JP2023539367A - コドン最適化したｒｅｐ１遺伝子およびその使用 - Google Patents

Abstract

本開示は、ヒトＲＥＰ１をコードするコドン最適化したヌクレオチド配列、コドン最適化したＲＥＰ１配列を含むベクター、および宿主細胞、ならびにヒトＲＥＰ１をコードするコドン最適化した配列を被験体に投与する工程を包含するコロイデレミアのような網膜障害を処置する方法を提供する。いくつかの局面において、本明細書で記載されるとおりのコドン最適化した核酸分子は、野生型ＣＨＭ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００３９０．４；配列番号３）のものと比較して増大したヒトコドン適応指数を有する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年９月２日出願の米国仮特許出願第６３／０７３，８３７号（その全開示は、本明細書に参考として援用される）の利益を主張する。

ＥＦＳ－ＷＥＢを介する配列表提出
２０２１年７月２８日またはその前後に作成し、ファイルサイズ約２７ ＫＢの「０９０４００－５０１１－ＷＯ－Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｌｉｓｔｉｎｇ」というファイル名のコンピューター可読テキストファイルは、本出願の配列表を含み、その全体において参考として援用される。

発明の背景
コロイデレミアは、５０，０００人の男性あたりおよそ１人が罹患する遺伝性網膜変性の希少なＸ連鎖劣性形態である。上記疾患は、小児期の夜盲とともに始まり、続いて、周辺視野欠損、人生の後半には中心視野欠損へと進行する、段階的な視力喪失を引き起こす。進行は、その個体の生涯を通じて継続するが、変化の速度および視力喪失の程度はともに、罹患した人々の間で、同じ家族の中であっても、変化する。

コロイデレミアは、Ｒａｂタンパク質の脂質修飾に関与するタンパク質であるＲａｂ ｅｓｃｏｒｔ ｐｒｏｔｅｉｎ－１（ＲＥＰ１）をコードするＣＨＭ遺伝子における機能喪失型変異によって引き起こされる。完全な疾患機序は、十分には理解されていないが、網膜における機能的タンパク質の欠如は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、光受容体および脈絡膜の細胞死および段階的な悪化を生じる。

コロイデレミアの承認された処置は、現在存在しないが、いくつかの前臨床研究は、コロイデレミア疾患表現型をレスキューするために、ＣＨＭの野生型ｃＤＮＡの使用を支持する。しかし、ヒト光受容体およびＲＰＥにおける野生型配列の発現レベルが最適未満であることから、コロイデレミアを処置する遺伝子治療アプローチは難題である。

発明の要旨
ヒトＲａｂ ｅｓｃｏｒｔ ｐｒｏｔｅｉｎ－１（ＲＥＰ１）タンパク質をコードするコドン最適化した核酸分子が開示される。１つの局面において、本開示は、配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸、または配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列を含み、配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトＲＥＰ１ポリペプチドをコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態において、配列番号１のヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる核酸が提供される。関連する実施形態において、上記核酸は、他の点では同一な細胞において、野生型ＣＨＭ核酸配列（例えば、配列番号３）の発現のレベルと比較して、より高いレベルで発現される。

いくつかの局面において、本明細書で記載されるとおりのコドン最適化した核酸分子は、野生型ＣＨＭ ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００３９０．４；配列番号３）のものと比較して増大したヒトコドン適応指数（human codon adaptation index）を有する。いくつかの実施形態において、上記コドン最適化した核酸分子は、少なくとも約０．９、少なくとも約０．９２、または少なくとも約０．９４のヒトコドン適応指数を有する。

ある特定の実施形態において、上記核酸は、配列番号３におけるＧ／Ｃヌクレオチドのパーセンテージと比較して、より高いＧ／Ｃヌクレオチドのパーセンテージを含む。他の実施形態において、上記核酸は、少なくとも約５５％、少なくとも約５７．５％、少なくとも約６０％または少なくとも約６１％であるＧ／Ｃヌクレオチドのパーセンテージを含む。いくつかの局面において、上記核酸は、約５５％～約７０％、約５７．５％～約７０％または約６１％～約７０％であるＧ／Ｃヌクレオチドのパーセンテージを含む。

他の実施形態において、上記核酸は、配列番号３に対して１またはそれより多くの最適化したパラメーター：最適コドンの頻度；直接反復配列（ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｅａｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の最大長の低減；制限酵素の除去（Ｂｇｌｌｌ（ＡＧＡＴＣＴ）の除去が挙げられるが、これらに限定されない）；ＣＩＳ作用エレメントの除去（不安定化（ＡＴＴＴＡ）エレメントの除去が挙げられるが、これらに限定されない）を含む。

別の実施形態において、上記核酸は、少なくとも１つの転写制御配列、好ましくは、上記核酸に対して異種である転写制御配列に作動可能に連結される。いくつかの局面において、上記転写制御配列は、例えば、光受容細胞において上記核酸の細胞特異的発現を生じる細胞特異的または組織特異的プロモーター（例えば、ＲＰＥにおいて選択的に発現される卵黄様黄斑ジストロフィー２（ｖｉｔｅｌｌｉｆｏｒｍ ｍａｃｕｌａｒ ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ ２）プロモーター）である。他の局面において、上記転写制御配列は、多くの細胞タイプにおいて上記核酸の類似の発現レベルを生じる構成的プロモーター（例えば、ＣＡＧ、ＣＢＡ（ニワトリβアクチン）、ＣＭＶ、またはＰＧＫプロモーター）である。好ましい実施形態において、上記転写制御配列は、（ｉ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント、（ｉｉ）ニワトリβアクチン遺伝子のプロモーター、第１のエキソンおよび第１のイントロン、ならびに（ｉｉｉ）Ｍｉｙａｚａｋｉら， Ｇｅｎｅ ７９（２）：２６９－７７（１９８９）に記載されるウサギβグロビン遺伝子のスプライスアクセプターを含むＣＡＧプロモーターを含む。特に好ましい実施形態において、上記ＣＡＧプロモーターは、配列番号４の配列を含むか、または配列番号４の配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一の配列を含む：

上記転写制御配列はまた、網膜においてＡＡＶ導入遺伝子発現を増強することが示されているウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）のような、ＲＥＰ１コード配列の下流の１またはこれより多くのエレメントを含み得る。関連する実施形態において、発現制御配列に作動可能に連結された、配列番号１のヌクレオチド配列、または配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含む核酸を含む発現カセットが、本明細書で提供される。

関連する実施形態において、配列番号１のヌクレオチド配列、または配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含む核酸を含むベクターが、本明細書で提供される。好ましい実施形態において、上記ベクターは、組換えアデノ随伴（ｒＡＡＶ）発現ベクターである。いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、天然のキャプシド（例えば、ＡＡＶ血清型２、ＡＡＶ血清型４、ＡＡＶ血清型５またはＡＡＶ血清型８のキャプシド）を含む。他の実施形態において、上記ｒＡＡＶベクターは、改変されたキャプシドを含む（例えば、天然のＡＡＶキャプシドに対して１もしくはこれより多くのペプチド挿入ならびに／あるいは１もしくはこれより多くのアミノ酸置換（例えば、チロシンからフェニルアラニン）および／またはアミノ酸挿入もしくはアミノ酸欠失）を含む（例えば、血清型２、４、５もしくは８のＡＡＶキャプシドに対して１もしくはこれより多くの改変を含む））。

別の実施形態において、配列番号１のヌクレオチド配列、または配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含む核酸を含む宿主細胞が、本明細書で提供される。いくつかの局面において、前記宿主細胞は、哺乳動物細胞（ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ２１細胞、Ｖｅｒｏ細胞またはＶ２７細胞が挙げられるが、これらに限定されない）である。関連する局面において、上記宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ２１細胞およびＶｅｒｏ細胞から選択される。他の局面において、上記宿主細胞は、光受容細胞（例えば、桿体；錐体）、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）、グリア細胞（例えば、ミュラーグリア細胞、小グリア細胞）、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、または網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞である。関連する実施形態において、本開示は、配列番号２のポリペプチドの発現を増大させる方法であって、上記方法は、上記宿主細胞を、配列番号２のポリペプチドが上記核酸分子によって発現される条件下で培養する工程を包含し、ここで上記ポリペプチドの発現は、配列番号３のヌクレオチド配列（比較配列）を含む参照核酸を含む同じ条件下で培養された宿主細胞と比較して増大される、方法を提供する。

別の実施形態において、本開示は、ヒト被験体において配列番号２のポリペプチドの発現を増大させる方法であって、上記方法は、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一、もしくは１００％同一であり、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子、またはこのような核酸配列を含むベクターを、上記被験体に投与する工程を包含し、ここで上記ポリペプチドの発現は、配列番号３のヌクレオチド配列（比較配列）を含む参照核酸分子または上記参照核酸分子を含むベクターと比較して増大される、方法を提供する。

いくつかの実施形態において、本開示は、ヒト被験体において不十分なＲＥＰ１活性と関連する眼の障害を処置する方法であって、上記方法は、上記被験体に、本明細書で開示される核酸分子またはベクターを投与する工程を包含する方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記網膜障害は、コロイデレミアである。

図１Ａ－Ｄ 図１Ａおよび１Ｂは、多能性転写因子ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４およびＳＯＸ２に対する抗体を使用して、コロイデレミア患者ＣＨＭ１（図１Ａ）およびＣＨＭ２（図１Ｂ）に由来するｉＰＳＣの免疫細胞化学分析を図示する。図１Ｃおよび１Ｄは、ＴＵＪ１、α－平滑筋アクチン（ＡＳＭＡ）および肝細胞核因子４α（ＨＮＦ４Ａ）の発現によって示されるとおりの外胚葉、中胚葉および内胚葉細胞系統へと無作為に分化したＣＨＭ１（図１Ｃ）およびＣＨＭ２（図１Ｄ）培養物の代表的画像を図示する。 同上。

図２Ａ－Ｃ 図２Ａおよび２Ｂは、コロイデレミア患者ＣＨＭ１（図２Ａ）およびＣＨＭ２（図２Ｂ）に由来するｉＰＳＣに由来するＲＰＥ細胞の免疫細胞化学分析を図示する。ＩＣＣによる４５日間の分化および成熟の後のＲＰＥ表現型は、Ｍｅｌａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＭＩＴＦ）およびＯｒｔｈｏｄｅｎｔｉｃｌｅ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２（ＯＴＸ２）の適切なＲＰＥ転写因子発現、成熟ＲＰＥ細胞マーカーＲＰＥ６５の発現、ならびに密着結合マーカーＺｏｎｕｌａ Ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ（ＺＯ－１）の発現を示した。核を、ＣＨＭ１画像に関してはＤＡＰＩで対比染色した。スケールバー＝５０μｍ。図２Ｃは、ＣＨＭ１ ＲＰＥおよびＣＨＭ２ ＲＰＥが野生型（ＷＴ）ＲＰＥに類似のレベルにおいて貪食することを図示するグラフである。さらに、食作用は、αＶβ５阻害後の食作用における減少によって認められるように、公知のインビボでの機序、αＶβ５インテグリン結合を介して起こる。定量的測定に関してｎ＝３；エラーバー±Ｓ．Ｄ．；「ＲＯＳなし」条件と比較して＊ｐ＜０．０５；両側ｔ検定。 同上。 同上。

図３Ａ－Ｂ 図３Ａ：各場合において、ＣＡＧプロモーターによって駆動される、コドン最適化したＲＥＰ１遺伝子を有するかまたは非改変ＲＥＰ１遺伝子を有する組換えＡＡＶビリオンでの形質導入後のＣＨＭ１ ＲＰＥまたは正常ｉＰＳＣ由来ＲＰＥ細胞におけるＲＥＰ１およびハスキーピングタンパク質ＧＡＤＰＨレベルを図示するウェスタンブロット画像が、示される。上記コドン最適化したＲＥＰ１は、有意により高いタンパク質発現レベルを示した。図３Ｂ：バンド強度を定量し、ＧＡＰＤＨに対する比としてグラフにした。定量的測定に関してｎ＝３；エラーバー±Ｓ．Ｄ．；ＷＴ－ＲＥＰ１と比較して＊ｐ＜０．０５；両側ｔ検定。 同上。

図４ 必要とされる構成要素（生化学的アッセイのリードアウトとして働くビオチン化プレニル基を含む）を示す機能的プレニル化アッセイの模式図。機能的ＲＥＰ１タンパク質を有する正常ＲＰＥ細胞は、Ｒａｂ２７Ａ ＧＴＰａｓｅのプレニル化を成功裡に促進し、ビオチン基の組み込みをもたらす。ＣＨＭ ＲＰＥにおいて、細胞は、ＲＥＰ１タンパク質を欠き、プレニル化されていないＲａｂ２７ａ ＧＴＰａｓｅタンパク質の蓄積を引き起こす。

図５Ａ－５Ｄ Ｒａｂ２７ａ ＧＴＰａｓｅのＣＡＧプロモーター回復プレニル化の制御下での、配列番号１のコドン最適化したＲＥＰ１を含むｒＡＡＶビリオンでのＣＨＭ１およびＣＨＭ２ ＲＰＥの形質導入。図５Ａおよび５Ｂ： 形質導入されたおよび形質導入されていないＣＨＭ１（図５Ａ）およびＣＨＭ２（図５Ｂ） ＲＰＥ細胞における（正常ｉＰＳＣ由来ＲＰＥ細胞と比較した）、ウェスタンブロット分析によるＲＥＰ１タンパク質のレベルおよび細胞溶解物中のプレニル化の尺度としてのビオチン化プレニルドナーの組み込みを図示するゲル画像。図５Ｃおよび５Ｄ： ＣＨＭ１（図５Ｃ）およびＣＨＭ２（図５Ｄ） ＲＰＥ細胞において、バンド強度を定量し、ハウスキーピングタンパク質ＧＡＤＰＨに対するビオチン化Ｒａｂ２７ａ ＧＴＰａｓｅとして棒グラフで示す。定量的測定に関してｎ＝３；エラーバー±Ｓ．Ｄ．； 処置されていないＣＨＭ ＲＰＥと比較して＊ｐ＜０．０５；両側ｔ検定。 同上。 同上。 同上。

