的一只动物被忽略。曲线图下方的图例仅指示了统计学上的显著差异。**：p<0.01
图57.人源化肝小鼠体内人肝细胞转导的验证和定量。(A)来自具有人源化肝的经处理的小鼠的代表性免疫荧光图像，所述人源化肝在2E11 vg i.v.下用具有不同衣壳血清型的ssAAV-RFP转导。肝切片上的DAPI(蓝色)、人特异性FAH(绿色)和病毒RFP(红色)。比例尺，50μM。(B)所有肝细胞(左图)以及人肝细胞(右图)的转导效率的定量，和人肝细胞再生水平(下图)的定量。每个数据点表示每个小鼠的感兴趣区域(单独的生物学复制品，参见“材料和方法”)。对每只小鼠的总共六到九个感兴趣区域进行了扫描和分析。指示了每组的平均值和标准偏差。曲线图中仅示出了统计学上的显著差异。**：p<0.01，****：p<0.0001
图58.用于文库生成的亲本衣壳。(A)18亲本衣壳在氨基酸水平上的系统发育关系。用于生成10亲本文库的亲本衣壳用红色示出。邻接树是使用Genious 6.0.6构建的。(B)具有指示的亲本贡献的嵌合衣壳DJ和LK03的交叉分析。对于简单的可视化，示出了两种嵌合体的相同亲本衣壳序列，但是其衍生自具有不同亲本组成的不同文库。AAV-DJ衍生自包含以下的文库：AAV2、AAV4、AAV5、AAV8、AAV9hu14、AAV-牛、AAV-禽类和AAV-山羊1衣壳序列，AAV-LK03衍生自包含以下的文库：AAV1、AAV2、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9hu14、AAV-牛、AAV-禽类和AAV-山羊1序列。(C)对具有指示的亲本贡献的AAV-DJ和AAV-LK03的AAP的交叉分析。
图59.通过随机克隆的桑格(Sanger)测序对10亲本文库进行分析。(A)对衍生自质粒文库(左)以及AAV文库(右)的若干经过改组的衣壳的氨基酸序列的交叉分析。为了保持一致，LK03和DJ未作为单独的亲本示出。标有叉号的位置不是新生突变，而是衍生自包含来自AAV4的一小段的AAV-LK03。亲本衣壳按以下顺序示出：AAV1、AAV2、AAV3B、AAV6、AAV8、AAV9hu14、AAV-恒河猴10(AAV-rhesus10)、AAV-猪2(AAV-porcine2)。(B)沿着衣壳序列对质粒和AAV水平(rAAV)上的输入的8个亲本序列以及10亲本文库的保守性分析。
图60.通过随机克隆的桑格测序对18亲本文库进行分析。(A)对衍生自质粒文库的若干经过改组的衣壳的氨基酸序列的交叉分析。亲本衣壳按以下顺序示出：AAV1、AAV2、AAV3B、AAV6、AAV8、AAV9hu14、AAV-恒河猴10、AAV-猪2、AAV4、AAV5、AAV12、AAV-牛、AAV-山羊1、AAV-猪1、AAV-小鼠1和AAV-禽类。(B)沿着衣壳序列对输入的16个亲本序列以及18亲本文库的保守性分析。衣壳DJ和LK03未作为亲本列出，因为其是由来自所用亲本的片段组成的嵌合体。
图61.人胰岛上的第二个文库筛选的结果。(A)在完整胰岛上进行三轮传代期间的10亲本文库和18亲本文库的复制。使用10,000或50,000的MOI用10亲本文库以生物学重复形式感染胰岛。使用50,000的MOI一式三份地执行用18亲本文库进行的感染。4天后，使用腺病毒5复制AAV，并从上清液和细胞中采集病毒。通过rep qPCR确定病毒种类的复制。对于每一轮，示出了用于感染的总病毒基因组拷贝和检索到的总病毒基因组拷贝。(B)三轮传代过程中的不同衣壳的富集。每次传代后，从病毒基因组扩增条形码序列，并通过高通量测序进行分析。
图62.不同嵌合和野生型AAV衣壳的转导效率。(A)将解离的胰岛细胞在1,000的MOI下用rAAV(AAV2、AAV3B、DJ和LK03衣壳)转导，并且在转导后48小时通过流式细胞术确定转导效率。(B)用CsCl梯度纯化的scCAG-GFP rAAV制剂转导解离的胰岛细胞，所述制剂由两个最佳亲本衣壳以及新型衣壳产生，所述新型衣壳是预筛选中的顶部转导物。使用三种不同的MOI进行转导。测量转导效率作为GFP表达型细胞数量与每个细胞的荧光强度的函数。
图63.新型衣壳对于核苷酸水平上的亲本贡献以及对于载体基因组和蛋白质组分的包装的分析。(A)矢量化经过改组的衣壳中的亲本衣壳片段交叉的核苷酸序列图谱分析。在对KP1、KP2和KP3序列的交叉分析下方指示了VP1、VP2、VP3和AAP编码序列。(B)用DJ、LK03以及新型衣壳变体包装的ssCAG-FLuc载体基因组的碱性Southern印迹分析。将1E09 vg装载在每个泳道中。分子大小标准由质粒组成，所述质粒用不同限制酶消化以获得期望大小的片段。载体基因组用FLuc特异性放射性标记探针进行探测。(C)用DJ、LK03以及新型衣壳变体包装的scCAG-GFP载体基因组的碱性Southern印迹分析。分子大小标准由质粒组成，所述质粒用不同限制酶消化以获得期望大小的片段。载体基因组用GFP特异性放射性标记探针进行探测。(D)纯化scCAG-GFP载体制剂的蛋白质印迹分析。将相当于1E09 vg的纯化病毒装载在4-12％Bis-Tris凝胶上，转移到硝酸纤维素膜上，并用B1抗体进行探测，所述抗体识别所有三种衣壳蛋白的C末端的高度保守的表位。
图64.包装有新型衣壳以及AAV8和DJ衣壳的rAAV的体内转导效率。(A)通过尾静脉向Balb/C SCID小鼠注射2E10 vg的表达rAAV的每种萤火虫荧光素酶，并在腹腔注射荧光素底物后使用实时成像监测肝中的荧光素酶表达数周。除包含3只动物的AAV8组外，每组注射四只动物。最大辐射度设置为2E09，阈值为5E07。(B)注射后34天，处死小鼠，并使用普洛麦格(Promega)荧光素酶测定系统离体分析若干器官的荧光素酶表达。(C)从小鼠肝分离基因组DNA，并通过qPCR分析载体拷贝数。仅指示了各组之间在统计学上的显著差异。*：p<0.1，**：p<0.01，***：p<0.001，****：p<0.0001
图65.新型序列的氨基酸比对。(A)使用MegAlign比对新型变体以及8个亲本血清型的衣壳序列。仅示出与共有序列的差异。指示了VP1、VP2和VP3的起始位点。(B)将新型变体以及8个亲本血清型的组装激活蛋白(AAP)序列进行比对。
图66.衣壳KP1对人胚胎干细胞衍生的β细胞的转导效率。使用DJ、LK03和KP1衣壳包装番茄红载体，并用指示的MOI转导hESC衍生的成熟β细胞。在转导后第6天对β细胞标志物C肽进行细胞内染色，并通过流式细胞仪分析细胞。
图67.人肝细胞再生水平、所有肝细胞以及人肝细胞的转导效率的定量。每个数据点表示每只小鼠的感兴趣区域。对每只小鼠的总共六到九个感兴趣区域进行了扫描和分析。指示了每只小鼠的平均值和标准偏差。曲线图中仅示出了各组之间统计学上的显著差异。**：p，0.01，****：p0.0001
图68.新型和亲本AAV衣壳对人胰岛和hESC衍生的β细胞的转导效率。(A)使用DJ、LK03和KP1衣壳用于包装番茄红载体，并用指示的MOI转导hESC衍生的成熟β细胞。在转导后第6天对β细胞标志物C肽进行细胞内染色，并通过流式细胞仪分析细胞。(B)还通过免疫荧光成像分析了相同的细胞。
具体实施方式
简介
在本领域中，仍然需要能够增加用于基因疗法的人胰腺组织或人胰岛中的转导的基因疗法载体，从而可以实现更高的核酸表达治疗水平。本发明满足了这一需求，并且提供了变体AAV衣壳多肽，所述变体AAV衣壳多肽与非变体亲本衣壳多肽相比在人胰腺组织或人胰岛中表现出增加的转导和/或向性。
详细描述
在各个实施例中，本发明提供了变体腺相关病毒(AAV)衣壳多肽，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽在人胰腺组织或人胰岛中表现出增加的转导或向性。在一些实施例中，变体AAV衣壳多肽被称为重组变体AAV衣壳多肽或变体rAAV衣壳多肽。
在其它各个实施例中，本发明提供了包括对变体AAV衣壳多肽进行编码的核酸序列的AAV载体，其中与对非变体亲本衣壳多肽进行编码的载体相比，所述变体AAV衣壳多肽在人胰腺组织或人胰岛中表现出增加的转导或向性。在一些实施例中，AAV载体被称为重组AAV或rAAV载体。
在一些实施例中，本发明提供了变体AAV衣壳多肽，其中相对于基本上相同的非变体亲本AAV衣壳蛋白，变体AAV衣壳多肽包括至少一种氨基酸差异(例如，氨基酸取代、氨基酸插入、氨基酸缺失)，并且其中与对非变体亲本衣壳多肽进行编码的载体相比，变体AAV衣壳蛋白在人胰腺组织或人胰岛中表现出增加的转导或向性。在一些实施例中，变体AAV衣壳多肽不包括存在于天然存在的AAV衣壳多肽中的氨基酸序列。
在一些实施例中，本发明提供了AAV载体，其包括：a)变体AAV衣壳蛋白，其中相对于基本上相同的非变体亲本AAV衣壳蛋白质，变体AAV衣壳多肽包括至少一种氨基酸差异(例如，氨基酸取代、氨基酸插入、氨基酸缺失)，并且其中与对非变体亲本衣壳多肽进行编码的载体相比，变体AAV衣壳蛋白在人胰腺组织或人胰岛中表现出增加的转导或向性。在一些实施例中，AAV衣壳多肽不包括存在于天然存在的AAV衣壳多肽中的氨基酸序列。
在更详细地描述本发明之前，应当理解，由于此些实施例可以改变，因此本发明不限于本文所述的特定实施例。还应了解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，并且所述术语不旨在是限制性的。本发明的范围将仅由所附权利要求限制。除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术术语和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。在提供了值范围的情况下，应当理解的是，介于该范围的上限与下限之间的每个中间值(到下限的单位的十分之一，除非另外明确说明)以及所述范围中的任何其它所陈述或中间值均涵盖于本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包含在更小的范围中，并且也涵盖在本发明内，这受制于所陈述的范围中的任何具体排除的限值。在所陈述的范围包含极限中的一个或两个限值的情况下，排除那些被包含在内的极限中的任一个或两个限值的范围也包含在本发明中。本文提供了在数值前面有术语“约”的某些范围。术语“约”在本文用于为其后面出现的精确数字以及接近或靠近所述术语后面的数字的数提供文字性支持。在判定数字是否接近或近似于特定叙述的数字时，接近或近似的未叙述的数字可以是在呈现的上下文中提供特定叙述的数字的实质性等效物的数字。本说明书中所引用的所有公开、专利以及专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的公开、专利或专利申请被专门地且单独地指示通过引用并入。此外，每个引用的出版物、专利或专利申请通过引用并入本文，以公开和描述与所引用出版物有关的主题。对任何出版物的引用是针对其在提交日之前的公开内容，并且不能理解为承认本文所述的发明由于先前发明而无权先于此些出版物。此外，所提供出版物的日期可能与实际出版物日期不同，所述实际出版物日期可能需要单独证实。
注意，权利要求可以被撰写为排除任何可选要素。因此，这样的陈述旨在用作使用与权利要求要素的叙述有关的排他性术语如“单独”、“仅”等或使用“否定型”限定的前提基础。如对于本领域技术人员而言将显而易见的是，在阅读本公开时，本文所描述和展示的单独实施例中的每一个都具有离散的组成部分和特征，所述组成部分和特征在不偏离本发明的范围或精神的情况下易于与其它若干实施例中的任一个的特征分离或组合。任何叙述的方法都可以按所叙述事件的顺序或以逻辑上可能的任何其它顺序进行。尽管类似于或等同于本文中所述的方法和材料的任何方法和材料也可以用于本发明的实践或测试，但是现在将对代表性说明方法和材料进行描述。
如本发明中所描述的，将采用以下术语，并如以下所指示的进行定义。
缩写
“AAV”是腺相关病毒的缩写，并且可以用于指病毒本身或其衍生物。除非另有要求，否则所述术语涵盖所有亚型以及天然存在的形式和重组形式两者。缩写“rAAV”是指重组腺相关病毒，也称为重组AAV载体(或“rAAV载体”)。
定义
术语“AAV”包含1型AAV(AAV1)、2型AAV(AAV2)、3型AAV(AAV3)、4型AAV(AAV4)、5型AAV(AAV5)、6型AAV(AAV6)、7型AAV(AAV7)、8型AAV(AAV8)、9型AAV(AAV9)、AAV 9_hu14、禽类AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、灵长类动物AAV、非灵长类动物AAV和绵羊AAV。“灵长类动物AAV”是指能够感染灵长类动物的AAV，“非灵长类动物AAV”是指能够感染非灵长类哺乳动物的AAV，“牛AAV”是指能够感染牛哺乳动物的AAV，等等。
如本文所使用的，“AAV载体”是指对各种核酸序列进行编码的AAV载体核酸序列，在一些实施例中，所述AAV载体核酸序列包含变体衣壳多肽(即，AAV载体包括对变体衣壳多肽进行编码的核酸序列，也称为变体AAV衣壳多肽)，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，变体AAV衣壳多肽在人胰腺组织或人胰岛中表现出增加的转导或向性。AAV载体还可以包括非AAV来源的异源核酸序列作为核酸插入物的一部分。此异源核酸序列通常包括用于细胞遗传转化的感兴趣的序列。通常，异源核酸序列的两侧是至少一个、通常两个AAV反向末端重复序列(ITR)。
短语“非变体亲本衣壳多肽”包含任何天然存在的AAV衣壳多肽和/或任何AAV野生型衣壳多肽。在一些实施例中，非变体亲本衣壳多肽包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、牛AAV和/或禽类AAV衣壳多肽。
在变体AAV衣壳多肽和非变体亲本衣壳多肽的上下文中，术语“基本上相同”是指具有1种或更多种氨基酸变化的序列。在一些实施例中，这些变化不影响衣壳多肽的包装功能。在一些实施例中，基本上相同包含与非变体亲本衣壳多肽约99％、约98％、约97％、约96％、约95％、约94％、约93％、约92％、约91％或约90％相同的变体AAV衣壳多肽。在一些实施例中，变体AAV衣壳多肽可以在变体AAV衣壳多肽的子区域上与非变体亲本衣壳多肽基本相同，如超过约25％、约50％、约75％或约90％的总多肽序列长度。
“AAV病毒体”或“AAV病毒”或“AAV病毒颗粒”或“AAV载体颗粒”是指由至少一种AAV衣壳多肽(包含变体AAV衣壳多肽和非变体亲本衣壳多肽两者)和衣壳化多核苷酸AAV转移载体组成的病毒颗粒。如果颗粒包括异源核酸(即，野生型AAV基因组以外的多核苷酸，如要递送到哺乳动物细胞的转基因)，则其可被称为“AAV载体颗粒”或简称为“AAV载体”。因此，AAV病毒体或AAV颗粒的产生必然包含AAV载体的产生，因为载体包含在AAV病毒体或AAV颗粒内。
“包装”是指一系列细胞内事件，其导致包裹核酸序列和/或其它治疗性分子的AAV病毒体或AAV颗粒的组装。包装可以指将核酸序列和/或其它治疗性分子衣壳化到包括本文所述的变体AAV衣壳多肽的衣壳中。通常，AAV的有限包装容量为约5kb。
如本文所使用的，短语“治疗性分子”可以包含核酸(包含例如载体)、多肽(包含例如抗体)和疫苗，以及可以由本发明的变体AAV衣壳多肽包装的任何其它治疗性分子。
AAV“rep”和“cap”基因是指对腺相关病毒(AAV)的复制和衣壳化蛋白进行编码的多核苷酸序列。AAV rep(复制)和cap(衣壳)在本文中被称为AAV“包装基因”。
AAV的“辅助病毒”是指允许AAV(例如野生型AAV)被哺乳动物细胞复制和包装的病毒。用于AAV的各种这样的辅助病毒是本领域已知的，包含腺病毒、疱疹病毒和如牛痘病毒等痘病毒。腺病毒涵盖许多不同的亚群，但是作为辅助病毒最常用的是C亚群中的5型腺病毒。许多人类、非人类哺乳动物和禽类的腺病毒是已知的并且可从如ATCC等存放处获得。疱疹病毒家族的病毒包含例如单纯疱疹病毒(HSV)和爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)，以及巨细胞病毒(CMV)和伪狂犬病病毒(PRV)；这些病毒也可以从如ATCC等存放处获得。
“一种或多种辅助病毒功能”是指在辅助病毒基因组中编码的允许AAV复制和包装的一种或多种功能(结合本文所述的关于复制和包装的其它要求)。如本文所描述的，“辅助病毒功能”可以以多种方式提供，包含通过提供辅助病毒或向反式生产细胞提供例如编码一种或多种必需功能的多核苷酸序列。
“感染性”病毒体、病毒或病毒颗粒是包括可递送到病毒物种的嗜细胞中的多核苷酸组分的病毒颗粒。所述术语不一定暗示病毒有任何复制能力。如本文所使用的，“感染性”病毒或病毒颗粒是在一种接近靶细胞后可以感染靶细胞并且可以在靶细胞中表达异源核酸的病毒或病毒颗粒。因此，“感染性”是指病毒颗粒接近靶细胞、进入靶细胞并在靶细胞中表达异源核酸的能力。感染性可以指体外感染性或体内感染性。在本公开和本领域的其它地方描述了用于对感染性病毒颗粒进行计数的测定。病毒感染性可以表达为感染性病毒颗粒与总病毒颗粒之比。总病毒颗粒可以表达为病毒基因组拷贝数。病毒颗粒在细胞中表达异源核酸的能力可以被称为“转导”。可以使用多种技术来测定病毒颗粒在细胞中表达异源核酸的能力，包含标志基因的评估，如绿色荧光蛋白(GFP)测定(例如，其中病毒包括对GFP进行编码的核苷酸序列)，其中GFP在感染了病毒颗粒的细胞中产生并进行检测和/或测量；或对所产生蛋白质的测量，例如通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或荧光激活细胞分选(FACS)进行测量。
“有复制能力的”病毒体或病毒(例如有复制能力的AAV)是指感染性表型野生型病毒，并且可以在被感染的细胞中(即在辅助病毒或辅助病毒功能存在的情况下)复制。在AAV的情况下，复制能力通常要求存在功能性AAV包装基因。在一些实施例中，如本文所描述的，AAV载体缺乏一种或多种AAV包装基因，并且在哺乳动物细胞中(特别是在人类细胞中)是无复制能力。在一些实施例中，AAV载体缺乏任何AAV包装基因序列，从而最小化通过AAV包装基因与进入的AAV载体之间的重组产生有复制能力的AAV的可能性。在许多实施例中，如本文所述的AAV载体制剂是含有很少(如果有的话)有复制能力的AAV(rcAAV，也称为RCA)的那些载体制剂(例如，每102个AAV颗粒少于约1个rcAAV、每104个AAV颗粒少于约1个rcAAV、每108个AAV颗粒少于约1个rcAAV、每1012个AAV颗粒少于约1个rcAAV，或无rcAAV)。
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文中可互换使用，用于指所有形式的核酸、寡核苷酸，包含脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。多核苷酸包含基因组DNA、cDNA和反义DNA，以及剪接或未剪接的mRNA、rRNA、tRNA、lncRNA、RNA拮抗剂和抑制性DNA或RNA(RNAi，例如，小发夹或短发夹(sh)RNA、microRNA(miRNA)、适配子、小干扰或短干扰(si)RNA、反式剪接RNA或反义RNA)。多核苷酸还包含非编码RNA，所述非编码RNA包含但不限于例如RNAi、miRNA、lncRNA、RNA拮抗剂、适配子和本领域技术人员已知的任何其它非编码RNA。多核苷酸包含天然存在的、合成的和故意改变或修饰的多核苷酸以及类似物和衍生物。术语“多核苷酸”还指任何长度的聚合形式的核苷酸，包含脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物，并且与核酸序列同义。多核苷酸可以包括经过修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物，并且可以被非核苷酸组分打断。如果存在，则对核苷酸结构的修饰可以在组装聚合物之前或之后进行。如本文所使用的，术语多核苷酸可互换地指双链分子和单链分子。除非另有说明或要求，否则如本文所述的涵盖多核苷酸的任何实施例涵盖双链形式和已知或预测构成双链形式的两种互补单链形式中的每一种。多核苷酸可以是单链、双链或三链、线性或环状的，并且可以具有任何长度。在讨论多核苷酸时，在本文中可以根据在5'至3'方向上提供序列的惯例描述特定多核苷酸的序列或结构。
“基因”是指含有至少一个开放阅读框的多核苷酸，所述开放阅读框能够在转录和转译后对特定的蛋白质或多肽进行编码。
“小干扰”或“短干扰RNA”或siRNA是靶向感兴趣基因(“靶基因”)的核苷酸的RNA双链体。“RNA双链体”是指通过RNA分子的两个区域之间的互补配对形成的结构。siRNA“靶向”基因，并且siRNA的双链体部分的核苷酸序列与靶基因的核苷酸序列互补。在一些实施例中，siRNA的双链体的长度小于30个核苷酸。在一些实施例中，双链体的长度可以是29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个核苷酸。在一些实施例中，双链体的长度为19到25个核苷酸。siRNA的RNA双链体部分可以是发夹结构的一部分。除了双链体部分之外，发夹结构可以包含位于形成双链体的两个序列之间的环部分。所述环的长度可以变化。在一些实施例中，环的长度为5、6、7、8、9、10、11、12或13个核苷酸。发夹结构还可以包含3'或5'突出部分。在一些实施例中，突出是长度为0、1、2、3、4或5个核苷酸的3'或5'突出。
如本文所使用的，术语“microRNA”是指任何类型的干扰RNA，包含但不限于内源性microRNA和人工microRNA(例如，合成miRNA)。内源性microRNA是基因组中天然编码的小RNA，能够调节mRNA的生产利用。人工microRNA可以是除内源性microRNA之外的任何类型的RNA序列，其能够调节mRNA的活性。microRNA序列可以是由这些序列中的任何一个或多个组成的RNA分子。MicroRNA(或“miRNA”)序列已在出版物中进行了描述，如Lim等人.,2003,《基因与发展(Genes&Development)》,17,991-1008；Lim等人,2003,《科学(Science)》,299,1540；Lee和Ambrose,2001,《科学(Science)》,294,862；Lau等人,2001,《科学(Science)》294,858-861；Lagos-Quintana等人,2002,《当代生物学(Current Biology)》,12,735-739；Lagos-Quintana等人2001,《科学(Science)》,294,853-857以及Lagos-Quintana等人,2003,《RNA》,9,175-179。microRNA的实例包含较大RNA的任何RNA片段，或者是miRNA、siRNA、stRNA、sncRNA、tncRNA、snoRNA、smRNA、shRNA、snRNA或其它小的非编码RNA。参见，例如，美国专利申请20050272923、20050266552、20050142581和20050075492。“microRNA前体”(或“pre-miRNA”)是指其中掺入了microRNA序列的具有茎环结构的核酸。“成熟的microRNA”(或“成熟的miRNA”)包含从microRNA前体(“pre-miRNA”)切割或合成(例如，通过无细胞合成在实验室中合成)的microRNA，并具有约19个核苷酸到约27个核苷酸的长度，例如，成熟的microRNA的长度可以为19nt、20nt、21nt、22nt、23nt、24nt、25nt、26nt或27nt。成熟的microRNA可以与靶mRNA结合并抑制靶mRNA的转译。
应用于多核苷酸的“重组”意指多核苷酸是克隆、限制或连接步骤以及导致构建体与自然界中发现的多核苷酸有区别和/或不同的其它程序的各种组合的产物。重组病毒是包裹重组多核苷酸的病毒颗粒。所述术语分别包含原始多核苷酸构建体的复制和原始病毒构建体的后代。
“控制元件”或“控制序列”是参与分子的相互作用的核苷酸序列，所述相互作用有助于对多核苷酸进行功能调节，包含多核苷酸的复制、重复、转录、剪接、翻译或降解。调节会影响过程的频率、速度或特异性并且在本质上会具有增强或抑制性。本领域已知的控制元件包含例如转录调节序列，如启动子和增强子和降解子。启动子是在某些条件下能够结合RNA聚合酶并且启动对通常位于启动子下游(沿3'方向)的编码区进行转录的DNA区域。
“操作性地连接”或“可操作地连接”是指遗传元件的并列，其中元件处于允许其按预期方式操作的关系中。例如，如果启动子帮助启动对编码序列进行转录，则启动子与编码区域操作性地连接。只要维持这一功能关系，启动子与编码区域之间就会存在插入残基。
“异源”意指衍生自与其所比较的实体的其余部分的基因型不同的实体。例如，通过基因工程技术引入到衍生自不同物种的质粒或载体中的多核苷酸是异源多核苷酸。从启动子的天然编码序列中移除并且与未发现与启动子有天然连接的编码序列操作性地连接的启动子是异源启动子。例如，包含对异源基因产物进行编码的异源核酸的AAV是包含天然存在的野生型AAV中通常不包含的核酸的AAV，并且编码后的异源基因产物是通常不由天然存在的野生型AAV编码的基因产物。包含对变体AAV衣壳多肽进行编码的核酸的AAV包含异源核酸序列。一旦转移/递送到宿主细胞中，包含在病毒体中的异源多核苷酸可以被表达(例如，如果合适的话，被转录和转译)。可替代地，病毒体内包含的转移/递送到宿主细胞中的异源多核苷酸无需表达。尽管术语“异源”在本文中并不总是指多核苷酸，但即使在没有修饰词“异源”的情况下，所指的多核苷酸也旨在包含异源多核苷酸，尽管有所省略。
术语“遗传改变”和“遗传修饰”(及其语法变体)在本文中可互换使用以指代其中遗传元件(例如，多核苷酸)被引入除有丝分裂或减数分裂之外的细胞中的过程。所述元件对于细胞可以是异源的，或者其可以是已经存在于细胞中的元件的另外的拷贝或改进版本。遗传改变可以例如通过用重组质粒或其它多核苷酸通过本领域已知的任何方法转染细胞来实现，如电穿孔、磷酸钙沉淀、或多核苷酸-脂质体复合。遗传改变还可以例如通过用DNA或RNA病毒或病毒载体转导或感染来实现。通常，遗传元件被引入细胞中的染色体或微型染色体中；但是任何改变细胞及其后代的表型和/或基因型的改变都包括在此术语中。
如果序列在体外细胞的延长培养期间可用于执行其功能，则细胞被称为“稳定地”改变、转导、遗传修饰或用基因序列转化。通常，此类细胞被“可遗传地”改变(遗传修饰)，因为遗传改变被引入并且可由改变的细胞的后代继承。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，用于指任何长度的氨基酸的聚合物。由“多核苷酸序列”编码的“多肽”、“蛋白质”和“肽”包含全长天然序列(与天然存在的蛋白质一样)以及功能性子序列、经修饰的形式或序列变体，只要子序列、经修饰的形式或变体保留了天然全长蛋白质的一定程度的功能。在本文所述的方法和用途中，由多核苷酸序列编码的此些多肽、蛋白质和肽可以但不要求与有缺陷的、或其表达不充分的、或在所治疗的哺乳动物中不足的内源性蛋白质相同。这些术语还涵盖经修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、磷酸化、甲基化、羧基化、脱酰胺化、乙酰化或与标记成分结合。当在向哺乳动物受试者递送基因产物的背景下讨论时，多肽如抗血管生成多肽、神经保护多肽等及其组合物是指保留了完整蛋白质所需的生化功能的相应的完整多肽、或其任何片段或基因工程衍生物。
如本文所使用的，在本公开方法中使用的遗传编码的L-对映体氨基酸的缩写是常规的，并且如下表1所示。
表1：氨基酸缩写
氨基酸 单字母符号 常用缩写
丙氨酸 A Ala
精氨酸 R Arg
天冬酰胺 N Asn
天冬氨酸 D Asp
半胱氨酸 C Cys
谷氨酰胺 Q Gln
谷氨酸 E Glu
甘氨酸 G Gly
组氨酸 H His
异亮氨酸 I Ile
亮氨酸 L Leu
赖氨酸 K Lys
蛋氨酸 M Met
苯丙氨酸 F Phe
脯氨酸 P Pro
丝氨酸 S Ser
苏氨酸 T Thr
色氨酸 W Trp
酪氨酸 Y Tyr
缬氨酸 V Val
“亲水性氨基酸”是指根据标准化一致疏水性标度(Eisenberg等人,1984,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》179:125-142)的表现出小于零的疏水性的氨基酸。遗传编码的亲水性氨基酸包含Thr(T)、Ser(S)、His(H)、Glu(E)、Asn(N)、Gln(Q)、Asp(D)、Lys(K)和Arg(R)。
“酸性氨基酸”是指侧链pK值小于7的亲水性氨基酸。由于氢离子的损失，酸性氨基酸通常在生理pH下具有带负电的侧链。基因编码的酸性氨基酸包含Glu(E)和Asp(D)。
“碱性氨基酸”是指侧链pK值大于7的亲水性氨基酸。由于与氢离子缔合，碱性氨基酸通常在生理pH下具有带正电的侧链。遗传编码的碱性氨基酸包含His(H)、Arg(R)和Lys(K)。