図６Ａ－６Ｃ 図６Ａ： 抗ＲＥＰ１および抗ＲＡＢ２７Ａ抗体でのＣＨＭ１ ＲＰＥの免疫染色は、ＣＨＭ１ ＲＰＥが、Ｒａｂ２７ａ ＧＴＰａｓｅの適切な膜局在化を欠いたことを示す。図６Ｂおよび６Ｃ： ｒＡＡＶベクターによる配列番号１のコドン最適化したＲＥＰ１の送達は、ＣＨＭ１ ＲＰＥ（図６Ｂ）におけるＲａｂ２７ ＧＴＰａｓｅ膜輸送を補正し、コントロールＲＰＥ表現型への局在化を回復させた（図６Ｃ）。

図７： 配列番号１の最適化領域と配列番号３の天然のＲＥＰ１とのＤＮＡアラインメント。 同上。

図８は、以下の実施例２に記載されるｒＡＡＶ内に含まれる導入遺伝子カセットの模式図である。上記導入遺伝子カセットは、５’ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＣＡＧプロモーター、配列番号１のコドン最適化したヒトＣＨＭ ｃＤＮＡ、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、および３’側のＡＡＶ２ ＩＴＲを含み、配列番号５のヌクレオチド配列を有する。

図９は、房水フレア、房水細胞（ａｑｕｅｏｕｓ ｃｅｌｌ）、および硝子体細胞（ｖｉｔｒｅｏｕｓ ｃｅｌｌ）によって評価されるように、眼の炎症の定量を介して、非ヒト霊長類への硝子体内投与後に４Ｄ－１１０（図８に示される導入遺伝子カセットおよび配列番号９のキャプシドタンパク質を含む）の安全性を図示する。一過性の軽度の眼の炎症の検眼鏡検査による徴候を、高用量で観察した。これらの変化は、全身性のステロイド処置における増大に応答した。４Ｄ－１１０に関連すると考えられる有害な所見は存在しなかった。ＩＯＰ値は、異なる試験期間において全ての動物において正常範囲内であった。黄斑形態を含むＥＲＧ値およびＯＣＴ画像はまた、正常範囲内であった。 同上。

図１０は、４Ｄ－１１０を硝子体内投与されたＮＨＰにおいて３つの剖検時点におけるｑＰＣＲによって測定されるように、選択された網膜組織、眼組織および非眼組織におけるベクターゲノム生体分布を図示する。ＬＯＤ＝検出下限；全てのサンプル「ＢＬＯＤ」は、可視化目的でＬＯＤ値においてグラフ化した。 同上。

図１１は、４Ｄ－１１０を硝子体内投与したＮＨＰにおいて３つの剖検時点におけるＲＴ－ｑＰＣＲによって測定されるように、選択された網膜組織、眼組織および非眼組織におけるＲＥＰ１導入遺伝子ｍＲＮＡ発現を図示する。ＬＯＤ＝検出下限；全てのサンプル「ＢＬＯＤ」は、可視化目的でＬＯＤ値においてグラフ化した。 同上。

発明の詳細な説明
定義

「コドン適応指数（ｃｏｄｏｎ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ）」とは、本明細書で使用される場合、コドン使用バイアスの尺度をいう。コドン適応指数（ＣＡＩ）は、参照遺伝子セットに関する所定のタンパク質コード遺伝子配列の偏差を測定する（Ｓｈａｒｐ Ｐ Ｍ ａｎｄ Ｌｉ Ｗ Ｈ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５（３）：１２８１－９５ （１９８７））。ＣＡＩは、遺伝子配列の長さ（コドン単位で測定）にわたり各コドンに対して関連付けられた重みの幾何平均を決定することによって計算される：
各アミノ酸に関して、そのコドンの各々の重みは、ＣＡＩにおいて、そのアミノ酸に関して、観察されたコドン頻度（ｆｉ）と同義コドンの頻度（ｆｊ）との間の比として計算される：

用語「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」とは、その元の環境（それが天然に存在する環境）から除去されている生物学的材料（細胞、核酸またはタンパク質）を示す。例えば、植物または動物において天然の状態で存在するポリヌクレオチドは、単離されていないが、そのポリヌクレオチドが天然に存在する隣接する核酸から分離されたその同じポリヌクレオチドは、「単離され」ていると考えられる。

用語「４Ｄ－１１０」とは、（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むキャプシドタンパク質、および配列番号５のヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む組換えＡＡＶ粒子をいう。

用語「Ｒ１００」とは、配列番号９のアミノ酸配列を含む改変体ＡＡＶキャプシドタンパク質をいう。

用語「有する（ｈａｖｉｎｇ）」とは、本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」に等価であり、制限がなく、さらなる要素を許容することが意図される。

本明細書で使用される場合、「コード領域（ｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）」または「コード配列（ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、アミノ酸へと翻訳可能なコドンからなるポリヌクレオチドの一部である。「終止コドン（ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎ）」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）は、代表的には、アミノ酸へと翻訳されないが、それは、コード領域の一部であるとみなされ得る。しかし任意の隣接する配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写終結因子、イントロンなどは、コード領域の一部ではない。コード領域の境界は、代表的には、得られるポリペプチドのアミノ末端をコードする５’末端の開始コドン、および得られるポリペプチドのカルボキシ末端をコードする３’末端の翻訳終止コドンによって決定される。２またはこれより多くのコード領域が、単一のポリヌクレオチド構築物において（例えば、１つのベクター上に）、または別個のポリヌクレオチド構築物において（例えば、別個の（異なる）ベクター上に）存在し得る。そうすると、１個のベクターが、ただ１つのコード領域を含み得るか、または２もしくはこれより多くのコード領域を含み得るということになる。

本明細書で使用される場合、用語「調節領域（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｅｇｉｏｎ）」とは、コード領域の上流に（５’非コード配列）、その内部に、またはその下流に（３’非コード配列）位置し、転写、ＲＮＡプロセシング、安定性、または関連付けられたコード領域の翻訳に影響するヌクレオチド配列をいう。調節領域は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステム－ループ構造を含み得る。コード領域が、真核生物細胞における発現に関して意図される場合、ポリアデニル化シグナルよび転写終結配列は通常、コード配列に対して３’側に位置する。

本明細書で使用される場合、用語「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」は、「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」または「核酸分子（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」と交換可能に使用され、ヌクレオチドのポリマーが意図される。

遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）をコードするポリヌクレオチドは、１もしくはこれより多くのコード領域と作動可能に関連付けられたプロモーターおよび／または他の転写もしくは翻訳制御エレメントを含み得る。作動可能な関連において、遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）のコード領域は、１もしくはこれより多くの調節領域と、上記遺伝子産物の発現を上記調節領域の影響または制御下に置くような方法において関連付けられる。例えば、コード領域およびプロモーターは、プロモーター機能の誘導が、上記コード領域によってコードされる遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写を生じる場合、および上記プロモーターと上記コード領域との間の連結の性質が、上記プロモーターが上記遺伝子産物の発現を指示する能力にも干渉せず、ＤＮＡテンプレートが転写される能力にも干渉しない場合、「作動可能に関連付けられる（ｏｐｅｒａｂｌｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）」。他の転写制御エレメント、プロモーターの他に、例えば、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、および転写終結シグナルはまた、遺伝子産物発現を指示するために、コード領域と作動可能に関連付けられ得る。

「転写制御配列（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）とは、宿主細胞においてコード配列の発現を提供するＤＮＡ調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど）をいう。種々の転写制御領域が、当業者に公知である。これらとしては、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域（例えば、サイトメガロウイルス（イントロン－Ａとともに、最初期プロモーター）、シミアンウイルス４０（初期プロモーター）、およびレトロウイルス（例えば、ラウス肉腫ウイルス）に由来するプロモーターおよびエンハンサーセグメントが挙げられるが、これらに限定されない。他の転写制御領域としては、脊椎動物遺伝子（例えば、アクチン、ヒートショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギβグロビン）、ならびに真核生物細胞において遺伝子発現を制御し得る他の配列に由来するものが挙げられる。さらなる適切な転写制御領域としては、組織特異的プロモーターおよびエンハンサー、ならびにリンホカイン誘導性プロモーター（例えば、インターフェロンもしくはインターロイキンによって誘導可能なプロモーター）が挙げられる。

同様に、種々の翻訳制御エレメントが、当業者に公知である。これらとしては、リボソーム結合部位、翻訳開始および終結コドン、ならびにピコルナウイルスに由来するエレメント（特に、内部リボソーム進入部位すなわちＩＲＥＳ（ＣＩＴＥ配列ともいわれる））が挙げられるが、これらに限定されない。

用語「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」とは、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドが遺伝子産物（例えば、ＲＮＡまたはポリペプチド）を生成するプロセスをいう。それは、ポリヌクレオチドをメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または任意の他のＲＮＡ生成物へと翻訳すること、およびｍＲＮＡをポリペプチドへと翻訳することを含むが、これらに限定されない。発現は、「遺伝子産物（ｇｅｎｅ ｐｒｏｔｕｃｔ）」を生成する。本明細書で使用される場合、遺伝子産物は、核酸（例えば、遺伝子の転写によって生成されるメッセンジャーＲＮＡ）、または転写物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書で記載される遺伝子産物は、転写後修飾（例えば、ポリアデニル化またはスプライシング）を有する核酸、または翻訳後修飾（例えば、メチル化、グリコシル化、脂質の付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、またはタンパク質分解性切断）を有するポリペプチドをさらに含む。

「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」とは、核酸のクローニングおよび／または宿主細胞への核酸の移入のための任意のビヒクルをいう。ベクターは、別の核酸セグメントが、結合したセグメントの複製をもたらすように結合され得るレプリコンであり得る。用語「ベクター」は、上記核酸を細胞へとインビトロで、エキソビボで、またはインビボで導入するためのウイルスおよび非ウイルスビヒクルの両方を含む。多くのベクターが公知であり、当該分野で使用される（例えば、プラスミド、改変された真核生物性ウイルス、または改変された細菌性ウイルスが挙げられる）。適切なベクターへのポリヌクレオチドの挿入は、適切なポリヌクレオチドフラグメントを、相補的な粘着末端を有する選択されたベクターにライゲーションすることによって達成され得る。

ベクターは、上記ベクターを組み込んだ細胞の選択または同定を提供する選択マーカーまたはレポーターをコードするように操作され得る。選択マーカーまたはレポーターの発現は、上記ベクター上に含まれる他のコード領域を組み込み、発現する宿主細胞の同定および／または選択を可能にする。当該分野で公知のかつ使用される選択マーカー遺伝子の例としては、以下が挙げられる： アンピシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ビアラホス除草剤、スルホンアミドなどへの耐性を提供する遺伝子；および表現型マーカーとして使用される遺伝子（すなわち、アントシアニン調節遺伝子、イソペンタニルトランスフェラーゼ遺伝子など）。当該分野で公知のかつ使用されるレポーターの例としては、以下が挙げられる： ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、－ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、－グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）など。選択マーカーはまた、レポーターであると考えられ得る。

使用され得る真核生物性ウイルスベクターとしては、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルスベクター）、バキュロウイルスベクター、またはヘルペスウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。非ウイルスベクターとしては、プラスミド、リポソーム、荷電された脂質（サイトフェクチン（ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ））、ＤＮＡ－タンパク質複合体、および生体ポリマーが挙げられる。

「プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」および「プロモーター配列（ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、交換可能に使用され、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御し得るＤＮＡ配列をいう。一般に、コード配列は、プロモーター配列に対して３’側に位置する。プロモーターは、それらの全体において天然の遺伝子に由来し得るか、または天然において見出される異なるプロモーターから由来する異なるエレメントから構成され得るか、またはさらには、合成ＤＮＡセグメントを含む。異なるプロモーターが、異なる組織もしくは細胞タイプにおいて、または異なる発生段階において、または異なる環境的もしくは生理学的条件に応じて、遺伝子の発現を指示し得ることは、当業者によって理解される。大部分の細胞タイプにおいて、大部分の場合に、遺伝子を発現させるプロモーターは、一般には「構成的プロモーター（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」といわれる。特定の細胞タイプにおいて遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「細胞特異的プロモーター（ｃｅｌｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」または「組織特異的プロモーター（ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」といわれる。特定の発生または細胞分化の段階において遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「発生特異的プロモーター（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌｌｙ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」または「細胞分化特異的プロモーター（ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ」」といわれる。プロモーターを誘導する薬剤、生物学的分子、化学物質、リガンド、光などへの細胞の曝露またはそれらでの細胞の処理後に誘導され、遺伝子を発現させるプロモーターは、一般に「誘導性プロモーター（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」または「調節性プロモーター（ｒｅｇｕｌａｔａｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」といわれる。大部分の場合において、調節配列の正確な境界が完全に定義されているわけではないことから、異なる長さのＤＮＡフラグメントが同一のプロモーター活性を有し得ることはさらに認識される。

用語「プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）」とは、しばしば、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を運び、通常は、環状の２本鎖ＤＮＡ分子の形態にある染色体外エレメントをいう。このようなエレメントは、任意の供給源に由来する１本鎖もしくは２本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡの直線状、環状、もしくはスーパーコイルの、自律的に複製する配列、ゲノム組み込み配列、ファージもしくはヌクレオチド配列であり得る。その中で、多くのヌクレオチド配列が、プロモーターフラグメントおよび選択された遺伝子産物に関するＤＮＡ配列を、適切な３’非翻訳配列とともに細胞へと導入し得る特有の構造へと結合されているまたは組み換えられている。

ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドとある特定のパーセントの「配列同一性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」を有する。これは、整列された場合に、塩基またはアミノ酸のそのパーセンテージが、その２つの配列を比較すると同じであることを意味する。配列類似性は、多くの異なる様式で決定され得る。配列同一性を決定するために、配列を、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてワールドワイドウェブで入手可能な、ＢＬＡＳＴを含む方法およびコンピュータープログラムを使用して整列し得る。別のアラインメントアルゴリズムは、ＦＡＳＴＡであり、Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．， ＵＳＡからＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージの中で利用可能である。アラインメントに関する他の技術は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ． ２６６： Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ （１９９６）， 編． Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．において記載される。配列の中でギャップを許容するアラインメントプログラムは、特に重要である。Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列アラインメントにおいてギャップを許容するアルゴリズムのうちの１タイプである。Ｍｅｔｈ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ７０： １７３－１８７ （１９９７）を参照のこと。また、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈアラインメント法を使用するＧＡＰプログラムは、配列を整列させるために利用され得る。Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３－４５３ （１９７０）を参照のこと。