“极性氨基酸”是指具有在生理pH下不带电荷的侧链的亲水性氨基酸，但是其具有至少一个键，在所述键中两个原子共有的一对电子被原子之一更紧密地保持。遗传编码的极性氨基酸包含Asn(N)、Gln(Q)、Ser(S)和Thr(T)。
“疏水性氨基酸”是指根据标准化一致疏水性标度(Eisenberg,1984,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol》179:125-142)的表现出大于零的疏水性的氨基酸。示例性疏水氨基酸包含Ile(I)、Phe(F)、Val(V)、Leu(L)、Trp(W)、Met(M)、Ala(A)、Gly(G)、Tyr(Y)、Pro(P)和脯氨酸类似物。
“芳香族氨基酸”是指侧链具有至少一个芳族环或芳杂环的疏水性氨基酸。芳族环或芳杂环可以包含一个或多个取代基，例如-OH、-SH、-CN、-F、-Cl、-Br、-I、-NO2、-NO、-NH2、-NHR、-NRR、-C(O)R、-C(O)OH、-C(O)OR、-C(O)NH2、-C(O)NHR、-C(O)NRR等，其中每个R独立地为(Cl-C6)烷基、经取代的(Cl-C6)烷基、(Cl-C6)烯基、经取代的(Cl-C6)烯基、(Cl-C6)炔基、经取代的(Cl-C6)炔基、(Cl-C21)芳基、经取代的(C5-C20)芳基、(C6-C26)烷芳基、经取代的(C6-C26)烷芳基、5-20元杂芳基、经取代的5-20元杂芳基、6-26元烷基杂芳基或经取代的6-26元烷基杂芳基。遗传编码的芳香族氨基酸包含Phe(F)、Tyr(Y)和Trp(W)。
“非极性氨基酸”是指具有在生理pH下不带电荷的侧链且具有键的疏水性氨基酸，在所述键中两个原子共同共享的一对电子通常被两个原子中的每一个均等地保持(即，侧链不是极性的)。遗传编码的非极性氨基酸包含Leu(L)、Val(V)、Ile(I)、Met(M)、Gly(G)和Ala(A)。
“脂肪族氨基酸”是指具有脂肪族烃侧链的疏水性氨基酸。遗传编码的脂肪族氨基酸包含Ala(A)、Val(V)、Leu(L)和Ile(I)。
关于氨基酸的术语“非天然的”可以包含不包括在上表1中列出的20种氨基酸之一中的任何氨基酸分子，以及本领域技术人员已知的任何经修饰的或衍生的氨基酸。非天然氨基酸可以包含但不限于：β-丙氨酸、α-氨基丁酸、γ-氨基丁酸、γ-(氨基苯基)丁酸、α-氨基异丁酸、ε-氨基己酸、7-氨基庚酸、β-天冬氨酸、氨基苯甲酸、氨基苯基乙酸、氨基苯基丁酸、γ-谷氨酸、半胱氨酸(ACM)、ε-赖氨酸、蛋氨酸砜、正亮氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸、d-鸟氨酸、对硝基-苯丙氨酸、羟基脯氨酸、1,2,3,4,-四氢异喹啉-3-羧酸和硫代脯氨酸。
关于多肽(如衣壳多肽)的术语“变体(variant或variants)”是指与亲本多肽序列相差至少一个氨基酸的多肽序列，也称为非变体多肽序列。在一些实施例中，多肽是衣壳多肽，并且变体通过至少一个氨基酸取代而不同。氨基酸还包含天然存在和非天然存在的氨基酸及其衍生物。氨基酸还包含D和L形式。
“分离的”质粒、核酸、载体、病毒、病毒体、宿主细胞或其它物质是指缺乏其它组分中的至少一些组分的物质的制剂，所述其它组分存在于物质或类似物质天然存在的地方或其最初制备的地方。因此，例如，可以通过使用纯化技术从源混合物中富集分离的物质来制备所述分离的物质。富集可以在绝对基础上测量，如每体积溶液的重量，或者可以相对于源混合物中存在的第二种潜在干扰物质进行测量。本发明的实施例的增加的富集越来越孤立。在一些实施例中，分离的质粒、核酸、载体、病毒、宿主细胞或其它物质是纯化的，例如纯度为约80％到约90％、纯度至少为约90％、纯度至少为约95％、纯度至少为约98％、或纯度至少为约99％或更多。
术语“高度保守的”意指至少约80％的一致性，优选地至少90％的一致性，并且更优选超过约97％的一致性。通过使用本领域技术人员已知的算法和计算机程序，本领域技术人员可以容易地确定一致性。
在核酸序列的上下文中，术语“百分比序列一致性”或“相同”是指两个序列中的残基在比对以获得最大对应性时是相同的。序列一致性比较的长度可以超过基因组的全长、对序列进行编码的基因的全长或至少约500到5000个核苷酸的片段。然而，也可能期望较小片段之间的一致性，例如至少约九个核苷酸，通常至少约20到约24个核苷酸、至少约28到约32个核苷酸、至少约36或更多个核苷酸。类似地，对于氨基酸序列，在蛋白质的全长或其片段上，可以容易地确定“百分比序列一致性”。合适地，片段长度为至少约8个氨基酸，并且可以高达约700个氨基酸。
如本文所使用的，术语“治疗(treatment、treating)”等是指获得期望药理学和/或生理学效果。就完全或部分预防疾病或其症状而言，所述效果可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于疾病的副作用而言可以是治疗性的。如本文所使用的，“治疗”涵盖哺乳动物，特别是人类的疾病的任何治疗，并且包含：(a)防止疾病在易患疾病或具有患病风险但尚未被诊断为患有疾病的受试者中发生；(b)抑制疾病，即，阻止其发展；以及(c)缓解疾病，即，使疾病消退。
术语“个体”、“受试者”和“患者”在本文中可互换地使用，并且是指哺乳动物，包含但不限于人类和非人类灵长类动物，包含猿猴和人类；哺乳类运动动物(例如，马)；哺乳类农场动物(例如，绵羊、山羊等)；哺乳类宠物(狗、猫等)；以及啮齿动物(例如，小鼠、大鼠等)。
术语“药学上可接受的”和“生理上可接受的”意指适于一种或多种体内递送或接触施用途径的生物学上可接受的调配物、气体、液体或固体或其混合物。“药学上可接受的”或“生理上可接受的”组合物是在生物学上或其它方面并非不合期望的材料，例如，可以将该材料施用于受试者而不会引起实质的不合期望的生物学作用。因此，此类药物组合物可以用于例如向受试者施用如本文所公开的AAV载体或AAV病毒体或转化细胞。
如本文所使用的，短语“单位剂型”是指适合作为待治疗对象的单一剂量的物理上离散的单位；每个单位包含预定的量，任选地与药物载剂(赋形剂、稀释剂、媒剂或填充剂)结合，所述药物载剂当以一种或多种剂量施用时会产生期望的效果(例如，预防或治疗效果)。在一些实施例中，单位剂型可以在例如安瓿和小瓶内，包含液体组合物或处于冷冻干燥或冻干状态的组合物；例如，可以在体内施用或递送之前添加无菌液体载剂。单独的单位剂型可以包含在多剂量试剂盒或容器中。AAV载体或AAV病毒体及其药物组合物可以按单一或多个单位剂型进行包装，以便于施用和剂量均匀。
“治疗有效量”将落入可通过实验和/或临床试验确定的相对较宽的范围内。例如，对于体内注射，例如直接注射到受试者的组织(例如，胰腺组织)中，治疗有效剂量将为大约每千克受试者体重约106到约1015的AAV病毒体。在一些实施例中，治疗有效剂量将为大约每千克受试者体重约108到1012AAV病毒体。通过建立剂量应答曲线的常规试验，本领域普通技术人员可以容易地确立其它有效剂量。
“有效量”或“足够量”是指以单剂量或多剂量单独地或与一种或多种其它组合物(如药物等治疗剂)、治疗、协议或治疗性方案药剂(包含例如疫苗方案)一起提供任何持续时间(长期或短期)的可检测应答、任何可测量或可检测程度或任何持续时间(例如，数分钟、数小时、数天、数月、数年或治愈)的对受试者的预期或期望结果或益处的量。
用于治疗(例如，改善或提供治疗益处或改进)的“有效量”或“足够量”的剂量通常在可测量的程度上有效地对疾病的一种、多种或所有不利症状、后果或并发症、例如由疾病引起或与之相关的一种或多种不利症状、病症、疾病、病理或并发症提供反应，但是降低、减少、抑制、压抑、限制或控制疾病的进展或恶化也是令人满意的结果。
“预防”及其语法变化意指在疾病发生之前接触、施用或体内递送到受试者的方法。可以在由疾病引起或与之相关的不良症状，病状，并发症等发生之前执行向受试者的施用或体内递送。例如，可以使用筛选(例如，遗传的)来鉴定这些受试者作为所述方法和用途的候选者，但是受试者可能没有表现出疾病。因此，这些受试者包含那些因功能性基因产物(蛋白质)数量不足或缺乏，或产生导致疾病的畸变、部分功能性或非功能性基因产物(蛋白质)而被筛选为阳性的受试者；以及因导致疾病的畸变或缺陷(突变)基因产物(蛋白质)而被筛选为阳性的受试者，即使这些受试者没有表现出疾病症状。
短语“增强的中和性质”是指AAV载体或病毒体更好地逃避受试者中和抗体结合的能力。在一些情况下，较少的中和抗体允许AAV感染产生更高水平的转导，从而使得本发明的变体AAV衣壳多肽、AAV载体和病毒体更适于基因疗法目的。
短语“向性”和“转导”是相互关联的，但存在差异。如本文所使用的，术语“向性”是指AAV载体或病毒体感染一种或多种特定细胞类型的能力，但也可以涵盖载体如何在一种或多种特定细胞类型中转导细胞；即，向性是指AAV载体或病毒体优先进入某些细胞或一种或多种组织类型和/或优先与有助于进入某些细胞或组织类型的细胞表面相互作用，任选地和优选地随后表达(例如，转录和任选地转译)由AAV载体或病毒体在细胞中承载的序列，例如，对于重组病毒，表达异源核苷酸序列。如本文所使用的，术语“转导”是指AAV载体或病毒体感染一种或多种特定细胞类型的能力；即，转导是指AAV载体或病毒体进入到细胞中，并且将包含在AAV载体或病毒体中的遗传物质转移到细胞中以从载体基因组获得表达。在某些情况下，但并非在所有情况下，转导和向性可能相互关联。
术语“向性概况”是指一种或多种靶细胞、组织和/或器官的转导模式。例如，一些经过改组的AAV衣壳(变体AAV衣壳多肽)提供了人胰腺组织或人胰岛的有效转导。相反，一些经过改组的AAV衣壳仅具有低水平的肝、生殖腺和/或生殖细胞转导。本文公开的变体AAV衣壳多肽提供了人胰腺组织或人胰岛的有效和/或增强的转导。
除非另有说明，否则“有效转导”或“有效向性”或类似术语可以通过参照合适的对照(例如，分别为至少约50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、100％、110％、125％、150％、175％或200％或更多的对照的转导或向性)来确定。合适的对照将取决于多种因素，包含期望的向性概况。类似地，可以通过参考合适的对照来判定衣壳和/或病毒是否“不能有效地转导”或对于靶组织“不具有有效的向性”或类似术语。
如在本文中和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包含复数指代物，除非上下文另有明确指明。因此，例如，提及“AAV病毒体”时包含多个此类病毒体，并且提及“宿主细胞”时包含本领域技术人员已知的一种或多种宿主细胞及其等同物，等等。另外应注意，权利要求可以被撰写为排除任何任选要素。因此，本声明旨在充当对于此类与权利要求要素的叙述相结合的排除性术语(如“单独地”、“仅”等)的使用或“否定型”限制的使用的先行基础。
在进一步描述本发明之前，应理解的是，本发明不限于所描述的具体实施例，因为这些实施例当然可以变化。还应理解，在此所使用的术语仅用于描述具体实施例的目的，并且不旨在为限制性的，因为本发明的范围仅受所附权利要求限制。
AAV衣壳和载体特征
本发明的AAV载体具有许多特征。在一些实施例中，载体包括对变体AAV衣壳多肽进行编码的核酸序列。此类AAV载体及其特征在下文详细描述。
本发明的示例性AAV载体包括对变体AAV衣壳蛋白进行编码的核酸，所述变体AAV衣壳蛋白在氨基酸序列上与野生型或非变体亲本衣壳蛋白至少有一个氨基酸不同。一个或多个氨基酸差异可以位于衣壳中的溶剂可及位点，例如，溶剂可及环，或位于内腔中(即，AAV衣壳的内部空间)。在一些实施例中，内腔包含AAV衣壳的内部空间。例如，一个或多个氨基酸取代可以位于AAV衣壳多肽的GH环中。在一些实施例中，变体AAV衣壳多肽在AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9衣壳多肽中包含氨基酸取代。
在一些实施例中，本发明提供了分离的核酸，所述分离的核酸包括对变体腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白进行编码的核苷酸序列，其中所述变体AAV衣壳蛋白包括相对于非变体衣壳氨基酸序列或非变体亲本衣壳多肽序列的子部分具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％的氨基酸序列，并且与对非变体亲本衣壳多肽进行编码的载体相比，在人胰腺组织或人胰岛中表现出增加的转导或向性。在一些实施例中，本发明提供了一种分离的核酸，所述分离的核酸包括对变体腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白进行编码的核苷酸序列，其中所述变体AAV衣壳蛋白包括相对于亲本非变体衣壳氨基酸序列或非变体亲本衣壳多肽序列的子部分，如野生型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8或AAV9衣壳多肽具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％的氨基酸序列，并且其中与对非变体亲本衣壳多肽进行编码的载体相比，所述变体AAV衣壳多肽在人胰腺组织或人胰岛中表现出增加的转导或向性。在一些实施例中，变体AAV衣壳多肽包括来自AAV血清型1、3、6、8和9(即，AAV1、AAV6、AAV8和AAV9)的非变体亲本衣壳多肽序列的一个或多个区域或子部分。在一些实施例中，变体AAV衣壳多肽包括选自SEQID NO:27-44中任一个的非变体亲本衣壳多肽序列的一个或多个区域或子部分。
在一些实施例中，主题AAV载体可以对变体衣壳多肽进行编码，所述变体衣壳多肽的氨基酸序列与非变体亲本衣壳多肽或非变体亲本衣壳多肽的子部分具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、或至少约99％或100％的氨基酸序列一致性。在一些实施例中，变体AAV衣壳多肽由本领域已知的其它载体/质粒进行编码。在一些实施例中，非变体亲本衣壳多肽序列是SEQ ID NO:27-44中的任一个。在一些实施例中，非变体亲本衣壳多肽序列由SEQ ID NO:45-62中的任一个进行编码。
在一些实施例中，当提及氨基酸或其片段时，变体AAV衣壳多肽表现出基本同源性或“基本类似性”，这表明当与另一个氨基酸(或其互补链)的适当氨基酸插入或缺失进行最佳比对时，比对序列具有至少约95％到约99％的氨基酸序列一致性。在一些实施例中，同源性是长度为至少8个氨基酸，或更理想地，至少约15个氨基酸的全长序列或其多肽(例如，衣壳蛋白)或其片段，包含非变体亲本衣壳多肽序列的子部分。例如，变体AAV衣壳多肽可以包括与非变体亲本衣壳多肽序列或非变体亲本衣壳多肽的子部分具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％的氨基酸序列一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，变体AAV衣壳多肽序列包括SEQ ID NO:1-7中的任一个。在一些实施例中，变体AAV衣壳多肽序列由SEQ ID NO:8-14中的任一个进行编码。在一些实施例中，非变体亲本衣壳多肽序列是SEQ ID NO:27-44中的任一个。在一些实施例中，非变体亲本衣壳多肽序列由SEQ ID NO:45-62中的任一个进行编码。
表2：变体AAV衣壳氨基酸序列
Figure BDA0002714660000000361
Figure BDA0002714660000000371
Figure BDA0002714660000000381
Figure BDA0002714660000000391
Figure BDA0002714660000000401
Figure BDA0002714660000000411
Figure BDA0002714660000000421
表3：变体AAV衣壳核酸序列
Figure BDA0002714660000000422
Figure BDA0002714660000000431
Figure BDA0002714660000000441
Figure BDA0002714660000000451
Figure BDA0002714660000000461
Figure BDA0002714660000000471
Figure BDA0002714660000000481
Figure BDA0002714660000000491
Figure BDA0002714660000000501
Figure BDA0002714660000000511
Figure BDA0002714660000000521
表4：亲本AAV衣壳氨基酸序列
Figure BDA0002714660000000522
Figure BDA0002714660000000531
Figure BDA0002714660000000541
Figure BDA0002714660000000551
Figure BDA0002714660000000561
Figure BDA0002714660000000571
表5：亲本AAV衣壳核酸序列
Figure BDA0002714660000000572
Figure BDA0002714660000000581
Figure BDA0002714660000000591
Figure BDA0002714660000000601
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Figure BDA0002714660000000661
Figure BDA0002714660000000671
Figure BDA0002714660000000681
Figure BDA0002714660000000691
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Figure BDA0002714660000000711
在一些实施例中，与非变体亲本衣壳多肽相比，本发明的变体AAV衣壳多肽在人胰腺组织或人胰岛中表现出增加的转导。在一些实施例中，转导增加了约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或约100％。在一些实施例中，转导增加了约5％到约80％、约10％到约70％、约20％到约60％、约30％到约60％或约40％到约50％。在一些实施例中，非变体亲本衣壳多肽序列是SEQ ID NO:27-44中的任一个。在一些实施例中，非变体亲本衣壳多肽序列由SEQ ID NO:45-62中的任一个进行编码。
在一些实施例中，与非变体亲本衣壳多肽相比，本发明的变体AAV衣壳多肽在人类胰腺组织或人胰岛中表现出增加的向性。在一些实施例中，向性增加了约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或约100％。在一些实施例中，向性增加了约5％到约80％、约10％到约70％、约20％到约60％、约30％到约60％或约40％到约50％。在一些实施例中，非变体亲本衣壳多肽序列是SEQ ID NO:27-44中的任一个。在一些实施例中，非变体亲本衣壳多肽序列由SEQ ID NO:45-62中的任一个进行编码。
在一些实施例中，与非变体亲本衣壳多肽相比，本发明的变体AAV衣壳多肽进一步表现出增强的中和性质。在一些实施例中，与非变体亲本衣壳多肽相比，本发明的变体AAV衣壳多肽进一步表现出对汇集的人免疫球蛋白的增强的中和性质。在一些实施例中，中和性质增强了约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或约100％。在一些实施例中，中和性质增强了约5％到约80％、约10％到约70％、约20％到约60％、约30％到约60％或约40％到约50％。在一些实施例中，增强的中和性质通过宿主中的中和抗体生成的减少来确定。在一些实施例中，中和抗体生成的减少是约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或约100％的减少。在一些实施例中，中和抗体生成的减少是约5％到约80％、约10％到约70％、约20％到约60％、约30％到约60％、或约40％到约50％的减少。在一些实施例中，非变体亲本衣壳多肽序列是SEQ ID NO:27-44中的任一个。在一些实施例中，非变体亲本衣壳多肽序列由SEQ ID NO:45-62中的任一个进行编码。
在一些实施例中，所述表现出增强的中和性质的变体AAV衣壳多肽选自由AAV-10A1(SEQ ID NO:1)和AAV-10A3(SEQ ID NO:2)组成的组。在一些实施例中，所述表现出增强的中和性质的变体AAV衣壳多肽是AAV-10A1(SEQ ID NO:1)。在一些实施例中，所述表现出增强的中和性质的变体AAV衣壳多肽是AAV-10A3(SEQ ID NO:2)。
在一些实施例中，与非变体亲本衣壳多肽相比，本发明的变体AAV衣壳多肽在一种或多种人干细胞类型中进一步表现出增加的转导或向性。在一些实施例中，人干细胞类型包含但不限于胚胎干细胞、成人组织干细胞(即，体细胞干细胞)、骨髓、祖细胞、诱导性多能干细胞和重编程干细胞。在一些实施例中，成体干细胞可以包含类器官干细胞(即，衍生自体内任何感兴趣的器官或器官系统的干细胞)。身体器官包含但不限于：皮肤、毛发、指甲、感觉受体、汗腺、油腺、骨骼、肌肉、大脑、脊髓、神经、垂体、松果体、下丘脑、甲状腺、甲状旁腺、胸腺、肾上腺、胰腺(胰岛组织)、心脏、血管、淋巴结、淋巴管、胸腺、脾、扁桃体、鼻、咽、喉、气管、支气管、肺、口、咽、食管、胃、小肠、大肠、直肠、肛管、牙齿、唾液腺、舌头、肝、胆囊、胰腺、阑尾、肾、输尿管、膀胱、尿道、睾丸、输精管、尿道、前列腺、阴茎、阴囊、卵巢、子宫、输卵管、阴道、外阴和乳腺(乳房)。身体的器官系统包含但不限于：皮肤系统、骨骼系统、肌肉系统、神经系统、内分泌系统、心血管系统、淋巴系统、呼吸系统、消化系统、泌尿系统和生殖系统。在一些实施例中，转导和/或向性增加了约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或约100％。在一些实施例中，转导和/或向性增加了约5％到约80％、约10％到约70％、约20％到约60％或约30％到约60％。在一些实施例中，非变体亲本衣壳多肽序列是SEQ ID NO:27-44中的任一个。在一些实施例中，非变体亲本衣壳多肽序列由SEQ ID NO:45-62中的任一个进行编码。
在一些实施例中，与非变体亲本衣壳多肽相比，本发明的变体AAV衣壳多肽在一种或多种非胰腺人组织中进一步表现出增加的转导或向性。在一些实施例中，与对非变体亲本衣壳多肽进行编码的载体相比，变体AAV衣壳多肽在一种或多种非胰腺人组织中进一步表现出增加的转导。在一些实施例中，与对非变体亲本衣壳多肽进行编码的载体相比，变体AAV衣壳多肽在一种或多种非胰腺人组织中进一步表现出增加的向性。在一些实施例中，转导和/或向性增加了约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或约100％。在一些实施例中，转导和/或向性增加了约5％到约80％、约10％到约70％、约20％到约60％或约30％到约60％。在一些实施例中，非变体亲本衣壳多肽序列是SEQ IDNO:27-44中的任一个。在一些实施例中，非变体亲本衣壳多肽序列由SEQ ID NO:45-62中的任一个进行编码。
在一些实施例中，与非变体亲本衣壳多肽相比，本发明的变体AAV衣壳多肽在一种或多种非胰腺人组织中进一步表现出增加的转导或向性。在一些实施例中，与对非变体亲本衣壳多肽进行编码的载体相比，变体AAV衣壳多肽在一种或多种非胰腺人组织中进一步表现出增加的转导。在一些实施例中，与对非变体亲本衣壳多肽进行编码的载体相比，变体AAV衣壳多肽在一种或多种非胰腺人组织中进一步表现出增加的向性。在一些实施例中，转导和/或向性增加了约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或约100％。在一些实施例中，转导和/或向性增加了约5％到约80％、约10％到约70％、约20％到约60％或约30％到约60％。在一些实施例中，非变体亲本衣壳多肽序列是SEQ IDNO:27-44中的任一个。在一些实施例中，非变体亲本衣壳多肽序列由SEQ ID NO:45-62中的任一个进行编码。
在一些实施例中，所述变体AAV衣壳多肽序列选自由以下组成的组：AAV-10A1(SEQID NO:1)、AAV-10A3(SEQ ID NO:2)、AAV-10A4(SEQ ID NO:3)、AAV-10A5(SEQ ID NO:4)、AAV-18A1(SEQ ID NO:5)、AAV-10B1(SEQ ID NO:6)、AAV-10B3(SEQ ID NO:7)、AAV-10B5(SEQ ID NO:8)、AAV-10B6(SEQ ID NO:9)、AAV-10B7(SEQ ID NO:10)、AAV-18B2(SEQ IDNO:12),以及AAV-18B3(SEQ ID NO:13)。在一些实施例中，所述变体AAV衣壳多肽序列选自由以下组成的组：AAV-10A1(SEQ ID NO:1)、AAV-10A3(SEQ ID NO:2)和AAV-18A1(SEQ IDNO:5)。在一些实施例中，变体AAV衣壳多肽包含包括另外的新生突变。在一些实施例中，变体AAV衣壳多肽表现出与非变体亲本衣壳多肽约99％、约98％、约97％、约96％、约95％、约94％、约93％、约92％、约91％或约90％的一致性。在一些实施例中，变体AAV衣壳多肽表现出与AAV-10A1(SEQ ID NO:1)、AAV-10A3(SEQ ID NO:2)、AAV-10A4(SEQ ID NO:3)、AAV-10A5(SEQ ID NO:4)、AAV-18A1(SEQ ID NO:5)、AAV-10B1(SEQ ID NO:6)、AAV-10B3(SEQ IDNO:7)、AAV-10B5(SEQ ID NO:8)、AAV-10B6(SEQ ID NO:9)、AAV-10B7(SEQ ID NO:10)、AAV-18B2(SEQ ID NO:12)和AAV-18B3(SEQ ID NO:13)约99％、约98％、约97％、约96％、约95％、约94％、约93％、约92％、约91％或约90％的一致性。在一些实施例中，变体AAV衣壳多肽表现出与AAV-10A1(SEQ ID NO:1)、AAV-10A3(SEQ ID NO:2)和AAV-18A1(SEQ ID NO:5)的一个或多个子区域约99％、约98％、约97％、约96％、约95％、约94％、约93％、约92％、约91％或约90％的一致性。在一些实施例中，非变体亲本衣壳多肽序列是SEQ ID NO:27-44中的任一个。在一些实施例中，非变体亲本衣壳多肽序列由SEQ ID NO:45-62中的任一个进行编码。
本发明还提供了用于生成变体AAV衣壳多肽，AAV-10A1(SEQ ID NO:1)、AAV-10A3(SEQ ID NO:2)、AAV-10A4(SEQ ID NO:3)、AAV-10A5(SEQ ID NO:4)、AAV-18A1(SEQ ID NO:5)、AAV-10B1(SEQ ID NO:6)、AAV-10B3(SEQ ID NO:7)、AAV-10B5(SEQ ID NO:8)、AAV-10B6(SEQ ID NO:9)、AAV-10B7(SEQ ID NO:10)、AAV-18B2(SEQ ID NO:12)和AAV-18B3(SEQ IDNO:13)。在一些实施例中，本发明还提供了生成变体AAV衣壳多肽，如AAV-10A1(SEQ ID NO:1)、AAV-10A3(SEQ ID NO:2)和AAV-18A1(SEQ ID NO:5)。这些方法采用已知的文库生成技术；然而，这些方法是新颖的，因为其在变体AAV衣壳多肽生成期间(即，变体AAV衣壳多肽的选择和进化)采用有复制能力的AAV载体。本发明提供了用于产生变体AAV衣壳多肽的方法，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽在人胰腺组织或人胰岛中表现出增加的转导或向性，所述方法包括：
a)生成变体AAV衣壳多肽基因的文库，其中所述变体AAV衣壳多肽基因包含多个包括来自多于一种非变体亲本衣壳多肽的序列的变体AAV衣壳多肽基因；
b)通过将所述变体AAV衣壳多肽基因文库克隆到AAV载体中来生成AAV载体文库，其中所述AAV载体是有复制能力的AAV载体；
c)从b)中筛选所述AAV载体文库，所述AAV载体文库对与非变体亲本衣壳多肽相比在人胰腺组织或人胰岛中表现出增加的转导或向性的变体AAV衣壳多肽进行编码；以及
d)从c)中选择所述变体AAV衣壳多肽。
在一些实施例中，所述方法进一步包括：e)确定来自d)的所述变体AAV衣壳多肽的序列。
在一些实施例中，与对非变体亲本衣壳多肽进行编码的载体相比，通过本发明的筛选方法生成的变体AAV衣壳多肽在人胰腺组织或人胰岛中表现出增加的转导。在一些实施例中，转导增加了约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或约100％。在一些实施例中，转导增加了约5％到约80％、约10％到约70％、约20％到约60％、约30％到约60％或约40％到约50％。在一些实施例中，非变体亲本衣壳多肽序列是SEQ ID NO:27-44中的任一个。在一些实施例中，非变体亲本衣壳多肽序列由SEQ ID NO:45-62中的任一个进行编码。
在一些实施例中，与对非变体亲本衣壳多肽进行编码的载体相比，通过本发明的筛选方法生成的变体AAV衣壳多肽在人胰腺组织或人胰岛中表现出增加的向性。在一些实施例中，向性增加了约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或约100％。在一些实施例中，向性增加了约5％到约80％、约10％到约70％、约20％到约60％、约30％到约60％或约40％到约50％。在一些实施例中，非变体亲本衣壳多肽序列是SEQ ID NO:27-44中的任一个。在一些实施例中，非变体亲本衣壳多肽序列由SEQ ID NO:45-62中的任一个进行编码。
在一些实施例中，与对非变体亲本衣壳多肽进行编码的载体相比，通过本发明的筛选方法生成的变体AAV衣壳多肽进一步表现出增强的中和性质。在一些实施例中，中和性质增强了约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或约100％。在一些实施例中，中和性质增强了约5％到约80％、约10％到约70％、约20％到约60％、约30％到约60％或约40％到约50％。在一些实施例中，增强的中和性质通过宿主中的中和抗体生成的减少来确定。在一些实施例中，中和抗体生成的减少是约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或约100％的减少。在一些实施例中，中和抗体生成的减少是约5％到约80％、约10％到约70％、约20％到约60％、约30％到约60％、或约40％到约50％的减少。在一些实施例中，非变体亲本衣壳多肽序列是SEQ ID NO:27-44中的任一个。在一些实施例中，非变体亲本衣壳多肽序列由SEQ ID NO:45-62中的任一个进行编码。
在一些实施例中，与对非变体亲本衣壳多肽进行编码的载体相比，通过本发明的筛选方法生成的变体AAV衣壳多肽在一种或多种非胰腺人组织中进一步表现出增加的转导或向性。在一些实施例中，与对非变体亲本衣壳多肽进行编码的载体相比，变体AAV衣壳多肽在一种或多种非胰腺人组织中进一步表现出增加的转导。在一些实施例中，与对非变体亲本衣壳多肽进行编码的载体相比，变体AAV衣壳多肽在一种或多种非胰腺人组织中进一步表现出增加的向性。在一些实施例中，转导和/或向性增加了约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或约100％。在一些实施例中，转导和/或向性增加了约5％到约80％、约10％到约70％、约20％到约60％或约30％到约60％。在一些实施例中，非变体亲本衣壳多肽序列是SEQ ID NO:27-44中的任一个。在一些实施例中，非变体亲本衣壳多肽序列由SEQ ID NO:45-62中的任一个进行编码。
在一些实施例中，与对非变体亲本衣壳多肽进行编码的载体相比，通过本发明的筛选方法生成的变体AAV衣壳多肽在一种或多种非胰腺人组织中进一步表现出增加的转导或向性。在一些实施例中，与对非变体亲本衣壳多肽进行编码的载体相比，变体AAV衣壳多肽在一种或多种非胰腺人组织中进一步表现出增加的转导。在一些实施例中，与对非变体亲本衣壳多肽进行编码的载体相比，变体AAV衣壳多肽在一种或多种非胰腺人组织中进一步表现出增加的向性。在一些实施例中，转导和/或向性增加了约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约99％或约100％。在一些实施例中，转导和/或向性增加了约5％到约80％、约10％到约70％、约20％到约60％或约30％到约60％。在一些实施例中，非变体亲本衣壳多肽序列是SEQ ID NO:27-44中的任一个。在一些实施例中，非变体亲本衣壳多肽序列由SEQ ID NO:45-62中的任一个进行编码。
可以通过本领域已知的技术来测量转导，包含例如免疫荧光和流式细胞术分析，包含以下实例2中所述的那些，以及本领域已知的其它方法。再次如在本领域中所描述的或如在以下实例1和2中所描述的，可以在人胰腺组织或人胰岛细胞中执行体外转导分析，包含例如通过测量GFP表达(或另一个标志基因)以确定转导。体内或离体转导分析可以通过本领域已知的技术来测量，包含例如基于萤火虫荧光素酶的测定，再次如在本领域中所描述的或如在以下实例中所描述的，包含例如通过测量荧光素酶表达(或另一个标志基因)以确定转导。在一些实施例中，将来自包装有变体AAV衣壳多肽的AAV载体的标志物表达与包装有非变体亲本衣壳多肽的AAV载体的标志物表达进行比较，以确定转导效率的变化。在一些实施例中，比较不同细胞类型的转导以确定向性，即，在至少两种不同细胞类型中将来自包装有变体AAV衣壳多肽的AAV载体的转导与来自包装有非变体衣壳多肽的AAV的转导进行比较，以确定特定细胞类型的向性，有时称为向性性质。在一些实施例中，所述至少一种细胞类型来自人胰腺组织或人胰岛细胞。在一些实施例中，所述至少一种细胞类型是人α-胰岛细胞或β-胰岛细胞。在一些实施例中，至少第二细胞类型包含但不限于：血细胞、血干细胞、肝细胞、生殖腺、生殖细胞、关节组织或细胞、胰腺(包含α-胰岛细胞和/或β-胰岛细胞)、脾脏组织或细胞、胃肠道、肺组织或细胞和/或肾脏组织或细胞。
用于生成变体AAV衣壳多肽的此类方法包含衣壳蛋白的DNA改组，其始于来自阵列或多个AAV假种(例如，AAV1、AAV2、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV 9_hu14、牛AAV、禽类AAV)的衣壳基因家族，所述衣壳基因家族进行酶改组以创建衣壳基因的多种文库，所述衣壳基因可以被克隆回AAV穿梭质粒中，并用于产生有效的复制型病毒文库(参见，例如，图1和图3)。为了最大化经过改组的衣壳(即，变体AAV衣壳多肽)与非变体亲本衣壳多肽相比能够功能性转导人胰腺组织和/或人胰岛的可能性，本发明考虑在原代人完整胰岛和解离的人胰岛细胞中同时进行两种筛选。
在完成两种筛选后，从每种筛选中选择变体，以进行完整的桑格测序以及与亲本血清型(即，亲本非变体衣壳多肽序列)的系统发育比较。在一些实施例中，亲本非变体衣壳多肽序列是加入初始文库的序列。来自每种筛选的最高度选择的变体(例如，在转导和/或向性方面表现出最高增加的那些变体)被分离，并用表达构建体进行矢量化，在某些情况下用于随后的验证实验。在一些实施例中，为了评估每个亲本AAV血清型(即，非变体亲本衣壳多肽)对选自每种筛选的进化的衣壳(即，变体AAV衣壳多肽)的遗传贡献，可以执行交叉图谱(参见例如图4和图21)和生物信息学预测分析(参见例如图10和图11)，以计算亲本(即，非变体亲本衣壳多肽)对新衣壳(即，变体AAV衣壳多肽)中每个位置的贡献的可能性的富集分数。两种方法都证明了进化的衣壳变体的高度改组性质，并强调了存在于所选衣壳中的独特结构域和共享结构域。在一些实施例中，对进化的变体贡献最大的亲本衣壳(即，非变体亲本衣壳多肽)包含AAV-10A1(SEQ ID NO:1)、AAV-10A3(SEQ ID NO:2)和AAV-18A1(SEQID NO:5)。
体外特征用于证明在各种胰腺衍生的细胞系中，变体AAV衣壳多肽的转导显著高于对照血清型(即，非变体亲本衣壳多肽)。
对于此类分析，可以进行AAV矢量化变体(由变体AAV衣壳多肽组成的AAV载体)的大规模超纯品生产，并且那些能够产生足以用于最终临床应用的高滴度的变体(例如，变体AAV-10A1(SEQ ID NO:1)、AAV-10A3(SEQ ID NO:2)、AAV-10A4(SEQ ID NO:3)、AAV-10A5(SEQ ID NO:4)、AAV-18A1(SEQ ID NO:5)、AAV-10B1(SEQ ID NO:6)、AAV-10B3(SEQ ID NO:7)、AAV-10B5(SEQ ID NO:8)、AAV-10B6(SEQ ID NO:9)、AAV-10B7(SEQ ID NO:10)、AAV-18B2(SEQ ID NO:12)和AAV-18B3(SEQ ID NO:13)，特别是变体AAV-10A1(SEQ ID NO:1)、AAV-10A3(SEQ ID NO:2)和AAV-18A1(SEQ ID NO:5))被认为进一步用于验证。
为了检查对本发明的变体AAV衣壳多肽进行编码的AAV载体的活性，可以使用离体人胰腺组织执行进一步的验证。采用离体人胰腺外植体转导以具体验证人胰腺组织中显著增加的表达。用于离体分析和/或测定的样品可以包含但不限于从手术标本中分离的人胰腺。可以通过手术隔离从男性和女性患者中获得此些人胰腺标本。用于离体分析和/或测定的样品可以包含但不限于非人胰腺分离。
在一些实施例中，人胰腺或胰岛可以用于体外分析和/或测定。
尽管嵌合人源化胰腺异种移植物是用于模拟类人体内系统的强大工具，但由于小鼠细胞的持续存在以及同时表达小鼠和人类蛋白的融合产物的嵌合性质，其在真正定义人类患者预期的转导方面能力有限。在一些实施例中，在移植到患者体内之前，可以用表达某些转录因子的rAAV处理从已故器官供体中采集的胰岛。胰岛移植作为1型糖尿病的治疗方法已经进行了多年，并且是本领域技术人员众所周知的方法。在一些实施例中，可以用如本文所述的本发明的rAAV载体处理从已故器官供体中采集的胰岛。
在一些实施例中，在分裂的和非分裂的人胰腺细胞类型中均表现出对变体亲本衣壳多肽进行编码的AAV载体的转导增加。在一些实施例中，在分裂的胰腺细胞中表现出对变体亲本衣壳多肽进行编码的AAV载体的转导增加。在一些实施例中，在具有长期转基因表达的非分裂胰腺细胞中表现出对变体亲本衣壳多肽进行编码的AAV载体的转导增加。
AAV载体元件
核酸插入物(也称为异源核苷酸序列)可以可操作地连接到控制元件，所述控制元件指导其在体内核苷酸序列中的转录或表达。此些控制元件可以包括通常与所选基因相关联的控制序列(例如，内源性细胞控制元件)。可替代地，可以采用异源控制序列。有用的异源控制序列通常包含那些衍生自对哺乳动物或病毒基因进行编码的序列。实例包含但不限于SV40早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复(LTR)启动子、腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)、单纯疱疹病毒(HSV)启动子、与感兴趣基因异源的内源性细胞启动子、如CMV立即早期启动子区域(CMVIE)等巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、合成启动子、杂交启动子等。另外，还可以使用衍生自非病毒基因的序列，如鼠类金属硫蛋白基因。此类启动子序列可商购自例如Stratagene公司(加利福尼亚州圣地亚哥)。
在一些实施例中，细胞类型特异性或组织特异性启动子可以可操作地连接到对异源基因产物进行编码的核酸插入物(也称为异源核苷酸序列)，并允许在一种或多种特定细胞类型或一种或多种组织中选择性地或优先地产生基因产物。在一些实施例中，诱导型启动子可以可操作地连接到异源核酸。
在一些实施例中，核酸用本发明的变体AAV衣壳多肽进行包装。在一些实施例中，核酸插入物或经包装的核酸的长度是至少50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400或1500个核酸。在一些实施例中，核酸插入物或经包装的核酸是至少50个核酸到至少1500个核酸。在一些实施例中，核酸插入物或经包装的核酸是至少100个核酸到至少1400个核酸。在一些实施例中，核酸插入物或经包装的核酸是至少200个核酸到至少1100个核酸。在一些实施例中，核酸插入物或经包装的核酸是至少300个核酸到至少1000个核酸。在一些实施例中，核酸插入物或经包装的核酸是至少100个核酸到至少900个核酸。在一些实施例中，核酸插入物或经包装的核酸是至少200个核酸到至少900个核酸。在一些实施例中，核酸插入物或经包装的核酸是至少300个核酸到至少900个核酸。在一些实施例中，核酸插入物或经包装的核酸是至少100个核酸到至少600个核酸。
在一些实施例中，由变体AAV衣壳多肽包装的AAV载体的总长度为至少约2000个核酸，并且总长度至多为约5000个核酸。在一些实施例中，由变体AAV衣壳多肽包装的AAV载体是约2000个核酸、约2400个核酸、约2800个核酸、约3000个核酸、约3200个核酸、约3400个核酸、约3600个核酸、约3800个核酸、约4000个核酸、约4200个核酸、约4400个核酸、约4600个核酸、约4700个核酸或约4800个核酸。在一些实施例中，由变体AAV衣壳多肽包装的AAV载体在约2000个核酸(2kb)到约5000个核酸(5kb)之间。在一些实施例中，由变体AAV衣壳多肽包装的AAV载体在约2400个核酸(2.4kb)到约4800个核酸(4.8kb)之间。在一些实施例中，由变体AAV衣壳多肽包装的AAV载体在约3000个核酸(3kb)到约5000个核酸(5kb)之间。在一些实施例中，由变体AAV衣壳多肽包装的AAV载体在约3000个核酸(3kb)到约4000个核酸(4kb)之间。
本文公开的AAV载体或AAV病毒体还可以包含常规控制元件，所述常规控制元件以允许在用AAV载体转染或用根据本发明产生的AAV病毒体感染的细胞中进行转录、转译和/或表达的方式可操作地连接到核酸插入物(也称为异源核苷酸序列)。如在此所使用，“可操作地连接的”序列包含与感兴趣的基因邻接的表达控制序列，和在相反侧或在远处起作用以控制感兴趣的基因的表达控制序列两者。
表达控制序列包含适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号，例如剪接和聚腺苷酸化(polyA)信号；使细胞质mRNA稳定的序列；增强转译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及当需要时，增强所编码产物的分泌的序列。大量的表达控制序列(包含选自天然的、组成型、诱导型和/或组织特异性的启动子)是本领域已知的并且可以被利用。
组成型启动子的实例包含但不限于逆转录病毒劳斯氏肉瘤病毒(RSV)LTR启动子(任选地具有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(任选地具有CMV增强子)(参见例如Boshart等人,《细胞(Cell)》41:521-530(1985))、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子、和EF1启动子(英杰公司(Invitrogen))。诱导型启动子允许调节基因表达并且可以通过外源供应的化合物、环境因素如温度、或特异性生理状态例如急性期、细胞的特定分化状态、或仅在复制细胞时的存在来调节。诱导型启动子和诱导型系统可以从多种商业来源中获得，包括但不限于英杰公司(Invitrogen)、克罗泰克公司(Clonetech)和阿瑞雅德公司(Ariad)。许多其它系统已被描述并且可以由本领域技术人员容易地选择。通过外源供应的化合物调节的诱导型启动子的实例包含：锌诱导型绵羊金属硫蛋白(MT)启动子、地塞米松(Dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动子系统(WO 98/10088)；蜕皮激素昆虫启动子(No等人,(1996)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,93:3346-3351)、四环素阻遏系统(Gossen等人,(1992)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,89:5547-5551)、四环素诱导系统(Gossen等人,(1995)《科学(Science)》,268:1766-1769，另请参见Harvey等人,(1998)《化学生物学新见(Curr.Opin.Chem.Biol.)》,2:512-518)、RU486诱导系统(Wang等人,(1997)《自然生物技术(Nat.Biotech.)》,15:239-243和Wang等人,(1997)《基因疗法(Gene Ther.)》,4:432-441)以及雷帕霉素诱导系统(Magari等人,(1997)《临床研究杂志(J.Clin.Invest.)》,100:2865-2872)。在此上下文中有用的其它类型的诱导型启动子是由特定的生理状态(例如，温度、急性期、细胞的特定分化状态或仅在复制细胞中)调节的那些启动子。
在另一个实施例中，将使用核酸插入物的天然启动子(也称为异源核苷酸序列)。当期望核酸插入物(也称为异源核苷酸序列)的表达应模拟天然表达时，天然启动子可能是优选的。当必须时序性或发育性地、或以组织特异性方式、或响应于特异性转录刺激调节核酸插入物(也称为异源核苷酸序列)的表达时，可以使用天然启动子。在另外的实施例中，还可以使用如增强子元件、聚腺苷酸化位点或Kozak共有序列等其它天然表达控制元件来模仿天然表达。
核酸插入物(也称为异源核苷酸序列)的另一个实施例包含可操作地连接到组织特异性启动子的基因。例如，如果期望在胰腺中表达，则应使用在胰腺中有活性的启动子。这些包含活性高于天然存在的启动子的来自对骨骼β-肌动蛋白、肌球蛋白轻链2A、肌营养不良蛋白和肌肉肌酸激酶进行编码的基因的启动子(参见Li等人,《自然生物技术(Nat.Biotech.)》,17:241-245(1999))。组织特异性启动子的实例已知用于肝(白蛋白，Miyatake等人,(1997)《病毒学杂志(J.Virol.)》,71:5124-32；乙型肝炎病毒核心启动子，Sandig等人,(1996)《基因疗法(Gene Ther.)》,3:1002-9；甲胎蛋白(AFP)，Arbuthnot等人,(1996)《人类基因疗法(Hum.Gene Ther.)》,7:1503-14)，骨钙蛋白(Stein等人,(1997)《分子生物学综述(Mol.Biol.Rep.)》,24:185-96)；骨涎蛋白(Chen等人,(1996)《骨与矿物研究杂志(J.Bone Miner.Res.)》,11:654-64)，淋巴细胞(CD2，Hansal等人,(1998)《免疫学杂志(J.Immunol.)》,161:1063-8；免疫球蛋白重链；T细胞受体链)，神经元，如神经元特异性烯醇化酶(NSE)启动子(Andersen等人,(1993)《细胞分子神经生物学(Cell.Mol.Neurobiol.)》,13:503-15)，神经细丝轻链基因(Piccioli等人,(1991)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,88:5611-5)和神经元特异性vgf基因(Piccioli等人,(1995)《神经元(Neuron)》,15:373-84)等。
在各个实施例中，带有一个或多个治疗上有用的核酸插入物(也称为异源核苷酸序列)的AAV载体或AAV病毒体还包含选择性标志物或报告基因，例如，对遗传霉素、潮霉素或嘌呤霉素抗性等进行编码的序列。选择性报告基因或标志基因可以用于表示细菌细胞中质粒/载体的存在，包含例如检查氨苄青霉素抗性。质粒的其它组分可以包含复制起源。这些和其它启动子和载体元件的选择是常规的，并且许多此些序列是可获得的(参见例如Sambrook等人以及其中引用的参考文献)。
宿主细胞和包装
宿主细胞对于生成感染性AAV载体以及基于所公开的AAV载体生成AAV病毒体是必需的。因此，本发明提供了用于基于本发明的AAV载体生成和包装AAV病毒体的宿主细胞。各种宿主细胞是本领域已知的并且在本发明的方法中得到应用。本文所描述的或本领域已知的任何宿主细胞都可以与本文所描述的组合物和方法一起使用。
本发明提供了包括主题核酸在内的宿主细胞，例如，分离的(经过遗传修饰的)宿主细胞。主题宿主细胞可以是分离的细胞，例如，体外培养的细胞。主题宿主细胞可用于产生主题AAV载体或AAV病毒体，如下所述。在使用主题宿主细胞产生主题AAV病毒体的情况下，其被称为“包装细胞”。在一些实施例中，用主题AAV载体对主题宿主细胞进行稳定遗传修饰。在其它实施例中，用主题AAV载体对主题宿主细胞进行瞬时遗传修饰。
在一些实施例中，使用已建立的技术将主题核酸稳定地或瞬时地引入到宿主细胞中，所述技术包含但不限于电穿孔、磷酸钙沉淀、脂质体介导的转染、杆状病毒感染等。为了进行稳定转化，主题核酸通常将进一步包含选择性标志物，例如，若干众所周知的选择性标志物中的任何一种，如新霉素抗性等。
通常，当通过转染递送根据本发明的AAV载体时，AAV载体以约5μg到约100μg DNA、约10到约50μg DNA到约1x104细胞到约1x1013细胞或约1x105细胞的量递送。然而，考虑到如所选载体、递送方法和所选宿主细胞等此些因素，可以调节载体DNA与宿主细胞的相对量，并且这种调节在本领域技术人员的技能水平之内。
在一些实施例中，用于生成感染性病毒体的宿主细胞可以选自任何生物有机体，包含原核(例如，细菌)细胞和真核细胞，包含昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。通过将主题核酸(即，AAV载体)引入多种细胞中的任一种来生成主题宿主细胞，所述多种细胞是例如哺乳动物细胞，包含例如鼠类细胞和灵长类动物细胞(例如，人细胞)。特别合乎期望的宿主细胞选自任何哺乳动物物种。在一些实施例中，细胞包含但不限于如以下的细胞：A549、WEHI、10T1/2、BHK、MDCK、COS 1、COS 7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、WI38、HeLa、CHO、293、Vero、NIH 3T3、PC12、Huh-7 Saos、C2C12、RAT1、Sf9、L细胞、HT1080、人胚胎肾细胞(HEK)、人胚胎干细胞、人成体组织干细胞、多能干细胞、诱导性多能干细胞、重新编程的干细胞、类器官干细胞、骨髓干细胞、HLHepG2、HepG2和原代成纤维细胞、衍生自包含人、猴、小鼠、大鼠、兔和仓鼠等哺乳动物的肝细胞和成肌细胞。对提供所述细胞的哺乳动物物种的选择不是对本发明的限制；也不是哺乳动物细胞的类型，即，成纤维细胞、肝细胞、肿瘤细胞等。对所用细胞的要求是其能够被AAV载体感染或转染。在一些实施例中，宿主细胞是Rep和Cap在细胞中稳定转染的细胞，在一些实施例中，其包含本文所述的变体AAV衣壳多肽。在一些实施例中，宿主细胞表达本发明的变体AAV衣壳多肽或如本文所述的AAV载体的一部分，如包含在AAV载体内的异源核酸序列。
在一些实施例中，制备根据本发明的宿主细胞涉及如组装所选DNA序列等技术。这种组装可以利用常规技术来完成。此类技术包含众所周知并且在上文引用的Sambrook等人中描述的cDNA和基因组克隆、结合聚合酶链反应使用腺病毒和AAV基因组的重叠寡核苷酸序列、合成方法以及提供期望的核苷酸序列的任何其它合适方法。
在一些实施例中，还可以使用技术人员已知技术的并且如说明书全文所讨论的那样将AAV载体引入到宿主细胞中。在优选的实施例中，使用标准转染技术，例如，CaPO4转染或电穿孔，和/或通过杂交腺病毒/AAV载体感染到细胞系中，如人胚胎肾细胞系HEK293(含有提供反式作用E1蛋白的功能性腺病毒E1基因的人肾细胞系)。
在一些实施例中，除了包括对变体AAV衣壳蛋白进行编码的核苷酸序列的核酸之外，主题遗传修饰的宿主细胞包含如上所述的核酸，所述核酸包括对一种或多种AAV Rep蛋白进行编码的核苷酸序列。在其它实施例中，主题宿主细胞进一步包括AAV载体。可以使用主题宿主细胞生成AAV病毒体。生成AAV病毒体的方法描述于例如美国专利公开第2005/0053922号和美国专利公开号第2009/0202490号中。
除了AAV载体之外，在示例性实施例中，宿主细胞包含驱动AAV衣壳多肽(包含变体AAV衣壳多肽和非变体亲本衣壳多肽)在宿主细胞中表达的序列，以及血清型与在核酸插入物(也称为异源核苷酸序列)中发现的AAV反向末端重复序列(ITR)的血清型相同的Rep序列，或交叉互补血清型。AAV Cap和Rep序列可以独立地从AAV来源获得，并且可以以本领域技术人员已知的或如本文所述的任何方式引入到宿主细胞中。另外，例如，当在AAV8衣壳中对AAV载体进行假型包装时，对必需的Rep蛋白中的每一个进行编码的序列可以由AAV8供应，或者对Rep蛋白进行编码的序列可以由不同的AAV血清型(例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7和/或AAV9)供应。
在一些实施例中，宿主细胞在如以上所述的那些合适的启动子(包含例如本发明的变体AAV衣壳多肽)的控制下稳定地包含衣壳蛋白。在一些实施例中，衣壳蛋白在诱导型启动子的控制下进行表达。在一些实施例中，衣壳蛋白以反式形式供应到宿主细胞。当以反式形式递送到宿主细胞时，衣壳蛋白可以通过质粒进行递送，所述质粒包含用于指导所选衣壳蛋白在宿主细胞中表达所必需的序列。在一些实施例中，当以反式形式递送到宿主细胞时，对衣壳蛋白(包含例如本发明的变体AAV衣壳多肽)进行编码衣的载体还承载包装AAV所需的其它序列，例如，Rep序列。
在一些实施例中，宿主细胞在如以上所述的那些合适的启动子的控制下稳定地包含Rep序列。在一些实施例中，必需的Rep蛋白在诱导型启动子的控制下进行表达。在另一个实施例中，Rep蛋白以反式形式供应到宿主细胞。当以反式形式递送到宿主细胞时，Rep蛋白可以通过质粒进行递送，所述质粒包含用于指导所选Rep蛋白在宿主细胞中表达所必需的序列。在一些实施例中，当以反式形式递送到宿主细胞时，对衣壳蛋白(包含例如本发明的变体AAV衣壳多肽)进行编码衣的载体还承载包装AAV载体所需的其它序列，例如，Rep序列。
在一些实施例中，可以将Rep和Cap序列转染到单独的核酸分子上的宿主细胞中，并作为未整合的游离基因稳定地存在于细胞中。在另一个实施例中，Rep和Cap序列稳定地整合到细胞的染色体中。另一个实施例具有在宿主细胞中瞬时地表达的Rep和Cap序列。例如，用于此类转染的有用的核酸分子包括5'到3'的启动子、插入启动子与Rep基因序列的起始位点之间的任选的间隔子、AAV Rep基因序列和AAV Cap基因序列。
尽管一个或多个提供Rep和衣壳的分子可以瞬时地(即，通过转染)存在于宿主细胞中，但是在一些实施例中，Rep和衣壳蛋白之一或两者以及控制其表达的一个或多个启动子在宿主细胞中稳定地表达，例如，作为游离基因或通过整合到宿主细胞的染色体中。用于构建本发明实施例的方法是常规的基因工程或重组工程技术，如上述参考文献中所述。
在一些实施例中，包装宿主细胞可能需要辅助功能，以将本发明的AAV载体包装到AAV病毒体中。在一些实施例中，这些功能可以由疱疹病毒供应。在一些实施例中，必需的辅助功能各自从人或非人的灵长类动物腺病毒来源提供，并且可从多种来源获得，包含(美国)弗吉尼亚州马纳萨斯市的美国典型培养物保藏中心(ATCC)。在一些实施例中，宿主细胞具有和/或包含E1a基因产物、E1b基因产物、E2a基因产物和/或E4 ORF6基因产物。在一些实施例中，宿主细胞可以包含其它腺病毒基因，如VAI RNA。在一些实施例中，宿主细胞中不存在其它腺病毒基因或基因功能。
异源核酸、核酸基因产物和多肽基因产物
在各个实施例中，本发明提供了能够形成衣壳的变体AAV衣壳多肽，所述衣壳能够包装各种治疗性分子，包含核酸和多肽。在一些实施例中，治疗性分子是疫苗。在各个实施例中，本发明提供了能够包含核酸插入物的AAV载体，所述核酸插入物包含例如转基因插入物或其它核酸插入物。这使得载体能够表达多肽。此些核酸可以包括异源核酸、核酸基因产物和多肽基因产物。核酸插入物的特征如以下所描述。
在一些实施例中，本文所述的AAV载体包含核酸插入物。在一些实施例中，核酸插入物包含但不限于选自由以下组成的组的核酸序列：非编码RNA、蛋白质编码序列、表达盒、多表达盒，用于同源重组的序列、基因组基因靶向盒和治疗性表达盒。
在一些实施例中，所述表达盒是CRISPR/CAS表达系统。
在一些实施例中，核酸插入物包括异源核酸，所述异源核酸包括对异源基因产物(例如，核酸基因产物或多肽基因产物)进行编码的核苷酸序列。在一些实施例中，基因产物是干扰RNA(例如，shRNA、siRNA、miRNA)。在一些实施例中，基因产物是适配子。基因产物可以是自补的核酸。在一些实施例中，基因产物是多肽。
合适的异源基因产物包含干扰RNA、反义RNA、核酶和适配子。在基因产物是干扰RNA(RNAi)的情况下，合适的RNAi包含降低细胞中靶多肽水平的RNAi。