１つの実施形態において、本発明は、配列番号２のポリペプチド（ヒトＲＥＰ１）をコードするヌクレオチド配列を含む改変された核酸分子を提供し、ここで上記核酸配列は、コドン最適化されている。別の実施形態において、配列番号２のポリペプチドをコードし、コドン最適化を受ける出発核酸配列は、配列番号３として示されるヌクレオチド配列を有する。好ましい実施形態において、配列番号２のポリペプチドをコードする配列は、ヒト発現のためにコドン最適化される。配列番号１は、ヒト発現のために最適化された、配列番号３のコドン最適化したバージョンである。：

いくつかの実施形態において、ヒトＲＥＰ１をコードするコドン最適化された配列は、配列番号１のＴＡＡ終止コドンを欠いて提供される（すなわち、配列番号１のヌクレオチド１～１９５９からなる）。

１つの局面において、本開示は、配列番号１のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、または配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％同一であり、かつ配列番号２のアミノ酸配列を有するヒトＲＥＰ１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する：

用語「コドン最適化された（ｃｏｄｏｎ－ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）」とは、種々の宿主の形質転換のための核酸分子の遺伝子またはコード領域に言及する場合、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドを変化させることなく、宿主生物の代表的なコドン使用を反映させる上記核酸分子の遺伝子またはコード領域におけるコドンの変更に言及する。このような最適化は、少なくとも１つの、または１つより多くの、またはかなりの数のコドンを、その生物の遺伝子においてより頻繁に使用される１もしくはこれより多くのコドンで置き換えることを含む。

任意のポリペプチド鎖のアミノ酸配列をコードするコドンを含むヌクレオチド配列における偏差は、その遺伝子をコードする配列においてバリエーションを可能にする。各コドンは３個のヌクレオチドからなり、ＤＮＡを構成するヌクレオチドが４個の特異的塩基に制限されることから、ヌクレオチドの６４種の考えられる組み合わせが存在し、そのうちの６１種はアミノ酸をコードする（残りの３種のコドンは、翻訳を終結するシグナルをコードする）。どのコドンがどのアミノ酸をコードするかを示す「遺伝コード（ｇｅｎｅｔｉｃ ｃｏｄｅ）」は、本明細書中、表１として再掲される。結果として、多くのアミノ酸は、１種より多くのコドンによって示される。例えば、アミノ酸アラニンおよびプロリンは、４種の三つ組によって、セリンおよびアルギニンは、６種の三つ組によってコードされるのに対して、トリプトファンおよびメチオニンは、ただ１種の三つ組によってコードされる。この縮重は、ＤＮＡ塩基組成が、ＤＮＡによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく、広い範囲にわたって変動することを可能にする。
表-US-00001 表1 標準的遺伝コード

多くの生物は、成長中のペプチド鎖の中に特定のアミノ酸を挿入するためのコードに対して、特定のコドンの使用に関するバイアスを示す。生物間でのコドン使用における差異であるコドン優先性、またはコドンバイアスは、遺伝コードの縮重によって与えられ、多くの生物間で十分に記録されている。コドンバイアスはしばしば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関し、これは、次に、特に、翻訳されているコドンの特性および特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられる。細胞において選択されるｔＲＮＡが優位であることは、一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンの反映である。よって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて所定の生物における最適な遺伝子発現に合わせて調整され得る。

広く種々の動物、植物および微生物種に関して利用可能な遺伝子配列が多数あることを考慮して、コドン使用の相対的頻度が計算されてきた。コドン使用の表は、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／（２０１２年１月１８日に訪問）において利用可能な「Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ」で入手可能である。Ｎａｋａｍｕｒａ， Ｙ．，ら． Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８：２９２（２０００）を参照のこと。

所定のポリペプチド配列をコードするために最適化された頻度でのコドンの無作為割り当ては、各アミノ酸に関するコドン頻度を計算し、次いで、そのコドンを上記ポリペプチド配列に無作為に割り当てることによって、手動で行われ得る。さらに、種々のアルゴリズムおよびコンピューターソフトウェアプログラムは、最適な配列を計算するために使用され得る。

非ウイルスベクター

いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるように改変された核酸を含む非ウイルスベクター（例えば、発現プラスミド）が、提供される。好ましくは、上記非ウイルスベクターは、配列番号１の核酸配列、または配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含むプラスミドである。

ウイルスベクター

好ましい実施形態において、本明細書で記載されるように改変された（コドン最適化された）核酸を含むウイルスベクターが、提供される。好ましくは、上記ウイルスベクターは、発現制御配列に作動可能に連結された、配列番号１の核酸配列、または配列番号１の核酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む。適切なウイルスベクターの例としては、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。

好ましい実施形態において、上記ウイルスベクターは、パルボウイルスゲノムの一部を含む（例えば、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子が欠失されているならびに／または改変されたＲＥＰ１遺伝子配列およびその関連する発現制御配列によって置き換えられているＡＡＶゲノム）。上記改変されたヒトＲＥＰ１遺伝子配列は、代表的には、ウイルスのｒｅｐおよびｃａｐタンパク質をコードする核酸の代わりに、ウイルス複製に適した１個または２個のＡＡＶ ＴＲエレメントに隣接して（すなわち、それらに挟まれて）挿入される（Ｘｉａｏら， １９９７， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１（２）： ９４１－９４８）。標的細胞における改変されたＲＥＰ１遺伝子配列の組織特異的発現を促進するのに使用するために適した他の調節配列がまた、含められ得る。

いくつかの好ましい実施形態において、上記ＡＡＶウイルスベクターは、５’から３’へと： （ａ）ＡＡＶ２末端反復、（ｂ）ＣＡＧプロモーター、（ｃ）本明細書で記載されるようにコドン最適化したＲＥＰ１遺伝子、（ｄ）ポリアデニル化配列、および（ｅ）ＡＡＶ２末端反復を含む核酸を含む。特に好ましい実施形態において、上記ＡＡＶウイルスベクターは、配列番号５の配列または配列番号５の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一の配列を含む核酸（導入遺伝子カセット）を含む：

配列番号５の導入遺伝子カセットの構成要素およびそれらそれぞれの位置は、以下の表２において特定される：
表２

上記５’ ＩＴＲは、以下の配列を有する：

上記３’ ＩＴＲは、以下の配列を有する：

上記ＳＶ４０ポリアデニル化配列は、以下の配列を有する：

当業者は、導入遺伝子を含み、ウイルス複製に必要とされるウイルスタンパク質（例えば、ｃａｐおよびｒｅｐ）を欠いているＡＡＶベクターが、このようなタンパク質がウイルス複製およびパッケージングにとって必要であることから複製できないことを理解する。ヘルパーウイルスとしては、代表的には、アデノウイルスまたは単純ヘルペスウイルスが挙げられる。あるいは、以下で考察されるように、上記ヘルパー機能（Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４、およびＶＡ ＲＮＡ）は、種々のヘルパーエレメントをコードする１もしくはこれより多くの核酸で細胞をトランスフェクトすることによるものを含むパッケージング細胞に提供され得る、および／または上記細胞は、上記ヘルパータンパク質をコードする上記核酸を含み得る。例えば、ＨＥＫ ２９３を、ヒト細胞をアデノウイルス５ ＤＮＡで形質転換することによって生成したところ、今や多くのアデノウイルス遺伝子（Ｅ１およびＥ３が挙げられるが、これらに限定されない）を発現する（例えば、Ｇｒａｈａｍら， １９７７， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ３６：５９－７２を参照のこと）。従って、それらのヘルパー機能は、例えば、それらをコードするプラスミドによって上記細胞に供給する必要性なしに、ＨＥＫ ２９３パッケージング細胞によって提供され得る。

上記ウイルスベクターは、任意の適切な核酸構築物（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ構築物）であり得、１本鎖、２本鎖、または二重鎖であり得る（すなわち、ＷＯ ２００１／９２５５１に記載されるように自己相補的）。

上記パッケージされたウイルスベクターのウイルスキャプシド構成要素は、パルボウイルスキャプシドであり得る。ＡＡＶ Ｃａｐおよびキメラキャプシドが好ましい。例えば、上記ウイルスキャプシドは、ＡＡＶキャプシドであり得る（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７ ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＲＨＭ４－１、ＡＡＶ２－ＴＴ、ＡＡＶ２－ＴＴ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ヘビＡＡＶ、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、および現在公知のまたは後に発見される任意の他のＡＡＶ）。例えば、Ｆｉｅｌｄｓら， ＶＩＲＯＬＯＧＹ， ｖｏｌｕｍｅ ２， ｃｈａｐｔｅｒ ６９（４．ｓｕｐ．ｔｈ ｅｄ．， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照のこと。

いくつかの実施形態において、上記パッケージされたウイルスベクターのウイルスキャプシド構成要素は、天然のＡＡＶキャプシドの改変体である（すなわち、天然のＡＡＶキャプシドに対して１もしくはこれより多くの改変を含む）。いくつかの実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５またはＡＡＶ８キャプシドの改変体である。好ましい実施形態において、上記キャプシドは、ＡＡＶ２キャプシドの改変体である（例えば、米国特許出願公開第２０１９／０２５５１９２Ａ１号に記載されるもの（例えば、配列番号４２～５９のいずれかのアミノ酸配列を含む））。特に好ましい実施形態において、上記キャプシドは、以下のアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含む：

配列番号９の改変体ＡＡＶキャプシドタンパク質は、天然のＡＡＶ２キャプシドに対して以下の改変を含む： （ｉ）アセンブルされたキャプシド（ＶＰ１タンパク質のみ）の内部に位置するアミノ酸位置３４においてプロリン（Ｐ）からアラニン（Ａ）への変異、および（ｉｉ）ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３に存在するアミノ酸位置５８８における１０個のアミノ酸（ロイシン－アラニン－イソロイシン－セリン－アスパラギン酸－グルタミン－スレオニン－リジン－ヒスチジン－アラニン／ＬＡＩＳＤＱＴＫＨＡ）の挿入。

ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質の完全体（full complement）は、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を含む。ＡＡＶ ＶＰキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＯＲＦは、完全体より小さいＡＡＶ Ｃａｐタンパク質を含んでいてもよいし、ＡＡＶ Ｃａｐタンパク質の完全体が提供されてもよい。

さらに別の実施形態において、本発明は、治療的なインビボ遺伝子治療における使用のための先祖ＡＡＶベクターの使用を提供する。具体的には、インシリコ由来配列を新たに合成し、生物学的活性について特徴づけた。この努力は、９個の機能的推定先祖ＡＡＶの生成およびＡｎｃ８０の同定、ＡＡＶ血清型１、２、８および９の予測される先祖をもたらした（Ｚｉｎｎら， ２０１５， Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １２：１０５６－１０６８）。ウイルス粒子へのアセンブルに加えて、このような先祖配列の予測および合成は、ＷＯ ２０１５／０５４６５３（その内容は、本明細書に参考として援用される）に記載される方法を使用することによって達成され得る。顕著なことには、先祖ウイルス配列からアセンブルされたウイルス粒子の使用は、現在のウイルスまたはその一部より、現在のヒト集団において既存の免疫に対して低減した感受性を示し得る。

本発明は、本発明のパッケージされたウイルスベクターを生成するために培養され得るパッケージング細胞（これは、「宿主細胞（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）」によって包含される）を含み得る。本発明のパッケージング細胞は、一般に、異種の（１）ウイルスベクター機能、（２）パッケージング機能、および（３）ヘルパー機能を有する細胞を含む。これらの構成要素の機能の各々は、次の節において考察される。

最初に、上記ベクターは、当業者に公知のいくつかの方法によって作製され得る（例えば、ＷＯ ２０１３／０６３３７９を参照のこと）。好ましい方法は、Ｇｒｉｅｇｅｒら， ２０１５， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２４（２）：２８７－２９７（その内容は、全ての目的のために本明細書に参考として援用される）に記載される。簡潔には、ＨＥＫ２９３細胞の効率的トランスフェクションが出発点として使用され、ここで適格な臨床用マスターセルバンクからの接着性ＨＥＫ２９３細胞株が、迅速かつスケール調整可能なｒＡＡＶ生成を可能にする振盪フラスコおよびＷＡＶＥバイオリアクター中での動物構成要素非含有懸濁条件において増殖させるために使用される。三重トランスフェクション法（例えば、ＷＯ ９６／４０２４０）を使用すると、懸濁ＨＥＫ２９３細胞株は、トランスフェクション後４８時間で採取される場合に１０^５ ベクターゲノム含有粒子（ｖｇ）／細胞を超えるまたは１０^１４ ｖｇ／Ｌを超える細胞培養物を生成する。より具体的には、三重トランスフェクションとは、上記パッケージング細胞が、３種のプラスミド（１種のプラスミドは、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をコードし、別のプラスミドは、種々のヘルパー機能をコードし（例えば、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４、およびＶＡ ＲＮＡのようなアデノウイルスまたはＨＳＶタンパク質）、別のプラスミドは、導入遺伝子およびその種々の制御エレメント（例えば、改変されたＲＥＰ１遺伝子およびＣＡＧプロモーター）をコードする）でトランスフェクトされるという事実に言及する。