在一些实施例中，示例性多肽、核酸或其它治疗性分子包含可用于治疗胰腺组织相关疾病的那些分子。示例性胰腺组织相关疾病包含但不限于：糖尿病(例如I型和II型)、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、遗传性胰腺炎、自身免疫性胰腺炎、胰腺癌(例如，胰腺腺癌、胰腺腺泡细胞癌、囊腺癌、胰母细胞瘤、胰腺粘液性囊性肿瘤等)、胰腺良性肿瘤(例如，胰腺浆液性囊腺瘤、胰腺实体假乳头状瘤等)、胰腺神经内分泌肿瘤、囊性纤维化、外分泌性胰腺功能不全(EPI)、胰腺假性囊肿、胰腺囊肿、Shwachman-Diamond综合征、Johanson-Blizzard综合征、共同管综合征、Zollinger-Ellison综合征、胆总管囊肿、胰性血液和先天性胰腺异常(例如，胰脏分裂、环状胰腺、异位胰腺组织)。
在一些实施例中，示例性多肽包含神经保护多肽和抗血管生成多肽。合适的多肽包含但不限于：胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、成纤维细胞生长因子2(FGF-2)、神经营养素、睫状神经营养因子(CNTF)、神经生长因子(NGF；例如，神经生长因子-β)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3(NT-3)、神经营养蛋白-4(NT-4)、神经营养蛋白-6(NT-6)、表皮生长因子(EGF)、色素上皮衍生因子(PEDF)、Wnt多肽、可溶性Flt-1、血管抑素，内皮抑素、VEGF、抗VEGF抗体、可溶性VEGFR、因子VIII(FVIII)、因子IX(FIX)和刺猬家族成员(音猬因子、印度刺猬、沙漠刺猬等)。
在一些实施例中，由异源核酸序列编码的有用的治疗产物包含激素以及生长和分化因子，所述因子包含但不限于：胰岛素、胰高血糖素、生长激素(GH)、甲状旁腺激素(PTH)、生长激素释放因子(GRF)、卵泡刺激素(FSH)、促黄体激素(LH)、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、血管生成抑制素、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、促红细胞生成素(EPO)、结缔组织生长因子(CTGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)、转化生长因子α超家族中的任一种，包含TGFα、激活素、抑制素或骨形态发生蛋白(BMP)BMP1-15中的任一种、生长因子的调蛋白/神经调节蛋白/ARIA/神经分化因子(NDF)家族中的任一种、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白NT-3和NT-4/5、睫状神经营养因子(CNTF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、神经营养素、凝集素、信号素/脑衰蛋白家族中的任一种、纺锤蛋白-1和纺锤蛋白-2、肝细胞生长因子(HGF)、蝶素、头蛋白、音猬因子和酪氨酸羟化酶。
在一些实施例中，有用的异源核酸序列产物包含调节免疫系统的蛋白质，所述免疫系统包含但不限于：如血小板生成素(TPO)等细胞因子和淋巴因子、白细胞介素(IL)IL-1到IL-25(包含IL-2、IL-4、IL-12和IL-18)、单核细胞趋化蛋白、白血病抑制因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、Fas配体、肿瘤坏死因子α和β、干扰素(α、β和γ)、干细胞因子、flk-2/flt3配体。免疫系统产生的基因产物也可用于本发明。这些基因产物包含但不限于：免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgD和IgE、嵌合免疫球蛋白、人源化抗体、单链抗体、T细胞受体、嵌合T细胞受体、单链T细胞受体、I类和II类MHC分子以及工程化免疫球蛋白和MHC分子。有用的基因产物还包含补体调节蛋白，如补体调节蛋白、膜辅因子蛋白(MCP)、衰变加速因子(DAF)、CR1、CF2和CD59。
在一些实施例中，有用的异源核酸序列产物包含激素、生长因子、细胞因子、淋巴因子、调节蛋白和免疫系统蛋白的受体中的任一种。有用的异源核酸序列还包含用于胆固醇调节和/或脂质调节的受体，所述受体包含低密度脂蛋白(LDL)受体、高密度脂蛋白(HDL)受体、极低密度脂蛋白(VLDL)受体和清道夫受体。本发明还涵盖了基因产物的使用，所述基因产物如类固醇激素受体超家族的成员，包含糖皮质激素受体和雌激素受体、维生素D受体和其它核受体。另外，有用的基因产物包含转录因子，如jun、fos、max、mad、血清反应因子(SRF)、AP-1、AP-2、myb、MyoD和成肌素、包含ETS盒的蛋白质、TFE3、E2F、ATF1、ATF2、ATF3、ATF4、ZF5、NFAT、CREB、HNF-4、C/EBP、SP1、CCAAT盒结合蛋白、干扰素调节因子(IRF-1)、威尔姆氏(Wilms)肿瘤蛋白、ETS结合蛋白、STAT、GATA盒结合蛋白，例如，GATA-3和翼螺旋蛋白的叉头家族。
在一些实施例中，有用的异源核酸序列产物包含：氨甲酰基合成酶I、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨酸琥珀酸合成酶、精氨酸琥珀酸裂解酶、精氨酸酶、富马酸乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羟化酶、α-1抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、胆色素原脱氨酶、胱硫醚β-合成酶、支链酮酸脱羧酶、白蛋白、异戊酰coA脱氢酶、丙酰CoA羧化酶、甲基丙二酰CoA变位酶、戊二酰CoA脱氢酶、胰岛素、β-葡萄糖苷酶、丙酮酸羧化酶、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶、H蛋白、T蛋白、囊性纤维化跨膜调节(CFTR)序列和肌营养不良蛋白cDNA序列。其它有用的基因产物包含可用于酶替代疗法的酶，并且可用于因酶活性不足而引起的多种疾病。例如，含有甘露糖-6-磷酸的酶可以用于溶酶体贮积病的治疗(例如，合适的基因包含对β-葡萄糖醛酸酶(GUSB)进行编码的基因)。
在一些实施例中，有用的异源核酸序列产物包含用于治疗血友病的那些异源核酸序列产物，所述血友病包含血友病B(包含因子IX)和血友病A(包含因子VIII及其变体，如异二聚体和B-缺失结构域的轻链和重链；美国专利第6,200,560号和美国专利第6,221,349号)。因子VIII基因对2351个氨基酸进行编码，并且蛋白质具有六个结构域，从氨基到末端羧基末端命名为A1-A2-B-A3-C1-C2(Wood等人,(1984)《自然(Nature)》,312:330；Vehar等人,(1984)《自然(Nature)》312:337；和Toole等人,(1984)《自然(Nature)》,342:337)。在细胞内处理人因子VIII以产生异二聚体，所述异二聚体主要包括含有A1、A2和B结构域的重链和含有A3、C1和C2结构域的轻链。单链多肽和异二聚体均作为非活性前体在血浆中循环，直到被A2结构域与B结构域之间的凝血酶酶切激活，从而释放B结构域并产生由A1和A2结构域组成的重链。B结构域以蛋白质的激活促凝剂形式缺失。另外，在天然蛋白质中，B结构域两侧的两条多肽链(“a”和“b”)与二价钙阳离子结合。
在一些实施例中，有用的基因产物包含非天然存在的多肽，如具有包含插入、缺失或氨基酸取代的非天然存在的氨基酸序列的嵌合或杂合多肽。例如，单链工程化的免疫球蛋白可用于某些免疫功能低下的患者。其它类型的非天然存在的基因序列包含反义分子和催化核酸，如用于减少靶向过度表达的核酶。
在一些实施例中，本发明提供了用于治疗干细胞疾病，例如骨髓干细胞或成体组织干细胞(即，成体干细胞)疾病的方法。在一些实施例中，成体干细胞可以包含类器官干细胞(即，衍生自体内任何感兴趣的器官或器官系统的干细胞)。身体器官包含但不限于：皮肤、毛发、指甲、感觉受体、汗腺、油腺、骨骼、肌肉、大脑、脊髓、神经、垂体、松果体、下丘脑、甲状腺、甲状旁腺、胸腺、肾上腺、胰腺(胰岛组织)、心脏、血管、淋巴结、淋巴管、胸腺、脾、扁桃体、鼻、咽、喉、气管、支气管、肺、口、咽、食管、胃、小肠、大肠、直肠、肛管、牙齿、唾液腺、舌头、肝、胆囊、胰腺、阑尾、肾、输尿管、膀胱、尿道、睾丸、输精管、尿道、前列腺、阴茎、阴囊、卵巢、子宫、输卵管、阴道、外阴和乳腺(乳房)。身体的器官系统包含但不限于：皮肤系统、骨骼系统、肌肉系统、神经系统、内分泌系统、心血管系统、淋巴系统、呼吸系统、消化系统、泌尿系统和生殖系统。在一些实施例中，治疗的病症是任何一种或多种类器官干细胞(即，衍生自体内任何感兴趣器官或器官系统的干细胞)中的病症。在一些实施例中，治疗是体内治疗(例如，将变体AAV衣壳多肽直接施用于受试者)。在一些实施例中，治疗是离体治疗(例如，将变体AAV衣壳多肽施用于从受试者分离的干细胞，然后将经处理的干细胞送回到受试者)。
异源核酸序列表达的减少和/或调节对于治疗以过度增殖的细胞为表征的过度增殖性病状(如癌症和银屑病)是特别合乎期望的。靶多肽包含与正常细胞相比在过度增殖的细胞中专门产生或以更高水平产生的那些多肽。靶抗原包含由如myb、myc、fyn等癌基因和易位基因bcr/abl、ras、src、P53、neu、trk和EGRF编码的多肽。除了作为靶抗原的癌基因产物之外，用于抗癌治疗和保护方案的靶多肽还包含由B细胞淋巴瘤制备的抗体的可变区和T细胞淋巴瘤的T细胞受体的可变区，所述T细胞淋巴瘤在一些实施例中用作自身免疫性疾病的靶抗原。可以将其它与肿瘤相关的多肽用作靶多肽，如在肿瘤细胞中以较高水平发现的多肽，包含被单克隆抗体17-1A识别的多肽和叶酸结合多肽。
在一些实施例中，合适的治疗性多肽和蛋白质包含通过针对与自身免疫(包含细胞受体和产生“自身”定向抗体的细胞)相关的靶向赋予广泛的保护性免疫应答而用于治疗患有自身免疫性疾病和病症的个体的多肽和蛋白质。T细胞介导的自身免疫性疾病包含：类风湿关节炎(RA)、多发性硬化症(MS)、干燥综合征、结节病、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)，自身免疫性甲状腺炎、反应性关节炎、强直性脊柱炎、硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、银屑病、脉管炎、韦格纳(Wegener)肉芽肿病、克罗恩(Crohn's)病和溃疡性结肠炎。这些疾病中的每一种均以与内源性抗原结合并引发与自身免疫性疾病相关联的炎性级联的T细胞受体(TCR)为表征。
在一些实施例中，异源核酸序列对免疫原进行编码，所述免疫原用于使人或非人动物对其它病原体免疫(即，用作例如疫苗)，所述病原体包含感染人和非人脊椎动物的细菌、病毒、真菌、寄生微生物或多细胞寄生虫，或来自癌细胞或肿瘤细胞。细菌性病原体的实例包含病原性革兰氏阳性球菌，所述病原性革兰氏阳性球菌包含肺炎双球菌；葡萄球菌(及其产生的毒素，例如，肠毒素B)；以及链球菌。病原性革兰氏阴性球菌包含脑膜炎球菌；淋球菌。病原性肠道革兰氏阴性杆菌包含肠杆菌属；假单胞菌属、不动杆菌属和艾肯菌属；类鼻疽菌属；沙门氏菌属；志贺氏菌属；嗜血杆菌属；莫拉氏菌属；杜克雷嗜血杆菌(引起软下疳)；布氏杆菌(布鲁氏菌病)；土拉热弗朗西丝菌(引起兔热病)；鼠疫耶尔森菌(鼠疫)和其它耶尔森菌(巴斯德菌)；念珠状链杆菌和螺菌属；革兰氏阳性杆菌包含单核细胞增生李斯特菌；红斑丹毒丝菌；白喉棒状杆菌(引起白喉)；霍乱菌；炭疽杆菌(引起炭疽)；杜诺凡病(腹股沟肉芽肿；由克雷伯氏肉芽肿引起)；以及巴尔通体病菌。由病原性厌氧细菌引起的疾病包含破伤风；肉毒中毒(肉毒杆菌及其毒素)；产气荚膜梭菌及其ε毒素；其它梭状芽胞杆菌；结核；麻风病；以及其它分枝杆菌病。病原性螺旋体病包含梅毒；密螺旋体病：雅司病、斑点病和地方性梅毒；以及钩端螺旋体病。由高等病原性细菌和病原性真菌引起的其它感染包含鼻疽病(伯克霍尔德氏菌)；放射菌病；诺卡氏放线菌病；隐球菌病、芽生菌病、组织胞浆菌病以及球孢子菌病；念珠菌病、曲霉菌病和毛霉病；孢子丝菌病；副球孢子菌病、霉样真菌病、光滑假丝酵母病、足分枝菌病以及着色芽生菌病；以及皮肤真菌病。立克次体感染包含斑疹伤寒；落基山斑疹热；Q热病(立克次体)；以及立克次体痘；支原体和衣原体感染的实例包含：肺炎支原体；性病淋巴肉芽肿(由沙眼衣原体引起)；鹦鹉热；以及围产期衣原体感染。涵盖致病性原生动物和蠕虫的致病性真核生物及其产生的感染包含：阿米巴病(由溶组织内阿米巴引起；疟疾(由疟原虫引起)；利什曼病(由利什曼原虫引起)；锥虫病(由锥虫引起)；弓形虫病(由刚地弓形虫)引起；卡氏肺孢菌病；巴贝西虫病(由巴贝西虫引起)；贾第虫病(由肠兰伯氏鞭毛虫引起)；旋毛虫病(由旋毛虫属的蛔虫引起)；丝虫病(由丝虫目的蛔虫引起)；血吸虫病(由感染了血吸虫寄生虫的五个变种之一的淡水蜗牛携带)；线虫(线虫纲)；吸虫或蛭虫(扁形动物)；以及绦虫(绦虫纲；绦虫)感染。病毒的实例包含但不限于：人免疫缺陷病毒(HIV；例如，HIV-1和HIV-2)、流感(例如，甲型流感、乙型流感和丙型流感)、副流感肝炎病毒(例如，甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎和戊型肝炎)、疱疹病毒(HSV；HHV；例如，1、2、3、4、5、6A、6B、7和8型疱疹病毒，包含1型和2型单纯疱疹病毒，又名HSV-1；HSV-2)、水痘-带状疱疹病毒(HHV-3)、爱泼斯坦-巴尔(Epstein Barr)病毒(HHV-4)、玫瑰病毒(HHV-6A和HHV-6B)；劳斯肉瘤病毒、巨细胞病毒(HHV-5)、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒；KSHV；HHV-8)、丘疹病毒(例如，人乳头瘤病毒；HPV；HPV-1、HPV-2、HPV-16和HPV-18)、细小病毒(例如，细小病毒B19)、正粘病毒、副粘病毒(例如，麻疹病毒、呼吸道病毒、风疹病毒、肺病毒、偏肺病毒)、小核糖核酸病毒(例如，口蹄疫病毒、水产病毒A、脑心肌炎病毒、泰勒病毒(theilovirus)、柯萨病毒A(cosavirus A)、杯状病毒A(cadicivirus A)、肠道病毒A、肠道病毒B、肠道病毒C、肠道病毒D、肠道病毒E、肠道病毒F、肠道病毒G、肠道病毒H、肠道病毒J、鼻病毒A、鼻病毒B、鼻病毒C、爱知病毒A(aichivirus A)、爱知病毒B、爱知病毒C、米勒格里病毒A(melegrivirus A)、人副肠孤病毒、永安河(ljungan)病毒和萨利病毒(salivirus)A)、披膜病毒(togavirus)(例如，黄病毒、甲病毒和风疹病毒)、牛痘病毒、马痘病毒、克里米亚-刚果(Crimean-Congo)出血热病毒、登革热病毒、东方马脑炎病毒、埃博拉病毒、汉坦病毒、人冠状病毒、人肠道病毒68、人肠道病毒70、非HIV逆转录病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、SARS冠状病毒、人逆转录病毒、人T淋巴细胞性病毒、伊斯法罕(Isfahan)病毒、日本脑炎病毒、拉沙病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、MERS冠状病毒、麻疹病毒、门戈(Mengo)脑心肌炎病毒、猴痘病毒、流行性腮腺炎病毒、诺沃克(Norwalk)病毒、皮辛德(Pichinde)病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、轮状病毒(例如，轮状病毒A、轮状病毒B和轮状病毒C)、风疹病毒、圣路易斯脑炎病毒、托斯卡纳(Toscana)病毒、尤库尼米(Uukuniemi)病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、西尼罗河病毒、黄热病病毒和ZIKA病毒，以及本领域技术人员已知的任何其它病毒。
用于生成AAV病毒体的方法
在各个实施例中，本发明提供了用于生成本发明的AAV病毒体的方法。用于生成AAV病毒体的多种方法是本领域已知的，并且可以用于生成包括本文所述的AAV载体的AAV病毒体。通常，所述方法包含将本发明的AAV载体插入或转导到能够将AAV载体包装到AAV病毒体中的宿主细胞中。以下描述和引用了示例性方法；然而，可以采用本领域技术人员已知的任何方法来生成本发明的AAV病毒体。
可以使用本领域众所周知的方法来构建包括异源核酸并用于生成AAV病毒体的AAV载体。参见例如Koerber等人(2009)《分子疗法(Mol.Ther.)》,17:2088；Koerber等人,(2008)《分子疗法》,16:1703-1709；以及美国专利第7,439,065号、第6,951,758号和第6,491,907号。例如，可以将一个或多个异源序列直接插入从中切除了主要的AAV开放阅读框(“ORF”)的AAV基因组中。只要保留足够的ITR部分以允许复制和包装功能，AAV基因组的其它部分也可以是缺失的。可以使用本领域众所周知的技术来设计此类构建体。参见例如美国专利第5,173,414号和第5,139,941号；国际出版物第WO 92/01070号(1992年1月23日出版)和WO 93/03769(1993年3月4日出版)；Lebkowski等人(1988)《分子和细胞生物学(Molec.Cell.Biol.)》8:3988-3996；Vincent等人(1990)《疫苗(Vaccines)》90(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press))；Carter,B.J.(1992)《生物技术当前述评(Current Opinion in Biotechnology)》3:533-539；Muzyczka,N.(1992)《微生物学与免疫学当前话题(Curr.Topics Microbiol.Immunol.)》158:97-129；Kotin,R.M.(1994)《人类基因疗法》5:793-801；Shelling和Smith(1994)《基因疗法》1:165-169；以及Zhou等人(1994)《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》179:1867-1875。
为了产生AAV病毒体，使用已知技术如通过转染将AAV载体引入到合适的宿主细胞中。许多转染技术是本领域众所周知的。参见例如Graham等人(1973)《病毒学(Virology)》,52:456；Sambrook等人(1989)《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning,a laboratorymanual)》,纽约冷泉港实验室出版社；Davis等人(1986)《分子生物学基本方法(BasicMethods in Molecular Biology)》,艾利维尔出版社(Elsevier)；以及Chu等人(1981)《基因(Gene)》13:197。特别合适的转染方法包含：磷酸钙共沉淀(Graham等人(1973)《病毒学》52:456-467)、直接微量注射到培养细胞中(Capecchi,M.R.(1980)《细胞》22:479-488)、电穿孔(Shigekawa等人(1988)《生物技术(BioTechniques)》6:742-751)、脂质体介导的基因转移(Mannino等人(1988)《生物技术》6:682-690)、脂质介导的转导(Felgner等人(1987)《美国国家科学院院刊》84:7413-7417)，以及使用高速微粒进行到核酸递送(Klein等人(1987)《自然》327:70-73)。
用于产生AAV病毒体的合适宿主细胞包含可以或已经用作异源AAV DNA分子的受体并且可以支持来自辅助病毒的期望AAV产生辅因子的表达的任何种类和/或类型的细胞。此些宿主细胞可以包含但不限于可以或已经用作异源DNA分子的受体的微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。所述术语包含经转染的原始细胞的后代。因此，本文所用的“宿主细胞”通常指已用外源DNA序列转染的细胞。可以使用来自稳定的人细胞系HEK293的细胞(容易通过例如美国典型培养物保藏中心获得，登记号为ATCC CRL1573)。人细胞系HEK293是人胚胎肾细胞系，所述人胚胎肾细胞系已经用5型腺病毒DNA片段转化(Graham等人(1977)《普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)》36:59)并表达腺病毒Ela和Elb基因(Aiello等人(1979)《病毒学》94:460)。HEK293细胞系易于转染，并提供了产生AAV病毒体的方便的平台。
在昆虫细胞中产生AAV病毒体的方法是本领域已知的，并且可以用于产生主题AAV病毒体。参见例如美国专利公开第2009/0203071号；美国专利第7,271,002号；和Chen(2008)《分子疗法》16:924。
在一些实施例中，通过本文所描述的或本领域已知的任何方法，将AAV病毒体或AAV载体包装到感染性病毒体或病毒颗粒中。
在一些实施例中，与非变体亲本衣壳多肽相比，变体AAV衣壳多肽允许类似的包装。
在一些实施例中，包装有变体AAV衣壳多肽的AAV载体比由非变体亲本衣壳多肽包装的载体更好地在体内转导到细胞中。
在一些实施例中，包装有变体AAV衣壳多肽的AAV载体比由非变体亲本衣壳多肽包装的载体更好地在体外转导到细胞中。
在一些实施例中，变体AAV衣壳多肽导致的核酸表达高于由非变体亲本衣壳多肽包装的核酸。
在一些实施例中，包装有所述变体AAV衣壳多肽的AAV载体比由非变体亲本衣壳多肽包装的转基因导致更好的转基因表达。
药物组合物和剂量
本发明提供了根据如本文所述的本发明的方法的可用于治疗受试者的药物组合物。此外，本发明提供了用于施用所述药物组合物的给药方案。本发明提供了包括以下的药物组合物：a)如本文所述的主题AAV载体或AAV病毒体，以及由衣壳包装或包含在衣壳内的治疗性分子，所述衣壳包括本文所述的变体多肽；b)药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或缓冲剂。在一些实施例中，药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或缓冲剂适用于人。
此类赋形剂、载剂、稀释剂和缓冲剂包含可以在没有过度毒性的情况下施用的任何药剂。药学上可接受的赋形剂包含但不局限于液体，如水、盐水、甘油、以及乙醇。可以包含药学上可接受的盐，例如无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；和有机酸的盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。另外，此类媒剂中可以存在辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。多种药学上可接受的赋形剂是本领域已知的，无需在此详细讨论。药学上可接受的赋形剂已在各种出版物中充分描述，所述出版物包含例如：A.Gennaro,(2000)《雷明顿：药学的科学与实践(Remington:The Science and Practice ofPharmacy)》,第20版,利平科特威廉姆斯威尔金斯出版社(Lippincott,Williams,&Wilkins)；《药物剂型和药物递送系统(Pharmaceutical Dosage Forms and DrugDelivery Systems)》(1999)H.C.Ansel等人编辑,第7版,利平科特威廉姆斯威尔金斯出版社；以及《药物赋形剂手册(Handbook of Pharmaceutical Excipients)》(2000)A.H.Kibbe等人编辑,第3版美国药剂师协会(Amer.Pharmaceutical Assoc.)。
主题组合物可以包括液体，所述液体包括本发明的主题变体AAV衣壳多肽或包括溶液、悬浮液或两者中的变体AAV衣壳多肽的AAV病毒体。如本文所使用的，液体组合物包含凝胶。在一些情况下，液体组合物是水性的。在一些实施例中，组合物是原位可胶凝水性组合物，例如，原位可胶凝水溶液。水性组合物具有光学相容的pH和渗透压。
此些组合物包含与药物施用或体内接触或递送相容的溶剂(水性或非水性)、溶液(水性或非水性)、乳液(例如，水包油或油包水)、悬浮液、糖浆、酏剂、分散液和悬浮介质、包被、等渗和吸收促进或延迟剂。水性和非水性溶剂、溶液和悬浮液可以包含悬浮剂和增稠剂。此些药学上可接受的载体包含片剂(包衣的或未包衣的)、胶囊(硬或软的)、微珠、粉末、颗粒剂和晶体。补充活性化合物(例如，防腐剂、抗菌剂、抗病毒剂和抗真菌剂)也可以掺入组合物中。
如本文所述或本领域技术人员已知的，可以将药物组合物配制为与特定的给药或递送途径相容。因此，药物组合物包含适合通过各种途径施用的载体、稀释剂或赋形剂。
适用于肠胃外施用的组合物包括活性化合物的水性溶液和非水性溶液、悬浮液或乳液。制剂通常是无菌的，并且可以与预期接受者的血液等渗。非限制性说明实例包含水、盐水、右旋糖、果糖、乙醇、动物油、植物油或合成油。
对于腹膜内或静脉内施用(例如，局部接触)，渗透剂可以包含在药物组合物中。渗透剂是本领域已知的，并且对于经粘膜施用而言包含例如洗涤剂、胆汁盐和夫西地酸(fusidic acid)衍生物。对于经皮施用，可以将活性成分配制成本领域众所周知的气雾剂、喷雾剂、软膏剂、油膏剂、凝胶剂或乳膏剂。对于与皮肤接触，药物组合物通常包含软膏剂、乳膏剂、洗剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油。有用的载体包含
Figure BDA0002714660000000981
羊毛脂、聚乙二醇、醇、透皮促进剂及其组合。
助溶剂和佐剂可以加入调配物中。助溶剂的非限制性实例包含羟基或其它极性基团，例如醇，如异丙醇；二醇，如丙二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇醚；甘油；聚氧乙烯醇和聚氧乙烯脂肪酸酯。佐剂包含例如表面活性剂，如大豆磷脂和油酸；山梨糖醇酯，如脱水山梨糖醇三油酸酯；以及聚乙烯吡咯烷酮。
适于AAV载体或AAV病毒体的药物组合物和递送系统及其方法和用途是本领域已知的(参见例如《雷明顿：药学科学与实践》(2003)第20版,麦克出版公司(Mack PublishingCo.),宾夕法尼亚州伊斯顿；《雷明顿氏药物科学(Remington's PharmaceuticalSciences)》(1990)第18版,麦克出版公司,宾夕法尼亚州伊斯顿；《默克索引(MerckIndex)》(1996)第12版,默克出版集团(Merck Publishing Group),新泽西州怀特豪斯；《固体剂型的药学原理(Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms)》(1993),技术出版有限公司(Technonic Publishing Co.,Inc.),宾夕法尼亚州兰卡斯特；Ansel和Stoklosa,《药物计算(Pharmaceutical Calculations)》(2001)第11版,利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司,马里兰州巴尔的摩；以及Poznansky等人,《药物递送系统(DrugDelivery Systems)》(1980),R.L.Juliano编辑,牛津,纽约,第253-315页。
剂量可以变化，并且取决于治疗是预防性的还是治疗性的、疾病治疗针对的类型、发作、进展、严重程度、频率、持续时间或概率、期望的临床终点、先前或同时的治疗、受试者的一般健康状况、年龄、性别、种族或免疫能力以及本领域技术人员将理解的其它因素。剂量、数量、频率或持续时间可按比例增加或减少，如治疗或治疗的任何副作用、并发症或其它风险因素以及受试者的状态所指示的。技术人员将理解可能影响提供足以提供治疗或预防益处的量所需的剂量和时间的因素。
如本文所公开的本发明的方法和用途可以在受试者被鉴定为具有针对治疗的疾病、具有一种或多种疾病症状、或被筛选并被鉴定为本文所述的阳性后约1小时到约2小时、约2小时到约4小时、约4小时到约12小时、约12小时到约24小时或约24小时到约72小时内实践，即使受试者不具有一种或多种疾病症状。在一些实施例中，如本文公开的本发明可以在约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约24小时、约36小时、约48小时或约72小时或更长时间内实施。当然，本发明的方法和用途可以在受试者被鉴定为具有针对治疗的疾病、具有一种或多种疾病症状、或被筛选并被鉴定为本文所述的阳性后的约1天到约7天、约7天到约14天、约14天到约21天、约21天到约48天或更长时间、数月或数年后实践。在一些实施例中，本文公开的本发明可以在约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天、约11天、约12天、约14天、约21天、约36天或约48天或更长时间内实践。
在一些实施例中，本发明提供了其中具有包装材料和其中的一种或多种组分的试剂盒。试剂盒通常包含标签或包装插页，所述标签或包装插页包含组分的描述或其中组分的体外、体内或离体使用说明。试剂盒可以包含此类组分的集合，例如，变体AAV衣壳多肽、AAV载体或AAV病毒体，以及任选地第二活性物质，如另一种化合物、试剂、药物或组合物。
试剂盒是指容纳试剂盒的一个或多个组分的物理结构。包装材料可以无菌地保持组分，并且可以由通常用于这种目的的材料制成(例如，纸、波纹纤维、玻璃、塑料、箔、安瓿、小瓶、管等)。
标签或插页可以包含其中一种或多种组分的鉴定信息、剂量、一种或多种活性成分的临床药理学，包含作用机理、药代动力学和药效学。标签或插页可以包含鉴定制造商、批号、制造商位置和日期、有效期的信息。标签或插页可以包含鉴定制造商信息、批号、制造商位置和日期的信息。标签或插页可以包含关于试剂盒组分可能用于的疾病的信息。标签或插页可以包含在方法、用途或治疗协议或治疗方案中临床医生或受试者使用试剂盒组分中的一种或多种的说明书。说明书可以包含剂量、频率或持续时间，以及用于实践本文所述的任何方法、用途、治疗协议或预防或治疗方案的说明书。
标签或插页可以包含关于组分可能提供的任何益处的信息，如预防或治疗益处。标签或插页可以包含关于潜在的不良副作用、并发症或反应的信息，如对受试者或临床医生关于不适合使用特定组合物的情况的警告。当受试者已经、将要或目前正在服用一种或多种可能与所述组合物不相容的其它药物时，或者受试者已经、将要或目前正在接受另一种不相容的治疗协议或治疗方案时，也可能发生副作用或并发症，因此，说明书可以包含关于此些不相容性的信息。
标签或插页包含“印刷品”(例如，纸或纸板)，或者分离或附贴到组件、试剂盒或包装材料(例如，盒子)，或附接到含有试剂盒组分的安瓿、试管或小瓶。标签或插页可以另外包含计算机可读介质，如，条形码印刷标签、磁盘、光盘(如CD或DVD-ROM/RAM、DVD)、MP3、磁带或电存储介质(如RAM和ROM)或这些的混杂体，如磁/光存储介质、FLASH介质或存储器型卡。
治疗疾病的方法
本发明还提供了用于通过施用本发明的AAV载体和/或核酸来治疗受试者疾病的方法，其中本文所述的AAV载体和/或核酸包装在功能性AAV衣壳内，其中所述功能性AAV衣壳包括本发明的一种或多种变体AAV衣壳多肽。在示例性的实施例中，本发明提供了向需要治疗的受试者施用本发明的药物组合物以治疗受试者疾病的方法。在各个实施例中，受试者另外不需要施用本发明的组合物。在一些实施例中，本发明提供了疫苗施用的方法。
在一些实施例中，变体AAV衣壳多肽包装由异源核酸组成的治疗性表达盒，所述异源核酸包括对异源基因产物(例如治疗性蛋白质或疫苗)进行编码的核苷酸序列。在一些实施例中，AAV病毒体或AAV载体包括治疗性表达盒，所述治疗性表达盒由异源核酸组成，所述异源核酸包括对异源基因产物(例如治疗性蛋白质或疫苗)进行编码的核苷酸序列。
在一些实施例中，本发明的变体AAV衣壳多肽被用作疫苗递送的一部分。疫苗递送可以包含治疗性蛋白质以及本文所述的核酸中的任一个的递送。在一些实施例中，本发明的变体AAV衣壳多肽被用作疫苗方案的一部分，并根据本文所述的方法给药。
在一些实施例中，本发明的变体AAV衣壳多肽、AAV病毒体或AAV载体用于治疗方案中。
在一些实施例中，本发明的变体AAV衣壳多肽、AAV病毒体或AAV载体用于治疗性多肽生产。
在一些情况下，当将主题变体AAV衣壳多肽或AAV载体引入到受试者细胞中时，可高水平产生由变体AAV衣壳多肽包装或由AAV载体编码的异源基因产物。例如，可以以约1μg到约50μg或更高的水平产生由变体AAV衣壳多肽包装或由AAV编码的异源多肽。
在一些情况下，当将主题变体AAV衣壳多肽、AAV病毒体或AAV载体引入到受试者中时，在至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或超过80％的靶细胞中产生由变体AAV衣壳多肽包装或由AAV载体编码的异源基因产物。
在一些实施例中，本发明提供了治疗疾病的方法，所述方法包括向有需要的个体施用有效量的如上所述由变体AAV衣壳多肽或主题AAV载体包装的治疗性分子。
主题变体AAV衣壳多肽或主题AAV载体可以全身、区域或局部施用，或通过任何途径施用，例如，通过注射、输注、口服(例如，摄入或吸入)或局部施用(例如，经皮施用)。此类递送和施用方法包含静脉内、肌内、腹膜内、皮内、皮下、腔内、颅内、经皮(局部)、肠道外，例如经粘膜或直肠。示例性施用和递送途径包含静脉内、腹膜内、动脉内、肌内、肠道外、皮下、胸膜内、局部、真皮、皮内、经皮、肠道外(例如经粘膜)、颅内、脊柱内、口服(消化道)、粘膜、呼吸、鼻内、插管、肺内、肺内滴注、颊、舌下、血管内、鞘内、腔内、离子电渗、眼内、眼科、光学、腺内、器官内和淋巴管内。
在一些情况下，由变体AAV衣壳多肽或主题AAV载体包装的治疗性分子的治疗有效量是当以一种或多种剂量施用于个体时有效减缓个体疾病或病症的进展或有效改善症状的量。例如，由变体AAV衣壳多肽或主题AAV载体包装的治疗性分子的治疗有效量可以是当以一种或多种剂量施用于个体时与没有用由变体AAV衣壳多肽或AAV载体包装的治疗性分子疗法的疾病进展相比有效减缓疾病进展至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％，或大于约80％的量。
因此，治疗的治疗效果或有益效果是向特定受试者提供的任何客观或主观可测量或可检测的改善或益处。治疗或有益效果可以但不必完全消融所有或任何特定的不良症状、病症、疾病或并发症。因此，在经过较短或较长的持续时间(数小时、数天、数周、数月等)，当由疾病引起的或与之相关联的不良症状、病症、疾病或并发症逐渐改善或部分减少，或由疾病引起的或与之相关联的一种或多种不良症状、病症、疾病或并发症的恶化或进展被抑制、减轻、减少、压抑、预防、限制或控制时，达到了令人满意的临床终点。
还可以通过本领域已知的一种或多种方法监测临床症状的改善，并将其用作对治疗效果的指标。还可以通过解剖或生理手段监测临床症状，如间接检眼镜检查、眼底照相、荧光素血管病变、光学相干断层扫描、视网膜电图(全视野、多焦点或其它)、外眼检查、裂隙灯活组织显微镜检查、压平眼压测量法、角膜厚度检查、自动屈光检查或其它功能性视力测量。在一些实施例中，当将由变体AAV衣壳多肽、主题AAV载体或AAV病毒包装的治疗性分子(包含例如疫苗)引入到受试者中时，产生异源基因产物，持续约2天到约6个月的时间段，例如，约2天到约7天、约1周到约4周、约1个月到约2个月，或约2个月到约6个月。在一些实施例中，当将由变体AAV衣壳多肽、主题AAV载体或病毒包装的治疗性分子(包含例如疫苗)引入到受试者中时，产生编码超过6个月时间段的异源基因产物，例如，约6个月到20年或更长，或大于1年，例如，约6个月到约1年、约1年到约2年、约2年到约5年、约5年到约10年、约10年到约15年、约15年到约20年，或者超过20年。在一些实施例中，施用方案是疫苗接种方案的一部分。
可以将多剂量的主题AAV病毒体施用于有需要的个体。在一段时间内施用多剂量的情况下，活性剂在一段时间内每月施用一次到约每年一次、约每年一次到每2年一次、约每2年一次到每5年一次，或约每5年一次到约每10年一次。例如，在约3个月到约2年、约2年到约5年、约5年到约10年、约10年至约20年，超过20年的时间段内施用主题AAV病毒体。施用的实际频率和治疗的实际持续时间取决于各种因素。在一些实施例中，施用方案是疫苗接种方案的一部分。
达到治疗效果的剂量(例如，以载体基因组/每千克体重(vg/kg)为单位的剂量)将基于若干因素而变化，所述因素包含但不限于：施用途径、达到治疗效果所需的异源多核苷酸表达水平、所治疗的具体疾病、对病毒载体的任何宿主免疫反应、对异源多核苷酸或表达产物(蛋白质)的宿主免疫反应以及所表达蛋白质的稳定性。本领域技术人员可以基于上述因素以及其它因素容易地确定用于治疗患有特定疾病或病症的患者的病毒体剂量范围。通常，剂量范围为至少约1x109、1x1010、1x1011、1x1012、1x1013或1x1014或更多的受试者体重的每千克载体基因组(vg/kg)，以达到治疗效果。
在一些实施例中，本发明的变体AAV多肽可以用于减少施用于受试者的AAV载体或其它治疗性分子的总量，其中当使用变体AAV衣壳多肽转导所述AAV载体或其它治疗性分子时，施用于受试者的AAV载体或其它治疗性分子的总量少于当使用非变体亲本衣壳多肽转导AAV载体或其它治疗性分子以获得类似的治疗效果(即，两种剂量诱导类似的治疗效果或不可区分的治疗效果)时施用于受试者的AAV载体或其它治疗性分子的量。在一些实施例中，当使用变体AAV衣壳多肽转导AAV载体或其它治疗性分子时，与使用非变体亲本衣壳多肽转导AAV载体或其它治疗性分子以获得类似的治疗效果(即，两种剂量诱导类似的治疗效果或不可区分的治疗效果)相比，施用于受试者的载体或其它治疗性分子的总量减少了约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％或更多。在一些实施例中，当使用变体AAV衣壳多肽转导AAV载体或其它治疗性分子时，与使用非变体亲本衣壳多肽转导AAV载体或其它治疗性分子以获得类似的治疗效果(即，两种剂量诱导类似的治疗效果或不可区分的治疗效果)相比，施用于受试者的AAV载体或其它治疗性分子的总量减少了约5％到约80％、约10％到约75％、约15％到约65％、约20％到约60％或约10％到约50％。
有效量或足够量可以但不必在单次施用中提供，可能需要多次施用，并且可以但不必单独施用或与另一种组合物(例如，药剂)、治疗、协议或治疗方案结合施用。例如，所述量可以如受试者的需要、所治疗疾病的类型、状态和严重程度或治疗的副作用(如果有的话)所指示的按比例地增加。另外，如果在没有第二种组合物(例如，另一种药物或药剂)、治疗、协议或治疗方案的情况下以单剂量或多剂量给药，则有效量或足够量不一定是有效的或足够的，因为在给定的受试者中，为了被认为是有效的或足够的，可以包含超过此些剂量的另外的剂量、量或持续时间，或另外的组合物(例如，药物或药剂)、治疗、协议或治疗方案。被认为有效的量还包含导致另一种治疗、治疗方案或协议的使用减少的量，如用于治疗凝血病症(例如，甲型血友病或乙型血友病)的重组凝血因子蛋白的施用。
有效量或足够量不需要对每个治疗的受试者有效，也不需要对给定组或人群中的大多数治疗的受试者有效。有效量或足够量是指特定受试者而不是组或一般人群中的有效性或充分性。这种方法的典型情况是，一些受试者会对给定的治疗方法或用途表现出较大的反应，或较小的反应或没有反应。因此，适当的量将取决于所治疗的病状、期望的治疗效果以及个体受试者(例如，受试者体内的生物利用度、性别、年龄等)。
关于疾病或其症状或潜在的细胞反应，可检测或可测量的改善包含疾病或由疾病引起的或与之相关联的并发症的发生、频率、严重性、进展或持续时间的主观或客观减轻、减少、抑制、压抑、限制或控制，或症状或疾病的潜在原因或结果的改善，或疾病的逆转。
因此，成功的治疗结果可以产生减轻、减少、抑制、压抑、限制、控制或预防受试者中疾病的发生、频率、严重性、进展或持续时间，或疾病的一种或多种不良症状或潜在原因或后果的“治疗效果”或“益处”。因此，影响疾病或不良症状的一个或多个潜在原因的治疗方法和用途被认为是有益的。恶化的减轻或减少，如使疾病或其不良症状稳定也是成功的治疗结果。
因此，治疗益处或改善不需要完全消融疾病或与之相关联的任何一个、大多数或所有不良症状、并发症、后果或潜在原因。因此，当受试者的疾病经过较短或较长的持续时间(数小时、数天、数周、数月等)逐渐改善，或疾病的发生、频率、严重性、进展或持续时间被部分减轻、减少、抑制、压抑、限制、控制或预防，或疾病被抑制或逆转(例如，使一种或多种症状或并发症稳定)时，达到了令人满意的终点。可以通过各种方法来确定方法或用途的有效性，如提供潜在治疗益处或疾病改善的治疗。
所公开的方法和用途可以与具有期望的治疗、有益、附加、协同或互补活性或效果的任何化合物、药剂、药物、治疗剂或其它治疗方案或协议组合。示例性组合组合物和治疗包含第二活性物质，如生物制剂(蛋白质)、药剂和药物。此类生物制剂(蛋白质)、药剂、药物、治疗剂和疗法可以在本发明的任何其它方法或用途之前、基本上同时或之后给药或实施，例如治疗受试者血液凝结疾病的治疗方法。
化合物、药剂、药物、治疗剂或其它治疗方案或协议可以作为组合组合物施用或分开施用，如同时或连续或按顺序(之前或之后)递送或施用如本文所述的AAV载体或AAV病毒体。因此，本发明提供了组合物，其中本发明的方法或用途与本文所描述的或本领域技术人员已知的任何化合物、药剂、药物、治疗方案、治疗协议、过程、药物或组合物组合。所述化合物、药剂、药物、治疗方案、治疗协议、过程、药物或组合物可以在向受试者施用如本文所述的AAV载体或AAV病毒体之前、基本上同时或之后施用或执行。因此，组合物实施例的具体非限制性实例包含前述或其它化合物、药剂、药物、治疗方案、治疗协议、过程、药物或组合物。
除其它事项外，本发明的方法和用途还包含导致减少对另一种化合物、药剂、药物、治疗方案、治疗协议、过程或药物的需要或使用的方法和用途。例如，对于血液凝结疾病，如果在给定受试者中施用重组凝血因子蛋白的频率降低或剂量减少或消除，以补充受试者中内源性凝血因子的不足或缺陷(异常或突变)，则本发明的方法或用途具有治疗益处。因此，根据本发明，提供了减少对另一种治疗或疗法的需求或使用的方法和用途。
本发明可用于动物，包含兽医应用。因此，合适的受试者包含哺乳动物，如人类以及非人类哺乳动物。术语“受试者”是指动物，通常是哺乳动物，如人、非人灵长类动物(猿、长臂猿、大猩猩、黑猩猩、猩猩、猕猴)、家畜(狗和猫)、农场动物(如鸡鸭、马、牛、山羊、绵羊、猪等家禽)和实验动物(小鼠、大鼠、兔子、豚鼠)。人类受试者包含胎儿、新生儿、婴儿、青少年和成人受试者。受试者包含动物疾病模型，例如，患有血液凝结疾病的小鼠和其它动物模型以及本领域技术人员已知的其它模型。
根据本发明可治疗的疾病的非限制性特定实例包含本文所述的那些以及胰腺疾病。胰腺疾病包含但不限于：糖尿病(例如I型和II型)、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、遗传性胰腺炎、自身免疫性胰腺炎、胰腺癌(例如，胰腺腺癌、胰腺腺泡细胞癌、囊腺癌、胰母细胞瘤、胰腺粘液性囊性肿瘤等)、胰腺良性肿瘤(例如，胰腺浆液性囊腺瘤、胰腺实体假乳头状瘤等)、胰腺神经内分泌肿瘤、囊性纤维化、外分泌性胰腺功能不全(EPI)、胰腺假性囊肿、胰腺囊肿、Shwachman-Diamond综合征、Johanson-Blizzard综合征、共同管综合征、Zollinger-Ellison综合征、胆总管囊肿、胰性血液或先天性胰腺异常(例如，胰脏分裂、环状胰腺、异位胰腺组织)。
在一个实施例中，本发明的方法或用途包含：(a)提供其衣壳包括如本文所述制备的变体AAV衣壳多肽的AAV病毒体，其中所述AAV病毒体包括异源核酸序列，其中所述异源核酸序列与赋予所述核酸序列转录的表达控制元件可操作地连接；(b)向哺乳动物施用一定量的AAV病毒体，使得所述异源核酸在哺乳动物中表达。
在一个实施例中，本发明的方法或用途包含：(a)提供由如本文所述制备的变体AAV衣壳多肽包装的治疗性分子(包含例如疫苗)，其中所述治疗性分子包括异源核酸序列，其中所述异源核酸序列与赋予所述核酸序列转录的表达控制元件可操作地连接；(b)向哺乳动物施用由变体AAV衣壳多肽包装的一定量的治疗性分子(包含例如疫苗)，使得所述异源核酸在哺乳动物中表达。
在另一个实施例中，本发明的方法或用途包含通过将由变体AAV衣壳多肽包装的异源多核苷酸、通过变体AAV衣壳多肽包装的多个异源多核苷酸、如本文所述制备的AAV病毒体或包括异源核酸序列的多个AAV病毒体施用到哺乳动物或哺乳动物细胞中而将异源多核苷酸序列递送或转移到哺乳动物或哺乳动物的细胞中，从而将异源多核苷酸序列递送或转移到哺乳动物或哺乳动物细胞中。在一些实施例中，异源核酸序列对在哺乳动物中表达的蛋白质进行编码，或其中异源核酸序列对减少哺乳动物中内原性蛋白质表达的抑制序列或蛋白质进行编码。
举例来说，关于血友病，据信，为了达到治疗效果，需要大于在正常个体中存在的因子浓度的1％的凝血因子浓度以将严重疾病表型改变为中度疾病表型。严重表型以关节损伤和威胁生命的出血为表征。为了将中度疾病表型转化为温和疾病表型，据信，需要大于正常值的约5％的凝血因子浓度。关于治疗此类血友病受试者，典型剂量是每千克受试者体重(vg/kg)至少1x1010 AAV载体基因组(vg)，或在约1x1010到约1x1011 vg/kg受试者体重之间，或在约1x1011到约1x1012 vg/kg受试者体重之间，或约1x1012到约1x1013 vg/kg受试者体重之间，以实现期望的治疗效果。
实例
实例1：用于人胰岛靶向的AAV的定向进化
简介
作为用于将基因转移到各种细胞类型中的强效媒剂，腺相关病毒(AAV)引起了人们的极大兴趣。尽管AAV有若干特征使自身成为人类基因疗法的有前景媒剂，但若干缺点阻碍了AAV在临床应用中的用途，如其混杂性、有限的转基因包装大小以及在一般群体中预先存在的中和抗体的高流行率。出于基因疗法的目的，转导既要高效又要具有高度细胞类型特异性。AAV细胞向性以及免疫原性由结构衣壳蛋白VP1、VP2和VP3的序列确定。
DNA改组是用于在体外进化具有特定功能的分子的有力方法并且在医学、制药学和农业研究等各种领域都有应用。AAV衣壳序列的改组在过去已经被成功地用于在体外和体内进化具有改善的细胞转导能力的重组AAV(rAAV)(D.Grimm.《病毒学杂志》82,5887-5911(2008)；以及L.Lisowski.《自然》506,382-386(2013))。
目的
这项研究的目的是为糖尿病研究领域的基因疗法应用生成AAV载体。已经生成了包含用于高通量测序的用独特条形码标记的经过改组的衣壳序列的高度复杂的AAV文库，并且已经通过在原代人胰岛中对其执行多轮传代来筛选出改善的胰岛转导。
结果
来自各种AAV野生型血清型和先前描述的变体的衣壳基因(图2)使用DNase改组方法进行改组(W.P.Stemmer.《美国国家科学院院刊》,91,10747-10751(1994))，并克隆到含有cap polyA下游条形码序列的AAV主链文库中(图3)。用独特的条形码标记每个AAV变体允许通过高通量测序跟踪多轮传代之间的变体富集。对10亲本文库进行了更详细的分析，并且通过桑格测序发现其交叉率良好(图4)(W.Huang.《生物技术》,60,91-94(2016))。使用PacBio测序技术执行高通量衣壳+BC测序，并且结果显示10亲本衣壳序列的贡献水平类似(图5)且衣壳-BC的连接良好(参见例如图1)。
根据cap改组的带条形码的AAV文库的高感染复数(MOI)以及亲本cap AAV的对照池对人胰岛进行感染，其中每个对照池均标记有唯一的条形码(图8和图12)。添加人腺病毒5作为辅助病毒，以在大多数筛选中复制AAV。实验中同时使用完整胰岛和解离的胰岛，并且对每次筛选进行了三轮传代。在每一轮中，通过qPCR评估AAV复制，并且示出AAV文库以及18亲本混合物以在胰岛中进行复制(数据未显示)。
每轮传代后，使用MiSeq测序仪(Illumina)对从病毒基因组扩增的AAV条形码进行高通量测序。用18亲本混合物感染完整胰岛显示出对含有DJ衣壳序列的AAV的选择压力(图10)，尽管发现LK03在胰岛转导方面比DJ更好。这表明，在长时间传代过程中，具有提供改进转导的衣壳序列的变体可能会丢失，而那些复制良好的变体可能会占据整个种群。出于这个原因，使用10亲本文库执行了不包含与Ad5重复感染的筛选。对两个文库进行传代后获得的条形码的深度测序显示了若干衣壳变体的快速富集(图11、13、14)。
实例2：具有增强的人胰腺组织或人胰岛细胞向性的新型重组腺相关病毒衣壳
目的
本发明的目的是找到转导人胰岛细胞的具有增强能力的rAAV载体。这对于针对内分泌失调(特别是1型和2型糖尿病)的新疗法很有用。
技术说明
使用AAV衣壳文库来选择选择性地转导解离的或完整人胰岛的AAV。这些衣壳序列使用条形码特异性反向引物来进行扩增，并用于生成以GFP作为转基因的rAAV(图18)。使用Accumax解离的胰岛，在37℃下以MOI＝1K或10K微克/细胞转导48小时(10％FBS/CMRL)，在转导后48小时进行铺板并通过流式细胞术进行分析。在冰上以MOI＝10K微克/细胞转导完整人胰岛1-2小时(2％FBS/CMRL)，随后悬浮培养3天，转导后第2天更换培养基，并且然后通过流式细胞术进行分析。使用针对2B4(胰岛表面标志物)和8G12(α细胞表面标志物)的单克隆抗体完成流式细胞术。经过几轮传代后，分离出最普遍的衣壳并进行测序。将表达GFP报告子的rAAV载体与先前分离的rAAV进行了比较，目前认为后者在转导人胰岛中最稳健。
使用冷转导协议对来自两个不同供体(MOI 10,000)的人完整胰岛进行转导。使用针对泛胰岛标志物和α细胞特异性标志物的抗体执行表面染色。
冷转导协议。将整个胰岛制成丸状，并去除上清液(在15mL Falcon管中)。将100μLCMRL+2％FBS添加到胰岛中。添加AAV，轻轻弹几次管。将15mL Falcon管在冰上温育(几乎平放约10-15度角)，并且将冰桶在冷藏室中的水平振动器(大约100rpm)上放置1-2小时。在37℃下预热胰岛培养基(CMRL-1066+10mM HEPES+0.5％人血清白蛋白+2％FBS+10mM烟酰胺+抗生素/抗真菌药+1X谷氨酸)。在24孔格式的无涂层/重悬平板中，每孔转移350-500个胰岛(使用AAV)。每孔添加1mL预热的胰岛培养基。放在37℃湿润的5％CO2培养箱中2天。在第2天更换培养基。在第3天采集用于FACS的胰岛(Dorrell等人《自然》使用表面抗体将胰岛细分为α、β、非α/非β的FACS协议的通信)。
在体内测试了新变体的转导效率。将具有CAG-Fluc的四个组中的不同AAV(DJ、AAV8、KP1、KP2和KP3)以2e10微克/小鼠的剂量注射到Balb/SCID小鼠(n＝4小鼠/组)中(参见图42)。每周进行体内荧光素酶成像，持续4-6周。在第7天和第5周采集若干器官(例如肝、胰腺、肺、心脏、脑、脾、肾)，并分析荧光素酶活性、Fluc转录水平和载体拷贝数。
结果
通过FACS评估原代人胰岛细胞的转导效率。当与最佳亲本LK03相比，若干衣壳变体表现出改善的转导(图19、20、22-28、30、31、33和34)。胰岛素和胰高血糖素的细胞内染色将显示变体中的任一种是否表现出对α细胞或β细胞的选择性。对其相对转导效率进行了比较，并且最佳候选物比以前的黄金标准稳健大约10倍。
这项研究表明，对衣壳的另外的遗传修饰提供了增强的rAAV转导，从而有效地将基因转移到靶细胞(例如胰岛细胞)中。其提供了针对胰腺α和/或β细胞靶向特异性的关键解决方案。
在来自两个不同供体(MOI 10,000)的人完整胰岛上进行了转导。使用针对泛胰岛标志物和α细胞特异性标志物的抗体执行表面染色，并且结果在图35-36中示出。各种人和非人细胞系中示出了新型变体的增强的转导效率(图39)。新型变体中的两个变体KP1和KP3具有比LK03更良好的中和性质(图46)。
在Balb/SCID小鼠体内测试了新变体的转导效率。向Balb/C SCID小鼠尾静脉注射包装有不同衣壳的2E+10vg荧光素酶载体。监测肝(腹侧和背侧)中的荧光素酶表达持续7天和14天。然后每周监测荧光素酶表达(腹膜)到第5周(第33天)。第7天和第14天的荧光素酶成像结果如图43所示，并在图44和45中定量。从第14天到第33天，新型变体的体内肝转导效率是稳定的(图47)。在第5周离体测试了各种器官中荧光素酶表达(图48)。与大脑、心脏和脾脏相比，肝中的载体拷贝数有所增加(图49)。
实例3：用于增强的原代人胰岛细胞转导的带条形码的腺相关病毒衣壳改组文库的生成和筛选
摘要
安全有效地将基因转移到朗格汉斯(Langerhans)胰岛是治疗糖尿病的有前景的方法。重组AAV介导的基因转移到胰岛中的过程因缺乏高效转导这些细胞的AAV血清型而受到阻碍。为了鉴定对人胰岛具有改善的向性的新AAV血清型，构建了两个高度复杂的带条形码的有复制能力的衣壳文库，通过单分子DNA测序验证了多样性，并在人类胰岛上进行了序列选择。通过高通量测序来跟踪富集的条形码，并且鉴定了三个衣壳变体，与先前鉴定的最佳衣壳相比，所述三个衣壳变体能够以5倍到10倍的更高效率转导解离的和完整胰岛。这些能够穿透完整的人胰岛的新型AAV衣壳变体代表了用于治疗糖尿病患者的强大基因疗法工具。在人源化嵌合小鼠模型中，所述衣壳之一在转导小鼠和人肝细胞方面也很稳健，因此提供了消除在用于人类临床试验之前使用替代衣壳进行临床前测试的要求的通用载体。
简介
病毒基因转移载体的开发仍然是活跃的研究领域1。尽管重组AAV载体已成为用于在临床前和临床研究中将基因转移到整个生物体中的安全媒剂，但仍然存在重要的局限性2。rAAV的主要缺点是包装尺寸限制在5kb左右，由于预先存在中和抗体而快速清除病毒，对天然存在的血清型的宿主向性有限，以及由于AAV的游离性质而导致在分裂细胞过程中表达的转基因丢失。由VP1、VP2和VP3蛋白组成的衣壳是基于对各种受体和共受体3的识别的细胞向性的主要决定因素。此外，衣壳变体可能表现出可变的进入后事件，如衣壳脱壳4、细胞内转运和核进入5，从而导致组织与物种之间的差异转导。天然和非天然AAV衣壳变体已使用生物采矿进行了分离，即天然存在的AAV的分离和表征6、衣壳肽显示文库7-9的筛选、表达显示细胞特异性设计的锚蛋白重复序列蛋白(DARPins)10的文库，以及通过迄今为止作为探索最彻底的途径的随机DNA改组11获得的衣壳文库的筛选。最近，由祖先AAV衣壳序列组成的文库的创建和筛选已被描述为获得具有非常特定的细胞靶向12的AAV的有价值的工具。
定向进化是以极大加速的方式模仿自然进化的强大工具。最重要的是，不需要关于序列-功能关系的先验知识，这与合理的设计策略相反。创建期望序列的高度多样化的文库，随后筛选表现出期望表型的那些变体。已经描述了用于文库生成的若干方法，如DNase介导的改组13-14、交错延伸聚合(STEP)15、瞬时模版的随机嵌合体生成16、限制酶介导的改组17等(关于详细方案，参见18)。对于这项研究，采用DNase介导的家族改组13、19的若干全长AAV衣壳序列来创建高度复杂和功能强大的文库。由于杂交13-14，这种技术利用了衍生自相关基因家族的随机片段化DNA重新组装成嵌合全长序列的能力。当部分重新组装的PCR产物在相关但不相同的模板的同源位置上事先准备时，会发生交换，从而启动模板切换。由于基于少于15个碱基一致性的交叉很难获得13-14文库的复杂程度，因此质量往往与亲本序列多样性负相关。DNA改组可以用于创建可以针对期望表型进行筛选的大型基因文库。这项技术的成功应用已针对许多领域进行了描述，如各种酶、启动子、免疫调节蛋白19-32的性质改善。在2000年，Soong等人率先描述了DNA改组在病毒进化20中的应用。利用这种高度多样化的病毒文库在几轮传代中受到严格的选择压力，并且富集变体被回收。这项技术导致了具有改善的包膜稳定性26的莫洛尼白血病病毒(MLV)颗粒以及具有新型宿主细胞向性25、28的MLV和HIV-1的开发。在2008年，Grimm,D等人率先报告了通过衣壳改组和多轮选择成功选择了改善的AAV变体8。先前已经描述了AAV衣壳进化的另一种方法——易错PCR与STEP结合。33很快，其它人创造并筛选了经过AAV衣壳改组的文库34-40(关于综述，参见11)。这些筛选中的一些筛选是在人腺病毒5的存在下执行的，以在选择轮次之间复制富集的AAV变体，但也已经报告了无腺病毒的AAV文库筛选41-44。
估计有3030万美国人受到1型或2型糖尿病的影响45。这些年来，已经对各种治疗糖尿病的策略进行了评估。在1型糖尿病患者中，将尸体人胰岛移植到肝管中已被用来替代β细胞，但迄今为止成功有限(关于综述，参见46)。胰岛高度血管化，并且需要大量氧气才能存活。由于移植胰岛的血管再生需要数周时间，因此这些移植物由于缺氧而遭受大量细胞死亡。提供或抑制某些转录因子的离体基因疗法可以用于改善移植物的存活和功能(关于综述，参见47)。最近，已证明敲除PHLDA3导致小鼠中移植胰岛的存活率增加48。除了上述方法外，最重要的是防止移植胰岛由于反复的自身免疫破坏而丢失。最近，一项研究描述了使用AAV过度表达Igf1，并且因此抵消了小鼠中自身免疫性糖尿病的进展49。
另一种治疗策略是通过某些转录因子(如Pdx1、Ngn3、MafA、Pax4和Arx，50-58)的过度表达或抑制将产生α细胞或其它内分泌或外分泌胰腺细胞类型的胰高血糖素转化为β细胞。(关于综述，参见59)。已证明在糖尿病小鼠模型中卵泡抑素过度表达可保持β细胞功能60。