所望の収量を達成するために、多くの変数が最適化される（例えば、増殖およびトランスフェクションの両方を支援する、適合する無血清懸濁培地の選択、トランスフェクション試薬、トランスフェクション条件および細胞密度の選択）。イオン交換クロマトグラフィー法に基づく普遍的な精製ストラテジーがまた開発され、これは、ＡＡＶ血清型１～６、８、９および種々のキメラキャプシドの高純度ベクター調製を生じた。このユーザーに優しいプロセスは、１週間以内に完了され得、完全粒子：空の粒子の高い比を生じ（＞９０％完全粒子）、精製後収量（＞１０^１３ ｖｇ／Ｌ）および臨床適用に適した純度を提供し、全ての血清型およびキメラ粒子に関して普遍的である。このスケール調整可能な製造技術は、網膜血管新生（ＡＡＶ２）、血友病Ｂ（ｓｃＡＡＶ８）、巨大軸索性ニューロパチー（ｓｃＡＡＶ９）および網膜色素変性（ＡＡＶ２）のためのＧＭＰフェーズＩ臨床ＡＡＶベクター（これらは、患者へと投与された）を製造するために利用されてきている。さらに、トランスフェクション後の多くの時点で培養培地からｒＡＡＶを採取する工程を包含する灌流法を実行することによって、全体的なベクター生成が最小でも５倍増大する。

パッケージング細胞は、パッケージングおよびベクター機能とともに、ウイルスベクター機能を含む。上記ウイルスベクター機能は、代表的には、パルボウイルスゲノムの一部（例えば、ｒｅｐおよびｃａｐが欠失され、改変されたＲＥＰ１配列およびその関連する発現制御配列によって置き換えられたＡＡＶゲノム）を含む。上記ウイルスベクター機能は、パッケージングのために上記ウイルスベクターの複製を生じるために十分な発現制御配列を含む。代表的には、上記ウイルスベクターは、パルボウイルスゲノムの一部（例えば、ｒｅｐおよびｃａｐが欠失され、導入遺伝子およびその関連する発現制御配列によって置き換えられたＡＡＶゲノム）を含む。上記導入遺伝子は、代表的には、欠失させたウイルスｒｅｐおよびｃａｐ ＯＲＦの代わりに、２個のＡＡＶ ＴＲによって挟まれる。適切な発現制御配列が含められる（例えば、組織特異的プロモーターおよび標的細胞における導入遺伝子の組織特異的発現を促進することにおける使用に適した他の調節配列）。上記導入遺伝子は、代表的には、治療用ポリペプチドまたはマーカーポリペプチドを生成するために発現され得る核酸配列である。

上記ウイルスベクターにおける使用のために選択された上記末端反復（ＴＲ）（分解性（ｒｅｓｏｌｖａｂｌｅ）および非分解性）は、好ましくは、ＡＡＶ配列（血清型１、２、３、４、５および６が好ましい）である。分解性ＡＡＶ ＴＲは、ＴＲが所望の機能（例えば、ウイルスパッケージング、組み込み、および／またはプロウイルスレスキューなど）を媒介する限りにおいて、野生型ＴＲ配列を有する必要はない（例えば、野生型配列は、挿入、欠失、短縮またはミスセンス変異によって変更され得る）。上記ＴＲは、ＡＡＶ逆位末端反復として機能する合成配列（例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉらの米国特許第５，４７８，７４５号（その全開示は、その全体において本明細書に参考として援用される）に記載されるとおりの「二重Ｄ配列（ｄｏｕｂｌｅ－Ｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」）であり得る。代表的であって、必須ではないが、上記ＴＲは、同じパルボウイルスに由来する（例えば、両方のＴＲ配列が、ＡＡＶ２に由来する）。

上記パッケージング機能は、キャプシド構成要素を含む。上記キャプシド構成要素は、好ましくは、パルボウイルスキャプシド（例えば、ＡＡＶキャプシドまたはキメラＡＡＶキャプシド機能）に由来する。適切なパルボウイルスのウイルスキャプシド構成要素の例は、パルボウイルス科（例えば、自律的パルボウイルスまたはディペンドウイルス）に由来するキャプシド構成要素である。例えば、上記キャプシド構成要素は、ＡＡＶキャプシド、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＲＨＭ４－１、ＲＨＭ１５－１、ＲＨＭ１５－２、ＲＨＭ１５－３／ＲＨＭ１５－５、ＲＨＭ１５－４、ＲＨＭ１５－６、ＡＡＶ Ｈｕ．２６、ＡＡＶ１．１、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．３．１、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ２ｉ８Ｇ９、ＡＡＶ２－ＴＴ、ＡＡＶ２－ＴＴ－Ｓ３１２Ｎ、ＡＡＶ３Ｂ－Ｓ３１２Ｎ、およびＡＡＶ－ＬＫ０３、ならびに未だ同定されていないかまたは非ヒト霊長類供給源に由来する他の新規なキャプシドから選択される。キャプシド構成要素は、２またはこれより多くのＡＡＶキャプシドからの構成要素を含み得る。

パッケージされたウイルスベクターは、ベクターＤＮＡのパッケージングおよび形質導入された細胞における改変されたＲＥＰ１遺伝子配列のその後の発現を生じるために十分な、ＴＲエレメントに挟まれた改変されたＲＥＰ１遺伝子配列および発現制御配列（本明細書で「導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）」または「導入遺伝子発現カセット（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）」といわれる）を概して含む。上記ウイルスベクター機能は、例えば、プラスミドまたはアンプリコンの構成要素として細胞に供給され得る。上記ウイルスベクター機能は、細胞株内で染色体外に存在してもよい、および／または細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれてもよい。

ウイルスベクター機能を有するヌクレオチド配列を、複製およびパッケージングのための細胞宿主へと導入する任意の方法が使用され得る。その方法としては、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、カチオン性もしくはアニオン性のリポソーム、および核局在化シグナルと組み合わせたリポソームが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスベクター機能がウイルスベクターを使用するトランスフェクションによって提供される実施形態において；ウイルス感染を生じさせるための標準的な方法が使用され得る。

上記パッケージング機能は、ウイルスベクター複製およびパッケージングのための遺伝子を含む。従って、例えば、上記パッケージング機能は、必要とされる場合、ウイルス遺伝子発現、ウイルスベクター複製、組み込まれた状態からのウイルスベクターのレスキュー、ウイルス遺伝子発現、およびウイルス粒子へのウイルスベクターのパッケージングに必要な機能を含み得る。上記パッケージング機能は、遺伝子構築物（例えば、プラスミドまたはアンプリコン）、バキュロウイルス、またはＨＳＶヘルパー構築物を使用して、パッケージング細胞へと一緒にまたは別個に供給され得る。上記パッケージング機能は、パッケージング細胞内で染色体外に存在し得るが、好ましくは、細胞の染色体ＤＮＡへと組み込まれる。例としては、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。

上記ヘルパー機能は、パッケージング細胞の活発な感染を確立するために必要とされるヘルパーウイルスエレメントを含み、それは、ウイルスベクターのパッケージングを開始するために必要とされる。例としては、ウイルスベクターのパッケージングを生じるために十分なアデノウイルス、バキュロウイルスおよび／またはヘルペスウイルスに由来する機能を含む。例えば、アデノウイルスヘルパー機能は、代表的には、アデノウイルス構成要素Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ４、およびＶＡ ＲＮＡを含む。上記パッケージング機能は、上記パッケージング細胞の、必要とされるウイルスでの感染によって供給され得る。上記パッケージング機能は、遺伝子構築物（例えば、プラスミドまたはアンプリコン）を使用して、上記パッケージング細胞へと一緒にまたは別個に供給され得る。例えば、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚら， ２００２， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７６：７９１に記載されるとおりのｐＸＲヘルパープラスミド、およびＧｒｉｍｍら， １９９８， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９：２７４５－２７６０に記載されるｐＤＧプラスミドを参照のこと。上記パッケージング機能は、パッケージング細胞内で染色体外に存在し得るが、好ましくは、上記細胞の染色体ＤＮＡへと組み込まれる（例えば、ＨＥＫ ２９３細胞中のＥ１またはＥ３）。

任意の適切なヘルパーウイルス機能が、使用され得る。例えば、上記パッケージング細胞が昆虫細胞である場合、バキュロウイルスがヘルパーウイルスとして働き得る。ヘルペスウイルスはまた、ＡＡＶパッケージング方法においてヘルパーウイルスとして使用され得る。ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするハイブリッドヘルペスウイルスは、有利なことには、よりスケール調整可能なＡＡＶベクター生成スキームを容易にし得る。

ヘルパー機能を有するヌクレオチド配列を、複製およびパッケージングのための細胞宿主へと導入する任意の方法が、使用され得る。その方法としては、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、カチオン性もしくはアニオン性のリポソーム、および核局在化シグナルと組み合わせたリポソームが挙げられるが、これらに限定されない。ヘルパー機能が、ウイルスベクターを使用するトランスフェクションまたはヘルパーウイルスを使用する感染によって提供される実施形態において；ウイルス感染を生じさせるための標準的な方法が使用され得る。

当該分野で公知の任意の適切な許容性細胞またはパッケージング細胞が、パッケージされたウイルスベクターの生成において使用され得る。哺乳動物細胞または昆虫細胞が、好ましい。本発明の実施においてパッケージング細胞の生成のために有用な細胞の例としては、例えば、ヒト細胞株（例えば、ＶＥＲＯ、ＷＩ３８、ＭＲＣ５、Ａ５４９、ＨＥＫ ２９３細胞（これらは構成的プロモーターの制御下で機能的なアデノウイルスＥ１を発現する）、Ｂ－５０または任意の他のＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２、Ｓａｏｓ－２、ＨｕＨ７、およびＨＴ１０８０細胞株が挙げられる。１つの局面において、上記パッケージング細胞は、懸濁培養において増殖させられ得、より好ましくは、上記細胞は、無血清培地中で増殖させられ得る。１つの実施形態において、上記パッケージング細胞は、無血清培地中での懸濁状態で増殖するＨＥＫ２９３である。別の実施形態において、上記パッケージング細胞は、米国特許第９，４４１，２０６号に記載され、ＡＴＣＣ Ｎｏ． ＰＴＡ １３２７４として寄託されたＨＥＫ２９３細胞である。多くのｒＡＡＶパッケージング細胞株が、当該分野で公知である（ＷＯ ２００２／４６３５９に開示されるものが挙げられるが、これらに限定されない）。別の局面において、上記パッケージング細胞は、細胞スタック（cell stack）の形態において培養される（例えば、ＨＥＫ２９３細胞で播種された１０層の細胞スタック）。

パッケージング細胞として使用するための細胞株としては、昆虫細胞株が挙げられる。ＡＡＶの複製を可能にし、培養物中で維持され得る任意の昆虫細胞が、本発明に従って使用され得る。例としては、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（例えば、Ｓｆ９またはＳｆ２１細胞株）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｐｐ．細胞株、または蚊の細胞株（例えば、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ由来細胞株）が挙げられる。好ましい細胞株は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ Ｓｆ９細胞株である。以下の参考文献は、異種のポリペプチドの発現のための昆虫細胞の使用に関するそれらの技術、核酸をこのような細胞に導入する方法、および培養物においてこのような細胞を維持する方法に関して本明細書に参考として援用される： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 編． Ｒｉｃｈａｒｄ， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ Ｊ （１９９５）； Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら， Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ． Ｐｒｅｓｓ （１９９４）； Ｓａｍｕｌｓｋｉら， １９８９， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３：３８２２－３８２８； Ｋａｊｉｇａｙａら， １９９１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８： ４６４６－４６５０； Ｒｕｆｆｉｎｇら， １９９２， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６：６９２２－６９３０； Ｋｉｍｂａｕｅｒら， １９９６， Ｖｉｒｏｌ． ２１９：３７－４４； Ｚｈａｏら， ２０００， Ｖｉｒｏｌ． ２７２：３８２－３９３；およびＳａｍｕｌｓｋｉら， 米国特許第６，２０４，０５９号。

本発明に従うウイルスキャプシドは、当該分野で公知の任意の方法を使用して、例えば、バキュロウイルスからの発現によって生成され得る（Ｂｒｏｗｎら， （１９９４） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９８：４７７－４８８）。さらなる代替として、本発明のウイルスベクターは、例えば、Ｕｒａｂｅら， ２００２， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １３：１９３５－１９４３によって記載されるように、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子およびｒＡＡＶテンプレートを送達するために、バキュロウイルスベクターを使用して昆虫細胞において生成され得る。

別の局面において、本発明は、昆虫細胞でのｒＡＡＶ生成の方法を提供し、ここでバキュロウイルスパッケージングシステムまたはベクターは、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐコード領域を運ぶために、これらの遺伝子をバキュロウイルスベクターのポリへドリンコード領域へと操作し、宿主細胞へのトランスフェクションによってウイルス組換え体を生成することによって構築され得る。顕著なことには、ＡＡＶのためにバキュロウイルス生成を使用する場合、好ましくは上記ＡＡＶ ＤＮＡベクター生成物は、ＡＡＶ ＩＴＲへの変異を使用しない自己相補的ＡＡＶ様分子である。これは、機能的Ｒｅｐ酵素活性を欠くことによって、自己相補的ＤＮＡ分子を生じる昆虫細胞での不十分なＡＡＶニック形成の副生成物であると思われる。宿主細胞は、バキュロウイルス感染細胞であるか、またはバキュロウイルスヘルパー機能をコードするさらなる核酸をその中に導入されているか、またはこれらのバキュロウイルスヘルパー機能をその中に含む。これらのバキュロウイルスは、上記ＡＡＶ構成要素を発現し得、その後、上記キャプシドの生成を促進し得る。

生成の間に、上記パッケージング細胞は、一般に、ウイルスベクターの複製およびパッケージングを生じるために十分なヘルパー機能およびパッケージング機能とともに、１もしくはこれより多くのウイルスベクター機能を含む。これらの種々の機能は、遺伝子構築物（例えば、プラスミドまたはアンプリコン）を使用して、パッケージング細胞へと一緒にまたは別個に供給され得、それらは、上記細胞株内で染色体外に存在し得るか、または細胞の染色体ＤＮＡへと組み込まれる。

上記細胞は、既に組み込まれた、述べられた機能のうちのいずれか１もしくはこれより多くのものを伴って供給され得る（例えば、染色体外に組み込まれたかまたは細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれた１もしくはこれより多くのベクター機能を有する細胞株、染色体外に組み込まれたかまたは細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれた１もしくはこれより多くのパッケージング機能を有する細胞株、あるいは染色体外に組み込まれたかまたは細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれたヘルパー機能を有する細胞株）。