迄今为止，只有很少的研究描述了AAV作为胰岛基因疗法媒剂的用途，并且大部分工作是用鼠类胰岛执行的。已经描述了AAV8衣壳与β细胞型特异性胰岛素启动子结合以在小鼠中腹膜内递送后实现β细胞的高度特异性转导61。另一项研究发现AAV6在体外以及通过管内途径高效转导小鼠胰岛，但AAV8被证明是系统递送时更强健的血清型62。由于逃避细胞内泛素化-蛋白酶体降解63-67，表面暴露的衣壳酪氨酸残基对苯丙氨酸的定点诱变已被描述为增强若干血清型的转导效率。最近，据报道，与野生型AAV868相比，Y-F突变AAV8载体实现了高达十倍的向小鼠胰岛的基因转移。有趣的是，在大鼠中的研究发现AAV5是此啮齿动物中用于胰岛转导的最佳衣壳69。AAV2是最常被描述用于转导人胰岛70、71的血清型。最近发现，与AAV2和AAV3B相比，衣壳变体DJ和LK03对人胰岛具有更好的转导效率，然而，观察到这些衣壳72对α细胞有强烈的偏好。
这项研究试图开发具有进一步增强的人胰岛细胞转导效率的衣壳变体。出于这个目的，将衣壳重组带条形码的AAV文库在人胰岛上进行多轮选择，并分析富集的衣壳变体以提高转导效率。通过采用高通量的条形码测序而不是基于低通量桑格的衣壳序列分析对衣壳进行条形码编码以符合嵌合变体的富集。这种被称为AAV条形码序列的新型技术首次被描述用于对来自小AAV文库或亲本池73的变体的体内跟踪。在所有经测试的候选物中，发现三种嵌合变体在体外和体内表现出显著改善的人胰岛——特别是β细胞以及其它细胞类型——的转导能力。除了用于糖尿病治疗的靶向胰岛的基因疗法应用之外，这些新型衣壳还可以用于各种基因疗法应用。
结果：
对亲本衣壳的人胰岛转导效率的评价
第一步是证实先前的数据，所述数据表明AAV-DJ和AAV-LK03具有比紧密相关的自然血清型AAV-2和AAV3B更高的人胰岛转导效率72。用包装有不同衣壳的单链(ss)和自补(sc)GFP表达性载体转导人胰岛，并使用流式细胞术测量转导效率(图62A)。如所预期的，AAV-DJ和AAV-LK03在人胰岛中具有比AAV2和AAV3B更高的转导率。证实此结果为用经过改组的衣壳文库进行筛选之前的验证研究提供了基础。对于本研究，生成了含有亲本AAV的对照AAV池，每种亲本AAV在衣壳编码序列的正下游携带有独特的条形码(BC)序列。在混合18种亲本AAV中的每种亲本AAV的相等拷贝数后，对池进行纯化，并通过条形码的高通量测序来分析其组分(图50C)。尽管亲本AAV中的一些在池中呈现不足或过度呈现，但是发现18亲本池可用于试点文库筛选中，作为用于在衣壳选择筛选中使用条形码测序的第一验证。为了评估哪种衣壳最适合转导人胰岛，用18亲本池感染完整的人胰岛以及解离的人胰岛，并用人腺病毒5对其进行超感染以复制AAV。使用完整胰岛比解离的胰岛高十倍的感染复数(MOI)进行感染，因为推断出中心的胰岛细胞比外围的胰岛细胞更难感染。连续执行三轮选择，并在每轮中评估AAV复制(图51)以及病毒池的组成(图52)。对于第1轮和第2轮选择，在完整胰岛上繁殖后，恢复比输入更低的病毒基因组拷贝数，而复制在第3轮开始。当使用2K的较低MOI感染解离的胰岛细胞时，在胰岛培养后获得的病毒量高于每轮选择的输入量。使用BC序列的下一代测序(NGS)来评估每轮的AAV组成。针对每个样品，获得介于400,000与1,000,000之间的序列读段。某些亲本AAV明显优于其它亲本AAV，因为在一轮选择后，池的多样性已经减少，特别是在使用完整胰岛时(图52)。AAV2、AAV3B以及经过改组的变体DJ和LK03在第一次传代后就已经富集。在完整胰岛上第三次传代后，如所预期的，AAV-DJ和AAV-LK03被均等地呈现，而AAV2和AAV3B出现的程度较低。在解离的胰岛细胞上传代18亲本池显示了AAV-DJ的早期富集，其中AAV2、LK03、AAV3B和AAV-恒河猴10的比例较低。此实验验证了选择筛选方法，因为所述选择筛选方法证实了表明AAV-DJ和AAV-LK03稳健地转导原代人胰岛的先前转导研究。
高度多样化的带条形码的经过衣壳改组的AAV文库的生成
在生成经过改组的AAV文库之前，创建高度多样化的AAV条形码(BC)文库。出于这个目的，将由20个核苷酸(nt)长的接头分离的两个12个核苷酸(nt)长的随机条形码序列组成的片段克隆到含有AAV载体的ITR中，所述AAV载体含有AAV2 p5启动子和rep基因，但没有cap序列。紧邻cap polyA序列的3'克隆条形码片段，从而允许通过高通量测序来跟踪整个选择过程中的变体富集。如具有和不具有BC的野生型AAV的复制研究(数据未示出)所示，BC序列的插入未对病毒功能造成负面影响。条形码质粒文库的高通量测序示出了足够高的多样性程度，其中所有BC读段的超过93％具有独特序列(表6)。在超过120万个读段中，只有一个单个BC序列出现了6次，20个不同的BC序列出现了5次重复，发现342个不同的BC序列每个出现了4次，检测到4844个BC每个出现了三次，并且发现74,433个BC序列(6％)出现了两次。由于条形码的高通量测序涉及扩增步骤，因此BC文库中重复条形码的实际数量极有可能低于此数量。基于从转化反应的等分试样中获得的菌落数，估计条形码文库的大小为1E07。然后，使用来自10个相关AAV或18个更多样化的AAV的序列生成经过改组的衣壳，并将其克隆到BC文库载体中。图58A中描绘了用于改组的亲本序列的系统发育分析。那些衣壳序列中的两个序列DJ和LK03衍生自在实验室中使用早期生成文库执行的先前筛选，并且DJ是AAV2、AAV8和AAV9hu14的杂交体或者LK03是AAV1、AAV3B、AAV4、AAV8和AAV9hu14的杂交体(图58B)。图58B展示了DJ和LK03衣壳的组成，并且图58C示出了DJ和LK03组装激活蛋白的组成(AAP)。经过衣壳改组的带条形码的10亲本文库和18亲本文库各自的大小为大约5E06个不同的克隆，如通过在平板接种小等分试样的文库转化反应后在琼脂平板上生长的菌落数来估计的。鉴于BC测序后的重复数量较少，估计所述文库中的每个文库的复杂性为至少100万。
表6：BC文库以及质粒和AAV水平的经过衣壳改组的文库的条形码NGS数据。示出了顶部相同的序列，每个序列在序列读段内呈现的次数在括号中示出。
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Figure BDA0002714660000001161
使用三种不同的方法评估文库多样性的程度：条形码的高通量MiSeq分析、包含条形码的衣壳的PacBio测序以及包含条形码的衣壳的桑格测序。来自质粒文库以及AAV文库的条形码的扩增和高通量测序显示出程度非常高的复杂性，其中重复数量较少。针对每个样品，获得至少100万个读段(表6)。当在质粒水平上分析10亲本文库时，即在转染到293T细胞中之前，发现所有读段的88.3％包含独特序列，其中发现最大重复数量为125万个读段中有7个读段。对于18亲本质粒文库，88.6％的读段是独特的，针对一个单独的BC序列获得的最大读段数量是180万个读段中有8个。AAV文库的NGS数据分析显示，10亲本文库和18亲本文库分别有约76％和80％的独特BC序列(表6)。在10亲本AAV文库中，一个单独的BC序列呈现有287个读段(0.025％)，在18亲本AAV文库中，针对单独的BC获得的最高读段数量为232(0.023％)。还有存在数量较少的其它重复，特别是10次以及更少。
作为低通量方法，来自两个质粒文库以及来自10亲本AAV文库的若干衣壳通过桑格测序进行分析并使用可由Gillam实验室在线提供的Xover程序进行重组分析。(图59A，图60A)。对于在AAV水平上分析多样性，跨越衣壳和条形码的区域从提取的病毒基因组扩增、克隆和测序(图59A，右图)。除了描绘经过改组的衣壳的交叉图之外，还使用由Xover软件生成的亲本贡献数据对整个衣壳序列执行保守分析。计算并绘制每个氨基酸残基的保守值(图59B，图60B)。使用此分析将会允许评估以查看文库内的序列多样性与亲本序列相比是否显著减少。在质粒水平以及AAV水平上的10亲本文库的情况下，保守模式与亲本序列的保守模式紧密匹配(图59B)，而18亲本质粒文库在大部分衣壳中表现出比亲本更高的保守水平(图60B)。衣壳氨基酸序列的交叉分析表明，10亲本文库被很好地改组，平均比率为每个衣壳11个交叉事件。少数克隆在位置24处含有谷氨酰胺，所述谷氨酰胺源自嵌合亲本LK03内的AAV4衍生序列。出于一致性的原因，LK03和DJ在交叉分析图中没有作为亲本包含在内，因此此残基被标志为新生突变。在平均有8个交叉的情况下，18亲本文库被不那么彻底地改组。此观察结果可以用较大比例的亲本衣壳在大段中彼此同源性较低来解释。基于少于15个碱基的一致性的交叉很难获得。13这可能是因为当等摩尔量的每种亲本混合在一起时，彼此同源性低的片段不容易重组。还可以用此限制来解释在文库衣壳的3'半部分内发现较少交叉的观察结果，因为衣壳的这一部分包含在不同血清型之间具有较低序列同源性的若干段。发现AAV水平上的10亲本文库的复杂性与质粒水平上的类似，这表明在293T细胞中产生AAV期间的衣壳组装不是显著降低多样性的瓶颈(图59)。此外，交叉分析模式表明，亲本看起来在文库内大致均等且随机地呈现，虽然经过改组的克隆的3'部分中AAV3B序列似乎稍受青睐。这可以通过以下事实来得到部分解释：除了AAV3B之外，嵌合衣壳LK03也用作用于改组的亲本序列。LK03的整个3'半部分衍生自AAV3B，因此含有AAV3B序列的片段在最初的片段池中过度呈现。除了对各个衣壳进行桑格测序之外，在转染到293T细胞中之前，在质粒水平上(图50A)以及在AAV水平上(图50B)对10亲本文库执行PacBio测序。在质粒水平上针对10亲本文库获得21,000个全长读段，同时分析了10亲本AAV文库的所述读段数量的约一半。曲线图描绘了每个亲本氨基酸残基在整个衣壳长度上的贡献。如通过桑格测序观察到的，PacBio测序显示衣壳基因的5'半部分比3'半部分包含分布更均匀的所有亲本序列。具体地，来自AAV猪2和AAV9hu14的残基贡献在氨基酸位置450与650之间的序列段中明显减少，而AAV3B序列被过度呈现。AAV3B序列的过度呈现可能至少部分是由于以下事实：包含来自AAV3B的大序列段的LK03(图58B)被用作用于改组的亲本。
执行另一项分析是为了查看每个衣壳是否与独特的条形码序列连接并且是否发现有非常高水平的衣壳-BC键。根据PacBio测序，所有序列中只有0.5％具有共享相同条形码的不同衣壳。没有检测到不同条形码共享共同衣壳序列的情况。
亲本AAV池的生成与分析
(基于载体基因组拷贝数)生成由等量的18个带条形码的亲本AAV中的每一个组成的对照AAV池，然后通过双CsCl离心纯化所述池。通过条形码的高通量测序分析了所述池的组分(图50C)。尽管在纯化前将等量的每种病毒汇集在一起，但亲本AAV中的一些在所述池中呈现不足。那些亲本AAV可能以CsCl梯度中所收集分离部位之外的密度条带化。然而，大多数亲本序列在池中相当均等地呈现。还通过扩增的衣壳加BC序列的PacBio高通量测序来分析亲本AAV池(图50D)。使用PacBio测序获得与BC NGS数据相比类似但不相同的所述池的组分数据。这些差异可能是由于某些BC序列或衣壳加BC序列的细微扩增差异所致。尽管其有缺点，但是发现18亲本池作为在衣壳选择筛选中使用条形码测序的第一个验证在试点文库筛选中是有用的。
人胰岛上18亲本池的传代
首先将AAV-2的转导效率与AAV-DJ和AAV-LK03进行比较(图62A)，因为先前未发表的研究显示后两种载体在人胰岛中最为强健(Song等人，ASGCT摘要)。证实此结果(图62A)为用经过改组的衣壳文库进行筛选之前的验证研究提供了基础。AAV衣壳的18亲本池分别以20K和2K的MOI感染到完整和解离的人胰岛上，并用人腺病毒5超感染以复制AAV。连续执行了三轮选择，并在每轮中评估了AAV复制(图51)以及病毒池的组分(图52)。对于第1轮和第2轮选择，在完整胰岛上繁殖后，恢复比输入更低的病毒基因组拷贝数，而复制在第3轮开始。当使用2K的较低MOI感染解离的胰岛细胞时，在胰岛培养后获得的病毒量高于每轮选择的输入量。BC序列的NGS用于评估每一轮AAV的组分。每个样品获得介于400,000与1,000,000之间的读段。某些亲本AAV明显优于其它亲本AAV，因为在一轮选择后，池的多样性已经减少，特别是在使用完整胰岛的情况下(图52)。AAV2、AAV3B以及经过改组的变体DJ和LK03在第一次传代后就已经富集。在完整胰岛上第三次传代后，DJ和LK03被均等地呈现，而在解离的胰岛上第二次传代后，DJ明显占据了病毒池的主导地位，这进一步验证了我们的选择筛选方法。
人胰岛上经过衣壳改组的文库的传代
两个文库用于分别以20K和2K的MOI感染完整的和解离的胰岛，并且Ad5用于复制AAV。每一轮后，通过qPCR评估病毒复制(图51)，并通过BC序列的NGS跟踪变体的富集(图52)。NGS样品大小介于400,000与800,000个序列读段之间。与18亲本池相反，在每一轮选择中均观察到文库的复制，这可能表明某些衣壳序列赋予了改善的向性、转导和/或复制。在18亲本文库的情况下，早在第1轮就选择了不同的衣壳变体。针对10亲本文库，使用两个不同的MOI(10K和50K)对完整胰岛一式两份地执行第二组文库筛选。此外，使用50K的MOI一式三份地执行了另一18亲本文库筛选。此文库筛选的复制数据如图61A所示，BC NGS数据如图61B所示。在此第二组文库筛选期间观察到了类似的复制和富集水平。然而，这次发现一个变体在10亲本文库(变体10B5，以黄色突出显示)的两次独立筛选(MOI 10K B和MOI 50K B)中富集，这表明此特定变体在胰岛中可能具有显著的选择优势。发现不同的变体在18亲本文库(18B2，以品红色突出显示)的一式三份的筛选中的两个筛选中富集。
用于改善胰岛转导的所选AAV衣壳变体的评估
使用BC序列特异性反向引物(图53A)在三轮选择后(关于那些变体的富集数据，参见图52和图61B)从不同的筛选中回收了总共17个富集的衣壳序列，克隆了TOPO，并进行测序。对每个BC的若干克隆进行测序，以确保左BC序列与BC NGS获得的序列匹配。对于衣壳中的若干个衣壳，观察到克隆中的一些克隆的衣壳序列不同，特别是在5'端。这可能是由于不完全延伸后切换模板所致3-5，并且可以通过优化PCR条件和酶来缓解。不认为这是由于衣壳BC连接不充分引起的，因为对输入文库执行了详尽的分析，并且仅发现低水平的文库克隆包含与相同条形码连接的不同衣壳。同样，用两个密切相关的亲本序列进行的实验显示，在扩增过程中确实发生了模板切换(数据未显示)。决定对与共有序列匹配的衣壳进行矢量化处理。发现所有富集衣壳在3'半部分中共享来自AAV3B的巨大贡献，而5'半部分则更加多样化(数据未显示)。尽管3'半部分中的AAV3B序列在输入文库中必定被过度呈现，但其它亲本序列仍然有相当不错的贡献，如桑格和PacBio测序所示。在早期的实验中已经确定，DJ和LK03衣壳以比AAV2或AAV3B衣壳更高的效率转导胰岛(图62A)，因此新型衣壳仅与DJ和LK03相比较。所有17个衣壳变体以及先前建立的最佳胰岛衣壳(LK03)之一用于包装自补AAV载体，其中GFP作为由CAG启动子驱动的转基因。所述衣壳中的三个衣壳未能产生高滴度的rAAV，并且被排除在进一步评估之外。在最初的预筛选中，衍生自rAAV的粗制细胞裂解液用于以低MOI转导解离的胰岛细胞。转导后两天，通过流式细胞术测定GFP表达性细胞的转导效率。虽然多个衣壳变体表现出比AAV-LK03更高的转导效率，但其它变体仅略有改善或根本没有改善(图53B)。三个改善最多的衣壳(10A1、18A1和10A3)全部衍生自第一组文库馆筛选，并且从现在开始被称为KP1、KP2和KP3。那些衣壳用于产生高滴度的双CsCl梯度纯化的rAAV制剂。使用三种不同的MOI用那些变体以及AAV-DJ和AAV-LK03转导解离的胰岛细胞，并通过FACS分析其转导。证实变体以高于最佳亲本的效率转导胰岛细胞(图53C，图62A)。与变体衣壳AAV相比，用AAV-DJ或AAV-LK03转导相同片断的胰岛细胞需要至少高10倍的滴度。下一步是判定新型衣壳是否特异性地靶向α或β细胞。当与AAV-DJ和AAV-LK03相比时，用包装有KP1和KP2衣壳的高MOI的scCAG-GFP载体转导的胰岛的亚群特异性染色显示了改善的β细胞转导，而α细胞转导略有改善(图53D)。此外，由于在此实验中使用完整胰岛，因此证明了当使用足够高的MOI时，新型AAV能够穿透胰岛并转导几乎所有的α和β细胞。
按照最近开发的富集协议，由人胚胎干细胞(hESC)生成β细胞75，并使用三种不同的MOI测试新型衣壳之一与AAV-DJ和AAV-LK03相比的转导效率。在此实验中使用了番茄红表达载体，并对细胞进行β细胞标志物C肽染色(图66，图68)。类似于在患者衍生的胰岛细胞中观察到的情况，需要5到10倍更高滴度的AAV-DJ或AAV-LK03，以在那些细胞中达到与AAV-KP1类似的转导率。应当注意，转导效率是由番茄红表达细胞的百分比和在那些细胞中转导的细胞AAV-KP1的荧光强度两者决定的。
下一步是试图阐明改善的衣壳的常见序列特征。图54A描绘了具有最高的胰岛细胞转导效率的三个改善最多的衣壳氨基酸衣壳序列的交叉分析。虽然衣壳KP1的N-末端部分包含来自许多不同亲本序列的段，但是衣壳KP2和KP3在此序列段中差异较小。然而，如在胰岛筛选过程中所看到的所有富集的衣壳，那些衣壳的一半的大部分C末端衍生自AAV3B，这表明这一段可能包含对胰岛细胞向性至关重要的序列决定因素。AAV3B是与三个新型衣壳最紧密相关的亲本衣壳，与KP1和KP3具有92％的序列一致性并且与KP2具有95％的一致性。当用核苷酸序列执行交叉分析时(图63A)，亲本贡献在大多数情况下与那些针对氨基酸序列发现的非常类似，然而，一些亲本贡献模式不同。例如，在KP2衣壳的情况下，核苷酸位置900周围的区域衍生自AAV-猪2衣壳，而不是氨基酸交叉分析表明的AAV1或AAV6衣壳。Xover程序将始终试图最小化交叉事件的数量。由于氨基酸位置275与313之间的所有亲本序列共享共同的氨基酸序列(图65A)，但具有不同的核苷酸序列，因此，当使用氨基酸序列时，此段被示出为衍生自AAV1或AAV6，但是当使用核苷酸序列执行分析时，其被示出为衍生自AAV6和AAV-猪2。与核苷酸序列相比，氨基酸序列的交叉数也较少。例如，KP1衣壳在核苷酸水平上具有19个交叉，而在氨基酸水平上被减少为15个交叉事件。由于衣壳的功能性由氨基酸序列确定，因此将重点放在氨基酸序列交叉分析上。所有三个改善的衣壳在氨基酸225与267之间的序列段中共享三个对于AAV1和AAV6是独特的残基的事实可能表明这些残基对人胰岛的转导很重要(图54A，图65A)。由于AAP在衣壳基因内使用不同的阅读框，因此也对此蛋白质执行了交叉分析。发现所有三个新型变体均包含嵌合AAP序列(图54B，图65B)。如核苷酸序列交叉分析所见，若干KP2 AAP残基衍生自AAV-猪2。除交叉分析外，还执行了富集分析，证实了所有三个衣壳中某些氨基酸残基的强选择压力(图54C)。在N末端，两个改善最多的变体KP1和KP3示出了对AAV2残基的强选择，而其在C末端共享AAV8衍生的残基。KP2衣壳在位置150与210之间示出了若干AAV2残基的强富集。所有三个衣壳在被描述为是AAV3B的关键HSPG结合位点的位置(图S65A中的位置597)都有精氨酸76。执行了新型变体的预测性三维结构VP3衣壳映射，以示出在衣壳外部显示的那些残基(图5D)。发现所有三个改善的衣壳在VP3高变区(HVR)I(根据77标记)中含有谷氨酸，所述高变区位于衍生自AAV8或AAV-恒河猴10的5倍对称孔(图S65A中的位置330)。AAV3B以及除AAV9hu14以外的所有其它亲本在此位置具有天冬氨酸残基。在所有三个衣壳中共享的另外两个残基是HVR I中的丙氨酸和苏氨酸(图S65A中的位置264和266)。KP1和KP3衣壳在HVR II中也含有表面暴露的残基精氨酸(图S65A中的位置333)，所述残基精氨酸还由亲本衣壳AAV8、AAV9hu14和AAV-恒河猴10共享。另外，KP1和KP3衣壳在HVR VIII与IX之间的可变段中显示了残基天冬氨酸、天冬酰胺、亮氨酸和天冬酰胺，Gao和同事们将其称为HVR 1178(图S65A中的位置660、666、670和671)。在HVR IX中，KP1和KP3衣壳共享AAV8衍生的表面暴露的残基酪氨酸、苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸、天冬酰胺和谷氨酸(图S65A中的位置709、712、713、717、719和721)。KP1衣壳在此位置(图S65A中的位置390)显示了衍生自AAV-猪2的表面暴露甲硫氨酸，而KP3在此位置具有AAV3B衍生的Valin。此外，KP1在位置664处包含衍生自AAV9hu14的丙氨酸，而KP3在此位置具有与AAV3B相同的苏氨酸残基。表面暴露的残基667(赖氨酸)和668(天冬氨酸)衍生自针对KP1的AAV9hu14，而其源自针对KP3的AAV8(谷氨酰胺和丝氨酸)。除了在衣壳表面上显示的残基外，所有三个新型衣壳共享若干埋在衣壳内部的VP3残基(分别位于位置225、234、313和315处的丙氨酸、苏氨酸、精氨酸和天冬酰胺)。这些残基也可能有助于观察到的强转导效率，因为其可能参与了脱壳和其它进入后步骤。
下一步是评估新型衣壳是否能够以与AAV-DJ和AAV-LK03衣壳类似的效率包装自补和单链载体基因组。因此，使用来自CsCl纯化的rAAV制剂的分离载体基因组执行碱性Southern印迹分析(图63B)，并且发现单链CAG-萤火虫荧光素酶基因组以预期的3.7kb大小进行包装(图63B)。当分析包装自补CAG-GFP基因组的rAAV制剂时，发现了4.3kb的条带表示自补的全长基因组，其中两个表达盒在trs缺失的ITR处相接。然而，除了预期的4.3kb产物，观察到约为预期大小一半的条带，其可能表示单链载体(图63C)。其原因可能是，表达具有野生型ATG起始密码子的rep的包装载体用于产生病毒，因为这与产生sc载体时ss基因组包装水平的增加有关。将ATG起始密码子突变为效率较低的ACG起始密码子后，Rep蛋白表达水平较低与ds基因组包装率较高有关(Wu等人，2007)。79而且，转染后超过52小时的温育时间被描述为增加双链(ds)向单链(ss)基因组的逆转(Gray等人，2011)。80然而，对于目前的研究，重要的是要注意新型变体以及AAV-DJ和AAV-LK03的全长基因组以及较短基因组的包装效率相等。因此，改善的新型衣壳的转导效率不能归因于全长功能基因组的包装增加。此外，衣壳蛋白变体由所有三个衣壳蛋白VP3、VP1和VP2以10:1:1的预期化学计量比组成(图63D)。
一组不同的细胞系上的转导效率的评估
用包装有两个亲本(DJ，LK03)和三个进化衣壳(KP1，KP2，KP3)的单链萤火虫荧光素酶rAAV载体以1K的MOI转导了若干衍生自人类和动物来源的原代细胞和细胞系，并使用荧光素酶测定分析其转导效率。AAV-LK03不能有效地转导鼠类细胞，而AAV-DJ可以高效转导所有细胞系。与AAV-DJ相比，新型变体在人胰岛细胞、293、Hela、HuH7、R7T1、αTC1、HepG2、CHO K1、人肌肉干细胞、小鼠成肌细胞、SNU 737以及FRhK-4细胞上示出了改善的转导效率(图55A，图64A)。通常，AAV-KP1示出了最高的增强程度。与DJ相比，新型衣壳变体的转导在人角质形成细胞、分化的人成肌细胞以及原代小鼠胚胎成纤维细胞上没有改善或仅略有改善。
新型衣壳变体的中和性质
通过两个不同批次的汇集的人免疫球蛋白分析了新型衣壳变体以及AAV-DJ和AAV-LK03对中和的敏感性(图55B)。对每个样品进行七个生物学重复的实验，分为两个独立的实验。尽管AAV-DJ示出了对中和的最高抗性，50％的抑制需要约120ug/ml IVIG，但AAV-LK03非常敏感，仅用约15ug/ml就达到了50％的中和。AAV-KP2具有与AAV-LK03类似的中和性质，而AAV-KP1和AAV-KP3需要更多的IVIG进行中和(KP3为45ug/ml，KP1为55ug/ml)。总而言之，当使用汇集的人IVIG进行中和时，新型变体衣壳中的两个衣壳的性能优于AAV-LK03，但不如AAV-DJ有利。
AAV-KP变体在小鼠体内的生物分布
向小鼠静脉注射每只小鼠2E10 vg的萤火虫荧光素酶载体rAAV，所述载体包装有AAV8、AAV-DJ以及AAV-KP1、KP2和KP3衣壳，并通过活体成像在数周内监测转基因表达(图56，图64A)。发现大多数AAV靶向肝。AAV-KP1似乎比AAV-DJ更快地转导小鼠肝，但是一旦在稍后的时间点达到稳态表达，表达水平仅稍高。注射后三十五天，从每只小鼠中采集若干器官并分析其荧光素酶表达。除肝外，在每组小鼠中检测到非常低的表达水平和较高的变异(图64B)。注射AAV-KP2以及AAV-KP3的小鼠在心脏组织中的荧光素酶表达高于注射AAV-DJ或AAV8的小鼠，并且所有三个变体都比DJ或AAV8高效地转导了脾脏。来自KP变体AAV注射的小鼠的肾脏组织也具有比来自AAV-DJ注射的小鼠的荧光素酶表达更高的荧光素酶表达，但是当与AAV-8注射的小鼠相比时，其水平没有显著更高。使用qPCR在器官中定量载体基因组。然而，仅在肝样品中检测到明显高于背景的载体基因组拷贝(图64C)。注射AAV-KP1的小鼠比接受AAV-DJ或AAV-8包装的载体的小鼠具有更高的载体拷贝数。注射AAV-KP3的小鼠比注射AAV8的小鼠肝中含有更多的载体基因组。然而，注射AAV-KP2的小鼠与注射AAV8的小鼠含有类似水平的rAAV基因组。
在体内评估异种移植肝模型中功能性肝细胞的转导
转导了人源化FRG异种移植小鼠以评估在适当的体内环境中经过改组的衣壳之一的功能性人肝转导能力。如高水平人白蛋白(介于5.6与8mg/ml之间)的表达所示，小鼠被人肝细胞高度再繁殖。通过静脉注射以1E11微克/小鼠的剂量向人源化小鼠施用包装有DJ、LK03或KP1衣壳的番茄红表达rAAV，并在AAV施用后14天评估人和小鼠肝细胞中番茄红蛋白的表达(图57)。观察到LK03在人肝细胞中具较有高的转导效率，但是在小鼠肝细胞中没有，而用DJ转导对人细胞不是特异性的。还发现KP1可以转导人和小鼠肝细胞，然而水平高于那些用DJ转导的。在四只注射AAV-KP1的小鼠中有三只小鼠对人肝细胞的转导效率与在注射AAV-LK03的小鼠中发现的类似。然而，注射AAV-KP1的小鼠的总转导率较高，因为与AAV-LK03不同，AAV-KP1既转导小鼠细胞又转导人细胞。
讨论
在当前研究中鉴定的新衣壳在转导人胰岛细胞，特别是β细胞方面效率至少高10倍。当测试变体之一对hESC衍生的β细胞的转导效率时，达到了类似水平的改善。另外，已证实先前的观察，衣壳变体AAV-DJ和AAV-LK03能够以与AAV2或AAV3B相等或比其更好的效率转导人胰岛。然而，需要高MOI以有效靶向胰岛中心内的细胞，并且β细胞转导的效率不如α细胞。
最近有几项研究已使用小鼠的逆行胰腺导管内递送安全有效地将rAAV载体施用于胰腺49、81、82。发现过表达或抑制若干转录因子可有效地将胰岛祖细胞和定型胰岛α细胞转化为β细胞50、52-58。内镜逆行胰胆管造影术(ERCP)常规地用于检查患者的胰管和胆管，并且可以用于递送治疗糖尿病的新型载体。
详细描述了生成带条形码的经过衣壳改组的AAV文库的方法，以便其它研究人员可以在其自己的实验室中容易地应用此协议，或者用来自AAV或任何其它病毒的基因来生成可以筛选期望性质的文库。除了用于文库生成的协议之外，还描述了包含亲本AAV的池的生成，所述亲本AAV被证明在传代方案期间可用作亲本对照。此池可以用于优化选择参数的任何文库选择以分离具有期望性质的AAV衣壳。通过为特定筛选预先确定适当的MOI和选择轮数，可以将成本和时间降到最低。与申请人实验室中常规采用五轮选择的研究相反，在当前的研究中，发现三轮选择足以富集和扩增变体，其中转导提高到所述变体可以可靠分离的水平。
另外，将短DNA条形码和单分子DNA测序方法结合起来将使人们能够优化其它重要参数，如在选择过程中使用的最佳MOI，以及有效富集所需的筛选轮数。当通过转染从质粒文库生成AAV文库时，应注意不要通过将AAV质粒DNA的量减少到与以前的病毒产生协议相比几乎少20倍来使具有文库质粒DNA的细胞过载。据报道，每个细胞5000个AAV基因组的转染拷贝数足够低，以最小化交叉包装，同时仍然实现高滴度的文库。83虽然不能排除以包装衣壳与对应病毒基因组之间的序列差异为表征的交叉包装的可能性，但从我们的筛选中发现了若干富集的衣壳表现出期望的表型，这表明交叉包装或嵌合现象并不是我们文库的主要问题。此外，以前在转染过程中使用高浓度AAV质粒生成的AAV文库成功生成了表型8、37-39极大地改善的变体，这表明在AAV包装11的情况下，由于迄今未知的原因，似乎存在强衣壳基因型连锁。
当筛选人胰岛上的文库时，富集了若干衣壳序列，其中三个衣壳序列不仅对人胰岛，而且对多种其它细胞类型都具有改善的转导效率。虽然尚不清楚新型衣壳中的哪些氨基酸残基负责改善胰岛的表型，但在改善的衣壳序列中发现了若干特征，这些特征可能赋予胰岛细胞以及其它细胞类型增强的转导。所有三个改善的衣壳的C末端部分都富含AAV3B残基，这表明这些氨基酸可能对胰岛向性发挥重要作用。在N末端，这两个改善最多的变体KP1和KP3示出了对AAV2残基的强大选择，并且所有三个衣壳在位置265处均含有源自AAV1或AAV6的苏氨酸(图65A)。所有三个衣壳在位置594处(图65A中的位置597)都有一个精氨酸，所述位置已被描述为是AAV3B的关键HSPG结合位点6(Lerch和Chapman)。