上記ｒＡＡＶベクターは、当該分野で標準的な方法によって（例えば、カラムクロマトグラフィーまたは塩化セシウム勾配によって）精製され得る。ｒＡＡＶベクターを精製するための方法は、当該分野で公知であり、Ｃｌａｒｋら， １９９９， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １０（６）：１０３１－１０３９； Ｓｃｈｅｎｐｐ ａｎｄ Ｃｌａｒｋ， ２００２， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． ６９：４２７－４４３； 米国特許第６，５６６，１１８号およびＷＯ ９８／０９６５７に記載される方法を含む。

処置方法

ある特定の実施形態において、コロイデレミアの処置を必要とする被験体におけるそのような処置のための方法であって、上記被験体に、治療上有効な量の、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一の、もしくは１００％同一のヌクレオチド配列を有する核酸、またはこのような核酸および少なくとも１種の薬学的に受容可能な賦形剤を含む薬学的組成物を投与する工程による方法が、提供される。

関連する局面において、コロイデレミアの処置において使用するための、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一のもしくは１００％同一のヌクレオチド配列を含む核酸が提供される。

他の関連する局面において、医薬の製造のための、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一のもしくは１００％同一のヌクレオチド配列を含む核酸の使用が提供される。

他の関連する局面において、コロイデレミアの処置のための医薬の製造のための、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一のもしくは１００％同一のヌクレオチド配列を含む核酸の使用が提供される。

いくつかの局面において、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一のもしくは１００％同一のヌクレオチド配列は、発現制御配列に作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、配列番号１のヌクレオチド配列は、ＣＡＧプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの好ましい実施形態において、上記ＣＡＧプロモーターは、配列番号４の配列を有する。

いくつかの実施形態において、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一もしくは１００％同一のヌクレオチド配列は、発現カセットの一部を形成する。いくつかの局面において、上記発現カセットは、５’から３’へと： （ａ）ＡＡＶ２末端反復、（ｂ）ＣＡＧプロモーター、（ｃ）配列番号１のコドン最適化したＲＥＰ１遺伝子、（ｄ）ＳＶ４０ポリアデニル化配列、および（ｅ）ＡＡＶ２末端反復を含む。好ましい実施形態において、上記５’側のＡＡＶ２末端反復は、配列番号６として示されるヌクレオチド配列を有する、および／または上記ＣＡＧプロモーターは、配列番号４として示されるヌクレオチド配列を有する、および／または上記ＳＶ４０ポリアデニル化配列は、配列番号８として示されるヌクレオチド配列を有する、および／または上記３’側のＡＡＶ２末端反復は、配列番号７として示されるヌクレオチド配列を有する。特に好ましい実施形態において、上記発現カセットは、配列番号５のヌクレオチド配列、または配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％同一の配列を含む核酸を含む。

さらなる実施形態において、コロイデレミアの処置を必要とする被験体におけるこのような処置のための方法であって、上記被験体に、治療上有効な量の組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンまたは上記ｒＡＡＶビリオンを含む薬学的組成物を投与する工程であって、上記ｒＡＡＶビリオンは、（ｉ）発現制御配列に作動可能に連結された、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一もしくは１００％同一のヌクレオチド配列を有する核酸、および（ｉｉ）ＡＡＶキャプシドを含む工程による方法が、提供される。

関連する実施形態において、コロイデレミアの処置のための、（ｉ）発現制御配列に作動可能に連結された、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一のもしくは１００％同一のヌクレオチド配列を有する核酸、および（ｉｉ）ＡＡＶキャプシドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンの使用が提供される。

他の関連する実施形態において、コロイデレミアの処置のための医薬の製造のための、（ｉ）発現制御配列に作動可能に連結された、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一のもしくは１００％同一のヌクレオチド配列を有する核酸、および（ｉｉ）ＡＡＶキャプシドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンの使用が提供される。

いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶビリオンは、天然のＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５またはＡＡＶ８キャプシドを含む。他の実施形態において、上記ｒＡＡＶビリオンは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５またはＡＡＶ８に対して１もしくはこれより多くの改変を含む改変体ＡＡＶキャプシドを含む。好ましい実施形態において、上記ＡＡＶキャプシドは、配列番号９の配列を含む。

いくつかの実施形態において、上記ｒＡＡＶビリオンは、（ｉ）天然のＡＡＶ２キャプシドまたはその改変体、および（ｉｉ）５’から３’へと： （ａ）ＡＡＶ２末端反復、（ｂ）ＣＡＧプロモーター、（ｃ）配列番号１のコドン最適化したＲＥＰ１遺伝子、（ｄ）ＳＶ４０ポリアデニル化配列、および（ｅ）ＡＡＶ２末端反復を含む発現カセットを含む。好ましい実施形態において、上記ｒＡＡＶは、（ｉ）配列番号９のキャプシドタンパク質を含むキャプシド、ならびに（ｉｉ）配列番号６の５’側のＡＡＶ２末端反復、配列番号４のＣＡＧプロモーター、配列番号８のＳＶ４０ポリアデニル化配列および配列番号７の３’側のＡＡＶ２末端反復を含む核酸を含む。特に好ましい実施形態において、上記ｒＡＡＶは、（ｉ）配列番号９のキャプシドタンパク質を含むキャプシド、および（ｉｉ）配列番号５のヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。

特に好ましい実施形態において、コロイデレミアの処置における、またはコロイデレミアの処置のための医薬の製造のためのｒＡＡＶの使用が提供され、ここで上記ｒＡＡＶは、（ｉ）配列番号５のヌクレオチド配列を含む核酸および（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含むキャプシドを含む。いくつかの局面において、上記ｒＡＡＶは、硝子体内注射によって投与される。

他の特に好ましい実施形態において、コロイデレミアを処置するための方法であって、上記方法は、被験体に、有効量の、（ｉ）配列番号５のヌクレオチド配列を含む核酸および（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を有するキャプシドタンパク質を含むキャプシドを含むｒＡＡＶを投与する工程を包含する方法が、提供される。いくつかの局面において、上記ｒＡＡＶは、硝子体内注射によって被験体に投与される。

他の局面において、発現制御配列に作動可能に連結された、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一のもしくは１００％同一のヌクレオチド配列を有する核酸、および少なくとも１種の薬学的に受容可能な賦形剤を含む薬学的組成物が、提供される。

いくつかの実施形態において、上記薬学的組成物は、構成的プロモーター（好ましくは、配列番号４のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一のもしくは１００％同一の配列を有するＣＡＧプロモーター）に作動可能に連結された配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸を含む。

他の局面において、少なくとも１種の薬学的に受容可能な賦形剤、ならびに（ｉ）ＡＡＶキャプシド、ならびに（ｉｉ）５’から３’へと： （ａ）ＡＡＶ２末端反復、（ｂ）ＣＡＧプロモーター、（ｃ）配列番号１のコドン最適化したＲＥＰ１遺伝子、（ｄ）ＳＶ４０ポリアデニル化配列および（ｅ）ＡＡＶ２末端反復を含む核酸を含む感染性ｒＡＡＶを含む薬学的組成物が、提供される。関連する実施形態において、上記薬学的組成物は、１０^９ ｖｇ～１０^１４ ｖｇの間、好ましくは１０^１０ ｖｇ～１０^１３ ｖｇの間のｒＡＡＶを含み、より好ましくは、約３×１０^１１ ｖｇまたは約１×１０^１２ ｖｇのｒＡＡＶを含む。

好ましい実施形態において、上記薬学的組成物は、（ｉ）配列番号９の配列を含むかまたはそれからなるキャプシドタンパク質を含むキャプシド、および（ｉｉ）配列番号１のコドン最適化したＲＥＰ１遺伝子を含む核酸を含むｒＡＡＶを含み、ここで上記核酸は、配列番号６の５’側のＡＡＶ２末端反復および／または配列番号４のＣＡＧプロモーターおよび／または配列番号８のＳＶ４０ポリアデニル化配列および／または配列番号７のＡＡＶ２末端反復をさらに含む。関連する実施形態において、上記薬学的組成物は、１０^９ ｖｇ～１０^１４ ｖｇの間、好ましくは１０^１０ ｖｇ～１０^１３ ｖｇの間のｒＡＡＶを含み、より好ましくは、約３×１０^１１ ｖｇまたは約１×１０^１２ ｖｇのｒＡＡＶを含む。

いくつかの実施形態において、ヒト被験体の１もしくはこれより多くの網膜色素上皮細胞および１もしくはこれより多くの桿体光受容細胞においてＲＥＰ１を発現させるための方法であって、上記方法は、上記ヒト被験体に、有効量の、本明細書で記載されるとおりの感染性ｒＡＡＶを投与する工程を包含し、ここで上記ＲＥＰ１は、１もしくはこれより多くの網膜色素上皮細胞および１もしくはこれより多くの桿体光受容細胞において発現される方法が、提供される。いくつかの好ましい実施形態において、感染性ｒＡＡＶの有効量は、１０^９ ｖｇ／眼～１０^１４ ｖｇ／眼である、および／または上記ｒＡＡＶの単回用量は、上記ヒト被験体に（両側または片側に）硝子体内投与される、および／または上記ｒＡＡＶは、配列番号９のキャプシドを含む、および／または上記ｒＡＡＶは、配列番号５のヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。

特に好ましい実施形態において、少なくとも１種の薬学的に受容可能な賦形剤、ならびに（ｉ）配列番号９の配列を含むかまたはそれからなるキャプシドタンパク質を含むキャプシドおよび（ｉｉ）配列番号５のヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる核酸を含む感染性ｒＡＡＶを含む薬学的組成物が、提供される。関連する実施形態において、上記薬学的組成物は、１０^９ ｖｇ～１０^１４ ｖｇの間、好ましくは１０^１０ ｖｇ～１０^１３ ｖｇの間のｒＡＡＶを含み、より好ましくは、約３×１０^１１ ｖｇまたは約１×１０^１２ ｖｇのｒＡＡＶを含む。

いくつかの実施形態において、本明細書で記載されるとおりの核酸または感染性ｒＡＡＶは、コロイデレミアを有するヒトへの眼周囲または眼内（硝子体内、脈絡膜上または網膜下）注射によって投与され、それによって、上記コロイデレミアは、上記被験体において処置される。他の実施形態において、本明細書で記載されるとおりの核酸または感染性ｒＡＡＶは、コロイデレミアを有するヒトに、網膜下または硝子体内に投与され、それによって、上記コロイデレミアは、上記被験体において処置される。好ましい実施形態において、コロイデレミアを有するヒト被験体は、本明細書で記載されるとおりのｒＡＡＶの１回の硝子体内注射（両側または片側）を投与される。

関連する局面において、処置される被験体におけるコロイデレミアの処置は、（ｉ）コントロールと比較して（例えば、処置される患者における処置前のベースライン測定値と比較して、上記核酸またはｒＡＡＶが片側に投与される場合に処置されていない眼と比較して、またはコロイデレミア患者の処置されていない現在のもしくは過去のコントロール群と比較して）視覚的機能（ｖｉｓｕａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）または機能的視力（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｖｉｓｉｏｎ）における改善（すなわち、増大）、ならびに／または（ｉｉ）例えば、処置後６ヶ月、１２ヶ月、または２４ヶ月において、コントロール（例えば、同じ患者の処置されていない眼または処置されていないコントロール群）と比較して、処置された眼における視覚的機能の喪失および／または網膜変性の減少を含む。これらの改善は、適切な眼科学検査（視力検査、マイクロペリメトリー、および他の視野検査、解剖学的検査（例えば、光干渉断層撮影によるスキャンおよび眼底自発蛍光画像化）、網膜電気生理学、および／またはクオリティー・オブ・ライフ（ＱｏＬ）評価が挙げられるが、これらに限定されない）によって評価され得る。

いくつかの局面において、本明細書で記載されるとおりの核酸またはｒＡＡＶ（またはこれらを含む薬学的組成物）の有効量は、ヒト患者においてコロイデレミアを処置するために有効な量である。関連する局面において、本明細書で記載されるとおりのｒＡＡＶの有効量は、１０^９～１０^１４ ｒＡＡＶ粒子（またはベクターゲノム（ｖｇ））／眼）の間、好ましくは１０^１０～１０^１３ ｖｇ／眼の間、または１×１０^１１ ｖｇ／眼～５×１０^１２ ｖｇ／眼の間であり、より好ましくは、約３×１０^１１ ｖｇ／眼または約１×１０^１２ ｖｇ／眼である。いくつかの好ましい実施形態において、約３×１０^１１ ｖｇ／眼または約１×１０^１２ ｖｇ／眼という単回用量が、コロイデレミアを有するヒト患者へと硝子体内に投与され、それによって、コロイデレミアが処置される。

実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を例証し、本発明の範囲を限定することはいずれにしても意図されない。本発明は、その好ましい実施形態に関連して記載されてきたが、その種々の改変は、本出願を読めば当業者に明らかである。

実施例１ － ＲＥＰ１ ｃＤＮＡ配列のコドン最適化
ヒトＲＥＰ１オープンリーディングフレームｃＤＮＡ配列（ＮＣＢＩ参照配列 ＮＭ＿０００３９０．４）を、ヒト発現のためにコドン最適化した。最適化アルゴリズムは、コドン使用バイアス、ＧＣ含有量、ＣｐＧジヌクレオチド含有量、ネガティブＣｐＧアイランド（negative CpG island）、ｍＲＮＡ二次構造、ＲＮＡ不安定性モチーフ、潜在性スプライシング部位、未熟なポリアデニル化部位、内部カイサイト（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｈｉ ｓｉｔｅ）およびリボソーム結合部位、ならびに反復配列が挙げられるが、これらに限定されないパラメーターを含んだ。

天然のヒトＲＥＰ１遺伝子は、翻訳効率を低減し得るかまたはさらには翻訳機構を分離させ（disengage）得る希なタンデムコドンを使用する。ヒトにおけるコドン使用バイアスを、コドン適応指数（ＣＡＩ）を０．７０から０．９４へと上げることよって変化させた。平均ＧＣ含有量を、天然の配列における５４．２４から最適化した配列における６１．２２へと最適化して、ｍＲＮＡの半減期を長くした。ステム－ループ構造（これは、リボソーム結合およびｍＲＮＡの安定性に影響を与える）を、最適化した配列の中で破壊した。さらに、負のｃｉｓ作用部位（例えば、ＡＴＴＴＡ）（そのうちの６箇所を最適化された配列では欠失させている）を、スクリーニングし、欠失させて、ヒト細胞における遺伝子の発現を最適化し、いくつかの制限酵素部位を欠失させた（２個のＢｇｌＩＩ（ＡＧＡＴＣＴ）、１個のＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ）、１個のＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ）および１個のＡＲＥ部位を欠失させた）。

得られたコドン最適化したヌクレオチド配列（配列番号１として示される）は、改善されたコドン使用、変化させたＧＣ含有量、より良好なｍＲＮＡ安定性、および配列番号３の天然の配列に対する負のｃｉｓ作用エレメントの改変を含む。

実施例２ － コドン最適化したＲＥＰ１ ｃＤＮＡ配列は、コロイデレミアを有する患者に由来するＲＰＥ細胞においてより高いレベルで発現される
ヒトインビトロモデルシステムを、ヒトコロイデレミア患者に由来する病的なヒトＲＰＥ細胞において、配列番号１のヌクレオチド配列を有するコドン最適化したヒトＲＥＰ１核酸の発現およびＣＨＭ疾患表現型の機能的補正を評価するために作製した。このモデルシステムを、コロイデレミア（ＣＨＭ）の適切な非ヒト霊長類モデルが前臨床試験に関しては存在しないことから、インビトロ薬理学のために選択した。２つのＣＨＭ患者線維芽細胞サンプルを、ｉＰＳＣへと再プログラミングし、次いで、機能的成熟ＲＰＥ細胞へと分化させた。ＣＨＭ患者におけるＲｅｐ１タンパク質の欠如は、細胞のＲａｂ２７ａ輸送およびプレニル化における欠陥と相関することが示されている（例えば、Ｓｔｒｕｎｎｉｋｏｖａ， Ｎ．Ｖ．ら， ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ． ４， ｅ８４０２ （２００９）； Ｓｅｒｇｅｅｖ， Ｙ．Ｖ．ら， Ｍｕｔａｔ． Ｒｅｓ． － Ｆｕｎｄａｍ． Ｍｏｌ． Ｍｅｃｈ． Ｍｕｔａｇｅｎ， ６６５， ４４－５０ （２００９）； Ｒａｋ， Ａ．ら， Ｃｅｌｌ １１７， ７４９－７６０ （２００４）を参照のこと）。

材料および方法

コロイデレミア患者細胞からの人工多能性幹細胞株の作製

２名のコロイデレミア患者（ここではＣＨＭ１およびＣＨＭ２という）に由来する線維芽細胞の細胞再プログラミングを、Ｓｉｍｐｌｉｃｏｎ ＲＮＡ再プログラミング（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によって行った。１０日目に、およそ５×１０^４～１×１０^５の再プログラミングした細胞を、ヒトｉＰＳＣ Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ Ｂｏｏｓｔ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ＩＩ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を追加補充したＢ１８Ｒタンパク質（２００ｎｇ／ｍＬ）を含むマウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）馴化培地中、増殖因子低減Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に再プレートした。２０日目に、変化した形態および小さなコロニーを形成する能力によって認識される再プログラミングした細胞を、ｍＴｅＳＲ－１培地（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）へと移した。およそ２００個の細胞またはこれより大きなコロニーを、手動で単離し、ｍＴｅＳＲ－１培地中の増殖因子低減Ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングプレート上にプレートした。ＣＨＭ－ｉＰＳＣ株を、１個のコロニーから拡大した。上記ＣＨＭ－ｉＰＳＣ株を、ｍＴｅＳＲ－１維持培地中、Ｖｉｔｒｏｎｅｃｔｉｎ ＸＦ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で培養し、７０～８０％ コンフルエンスにおいて４～５日ごとにＧｅｎｔｌｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して継代した。全３種の胚葉への無作為の分化を確実にするために、ｉＰＳＣ胚様体（ＥＢ）を、１週間にわたって懸濁培養において形成させ、次いで、さらに４週間、ｍＴｅＳＲ－１基礎培地＋２０％ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、接着条件において分化させた。

ヒトコロイデレミア網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞の作製

ＲＰＥ細胞を、以前に記載されるように指向性分化プロトコールによって作製した（Ｌｅａｃｈら， Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ ｖｉｓｕａｌ ｓｃｉｅｎｃｅ ５６（２）：１００２－１３ （２０１５））。簡潔には、ｉＰＳＣを、１×Ｂ２７、１×Ｎ２、および１×ＮＥＡＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を有するＤＭＥＭ／Ｆ１２中のＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で直接継代した。０日目から２日目まで、５０ｎｇ／ｍｌ Ｎｏｇｇｉｎ、１０ｎｇ／ｍｌ Ｄｋｋ１、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）、および１０ｍＭ ニコチンアミドを、基礎培地に添加した。２日目から４日目まで、１０ｎｇ／ｍｌ Ｎｏｇｇｉｎ、１０ｎｇ／ｍｌ Ｄｋｋ１、１０ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ１、および５ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦならびに１０ｍＭ ニコチンアミドを、基礎培地に添加した。４日目から６日目まで、１０ｎｇ／ｍｌ Ｄｋｋ１および１０ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ１ならびに１００ｎｇ／ｍｌ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、基礎培地に添加した。６日目から１４日目まで、１００ｎｇ／ｍｌ Ａｃｔｉｖｉｎ Ａ、１０μＭ ＳＵ５４０２（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、および１ｍＭ ＶＩＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を、基礎培地に添加した。１４日目に、上記細胞を、非ＲＰＥ形態を有する細胞を剥がすことによって機械的に富化した。その後、残りのＲＰＥを、ＴｒｙｐＬＥ Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、約５分間、３７℃において消化した。上記細胞を、３０μｍ 単一細胞ストレーナーに通過させ、Ｍａｔｒｉｇｅｌコーティング組織培養プラスチックトランスウェル膜（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅｓ）、またはＸＶＩＶＯ－１０培地（Ｌｏｎｚａ）中のＣＣ２処理チャンバー付きスライドに播種した。

ヒトコロイデレミアＲＰＥ細胞の機能的特徴付け

ＣＨＭ ＲＰＥ細胞を、配合した培地を使用して培養して、桿体外節（ＲＯＳ）食作用を分析した（Ｍａｍｉｎｉｓｈｋｉｓら， Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ４７（８）：３６１２－２４ （２００６））。細胞を、０．１％ ゼラチンコーティングした黒色壁透明底９６ウェルプレート上に１×１０^５ 細胞／ｃｍ^２において四連でプレートし、３０日間培養した。光受容体ＲＯＳを、以前に記載される（Ｍｏｌｄａｙ ＲＳ ａｎｄ Ｍｏｌｄａｙ ＬＬ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １０５（６ Ｐｔ １）：２５８９－６０１ （１９８７））ようにウシの眼（Ｓｉｅｒｒａ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）から単離し、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）タンパク質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で蛍光標識した。いくつかの条件では、培養した細胞を、６２．５μｇ／ｍｌ αＶβ５インテグリン機能遮断抗体（Ａｂｃａｍ）またはＩｇＧアイソタイプコントロール（Ａｂｃａｍ）で、３０分間、３７℃において処理した。最初の抗体インキュベーション後に、細胞を、１×１０^６ ＦＩＴＣ－ＲＯＳ／ウェルで、５時間、３７℃および５％ ＣＯ２でチャレンジした（Ｂｕｃｈｈｏｌｚら， ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＭＥＤＩＣＩＮＥ ２（５）：３８４－９３ （２０１３））（Ｒｏｗｌａｎｄら， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， ７（８）：６４２－５３ （２０１３））。ＲＯＳインキュベーション後、上記ウェルを、ＰＢＳで６回洗浄し、次いで、０．４％ トリパンブルーを２０分間添加して、細胞外ＲＯＳからの蛍光をクエンチした。各ウェルを、落射蛍光顕微鏡法を使用して画像化し、顕微鏡写真の積算ピクセル密度（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｐｉｘｅｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）を、ローリングピクセル半径（ｒｏｌｌｉｎｇ ｐｉｘｅｌ ｒａｄｉｕｓ）５０を使用して、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアで決定した（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）。

免疫細胞化学

細胞を、４％ パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１５分間、４℃において固定した。全ての抗体染色を、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）－Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、２％ ウシ血清アルブミン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、および５％ ヤギ血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を有するＰＢＳのブロッキング溶液中で行った。一次抗体インキュベーションを、４℃において一晩行った。次いで、細胞を、二次抗体とともに１時間、室温においてインキュベートし、次いで、ＰＢＳ中のＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で５分間、室温において対比染色した。細胞を、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ．Ｄ１を使用して画像化した。画像処理を、Ｚｅｉｓｓ Ｚｅｎ ２ソフトウェアおよびＦＩＪＩを使用して行った。一次抗体および二次抗体のリストを、以下の表３に提供する：
表３：

ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット

ＣＨＭ ＲＰＥ細胞溶解物を、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｔａｂｌｅｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ）を有する標準ＲＩＰＡ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して採取し、氷上で１５分間インキュベートした。次いで、サンプルを、２１×ｇで１５分間遠心分離した。上清を集め、タンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定し、正規化し、２μＭ ＤＴＴに対して調節した。Ｂｉｏｒａｄ ４× Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒを添加し、サンプルを、７０℃において１０分間加熱した。ＸＴ Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎゲルで泳動し、続いて、膜にゲルを転写した。次いで、上記膜をブロッキングし、ＲＥＰ１抗体およびＧＡＤＰＨ抗体でプローブした。膜を、ＨＲＰに結合体化した二次抗体とともにインキュベートし、バンドをＥＣＬで可視化した。

プレニル化アッセイ

プレニル化アッセイを、ＲＰＥ細胞溶解物を使用して、Ｋｏｅｈｎｋｅら， ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８（１２）：１－１１ （２０１３）に記載されるように行った。ＰＢＳでの洗浄後、細胞溶解物を、冷プレニル化緩衝液（５００μＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．０、５０μＭ ＮａＣｌ、２μＭ ＭｇＣｌ_２、０．１μＭ ＧＤＰ、０．５％ ＮＰ－４０、およびＣｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｔａｂｌｅｔ）中で調製し、氷上で１０～１５分間インキュベートした。タンパク質濃度を、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定した。タンパク質濃度を、正規化し、溶解物を２μＭ ＤＴＴに対して調節した。プレニル化反応を、５０～２００μｇ タンパク質に相当する２０μＬの溶解物を使用して行った。機能的複合体に関する反応を、２μＭ ＲａｂＧＧＴａｓｅ、４μＭ Ｒａｂ２７ａおよび４μＭ ＢｉｏｔｉｎＧｅｒａｎｙｌ－ＰＰｉ（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）から構成した。反応を、２５℃において５時間インキュベートし、４× Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏｒａｄ）、ＤＴＴを４０ｍＭへと添加し、７０℃において１０分間加熱することによって停止した。ウェスタンブロット法を、ＸＴ Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎゲル上で製造業者のプロトコールに従って行った。プレニル化反応を、ストレプトアビジン－ＨＲＰ（Ａｂｃａｍ）を使用して分析した。

Ｒａｂ２７Ａ輸送アッセイ

ＲＰＥ細胞を、ビトロネクチンコーティングした８個のチャンバー付きスライド上に２５，０００細胞／ｃｍ^２でＸＶＩＶＯ－１０培地中に播種した。播種の２日後に、ＣＨＭ ＲＰＥ細胞を、（ｉ）配列番号５の配列を有する導入遺伝子発現カセットおよび（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を有する改変されたＡＡＶ２キャプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶビリオンで、５０００ ｖｇ／細胞の感染多重度（ＭＯＩ）において形質導入した。感染の１４日後に、細胞を固定し、上記のように染色した。

実験データ

２名のＣＨＭ患者の線維芽細胞サンプルを得、ｉＰＳＣへと再プログラミングし、続いて、上記のようにＲＰＥ細胞へと分化させた。より具体的には、線維芽細胞（ＣＨＭ１およびＣＨＭ２）の細胞再プログラミングを、制限された細胞分裂数にわたって自己複製するポリシストロン転写物において４種の再プログラミング因子（Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２およびＧｌｉｓ１）を発現する合成のインビトロで転写したＲＮＡを使用して、Ｓｉｍｐｌｉｃｏｎ ＲＮＡ再プログラミングによって行った。ヒトＰＳＣマーカーであるＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２およびＯＣＴ４の免疫細胞化学分析を行って、コロイデレミアｉＰＳＣ株、ＣＨＭ１およびＣＨＭ２の両方の多能性を確認した（図１ａおよび１ｂ）。作製したｉＰＳＣ株の多能性を確認するために、細胞を、ＥＢとして懸濁培養において無作為に分化させ、次いで、４週間にわたって接着条件において分化させ、外胚葉系統、中胚葉系統、および内胚葉系統へと分化する能力に関して評価した。そのときに、外胚葉、中胚葉、および内胚葉にそれぞれ属するニューロン（ＴＵＪ１＋）、平滑筋細胞（ＡＳＭＡ＋）、および肝細胞（ＨＮＦ４Ａ＋）と関連するマーカーを、検出した（図１ｃおよび１ｄ）。多能性を確認した後、ＣＨＭ１およびＣＨＭ２患者の細胞から作製した上記ｉＰＳＣ株を、ＲＰＥ細胞へと分化させた。ＲＰＥ細胞を３０日間成熟させ、続いて、適切なＲＰＥ細胞マーカー発現および機能に関して分析した。Ｍｅｌａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ（ＭＩＴＦ）およびＯｒｔｈｏｄｅｎｔｉｃｌｅ Ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２（ＯＴＸ２）、ＲＰＥ６５およびｚｏｎｕｌａ ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ（ＺＯ－１）のタンパク質発現および局在（図２ａおよび２ｂ）は、正常であった。光受容体外節食作用（ＲＰＥの公知の機能）（図２ｃ）の変化は確認されず、ＣＨＭ ｉＰＳＣ由来ＲＰＥ細胞は、天然のＲＰＥのものに類似の重要な生理学的特徴を示した。