有趣的是，尽管KP1与AAV3B和AAVLK03具有相似性，但其在人源化肝小鼠模型中转导小鼠肝细胞以及人肝细胞。此人源化模型以前曾用于选择几种高度人肝AAV转导载体(Lisowski Paulk)37、39，其中一种已在早期人类试验中证明能提供强健的hFVIII表达84、85。然而，在先前的筛选中选择的所有载体示出了小鼠组织或细胞在体外和体内的转导较差。相反，KP1变体在嵌合小鼠模型中示出了类似的人肝细胞转导，但与AAVLK03相反，示出了小鼠肝的有效转导这很有趣，因为一些人认为在此小鼠模型中人肝细胞的转导被夸大了，因为小鼠细胞的转导相对较低。如果在人源化小鼠模型中获得的人肝细胞结果受到小鼠肝细胞转导程度的影响，那么在人体试验中进行测试时，KP1变体可能会提供更强大的转导。因为此载体至少能转导小鼠和人的肝，所以不需要临床前试验的替代衣壳。最终，这些衣壳是基于人类临床肝的基因疗法试验未来研究的良好候选物。
Grimm小组最近的一份报告消除了人们的担忧，即针对定向进化研究生成的AAV衣壳文库的功能可能会因大部分嵌合变体池中的组装激活蛋白(AAP)失活而受到严重损害86。AAP以前曾被描述为在病毒组装中发挥重要作用9，87-89，但似乎对重组有惊人的耐受性。之前对来自其它经过改组的文库的随机衣壳的包装效率进行了测试，发现令人惊讶的是，绝大多数衣壳产生正常或仅轻微降低的rAAV滴度，这表明随机AAP序列在大多数情况下是无害的。本研究中选择的所有嵌合体的AAP序列都是嵌合的，并且用所述衣壳中的两个衣壳获得的rAAV滴度低于用LK03获得的rAAV滴度。在病毒产生过程中供应野生型AAP病毒并未被评估是否会提高滴度，但这有可能提高rAAV的产量。
发现将条形码文库用于分子进化研究是非常有益的，因为对富集变体的条形码进行高通量分析比对整个衣壳进行克隆和测序更具成本效益且更彻底。针对本研究生成的文库目前在许多其它靶细胞的筛选中进行评估，并且可能导致发现对其它临床基因疗法应用有用的其它AAV衣壳变体。
方法：
含有独特条形码序列文库的AAV载体的生成。使用其中衣壳编码序列被含有PacI和AscI的接头片段(由德国海德堡大学的D.Grimm和S.Grosse友情提供)置换掉的野生型AAV2载体作为用于构建带条形码的AAV文库的起始材料。通过使原始序列中的两个核苷酸(当对cap polyA信号的最后一个核苷酸进行计数作为起点时，位置6和24处的A到T和T到C)发生突变，将两个独特的限制位点(AgeI和EagI)引入到cap polyA信号的正下游。生成由20nt长的间隔序列分隔开的具有12个随机核苷酸的两个段组成的条形码，如前所述73。简而言之，将在5'端具有AgeI限制位点序列、随后是12个随机核苷酸和20nt长的间隔序列(CTAAAC CGG TNN NNN NNN NNN NAC GGA AAT ACG ATG TCG GGA)的寡核苷酸退火到在5'端含有Eag I位点、随后是12个随机核苷酸以及反义间隔序列(TTC TCG GCC GNN NNN NNN NNNNTC CCG ACA TCG TAT TTC CGT)的寡核苷酸，并使用缺乏核酸外切酶活性的克列诺聚合酶(NEB)进行延伸。将片段使用Qiaquick PCR纯化试剂盒(凯杰公司(Qiagen))纯化，并且随后用AgeI和EagI消化并使用Qiaquick PCR纯化柱进行纯化。将载体用相同的限制酶消化、去磷酸化、用苯酚-氯仿纯化并用乙醇沉淀。通过首先建立若干连接反应并用引物rightF(CGCGCC ACT AGT AAT AAA C)和QSeqRev(TAG AGC AAC TAG AGT TCG)执行菌落PCR测试可能的多个条形码插入物，评估最佳载体:插入物比。对于按比例放大反应，将条形码与载体以30ul的总体积以1:2.5的载体:插入物摩尔比连接、根据说明书使用Strataclean树脂进行脱盐(安捷伦科技公司(Agilent Technologies))并以2ul等分试样电穿孔到DH10B-MegaX细胞中(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher))。汇集经过电穿孔的细胞并将其用于接种500mlLB-Amp培养基。平板接种等分试样以评估文库大小和多样性。在37℃振荡器中16小时后，采集细菌，并使用Megaprep试剂盒(凯杰公司)分离质粒DNA。通过用XmaI和AhdI消化来证实ITR完整性。对来自测试板的若干单独的克隆进行测序以评估条形码多样性。
经过衣壳改组的带条形码的AAV文库的生成。DNAse I介导的家族改组基本上是如前所述执行的25、90、91。使用来自16种AAV血清型(AAV1、AAV2、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9hu14、AAV12、AAV恒河猴10、AAV猪1、AAV猪2、AAV牛、AAV小鼠1、AAV禽类、AAV山羊1)以及来自在先前的筛选8、37中选择的经过改组的变体AAV DJ和AAV LK03的衣壳序列作为用于改组反应的亲本序列。衣壳序列是从各种来源(德国海德堡大学D.Grimm、凯实验室(Kaylab)、斯坦福载体核心(Vector Core)、斯坦福)获得的。所有序列均含有紧邻cap的5'的PacI位点和紧邻cap的3'的AscI位点并且已被克隆到pBluescript中。在改组之前，使用位于两侧pBluescript序列中的引物分别扩增衣壳序列(外部F：AAT TAA CCC TCA CTA AAGG，外部R：GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C)。使用Phusion热启动Flex聚合酶(NEB)进行扩增，并采用25个PCR循环(30秒98℃，25个10秒98℃循环，15秒56℃，1分钟15秒72℃，随后是10分钟72℃)。使用Qiaquick PCR纯化试剂盒(凯杰公司)来纯化PCR产物，将所有18个衣壳(对于18亲本文库)或10个衣壳(对于10亲本文库，AAV1、AAV2、AAV3B、AAV6、AAV8、AAV9hu14、AAV12、AAV恒河猴10、DJ、LK03)以等摩尔比汇集，并在室温(RT)下使用DNase I(西格玛公司(Sigma))片段化。在不同的温育时间点，在1.5％琼脂糖凝胶上分析等分试样，同时通过在干冰/乙醇浴中温育来暂时终止反应。调节温育时间和DNAse浓度，直到大多数片段的范围为100bp到500bp。然后将整个反应加载到1.5％琼脂糖凝胶上，并且从凝胶电洗脱出期望大小范围内的片段、使用两轮苯酚-氯仿对片段进行纯化、随后通过一轮氯仿纯化来进行纯化并用乙醇沉淀。然后使用Phusion热启动Flex聚合酶和以下循环条件在无引物的PCR中重新组装DNA片段：30秒98℃，40个10秒98℃循环，30秒42℃，45秒72℃，随后是10分钟72℃。
使用引物rescueF(GTC TGA GTG ACT AGC ATT CG)和rescueR(GTC TAC TGA AGCTCA CTG AG)以及以下循环条件从组装反应扩增全长衣壳序列：30秒98℃，25个10秒98℃循环，15秒57℃，1分钟15秒72℃，随后是10分钟72℃。用新鲜的PCR混合物将扩增子稀释4倍，并另外进行一个延伸10分钟的循环以填满末端。使用PCR纯化试剂盒(凯杰公司)浓缩PCR产物后，将所述产物用PacI和AscI消化并连接到已用PacI、AscI处理过的BC文库载体中、去磷酸化并用苯酚-氯仿纯化。使用Strataclean树脂对连接反应进行脱盐、将其电穿孔到MegaXDH10B细胞中并如上所述在液体培养基中扩张以生成BC文库载体。平板接种转化细胞的等分试样，以使用桑格测序评估文库的文库大小和多样性。使用引物capF(TGG ATG ACT GCATCT TTG AA)、capF2(ATT GGC ATT GCG ATT CC)和QSeqRev(TAG AGC AAC TAG AGT TCG)对10亲本文库的40个克隆和18亲本文库的20个克隆进行测序。
使用磷酸钙转染方法在HEK 293T细胞中生成AAV库。与常规方案相比，经过转染的文库质粒DNA的量减少了近20倍，达到每个细胞大约5000个拷贝，以将AAV产生期间发生交叉包装事件的可能性降至最低。简而言之，在转染前两天，在40ml培养基中以每烧瓶8E06个细胞接种25个T225烧瓶。转染当天，汇合的细胞介于80％到90％之间。转染前1.5小时，将每烧瓶20ml培养基替换为新鲜的培养基，并以每T225中4ml 300mM CaCl2制备40ug pAd5辅助质粒和2ug文库质粒的混合物。将等量的CaCl2/DNA混合物和2xHBS(280mM NaCl，50mMHEPES pH 7.28，1.5mM Na2HPO4，pH 7.12)混合，并向每个烧瓶中加入8ml混合物。3天后，将细胞用每个烧瓶0.5ml 500mM EDTA进行分离，并且将细胞团块重新悬浮于Benzonase消化缓冲液(2mM MgCl2，50mM Tris-HCl，pH 8.5)中。通过使AAV进行三个冻融循环来将AAV从细胞中释放出来，通过用Benzonase(200U/ml，1小时37℃)消化来去除非衣壳化DNA，通过离心来沉淀细胞碎片，随后进行上清液的另一个CaCl2沉淀步骤(最终浓度为25mM，在冰上1小时)以及使用8％PEG-8000和625mM NaCl的最终浓度进行AAV沉淀步骤。将病毒重新悬浮于HEPES-EDTA缓冲液(50mM HEPES，pH 7.28，150mM NaCl，25mM EDTA)中，并与CsCl混合至最终耐火指数(RI)1.371，随后在超速离心机中以45000Rpm离心23小时。在用18号针刺穿离心管底部后收集级分，并且汇集RI范围为1.3766到1.3711的级分并用HEPES-EDTA重悬浮缓冲液调整到RI为1.3710。第二CsCl梯度离心步骤以65000Rpm进行至少8小时。收集级分，并且将RI为1.3766到1.3711的级分针对PBS透析过夜，随后对新鲜PBS进行另一次4小时透析并且在PBS中针对5％山梨糖醇透析2小时。所有透析步骤均在4℃下进行。从透析盒中回收病毒，并添加普朗尼克F-68至最终浓度为0.001％。将病毒无菌过滤、等分并以等分试样储存在-80℃下。使用MinElute病毒旋转试剂盒(凯杰公司Cat#57704)从10ul纯化病毒中提取基因组DNA，并且使用AAV2 rep基因特异性引物探针组(repF：TTC GAT CAA CTA CGC AGACAG，repR：GTC CGT GAG TGA AGC AGA TAT T，rep探针：TCT GAT GCT GTT TCC CTG CAGACA)通过qPCR来测定病毒基因组滴度。
带条形码的亲本AAV池的生成。使用PacI和AscI限制位点将来自所有18亲本AAV的衣壳克隆到BC文库载体中。每个亲本AAV都含有如通过序列分析证实的独特的条形码序列，并且用每个亲本AAV(每T225 37.5ug AAV质粒和37.5ug pAd5辅助质粒)转染具有293T细胞的2到6个T225。生成每个带条形码的亲本cap AAV的粗制裂解物，并汇集2.8E12 vg的10个亲本或1.1E12 vg的18个亲本，以分别生成10亲本和18亲本混合物。通过双CsCl梯度离心来纯化AAV池，如上所述。
进化的AAV衣壳的序列贡献分析。使用Sequencher 5.3软件组装重叠群，并比对Muscle多序列比对软件(MacVector，版本14.5.3)。使用Xover 3.0DNA/蛋白质改组模式分析软件生成经过改组的变体的亲本片段交叉图。如图所示，每种亲本血清型都用颜色编码。
AAV池和文库的PacBio测序。对于10亲本文库和18亲本池，使用capF和QSeqRev从提取的病毒基因组扩增含有衣壳和BC序列的2.4kb片段、将其加载到1％琼脂糖凝胶上、通过用SybrSafe染色进行可视化并使用凝胶提取试剂盒(凯杰公司)进行凝胶纯化。还在质粒水平上评估10亲本文库，之后使用限制酶(PacI和XbaI)释放衣壳序列来生成AAV文库，并如上所述对所述文库的扩增的衣壳序列进行凝胶纯化。在华盛顿大学PacBio测序服务中心执行文库制备和太平洋生物科学公司(Pacific Biosciences)(PacBio)测序。简而言之，SMRTbell文库是根据PacBio的“程序和清单——2kb模板制备和测序”方案使用SMRTbell模板制备试剂盒v1.0(PacBio Cat#100-259-100)制备的。使用PacBio‘结合和退火’计算器来测定用于SMRTbell文库的退火和结合的合适浓度。将SMRTbell文库退火并与P6 DNA聚合酶结合，以用于使用DNA/聚合酶结合试剂盒P6 v2.0(PacBio Cat#100-372-700)进行测序。使用标准MagBead方案和MagBead缓冲液试剂盒v2.0(PacBio Cat#100-642-800)将结合的SMRTbell文库加载到SMRT细胞上。DNA测序试剂盒4.0v2(PacBio Cat#100-612-400，也称为P6/C4化学)遵循标准的MagBead测序方案。在未启用‘阶段开始(Stage Start)’的情况下，收集测序数据持续6小时影片时间(movie time)。使用PacBio SMRT portal和RS_ReadsOfInsert.1方案生成循环共有序列(CCS)读段，其中过滤被设置为最小全通＝3并且最小预测准确度＝95％。
PacBio序列读段的生物信息学评估。下游生物信息学分析中包含衣壳序列全长为2,250-2,380个核苷酸的CCS读段。CCS读段中的插入缺失使用内部算法进行校正，所述内部算法首先使用Xover 3.0DNA/蛋白质改组模式分析软件评估亲本片段一致性。一旦测定了每个交叉片段的亲本一致性，就使用此信息来确定插入缺失进行校正。维持不导致插入缺失的单核苷酸多态性(SNP)。PacBio平台的SNP错误率为1.3-1.7％。假定高于此比率范围的SNP频率是从新生突变产生的。然后将FASTA格式的经过校正的序列与MUSCLE进行比对。在RAxML12133中使用最大似然法进行系统发育分析(Stamatakis等人，2005)。
伪色结构衣壳映射。(图54D)使用UCSF嵌合体版本1.12将嵌合体衣壳(仅VP3序列)伪色映射到AAV2 VLP结构5IPI上(Drouin等人，2016)。映射的颜色对应于在亲本片段交叉图中使用的亲本血清型颜色。衣壳外部视图表示出了所有链，而横截面视图去除了在5倍对称轴处围绕圆柱的链从而暴露出衣壳内腔。
替代性伪色结构衣壳映射。(图54E)使用PyMOL版本2.3.0将嵌合衣壳(仅VP3序列)伪色映射到AAV6结构4V8694上。仅示出了与最接近的亲本AAV3B不同的表面暴露的氨基酸。除以灰色示出的AAV3B外，所有映射的氨基酸残基颜色都对应于交叉和富集图中使用的亲本血清型颜色。
保守和富集计算。使用利用MacVector版本14.5.3获得的比对曲线计算每个位置的氨基酸保守。计算了有30个氨基酸残基的段的平均保守值，并将其用于生成曲线图。使用内部算法测定亲本保守百分比，所述算法鉴别出经过改组的文库中每个经过比对的位置上的每个亲本的百分比。最大平方大小表明100％的变体共享来自所述位置的所述亲本的所述氨基酸。所有其它平方大小与从所述亲本开始在所述位置具有所述氨基酸的变体的百分比0-100％成比例。基于最大似然通过比较来自亲本血清型的序列来计算每个嵌合体的序列中的每个氨基酸位置的富集得分。使用Xover版本3.0.74来生成每个嵌合体的交叉数据分析集。使用Excel版本16.20将那些数据转化为富集得分。用不同的颜色描绘文库亲本，如所示出的。
统计。用Prism v7.0d进行统计分析。使用Tukey多重比较测试经由双向ANOVA评估实验值。P值<0.05被认为具有统计学意义。
AAV条形码的高通量测序。将条形码序列用索引的引物(F：AAT GAT ACG GCG ACCACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T(I)CGC GCC ACT AGTAAT AAA C和R：CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT CGG TCT CGG CAT TCC TGC TGA ACCGCT CTT CCG ATC T(I)TAG AGC AAC TAG AGT TCG，其中索引(I)包含4到6个核苷酸)进行扩增、从2％含有SybrSafe的琼脂糖凝胶中进行凝胶纯化、汇集(最多30个样品)并在MiSeq仪器上测序。PCR循环次数被最小化以避免扩增偏倚并且取决于如通过rep qPCR测定的输入AAV基因组的浓度。使用以下循环条件：2分钟98℃，15到30个15秒98℃循环，15秒50℃，20秒72℃，最后在72℃下延伸15分钟。使用Phusion热启动Flex(NEB)用于所有扩增。
细胞培养条件
人胰岛培养物。来自已故非糖尿病器官供体的人胰岛由综合胰岛分布计划(IIDP)或阿尔伯塔大学通过斯坦福胰岛研究中心提供，并在CMRL-1066中用10％FBS、青链霉素、1％胰岛素转铁蛋白硒(赛默飞世尔公司)、1mM丙酮酸钠、2mM谷氨酰胺、2.5mM HEPES一起培养。使用超低附着培养皿进行所有胰岛细胞培养实验。
hESC衍生的β细胞：Mel1 INSGFP/W人胚胎干细胞(hESC)从S.J.Micallef和E.G.Stanley(澳大利亚蒙纳士免疫学和干细胞实验室(Monash Immunology and StemCell Laboratories))获得。细胞在hESC培养基[含10％KSR(Gibco)，10ng/ml FGF-2的DMEM/F12(Gibco)(R&D系统公司)]中的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上维持和繁殖。按照之前描述的方案，针对β细胞进行hESC的逐步分化75。简而言之，使用TrypLE(Gibco)将汇合的hESC解离为单细胞悬浮液，进行计数，并以每孔5.5×106个细胞接种在5.5ml hESC培养基中的6孔悬浮板中，所述培养基中补充有10ng/ml激活素A(R&D系统公司)和10ng/ml调节蛋白B(派普泰克公司(Peprotech))。在37℃和5％CO2下以100rpm在定轨振荡器上温育平板，以诱导3D球体形成。24小时后，用PBS洗涤球体，并重悬于第1天的培养基中。从第1天到第20天，培养基每天都在变化。培养基组分如下：第1天：含有0.2％FBS、1:5,000ITS(Gibco)、100ng/ml激活素A和50ng/ml WNT3a的RPMI(Gibco)(R&D系统公司)。第2天：含有0.2％FBS、1:2,000ITS和100ng/ml的激活素A的RPMI。第3天：含有0.2％FBS、1:1,000ITS、2.5μM TGFbiIV(CalBioChem公司)和25ng/ml KGF(R&D系统公司)的RPMI。第4-5天：含有0.4％FBS、1:1,000ITS和25ng/ml KGF的RPMI。第6-7天：具有25mM葡萄糖的DMEM(Gibco)，所述葡萄糖含有1:100B27(Gibco)和3nM TTNPB(西格玛公司)。第8天：具有25mM葡萄糖的DMEM，所述葡萄糖含有1:100B27、3nM TTNPB和50ng/ml EGF(R&D系统公司)。第9-11天：具有25mM葡萄糖的DMEM，所述葡萄糖含有1:100B27、50ng/ml EGF和50ng/ml KGF。第12-20天：具有25mM葡萄糖的DMEM，所述葡萄糖含有1:100B27、1:100谷氨酰胺(Gibco)、1:100NEAA(Gibco)、10μm ALKiII(Axxora)、500nM LDN-193189(Stemgent)、1μm Xxi(密理博(Millipore))、1μm T3(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))、0.5mM维生素C、1mM N-乙酰半胱氨酸(西格玛奥德里奇公司)、10μM硫酸锌(西格玛奥德里奇公司)和10μg/ml硫酸肝素。在第20天，收集球体，与Accumax(创新细胞技术)一起在37℃下温育10分钟，并且解离成单独的细胞。高GFP活细胞以低流速在Aria II上进行分选，并在Aggrewell-400(干细胞技术公司(StemCellTechnologies))中以每簇1,000个细胞在含有10％FBS、1:100谷氨酰胺(Gibco)、1:100NEAA(Gibco)、10μm ALKi II(Axxora)、0.5mM维生素C、1μM T3(西格玛奥德里奇公司)、1mM N-乙酰半胱氨酸(西格玛奥德里奇公司)、10μM硫酸锌(西格玛奥德里奇公司)和10μg/ml硫酸肝素的CMRL中重新聚集。在第23天，将重新聚集的富集β簇(eBC)从Aggrewells转移并以100rpm置于定轨振荡器上，并进一步培养6天。重新聚集后，每三天更换一次培养基。
人骨骼肌干细胞和肌管培养物。从6个单独的供体(斯坦福大学G.Charville的捐赠)中分离的原代肌肉干细胞的池在早期传代时冷冻，并使用等分试样进行实验。在含有1％青霉素/链霉素的DMEM中以1:500的细胞外基质蛋白(西格玛公司)涂敷板。hMuSC培养基是DMEM:MCDB培养基的1:1混合物，其补充有20％FBS、1％胰岛素转铁蛋白硒、1％抗生素/抗真菌药和10μM p38i(细胞信号技术Cat#SB203580)，用于维持如所描述的干细胞状态95。用于将原代hMuSCs分化为肌管的培养基缺乏p38i，并且包含2％马血清饥饿而不是20％的FBS持续7天。所有培养基每两天更换一次。
小鼠骨骼肌成肌细胞培养物。野生型C2C12小鼠成肌细胞(ATCC Cat#CRL-1772)保存在补充有10％FBS和1％抗生素/抗真菌剂的DMEM中。
293和293T细胞系培养物。在具有10％FBS、2mM谷氨酰胺、1％抗真菌抗生素、11mMHEPES pH 7.28和1mM丙酮酸钠的DMEM中培养HEK 293细胞(ATCC Cat#CRL-1573)和HEK293T细胞(ATCC Cat#CRL-3216)。
HeLa细胞培养物。在具有10％FBS、2mM谷氨酰胺、1％抗真菌抗生素的DMEM中培养HeLa细胞(ATCC Cat#CCL-2)。
小鼠胰腺β细胞培养物。在具有10％FBS、2mM谷氨酰胺、1％抗真菌抗生素、1ug/ml强力霉素的DMEM中培养R7T1细胞(斯坦福大学H.Moeller捐赠)。
小鼠胰腺α细胞培养物。在具有10％FBS、2mM谷氨酰胺、1％抗真菌抗生素、15mMHEPES，0.1mM NEAA的DMEM中培养αTC1克隆6细胞(ATCC Cat#CRL-2934)。
大鼠肝癌细胞培养物。在具有10％FBS、4mM谷氨酰胺、1％抗真菌抗生素的DMEM中培养H4TG细胞(ATCC Cat#CRL-1578)。
人肝癌细胞培养物。在具有10％FBS、2mM谷氨酰胺、1％抗真菌抗生素、1％非必需氨基酸的RPMI中培养SNU-387细胞(ATCC Cat#CRL-2237)和HepG2(ATCC Cat#HB-8065)。在具有10％FBS、2mM谷氨酰胺、1％抗真菌抗生素、1％非必需氨基酸的DMEM中培养HuH7细胞。
人角质形成细胞培养物。在具有10％FBS、2mM谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素的DMEM中培养HaCaT细胞(斯坦福大学A.Oro捐赠)。
仓鼠卵巢细胞培养物。在具有10％FBS、1％青霉素/链霉素的Ham's F12中培养CHO-K1细胞(ATCC Cat#CCL-61)。
恒河猴猕猴肾细胞培养物。在具有10％FBS、2mM谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素的DMEM中培养FRhK-4细胞(ATCC Cat#CRL-1688)。
小鼠成纤维细胞培养物。在具有10％FBS、2mM谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1％抗真菌抗生素、55uMβ巯基乙醇的DMEM中培养衍生自E14的原代小鼠胚胎成纤维细胞。
人胰岛上的AAV文库的选择。在AAV感染前，将胰岛放在10cm培养皿中，用10ml完全培养基回收过夜。感染前，使用Accumax将胰岛完整感染或解离成单细胞悬浮液(每1000个胰岛当量[IEQ]1ml Accumax)。将大约300IEQ或1.7E05分散胰岛细胞接种在超低附着24孔板的多个孔中，以18亲本AAV混合物或AAV文库的各种MOI感染，并在37℃保温箱中温育6小时。在用PBS洗涤两次以去除剩余的输入病毒后，用从ATCC获得的人腺病毒5(Cat#VR-5)对细胞进行超感染。对于完整胰岛，使用8E07 PFU，对于解离的胰岛，将4E07 PFU细胞添加到每孔1ml培养基中。在37℃下4天后，采集细胞和上清液，进行3次冻融循环，并在65℃下温育30分钟以使Ad5失活。通过离心(2分钟，10,000xg)去除细胞碎片，并从100ul澄清的上清液中分离出病毒基因组，使用rep引物-探针组通过qPCR进行滴定。对于随后的几轮传代，如果达到足够高的滴度，则使用与初始感染类似的MOI。当滴度较低时，用于感染的最大容量为200ul。
载体质粒。通过替换质粒pscAAV-GFP(John T Gray捐赠，Addgene，Cat#32396)中的CMV启动子来生成在CAG启动子(pscAAV-CAG-GFP，Addgene，Cat#83279)的控制下表达GFP的自补rAAV载体，其中CAG启动子衍生自pAAV-CAG-GFP(Edward Boyden捐赠，Addgene，Cat#37825)。在CAG启动子的控制下表达萤火虫荧光素酶的单链rAAV载体(pAAV-CAG-FLuc，Addgene，Cat#83281)是通过用从质粒pAAV-EF1α-FLuc-WPRE-HGHpA(Addgene，Cat#87951)获得的萤火虫荧光素酶序列替换质粒pAAV-CAG-GFP中的GFP序列而生成的。表达密码子多样化番茄红的单链rAAV载体是Edward Boyden捐赠的(pAAV-CAG-tdTomato，Addgene，Cat#59462)。
富集的AAV衣壳序列的回收和评估。在第三轮选择之后，使用引物capF和在其3'端包含相应BC特异性序列的反向引物从病毒基因组扩增衣壳序列。选择右侧的BC包含在引物序列中，使得左侧的BC作为期望变体的特异性扩增的对照。根据病毒滴度和病毒池中特定变体的频率调整PCR循环数。使用以下扩增参数：2分钟98℃，25到30个15秒98℃循环，20秒61℃，2分钟72℃，最后在72℃下延长10分钟。对PCR产物进行凝胶纯化，TOPO克隆，并进行测序。对每个BC的若干克隆进行测序，以确保左侧BC序列与通过BC NGS获得的序列匹配。对于衣壳中的若干衣壳，观察到克隆中的一些的衣壳序列不同，特别是在5'端。这可能是由于不完全扩展后的模板切换96-98，并且可以通过优化PCR条件和酶来缓解。使用与共有序列匹配的衣壳序列通过磷酸钙三重转染来包装自补CAG启动子驱动的GFP表达载体。对于每个T225烧瓶，使用25ug sc CAG-GFP转移载体、25ug包装质粒和25ug pAd5辅助质粒。生成粗制细胞裂解物，使用GFP特异性引物探针组通过qPCR确定rAAV滴度，并使用1K的MOI测试解离的人胰岛细胞的转导效率。转导后48小时，通过用Accumax温育，随后用分散酶处理，重新聚集的伪胰岛被解离为单细胞悬浮液。使用BD FACS Calibur仪器评估GFP表达性细胞的数量，并使用FlowJo软件版本10来分析和绘制数据。所选衣壳变体用于生成包装不同表达载体的CsCl梯度纯化的载体制剂。
通过碱性Southern印迹分析包装的载体基因组。执行碱性Southern印迹分析，以使用标准方法分析包装在rAAV衣壳中的DNA的大小。简而言之，碱性加载缓冲液(50mMNaOH，1mM EDTA，3％Ficoll，0.025％溴甲酚，0.042％二甲苯)中的1E09病毒基因组被加载到具有50mM NaOH，1mM的1％碱性琼脂糖凝胶上作为运行缓冲液。凝胶在40mV下于4℃下运行24小时，12小时后进行一次缓冲液交换。凝胶印迹后，将膜与10ug/ml鲑鱼精DNA在PerfectHyb加杂交缓冲液(西格玛公司)中在65℃下通过旋转预杂交2小时。添加含有GFP或FLuc序列的300nt长32的P标记探针，并在65℃下通过旋转杂交。膜在低严格条件下洗涤两次(2×柠檬酸钠盐，在65℃下洗涤20分钟)，随后在高严格条件下洗涤一次(2×柠檬酸钠盐与0.1％SDS，在65℃下洗涤30分钟)。将膜暴露于磷光成像仪屏幕上，并使用个人分子成像仪(Biorad)进行可视化。使用QuantityOne软件执行图像分析。