改変されていないＲＥＰ１に対するコドン最適化したＲＥＰ１導入遺伝子の発現レベルを、評価した。その目的のために、以下を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンを、単離した： （ｉ）配列番号９のアミノ酸配列を有する改変されたＡＡＶ２キャプシドタンパク質、および（ｉｉ）配列番号１のコドン最適化したＲＥＰ１または配列番号３の天然のＲＥＰ１（各々、配列番号４のＣＡＧプロモーターの制御下にある）のいずれかを含む導入遺伝子発現カセット。簡潔には、ＣＨＭ ＲＰＥ細胞を、上記ｒＡＡＶビリオンで、２種の異なるＭＯＩ、５００または５０００ ｖｇ／細胞において形質導入した。細胞溶解物を、形質導入の１４日後に集め、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析を行って、ＲＥＰ１発現レベルを評価した。図３Ａ～Ｂに図示されるように、コドン最適化したＲＥＰ１は、改変されていないＲＥＰ１より高い発現レベルを生じた。さらに、ＲＥＰ１タンパク質レベルは、より低い用量（ＭＯＩ ５００ ｖｇ／細胞）において正常ＲＰＥにおいて見出されるレベルに達した。

機能的アッセイを開発して、送達されたＲＥＰ１タンパク質がＲａｂ２７ａ ＧＴＰａｓｅをプレニル化する能力を評価した（図４）。ＣＨＭ ＲＰＥ細胞を、以下を含むｒＡＡＶで形質導入した：（ｉ）配列番号５の配列を有する導入遺伝子発現カセット、および（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を有する改変されたＡＡＶ２キャプシドタンパク質。形質導入したかまたはコントロールのＣＨＭ１およびＣＨＭ２ ＲＰＥ細胞からの細胞溶解物を、感染の１４日後に集めた。野生型ＲＰＥ細胞を、陽性コントロールとして使用した。Ｒａｂ２７ａ ＧＴＰａｓｅのプレニル化は、ＲＥＰ１およびプレニル化ドナーであるＲａｂＧＧＴａｓｅの存在下でのみ起こる。ＲａｂＧＧＴａｓｅからＲａｂ２７ａ ＧＴＰａｓｅへのプレニル転移を可視化するために、プレニル基を、ビオチンで標識した。上記細胞溶解物を、形質導入後に、Ｒａｂ２７ａ ＧＴＰａｓｅ、ＲａｂＧＧＴａｓｅおよびビオチン化プレニル基と合わせた。インビトロ反応物を、５時間インキュベートして、プレニル基転移を最適化した。反応後に、上記溶解物を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析に供した。ＳＡ－ＨＲＰ結合体は、各反応におけるプレニル化のレベルを明らかにした（図５ａ～ｄ）。正常線維芽細胞由来ｉＰＳＣ株に由来するＲＰＥ細胞を、この実験において陽性コントロールとして使用した。

第２の機能実験を行って、Ｒａｂ２７ａ ＧＴＰａｓｅｓのプレニル化が、上記ｒＡＡＶの送達後に、標的膜へのＲａｂ２７ａの適切な輸送を生じることを確認した。ＣＨＭ ＲＰＥ細胞を、低密度（２．５×１０^４ 細胞／ｃｍ^２）において培養し、次いで、以下を含むｒＡＡＶで、５０００ ｖｇ／細胞のＭＯＩにおいて形質導入した （ｉ）配列番号５の配列を有する導入遺伝子発現カセット、および（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を有する改変されたＡＡＶ２キャプシドタンパク質。１４日後、培養物を、抗ＲＥＰ１抗体および抗ＲＡＢ２７Ａ抗体で免疫染色し、画像化して、処理されていない培養物に対して形質導入されたものにおけるＲＡＢ２７Ａの細胞内局在を可視化した。ＣＨＭ ＲＰＥ細胞（図６ａ）の上記ｒＡＡＶでの処理は、正常ＦＢ－ｉＰＳＣ由来ＲＰＥ細胞（図６ｃ）に類似して、細胞質領域から標的膜へのＲＡＢ２７Ａの輸送を引き起こした（図６ｂ）。これらのデータは、配列番号１のコドン最適化したＲＥＰ１の送達の２週間後に、細胞質領域から標的膜へのＲＡＢ２７Ａ輸送が正常化され、この補正が、正常な細胞ＲＰＥ表現型の回復と関連したことを示す。

結論

上記の試験は、配列番号１のコドン最適化したＲＥＰ１が、天然の（改変されていない）ＲＥＰ１遺伝子と比較して、疾患関連（ＲＥＰ１欠損）ヒトＲＰＥ細胞において有意により高いレベルで発現されることを示す。上記試験はまた、配列番号１のコドン最適化したＲＥＰ１から発現されたＲＥＰ１が、機能的であり、プレニル化欠陥（Ｒａｂ２７）をレスキューし、ＲＡｂタンパク質における細胞内輸送欠陥を補正し、従って、病的なＲＰＥ細胞において正常な細胞ＲＰＥ表現型を回復させることを示す。インビトロ薬理学から、ｃｏｈＲＥＰ１が、正常遺伝子と比較した場合に、コロイデレミア患者に由来する網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞におけるＲＥＰ１タンパク質欠損の優れた補正を示すことが示される。

実施例３ － 非ヒト霊長類における硝子体内投与を介してＲ１００によって送達されるコドン最適化したＲＥＰ１ ｃＤＮＡ配列の安全性および生体分布の評価

材料および方法

ＧＬＰ毒物学および生体分布試験
２～１４歳齢の雄性カニクイザル（ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を、１００μＬ／眼の総用量容積について、強膜を介して各眼への２回の５０μＬ 硝子体内注射によって投与した。１×１０^１１ ｖｇ／眼の用量（片側投与）、３×１０^１１ ｖｇ／眼の用量（両側投与のみ）、および１×１０^１２ ｖｇ／眼の用量（片側および両側投与）を評価した。上記動物に、ケタミン ＩＭで麻酔をかけ、局所眼用液剤を、疼痛を排除するために与えた。２０～８０ｍｇのメチルプレドニゾロンを、ＩＭ注射によって注射後毎週投与した。訓練された獣医学スタッフが、投与後３週間目、１３週間目、および２６週間目に、安楽死させた。

４Ｄ－１１０（配列番号９のキャプシドタンパク質および配列番号５のヌクレオチド配列を含む異種核酸を含むｒＡＡＶ）ゲノム生体分布を、検証されたＧＬＰ準拠ｑＰＣＲアッセイを使用して、全ての主要な眼の区画（網膜、視神経、毛様体、虹彩、線維柱帯）、および主要な全身の器官（精巣を含む）において評価した。ゲノムが検出された組織では、導入遺伝子発現を、適格なＧＬＰ準拠ＲＴ－ｑＰＣＲアッセイによって評価した。

上記試験において行われる系列的毒物学評価は、以下であった： 臨床的眼評価（ＳＤ－ＯＣＴ画像化およびＥＲＧを含む完全眼科検査（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ））、全身評価、臨床病理、肉眼病理所見（ｇｒｏｓｓ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）および顕微的病理所見（microscopic pathology）。アッセイを検証して、抗キャプシド抗体および抗導入遺伝子抗体応答を決定した。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを検証して、Ｒ１００キャプシド（配列番号９の改変体キャプシドタンパク質を含む）および発現されたタンパク質に対する細胞応答を検出した。

中和抗体アッセイ

２ｖ６．１１細胞を、３×１０^４ 細胞／ウェルの密度において、感染の２４時間前にプレートした。ＣＡＧプロモーターによって駆動されるホタルルシフェラーゼをコードするｒＡＡＶベクターを、感染前に、３７℃において１時間、個々の血清サンプルとともにインキュベートし、次いで、細胞を、１，０００のゲノムＭＯＩにおいて感染させた。ルシフェラーゼ活性を、Ｌｕｃ－Ｓｃｒｅｅｎ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ－Ｇｌｏｗ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｇｅｎｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＯＮＥ－Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、感染の４８時間後に評価し、ＢｉｏＴｅｋ Ｃｙｔａｔｉｏｎ ３ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ ＲｅａｄｅｒおよびＧｅｎ５ソフトウェアを使用して定量した。

試験に登録する前に、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）血清を、Ｒ１００に対する中和抗体の存在に関してスクリーニングした。サンプルが１：１０血清希釈においてＡＡＶ形質導入の５０％未満の中和を生じた場合に、ＮＨＰを試験に登録した。

ＡＡＶ製造

組換えＲ１００ウイルスベクターを、ＨＥＫ２９３細胞における一過性のトランスフェクションによって生成した。細胞を、ＦＢＳを追加補充したＤＭＥＭ中で培養し、３７℃において５％ ＣＯ_２環境で維持した。細胞を、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して三重トランスフェクションした（ペイロード、キャプシド、およびヘルパープラスミド）。トランスフェクションの４８～９６時間後、ウイルス粒子を細胞および／または上清から採取し、細胞を、微小流動化を介して溶解した。細胞溶解物および／または上清を酵素処理して、プラスミドおよび宿主細胞ＤＮＡを分解し、次いで、清澄化し、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって濃縮した。次いで、そのＴＦＦ保持物を、精製のためにアフィニティー樹脂カラムにロードした。ｐＨ勾配溶離の後、アフィニティー後の材料を緩衝液交換し、次いで、（必要であれば）アニオン交換クロマトグラフィーによってさらに精製した。次いで、精製したｒＡＡＶを、０．００１％ ポリソルベート－２０を有するＤＰＢＳへと製剤化し、濾過滅菌し、充填してｒＡＡＶ薬物製品を得た。

結果

４Ｄ－１１０送達は、安全であり、ＮＨＰにおいて治療用導入遺伝子の発現を生じる。

４Ｄ－１１０（Ｒ１００．ＣＡＧ－ｃｏｈＲｅｐ１）は、フェーズ１－２臨床試験へと進められている。この製品に関する治験薬（ＩＮＤ）許可データ（ＩＮＤ－ｅｎａｂｌｉｎｇ ｄａｔａ）は、２つの別個の６ヶ月間の優良試験所基準（ＧＬＰ）毒物学および生体分布試験における評価を含む（表４）。４４頭のＮＨＰの合計６１の眼に、硝子体内注射によって、片眼投与、逐次的両側投与、または同時両側投与のいずれかで注射した。

表４． 優良試験所基準（ＧＬＰ）毒物学および生体分布試験

臨床所見、組織病理、ＯＣＴ、またはＥＲＧによって決定される場合、いずれの用量レベルでも、４Ｄ－１１０で顕著な毒性は観察されなかった。片眼への４Ｄ－１１０の投与は、最小限から軽度の前部ぶどう膜炎を生じるに過ぎなかった。これは、投与期直後の期間に制限され、３週間目までには消散した（図９）；いくらかの症例では、全身性ステロイド用量は、一過性に増大された。４Ｄ－１１０の両側投与は、低用量群および高用量群の両方において一過性の最小限から中等度の前部ぶどう膜炎を生じた；この所見は、概して２週間以内に消散し、全身性のステロイド処置における増大と一致した。

非常に高いレベルのベクターゲノムが、全ての時点（３週間目、左パネル；１３週間目、中央パネル；２６週間目、右パネル）において、処置した眼の網膜において存在した。これは、眼の組織中のベクターの持続を示す（図１０）。網膜に加えて、ベクターゲノムは、処置した眼において、房水、硝子体液、虹彩／毛様体、および視神経に由来するサンプル内で、全ての時点で検出された。眼以外の組織は、肝臓、脾臓、およびリンパ節において低レベルで検出可能であったことを除いて、ベクターゲノムは概して検出可能でなかった（図１０）。Ｒ１００ベクター由来の導入遺伝子発現は、低用量群および高用量群の両方の処置された網膜および虹彩／毛様体において検出された（図１１）。遺伝子発現は用量依存性であり、３週間目から１３週間目まで増大し、２６週間目では安定なままであった（図１１のそれぞれ左、中央および右パネル）。眼以外のベクター発現は、いずれの試験においても２６週間目で検出されなかった（図１１）。

ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用して、細胞性免疫応答を評価すると、いずれの動物も、Ｒ１００キャプシドペプチドまたは導入遺伝子ペプチドへの有意な応答を発生させなかった（データは示さず）。４Ｄ－１１０を投与した動物の大部分は、投与後に抗キャプシド抗体応答を生じた（データは示さず）。

まとめ

４Ｄ－１１０（Ｒ１００．ＣＡＧ－ｃｏｈＲｅｐ１）は近年、遺伝性網膜疾患であるコロイデレミアの臨床試験（ＮＣＴ０４４８３４４０）に移行された。この治療用製品は、２つの別個のＧＬＰ毒物学および生体分布試験において評価されている（表４）。合計４４頭のＮＨＰに、片眼投与、逐次的両側投与、または同時両側投与で注射した；合計６１のＮＨＰの眼に注射した。有意な試験物品関連有害事象もＴ細胞応答も報告されなかった。軽度から中等度の、一過性のコルチコステロイド応答性の前部ぶどう膜炎が観察された。導入遺伝子発現は、網膜に局在化し、評価した全身性の器官のいずれにおいても、発現は検出されなかった。硝子体内注射によるこの製品の安全性、薬物動態、および有効性（一連の視野検査および光干渉断層撮影によるスキャンによるものを含む）を決定するために、ヒト臨床試験が進行中である。

実施例４ － ヒトコロイデレミア患者において硝子体内投与を介してＲ１００によって送達されたコドン最適化したＲＥＰ１ ｃＤＮＡ配列の安全性の評価
最初のフェーズ１用量上昇安全性および耐容性データのまとめ

臨床試験設計および登録

臨床試験は、２用量レベル（３Ｅ１１または１Ｅ１２ ｖｇ／眼）での４Ｄ－１１０の単一の硝子体内注射の安全性、耐容性および生物学的活性を評価するために設計された標準的「３＋３」用量上昇を使用した。合計６名の患者を、各用量レベルで３名、用量上昇コホートに登録した。患者は、漸減を伴う標準的免疫抑制レジメンを受容した；治験責任者によって、調節がなされた。記載される結果は、投与後１～９ヶ月間のデータカットオフに基づく。

初期の耐容性および有害事象プロフィール

４Ｄ－１１０は、処置中に出現した有害事象（ＡＥ）のまとめの表（表５）において概説されるように、評価期間全体を通じて十分に耐容性を示した。

表５． 有害事象のまとめ

臨床評価

患者の眼および全身の状態は、血液検査および全身の検査（必要な場合）とともに、詳細な眼科的評価および網膜画像化を含め、綿密にモニターされる。種々の視覚的機能および解剖学的評価は、任意の予備的な有効性の合図を検出するために行われる。これらの評価としては、エリプソイドゾーン（ｅｌｌｉｐｓｏｉｄ ｚｏｎｅ）（ＥＺ）面積、眼底自発蛍光、マイクロペリメトリー、静的自動視野測定（ｓｔａｔｉｃ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｐｅｒｉｍｅｔｒｙ）、および最良矯正視力（ＢＣＶＡ）の測定が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の材料および方法は、好ましい実施形態に関して記載されてきたが、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される方法にバリエーションが適用され得ることは、当業者に明らかである。当業者に明らかな全てのこのような類似の置換および改変は、本発明の趣旨、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。

Claims (41)

1. 配列番号２のヒトＲａｂ ｅｓｃｏｒｔ ｐｒｏｔｅｉｎ－１（ＲＥＰ１）タンパク質をコードし、ヒトにおける発現のためにコドン最適化した核酸であって、前記核酸は、配列番号１として示されるヌクレオチド配列を含むか、または配列番号１として示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含み、ここで前記核酸は、他の点で同一の細胞において配列番号３の野生型ＲＥＰ１ヌクレオチド配列の発現のレベルと比較してより高いレベルで発現される、核酸。
2. 前記ヌクレオチド配列は、少なくとも０．９４のコドン適応指数を有する、請求項１に記載の核酸。
3. 配列番号１として示されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の核酸。
4. 請求項１～３のいずれか１項に記載の核酸および前記核酸配列に対して作動可能に連結されかつ異種である発現制御配列を含む発現カセット。
5. 前記発現制御配列は、構成的プロモーター、好ましくは、配列番号４として示されるヌクレオチド配列または配列番号４として示されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％同一の配列を含むＣＡＧプロモーターである、請求項４に記載の発現カセット。
6. ５’から３’へと：（ａ）ＡＡＶ２末端反復、（ｂ）ＣＡＧプロモーター、（ｃ）配列番号１のコドン最適化したＲＥＰ１遺伝子、（ｄ）ＳＶ４０ポリアデニル化配列および（ｅ）ＡＡＶ２末端反復を含む、請求項５に記載の発現カセット。
7. 前記５’側のＡＡＶ２末端反復は、配列番号６として示されるヌクレオチド配列を有する、および／または前記ＣＡＧプロモーターは、配列番号４として示されるヌクレオチド配列を有する、および／または前記ＳＶ４０ポリアデニル化配列は、配列番号８として示されるヌクレオチド配列を有する、および／または前記３’側のＡＡＶ２末端反復は、配列番号７として示されるヌクレオチド配列を有する、請求項６に記載の発現カセット。
8. 配列番号５のヌクレオチド配列、または配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％同一の配列を含むか、またはそれからなる、請求項７に記載の発現カセット。
9. 前記発現制御配列は、桿体および錐体における前記核酸の優先的発現を指示するプロモーターである、請求項３に記載の発現カセット。
10. 請求項１～３のいずれか１項に記載の核酸または請求項４～９のいずれか１項に記載の発現カセットを含むベクター。
11. 前記ベクターは、組換えアデノ随伴（ｒＡＡＶ）ベクターである、請求項１０に記載のベクター。
12. 前記ｒＡＡＶベクターは、血清型２、４、５もしくは８のＡＡＶキャプシド、またはその改変体を含む、請求項１１に記載のベクター。
13. 前記ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２キャプシドまたはその改変体を含む、請求項１２に記載のベクター。
14. 前記ｒＡＡＶベクターは、配列番号９の配列を含むかまたはそれからなるキャプシドタンパク質を含むＡＡＶ２キャプシド改変体を含む、請求項１３に記載のベクター。
15. 前記ｒＡＡＶベクターは、５’から３’へと： （ａ）ＡＡＶ２末端反復、（ｂ）ＣＡＧプロモーター、（ｃ）配列番号１のコドン最適化したＲＥＰ１遺伝子、（ｄ）ＳＶ４０ポリアデニル化配列、および（ｅ）ＡＡＶ２末端反復を含む核酸を含む、請求項１１～１４のいずれか１項に記載のベクター。
16. 前記５’側のＡＡＶ２末端反復は、配列番号６として示されるヌクレオチド配列を有する、および／または前記ＣＡＧプロモーターは、配列番号４として示されるヌクレオチド配列を有する、および／または前記ＳＶ４０ポリアデニル化配列は、配列番号８として示されるヌクレオチド配列を有する、および／または前記３’側のＡＡＶ２末端反復は、配列番号７として示されるヌクレオチド配列を有する、請求項１５に記載のベクター。
17. 前記ｒＡＡＶは、配列番号５のヌクレオチド配列、または配列番号５のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９８％同一の配列を含む核酸を含む、請求項１６に記載のベクター。
18. 前記ｒＡＡＶは、（ｉ）配列番号９の配列を含むかまたはそれからなるキャプシドタンパク質を含むキャプシド、および（ｉｉ）配列番号５のヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる核酸を含む、請求項１７に記載のベクター。
19. 請求項１～３のいずれか１項に記載の核酸または請求項４～９のいずれか１項に記載の発現カセットを含む宿主細胞。
20. 前記宿主細胞は、哺乳動物細胞である、請求項１９に記載の宿主細胞。
21. 前記宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ２１細胞もしくはＶｅｒｏ細胞である、および／または前記宿主細胞は、懸濁培養もしくは細胞スタック培養において増殖される、および／または前記宿主細胞は、光受容細胞、網膜神経節細胞、グリア細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、または網膜色素上皮細胞である、請求項１９または２０に記載の宿主細胞。
22. コロイデレミアの処置を必要とする被験体においてコロイデレミアを処置するための方法であって、前記方法は、治療上有効な量の、請求項１～３のいずれか１項に記載の核酸、請求項４～９のいずれか１項に記載の発現カセットまたは請求項１０～１８のいずれか１項に記載のベクターを前記被験体に投与する工程を包含する、方法。
23. コロイデレミアの処置を必要とする被験体においてコロイデレミアを処置するための方法であって、前記方法は、（ｉ）ＡＡＶキャプシド、ならびに（ｉｉ）５’から３’へと： （ａ）ＡＡＶ２末端反復、（ｂ）ＣＡＧプロモーター、（ｃ）配列番号１のコドン最適化したＲＥＰ１遺伝子、（ｄ）ＳＶ４０ポリアデニル化配列および（ｅ）ＡＡＶ２末端反復を含む核酸、を含む感染性ｒＡＡＶを、前記被験体に投与する工程を包含する、方法。
24. 前記５’側のＡＡＶ２末端反復は、配列番号６として示されるヌクレオチド配列を有する、および／または前記ＣＡＧプロモーターは、配列番号４として示されるヌクレオチド配列を有する、および／または前記ＳＶ４０ポリアデニル化配列は、配列番号８として示されるヌクレオチド配列を有する、および／または前記３’側のＡＡＶ２末端反復は、配列番号７として示されるヌクレオチド配列を有する、請求項２３に記載の方法。
25. 前記ｒＡＡＶは、（ｉ）配列番号９の配列を含むまたはからなるキャプシドタンパク質を含むキャプシド、および（ｉｉ）配列番号５のヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる核酸を含む、請求項２３または２４に記載の方法。
26. 前記核酸またはベクターは、硝子体内または網膜下注射によって前記被験体に投与される、および／または前記ベクターは、約１０^１０ ベクターゲノム（ｖｇ）／眼～約１０^１３ ｖｇ／眼の投与量で、好ましくは約１×１０^１１ ｖｇ／眼～約５×１０^１２ ｖｇ／眼、より好ましくは約３×１０^１１ ｖｇ／眼の投与量で、または約１×１０^１２ ｖｇ／眼の投与量で、前記被験体に投与される、請求項２２～２５のいずれか１項に記載の方法。
27. コロイデレミアの処置における使用のための、請求項１～３のいずれか１項に記載の核酸、請求項４～９のいずれか１項に記載の発現カセット、または請求項１０～１８のいずれか１項に記載のベクター。
28. コロイデレミアの処置のための医薬の製造における使用のための、請求項１～３のいずれか１項に記載の核酸、請求項４～９のいずれか１項に記載の発現カセット、または請求項１０～１８のいずれか１項に記載のベクター。
29. 前記核酸またはベクターは、硝子体内もしくは網膜下注射によって投与される、および／または前記ベクターは、約１０^１０ ベクターゲノム（ｖｇ）／眼～約１０^１３ ｖｇ／眼、好ましくは約１×１０^１１ ｖｇ／眼～約５×１０^１２ ｖｇ／眼の投与量での投与のためのものであり、より好ましくは約３×１０^１１ ｖｇ／眼の投与量でまたは約１×１０^１２ ｖｇ／眼の投与量での投与のためのものである、請求項２７または２８に記載の使用のための核酸、発現カセットまたはベクター。
30. コロイデレミアの処置における使用のための、（ｉ）ＡＡＶキャプシド、ならびに（ｉｉ）５’から３’へと： （ａ）ＡＡＶ２末端反復、（ｂ）ＣＡＧプロモーター、（ｃ）配列番号１のコドン最適化したＲＥＰ１遺伝子、（ｄ）ＳＶ４０ポリアデニル化配列、および（ｅ）ＡＡＶ２末端反復を含む核酸、を含む感染性ｒＡＡＶ。
31. コロイデレミアの処置のための医薬の製造における使用のための、（ｉ）ＡＡＶキャプシド、ならびに（ｉｉ）５’から３’へと： （ａ）ＡＡＶ２末端反復、（ｂ）ＣＡＧプロモーター、（ｃ）配列番号１のコドン最適化したＲＥＰ１遺伝子、（ｄ）ＳＶ４０ポリアデニル化配列、および（ｅ）ＡＡＶ２末端反復を含む核酸、を含む感染性ｒＡＡＶ。
32. 前記５’側のＡＡＶ２末端反復は、配列番号６として示されるヌクレオチド配列を有する、および／または前記ＣＡＧプロモーターは、配列番号４として示されるヌクレオチド配列を有する、および／または前記ＳＶ４０ポリアデニル化配列は、配列番号８として示されるヌクレオチド配列を有する、および／または前記３’側のＡＡＶ２末端反復は、配列番号７として示されるヌクレオチド配列を有する、請求項３０または３１に記載の感染性ｒＡＡＶ。
33. 前記ｒＡＡＶは、（ｉ）配列番号９の配列を含むかまたはそれからなるキャプシドタンパク質を含むキャプシド、および（ｉｉ）配列番号５のヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる核酸を含む、請求項３２に記載の感染性ｒＡＡＶ。
34. 前記ｒＡＡＶは、硝子体内注射によって投与される、および／または前記ベクターは、約１０^１０ ベクターゲノム（ｖｇ）／眼～約１０^１３ ｖｇ／眼、好ましくは約１×１０^１１ ｖｇ／眼～約５×１０^１２ ｖｇ／眼の投与量で投与され、より好ましくは、約３×１０^１１ ｖｇ／眼の投与量でまたは約１×１０^１２ ｖｇ／眼の投与量で投与される、請求項３０～３３のいずれか１項に記載の使用のための感染性ｒＡＡＶ。
35. 哺乳動物においてＲＥＰ１の減少したレベルによって媒介される疾患または状態を処置するための方法であって、前記方法は、治療上有効な量の、請求項１～３のいずれか１項に記載の核酸、請求項４～９のいずれか１項に記載の発現カセット、または請求項１０～１８のいずれか１項に記載のベクターを投与する工程を包含する、方法。
36. 哺乳動物においてＲＥＰ１のレベルを増大させるための方法であって、前記方法は、請求項１～３のいずれか１項に記載の核酸、請求項４～９のいずれか１項に記載の発現カセット、または請求項１０～１８のいずれか１項に記載のベクターを前記哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
37. 請求項１～３のいずれか１項に記載の核酸、請求項４～９のいずれか１項に記載の発現カセット、または請求項１０～１８のいずれか１項に記載のベクター、および少なくとも１種の薬学的に受容可能な賦形剤を含む、薬学的組成物。
38. （ｉ）ＡＡＶキャプシド、ならびに（ｉｉ）５’から３’へと： （ａ）ＡＡＶ２末端反復、（ｂ）ＣＡＧプロモーター、（ｃ）配列番号１のコドン最適化したＲＥＰ１遺伝子、（ｄ）ＳＶ４０ポリアデニル化配列、および（ｅ）ＡＡＶ２末端反復を含む核酸を含む感染性ｒＡＡＶを含む、薬学的組成物。
39. 前記５’側のＡＡＶ２末端反復は、配列番号６として示されるヌクレオチド配列を有する、および／または前記ＣＡＧプロモーターは、配列番号４として示されるヌクレオチド配列を有する、および／または前記ＳＶ４０ポリアデニル化配列は、配列番号８として示されるヌクレオチド配列を有する、および／または前記３’側のＡＡＶ２末端反復は、配列番号７として示されるヌクレオチド配列を有する、請求項３８に記載の薬学的組成物。
40. 前記ｒＡＡＶは、（ｉ）配列番号９の配列を含むかまたはそれからなるキャプシドタンパク質を含むキャプシド、および（ｉｉ）配列番号５のヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる核酸を含む、請求項３９に記載の薬学的組成物。
41. 前記薬学的組成物は、１０^９ ｖｇ～１０^１４ ｖｇの間の前記ｒＡＡＶ、好ましくは１０^１０ ｖｇ～１０^１３ ｖｇの間の前記ｒＡＡＶを含み、より好ましくは約３×１０^１１ ｖｇまたは約１×１０^１２ ｖｇの前記ｒＡＡＶを含む、請求項３８～４０のいずれか１項に記載の薬学的組成物。