通过蛋白质印迹分析衣壳蛋白。使用标准方法和设备执行蛋白质印迹分析。简而言之，使用MOPS运行缓冲液在4-12％的NuPAGE Bis-Tris凝胶(生命技术公司)上溶解蛋白质。为了检测衣壳蛋白，将膜用单克隆抗体B1(ARP，Cat#03-61058)以1:200的稀释度在RT下探测2小时。然后将膜与辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗小鼠IgG的二次抗体一起温育1小时，随后用皮尔斯ECL2底物和Biorad Chemdoc成像仪检测HRP。
衣壳变体的细胞类型特异性转导效率的评估。针对那些研究执行冷转导法。简而言之，将大约300个完整胰岛重新悬浮在具有2％FBS的100ul CMRL中，以10K的MOI添加rAAV(假设每个胰岛1,000个细胞)，并将混合物在冰上温育，同时在冷藏室中的水平振荡器上轻轻摇动。2小时后，将1ml预热的完全培养基(具有10mM HEPES、0.5％人血清白蛋白、2％FBS、10mM烟酰胺、1％抗真菌抗生素、1％谷氨酰胺的CMRL-1066)添加到每个样品，并将胰岛在24孔超低附着板上温育。2天后更换培养基，采集胰岛，使胰岛解离，并如前所述使用表面抗体通过FACS进行分析，将其细分成α细胞、β细胞和非α细胞/非β细胞99。
rAAV在hESC衍生的β细胞上的转导效率的评估。以10、100、1000的MOI将重组AAV与800,000个从20个球体中提取的高GFP细胞混合，并在含有10％FBS、1:100谷氨酰胺、1:100NEAA、10μm ALKi II、0.5mM维生素C、1μM T3、1mM N-乙酰半胱氨酸、10μM硫酸锌和10μg/ml的硫酸肝素的CMRL中以Aggrewell-400重新聚集。3天后，当重新聚集的eBC转移到6孔悬浮板中时，更换培养基。将其放置在100rpm的定轨振荡器上，并进一步培养3天。随后，将eBC解离，固定，渗透化并针对抗人C肽抗体(1:200)和抗人RFP抗体(Rockland，1:500)进行染色，用于LSRFortessa X20 Dual分析，如前所述100。用Flowjo软件分析数据。根据制造商的说明，使用分子探针抗体标记试剂盒在内部偶联抗人C肽抗体。使用Leica DMI4000 B拍摄现场图像。
变体在各种细胞系上的转导效率的评估。使用衣壳序列AAV DJ、AAV LK03以及变体AAV KP1、KP2和KP3包装单链CAG-萤火虫荧光素酶载体。重组AAV制备物经过双重CsCl纯化，一式三份，以100和1000的MOI转导多种人和小鼠原代细胞和细胞系。除分化的人肌肉细胞外，所有细胞在转导前一天都接种在48孔板上，以使其在转导时有约60-70％汇合(接种密度为每孔20,000-80,000，取决于大小和增殖率)。裂解细胞，并在转导后48小时使用荧光素酶测定试剂盒(Promega)测定荧光素酶活性。使用纯化的重组荧光素酶蛋白(Promega)生成标准曲线。
中和测定。使用两批不同的汇集的人类免疫球蛋白级分(IVIG，Baxter)评估新型变体对中和抗体的敏感性。基本上按照描述执行中和测定(Meliani等人，2015)101。简而言之，将IVIG制剂在补体灭活的FBS中稀释，并在37℃下与每个以不同的衣壳包装的总体积为100ul的ssCAG-FLuc载体的2E08载体基因组一起温育1小时。将前一天接种在48孔板上的Huh7细胞(每孔5E04)用病毒-IVIG混合物一式三份地(每孔22.5ul，对应于约100的MOI)转导，并在24小时后测定细胞裂解物中的荧光素酶活性。
小鼠。在俄勒冈健康与科学大学，在无特定病原的屏障设施中饲养和维护具有NOD菌株背景(FRG/N)的Fah/Rag2/Il2rgc(FRG)缺陷雌性小鼠。将FRG/N小鼠随意维持在经辐照的高脂肪低蛋白小鼠食物(实验室饮食Cat#Picolab-5LJ5)上，以减少通过酪氨酸途径的通量。从移植当天开始，FRG/N小鼠在酸性水上维持1周，以防止细菌生长。接下来的一周，小鼠被切换到8mg/L SMX-TMP抗生素水(补充有0.7mol/L右旋糖以增加适口性)1周。此后，使FRG/N小鼠在1mg/L NTBC水上循环。6到8周龄的雌性Balb/C SCID小鼠购自杰克逊实验室(Jackson Laboratories)(Cat#001803)，用于影像学研究。斯坦福大学、俄勒冈健康与科学大学和儿童医学研究所的机构动物护理和使用委员会批准了所有的小鼠操作程序。
肝细胞移植。用于转导研究的供体人肝细胞从BioreclarnationIVT(批次#QIE)获得。在移植前24小时，通过施用重组人腺病毒表达尿激酶(眼球后注射5E10 PFU)对断奶的FRG/N小鼠进行预处理，以促进人细胞移植。在5E05与1E06之间，将人肝细胞经脾内注射到麻醉的受体FRG/N小鼠中，并循环进行NTBC开关，以促进人肝细胞的移植和扩增。在手术前立即通过腹膜内注射给予广谱抗生素(头孢噻呋4mg/kg)，并在手术后持续两天。移植后六个月，使用Bethyl定量人白蛋白ELISA试剂盒(Cat#E88-129)确定循环的人白蛋白水平作为移植的量度。
体内转导实验。为了评估野生型小鼠肝转导效率，通过正常动态静脉侧尾静脉注射，将每个CAG-萤火虫荧光素酶载体的2E10载体基因组注射到白色Balb/C SCID小鼠中。使用AAV8代替LK03，因为以前已经证明此衣壳具有高度人特异性。通过腹膜内注射每g体重150ug的D-荧光素(Biosynth Cat#L-8220)和使用Ami成像系统的腹侧荧光素酶读数，每周一次监测小鼠肝中的荧光素酶活性。在第35天，处死小鼠并回收各种器官(肝、胰腺、心、肺、脾、脑和肾)。使用Bullet Storm匀浆器将器官在被动裂解缓冲液(Promega)中均质化，并且如上所述测量1mg每个组织样品的荧光素酶活性。从10mg每个组织样品中分离基因组DNA，并使用qPCR确定载体拷贝数。荧光素酶的引物是FLuc F：CAC ATA TCG AGG TGG ACA TTA C和FLuc R：TG TTT GTA TTC AGC CCA TAG。施用小鼠肌动蛋白引物(m-actF：CCT GTA TGCCTC TGG TCG TA和m-actR：CCT CGT AGA TGG GCA CAG T)进行标准化。
为了评估人肝细胞在体内的转导，将人源化FRG小鼠(每组3只)静脉注射1E11ssCAG-Td番茄红载体基因组，用DJ、LK03或KP1衣壳进行假型，并在这14天的转导过程中维持在1mg/L NTBC水平。在吸入异氟醚麻醉的情况下采集肝。将肝组织从若干叶切成若干2x5mm的小块，并在25℃避光条件下固定在10x体积的4％PFA中5小时。将固定的组织在PBS中洗涤1次，并通过蔗糖冷冻保护和再水化系列放置(10％w/v蔗糖在25℃下2小时，20％w/v蔗糖在4℃下过夜，30％w/v蔗糖在25℃下4小时)。将肝碎片在PBS中冲洗，吸干并用OCT(Tissue-Tek Cat#4583)固定在冰冻液(Tissue-Tek Cat#4557)中，并在液氮冷却的异戊烷浴中冷冻。将贴有标签的冷冻模具包裹在铝箔中，并放置于-80℃下直至切片。
肝免疫组织化学。在切片机中以每切片5μM切割每个具有四到五个肝叶的肝样品。将载玻片在-20℃下在甲醇中固定1分钟，并在室温(RT)下空气干燥。除通知外，所有以下步骤均在RT下完成。将载玻片在PBT(PBS+0.1％Tween20)中洗涤3x5分钟，在0.3％Triton-X-100的PBS中透性化1x10分钟，并在PBT中洗涤2x5分钟。在加湿室中，在PBT+10％正常驴血清(目录号ab7475；Abcam)中执行阻断持续1小时。将兔抗人FAH抗体(目录号HPA041370；西格玛公司)以1:200添加到PBT中，并在4℃下温育过夜。染色后洗涤在PBT中进行3x5分钟。将驴抗兔Alexa Fluor 488IgG抗体的二次抗体(目录号A-21206；赛默飞世尔公司)添加到PBT(1:500，DAPI为80ng/mL)中，并在RT下温育1小时。将载玻片在PBT中洗涤3x5分钟，在PBS中洗涤1x5分钟，随后用ProLong黄金抗褪色试剂(目录号9071S；细胞信号公司(CellSignaling))固定。抗体有效性对照包含仅二次染色，并在阳性对照人肝组织切片(目录号HF-314；Zyagen)和阴性对照未处理的小鼠肝切片(目录号MF-314-C57；Zyagen)上进行演示。在倒置蔡司激光扫描共聚焦显微镜(LSM 880)上通过具有Zen Pro软件的20×物镜执行成像。扫描AAV-RFP信号并直接捕获。使用Volocity软件(v6.3)对人肝细胞转导进行量化，并通过肉眼计数证实。简而言之，从每个肝样品的不同切片中扫描六到九个不同的感兴趣区域，每个切片平均计数约1,000个细胞选择大约30％-80％的FAH阳性染色区域进行分析。每个扫描区域的人肝细胞的百分比表示为Alexa Fluor 488信号的细胞数(FAH阳性)除以DAPI信号的细胞数(总细胞数)。通过将具有RFP信号的细胞数(AAV阳性)除以具有DAPI信号的细胞数来计算总转导效率。这两个数字的重叠表示不同AAV血清型对人肝细胞的转导效率。
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提供上述实例是为了向本领域普通技术人员提供如何制造和使用本发明的组合物、系统和方法的实施例的完整公开和描述，而不是旨在限制发明人认为是其发明的范围。对于本领域技术人员而言显而易见，用于执行本公开的上述模式的修改旨在落入所附权利要求的范围内。本说明书中所提及的所有专利和出版物指示本发明所属领域的技术人员的水平。本公开中引用的所有参考文献通过引用并入，其程度如同每个参考文献已经以全文引用的方式单独地并入。
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本文中所引用的所有参考文献在此通过引用以其整体并入本文中，并且出于所有目的，其程度如同每个单独的出版物或专利或专利申请具体地或单独地被指示出于所有目的以其整体通过引用并入。
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Claims (79)

1.一种变体腺相关病毒(AAV)衣壳多肽，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽在人胰腺组织或人胰岛中表现出增加的转导或向性。
2.根据权利要求1所述的变体AAV衣壳多肽，其中所述变体AAV衣壳多肽转导解离的或完整的人胰岛。
3.根据权利要求1所述的变体AAV衣壳多肽，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽表现出增加的转导。
4.根据权利要求1所述的变体AAV衣壳多肽，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽表现出增加的向性。
5.根据前述权利要求中任一项所述的变体AAV衣壳多肽，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽在人胰岛内的一种或多种类型的细胞中进一步表现出增加的转导或向性。
6.根据前述权利要求中任一项所述的变体AAV衣壳多肽，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽在体内表现出对人胰腺组织或人胰岛的转导增加。
7.根据前述权利要求中任一项所述的变体AAV衣壳多肽，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽在体外表现出对人胰腺组织或人胰岛的转导增加。
8.根据前述权利要求中任一项所述的变体AAV衣壳多肽，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽离体表现出对人胰腺组织或人胰岛的转导增加。
9.根据前述权利要求中任一项所述的变体AAV衣壳多肽，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽表现出增强的中和性质。
10.根据前述权利要求中任一项所述的变体AAV衣壳多肽，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽对汇集的人免疫球蛋白表现出增强的中和性质。
11.根据前述权利要求中任一项所述的变体AAV衣壳多肽，其中所述表现出增强的中和性质的变体AAV衣壳多肽选自由AAV-10A1(SEQ ID NO:1)和AAV-10A3(SEQ ID NO:2)组成的组。
12.根据前述权利要求中任一项所述的变体AAV衣壳多肽，其中所述表现出增强的中和性质的变体AAV衣壳多肽是AAV-10A1(SEQ ID NO:1)。
13.根据前述权利要求中任一项所述的变体AAV衣壳多肽，其中所述表现出增强的中和性质的变体AAV衣壳多肽是AAV-10A3(SEQ ID NO:3)。
14.根据前述权利要求中任一项所述的变体AAV衣壳多肽，其中所述变体AAV衣壳多肽是功能性AAV衣壳的一部分，其中所述功能性AAV衣壳包装核酸序列，所述核酸序列选自由非编码RNA、蛋白质编码序列、表达盒、多表达盒、同源重组序列、基因组基因靶向盒和治疗性表达盒组成的组。
15.根据权利要求14所述的变体AAV衣壳多肽，其中所述核酸序列含于AAV载体内。
16.根据权利要求14所述的变体AAV衣壳多肽，其中所述表达盒是CRISPR/CAS表达系统。
17.根据权利要求14所述的变体AAV衣壳多肽，其中所述治疗性表达盒对治疗性蛋白或抗体进行编码。
18.根据前述权利要求中任一项所述的变体AAV衣壳多肽，其中所述变体AAV衣壳多肽序列选自由以下组成的组：AAV-10A1(SEQ ID NO:1)、AAV-10A3(SEQ ID NO:2)、AAV-10A4(SEQ ID NO:3)、AAV-10A5(SEQ ID NO:4)、AAV-18A1(SEQ ID NO:5)、AAV-10B1(SEQ ID NO:6)、AAV-10B3(SEQ ID NO:7)、AAV-10B5(SEQ ID NO:8)、AAV-10B6(SEQ ID NO:9)、AAV-10B7(SEQ ID NO:10)、AAV-18B2(SEQ ID NO:12)以及AAV-18B3(SEQ ID NO:13)。
19.根据前述权利要求中任一项所述的变体AAV衣壳多肽，其中所述变体AAV衣壳多肽序列选自由以下组成的组：AAV-10A1(SEQ ID NO:1)、AAV-10A3(SEQ ID NO:2)和AAV-18A1(SEQ ID NO:5)。
20.一种在治疗性治疗方案或疫苗中使用根据前述权利要求中任一项所述的变体AAV衣壳多肽的方法。
21.一种在内分泌病症的治疗性治疗中使用根据前述权利要求中任一项所述的变体AAV衣壳多肽的方法。
22.一种在糖尿病的治疗性治疗中使用根据前述权利要求中任一项所述的变体AAV衣壳多肽的方法，所述糖尿病包含：I型和II型。
23.一种使用根据前述权利要求中任一项所述的变体AAV衣壳多肽来减少施用于受试者的核酸总量的方法，所述方法包括当使用变体AAV衣壳多肽转导所述核酸时，与使用非变体亲本衣壳多肽转导所述核酸以获得类似的治疗效果时施用于所述受试者的核酸量相比，向所述受试者施用更少的核酸总量。
24.一种腺相关病毒(AAV)载体，其包括对变体AAV衣壳多肽进行编码的核酸序列，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽在人胰腺组织或人胰岛中表现出增加的转导或向性。
25.根据权利要求24所述的AAV载体，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽表现出增加的转导。
26.根据权利要求25所述的AAV载体，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽表现出增加的向性。
27.根据权利要求24到26中任一项所述的AAV载体，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽在体内表现出对人胰腺组织或人胰岛的转导增加。
28.根据权利要求24到26中任一项所述的AAV载体，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽在体外表现出对人胰腺组织或人胰岛的转导增加。
29.根据权利要求24到27中任一项所述的AAV载体，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽离体表现出对人胰腺组织或人胰岛的转导增加。
30.根据权利要求24到28中任一项所述的AAV载体，其中所述载体进一步包括核酸序列，所述核酸序列选自由非编码RNA、编码序列、表达盒、多表达盒、同源重组序列、基因组基因靶向盒和治疗性表达盒组成的组。
31.根据权利要求30所述的AAV载体，其中所述变体AAV衣壳多肽允许以类似于非变体亲本衣壳多肽的方式进行核酸表达。
32.根据权利要求30所述的AAV载体，其中所述表达盒是CRISPR/CAS表达系统。
33.根据权利要求30所述的AAV载体，其中所述治疗性表达盒对治疗性蛋白或抗体进行编码。
34.根据权利要求24到33中任一项所述的AAV载体，其中所述变体AAV衣壳多肽序列选自由以下组成的组：AAV-10A1(SEQ ID NO:1)、AAV-10A3(SEQ ID NO:2)、AAV-10A4(SEQ IDNO:3)、AAV-10A5(SEQ ID NO:4)、AAV-18A1(SEQ ID NO:5)、AAV-10B1(SEQ ID NO:6)、AAV-10B3(SEQ ID NO:7)、AAV-10B5(SEQ ID NO:8)、AAV-10B6(SEQ ID NO:9)、AAV-10B7(SEQ IDNO:10)、AAV-18B2(SEQ ID NO:12)以及AAV-18B3(SEQ ID NO:13)。
35.根据权利要求24到34中任一项所述的AAV载体，其中所述变体AAV衣壳多肽序列选自由以下组成的组：AAV-10A1(SEQ ID NO:1)、AAV-10A3(SEQ ID NO:2)和AAV-18A1(SEQ IDNO:5)。
36.一种在治疗性治疗方案或疫苗中使用根据权利要求24到35中任一项所述的AAV载体的方法。
37.一种在内分泌病症的治疗性治疗中使用根据权利要求24到35中任一项所述的AAV载体的方法。
38.一种在糖尿病的治疗性治疗中使用根据权利要求24到35中任一项所述的AAV载体的方法，所述糖尿病包含：I型和II型。
39.一种使用根据前述权利要求中任一项所述的变体AAV衣壳多肽来减少施用于受试者的AAV载体总量的方法，所述方法包括当通过变体AAV衣壳多肽转导所述AAV载体时，与通过非变体亲本衣壳多肽转导所述AAV载体以获得类似的治疗效果时施用于所述受试者的AAV载体量相比，向所述受试者施用更少的AAV载体总量。
40.一种用于生成变体AAV衣壳多肽的方法，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽在人胰腺组织或人胰岛中表现出增加的转导或向性，所述方法包括：
a)生成变体AAV衣壳多肽基因的文库，其中所述变体AAV衣壳多肽基因包含多个包括来自多于一种非变体亲本衣壳多肽的序列的变体AAV衣壳多肽基因；
b)通过将所述变体AAV衣壳多肽基因文库克隆到AAV载体中来生成AAV载体文库，其中所述AAV载体是有复制能力的AAV载体；
c)筛选来自b)的所述AAV载体文库，所述AAV载体文库对与非变体亲本衣壳多肽相比在人胰腺组织或人胰岛中具有增加的转导或向性的变体AAV衣壳多肽进行编码；以及
d)从c)中选择所述变体AAV衣壳多肽。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述方法进一步包括：e)确定来自d)的所述变体AAV衣壳多肽的序列。
42.根据权利要求40或权利要求41所述的方法，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽表现出增加的转导。
43.根据权利要求40到42中任一项所述的方法，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽表现出增加的向性。
44.根据权利要求40到43中任一项所述的方法，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽进一步表现出增强的中和性质。
45.根据权利要求40到44中任一项所述的方法，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽对汇集的人免疫球蛋白进一步表现出增强的中和性质。
46.根据权利要求40到45中任一项所述的方法，其中所述进一步表现出增强的中和性质的变体AAV衣壳多肽选自由AAV-10A1(SEQ ID NO:1)和AAV-10A3(SEQ ID NO:2)组成的组。
47.根据权利要求40到45中任一项所述的方法，其中所述进一步表现出增强的中和性质的变体AAV衣壳多肽是AAV-10A1(SEQ ID NO:1)。
48.根据权利要求40到45中任一项所述的方法，其中所述进一步表现出增强的中和性质的变体AAV衣壳多肽是AAV-10A3(SEQ ID NO:2)。
49.根据权利要求40到48中任一项所述的方法，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽在体内表现出对人胰腺组织或人胰岛的转导增加。
50.根据权利要求40到49中任一项所述的方法，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽在体外表现出对人胰腺组织或人胰岛的转导增加。
51.根据权利要求40到50中任一项所述的方法，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽离体表现出对人胰腺组织或人胰岛的转导增加。
52.一种腺相关病毒(AAV)载体，其包括对变体AAV衣壳多肽进行编码的核酸序列，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽在人肝组织或人肝细胞中表现出增加的转导或向性。
53.根据权利要求52所述的AAV载体，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽表现出增加的转导。
54.根据权利要求53所述的AAV载体，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽表现出增加的向性。
55.根据权利要求52到54中任一项所述的AAV载体，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽在体内表现出对人肝组织或人肝细胞的转导增加。
56.根据权利要求52到54中任一项所述的AAV载体，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽在体外表现出对人肝组织或人肝细胞的转导增加。
57.根据权利要求52到55中任一项所述的AAV载体，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽离体表现出对人肝组织或人肝细胞的转导增加。
58.根据权利要求52到56中任一项所述的AAV载体，其中所述载体进一步包括核酸序列，所述核酸序列选自由非编码RNA、编码序列、表达盒、多表达盒、同源重组序列、基因组基因靶向盒和治疗性表达盒组成的组。
59.根据权利要求58所述的AAV载体，其中所述变体AAV衣壳多肽允许以类似于非变体亲本衣壳多肽的方式进行核酸表达。
60.根据权利要求58所述的AAV载体，其中所述表达盒是CRISPR/CAS表达系统。
61.根据权利要求58所述的AAV载体，其中所述治疗性表达盒对治疗性蛋白或抗体进行编码。
62.根据权利要求52到61中任一项所述的AAV载体，其中所述变体AAV衣壳多肽序列选自由以下组成的组：AAV-10A1(SEQ ID NO:1)、AAV-10A3(SEQ ID NO:2)、AAV-10A4(SEQ IDNO:3)、AAV-10A5(SEQ ID NO:4)、AAV-18A1(SEQ ID NO:5)、AAV-10B1(SEQ ID NO:6)、AAV-10B3(SEQ ID NO:7)、AAV-10B5(SEQ ID NO:8)、AAV-10B6(SEQ ID NO:9)、AAV-10B7(SEQ IDNO:10)、AAV-18B2(SEQ ID NO:12)以及AAV-18B3(SEQ ID NO:13)。
63.根据权利要求52到62中任一项所述的AAV载体，其中所述变体AAV衣壳多肽序列选自由以下组成的组：AAV-10A1(SEQ ID NO:1)、AAV-10A3(SEQ ID NO:2)和AAV-18A1(SEQ IDNO:5)。
64.一种在治疗性治疗方案或疫苗中使用根据权利要求52到63中任一项所述的AAV载体的方法。
65.一种在内分泌病症的治疗性治疗中使用根据权利要求52到63中任一项所述的AAV载体的方法。
66.一种在糖尿病的治疗性治疗中使用根据权利要求52到63中任一项所述的AAV载体的方法，所述糖尿病包含：I型和II型。
67.一种使用根据前述权利要求中任一项所述的变体AAV衣壳多肽来减少施用于受试者的AAV载体总量的方法，所述方法包括当通过变体AAV衣壳多肽转导所述AAV载体时，与通过非变体亲本衣壳多肽转导所述AAV载体以获得类似的治疗效果时施用于所述受试者的AAV载体量相比，向所述受试者施用更少的AAV载体总量。
68.一种用于生成变体AAV衣壳多肽的方法，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽在人肝组织或人肝细胞中表现出增加的转导或向性，所述方法包括：
a)生成变体AAV衣壳多肽基因的文库，其中所述变体AAV衣壳多肽基因包含多个包括来自多于一种非变体亲本衣壳多肽的序列的变体AAV衣壳多肽基因；
b)通过将所述变体AAV衣壳多肽基因文库克隆到AAV载体中来生成AAV载体文库，其中所述AAV载体是有复制能力的AAV载体；
c)筛选来自b)的所述AAV载体文库，所述AAV载体文库对与非变体亲本衣壳多肽相比在人胰腺组织或人胰岛中具有增加的转导或向性的变体AAV衣壳多肽进行编码；以及
d)从c)中选择所述变体AAV衣壳多肽。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述方法进一步包括：e)确定来自d)的所述变体AAV衣壳多肽的序列。
70.根据权利要求68或权利要求69所述的方法，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽表现出增加的转导。
71.根据权利要求68到70中任一项所述的方法，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽表现出增加的向性。
72.根据权利要求68到71中任一项所述的方法，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽进一步表现出增强的中和性质。
73.根据权利要求68到72中任一项所述的方法，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽对汇集的人免疫球蛋白进一步表现出增强的中和性质。
74.根据权利要求68到73中任一项所述的方法，其中所述进一步表现出增强的中和性质的变体AAV衣壳多肽选自由AAV-10A1(SEQ ID NO:1)和AAV-10A3(SEQ ID NO:2)组成的组。
75.根据权利要求68到73中任一项所述的方法，其中所述进一步表现出增强的中和性质的变体AAV衣壳多肽是AAV-10A1(SEQ ID NO:1)。
76.根据权利要求68到73中任一项所述的方法，其中所述进一步表现出增强的中和性质的变体AAV衣壳多肽是AAV-10A3(SEQ ID NO:2)。
77.根据权利要求68到76中任一项所述的方法，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽在体内表现出对人肝组织或人肝细胞的转导增加。
78.根据权利要求68到77中任一项所述的方法，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽在体外表现出对人胰腺组织或人胰岛的转导增加。
79.根据权利要求68到78中任一项所述的方法，其中与非变体亲本衣壳多肽相比，所述变体AAV衣壳多肽离体表现出对人胰腺组织或人胰岛的转导增加。
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