JP2021519791A - 増強されたヒト膵臓トロピズムを有する新規な組換えアデノ随伴ウイルスキャプシド - Google Patents
増強されたヒト膵臓トロピズムを有する新規な組換えアデノ随伴ウイルスキャプシド Download PDFInfo
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Abstract
Description
本出願は、2018年3月30日に出願された米国仮特許出願第62/651,010号および2018年10月12日に出願された米国仮特許出願第62/745,226号の優先権を主張し、これらの両方は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、助成番号U01DK089569の下で米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明の一定の権利を有する。
a)変異AAVキャプシドポリペプチド遺伝子のライブラリーを生成することであって、上記変異AAVキャプシドポリペプチド遺伝子が、2つ以上の非変異親キャプシドポリペプチド由来の配列を含む複数の変異AAVキャプシドポリペプチド遺伝子を含むことと、
b)上記変異AAVキャプシドポリペプチド遺伝子ライブラリーをAAVベクターにクローニングすることによってAAVベクターライブラリーを生成することであって、上記AAVベクターが、複製能を有するAAVベクターであることと、
c)非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、ヒト膵臓組織またはヒト膵島において増加した形質導入またはトロピズムについて、変異AAVキャプシドポリペプチドをコードするb)の上記AAVベクターライブラリーをスクリーニングすることと、
d)c)の上記変異AAVキャプシドポリペプチドを選択することと、を含む、方法を提供する。
より高い治療レベルの核酸発現を達成するように、遺伝子治療のためのヒト膵臓組織またはヒト膵島において増加した形質導入を可能にする遺伝子治療ベクターの必要性が当該技術分野に依然として存在する。本発明は、この必要性を満たし、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、ヒト膵臓組織またはヒト膵島において増加した形質導入および/またはトロピズムを示す変異AAVキャプシドポリペプチドを提供する。
様々な実施形態では、本発明は、変異アデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドポリペプチドであって、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、ヒト膵臓組織またはヒト膵島において増加した形質導入またはトロピズムを示す、変異AAVキャプシドポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、変異AAVキャプシドポリペプチドは、組換え変異AAVキャプシドポリペプチドまたは変異rAAVキャプシドポリペプチドと称される。
「AAV」は、アデノ随伴ウイルスの略称であり、ウイルス自体またはその誘導体を指すために使用されてもよい。この用語は、別段で必要とされる場合を除き、全てのサブタイプならびに天然に存在する形態および組換え形態の両方を包含する。「rAAV」という略称は、組換えAAVベクター(または「rAAVベクター」)とも称される組換えアデノ随伴ウイルスを指す。
「AAV」という用語には、1型AAV(AAV1)、2型AAV(AAV2)、3型AAV(AAV3)、4型AAV(AAV4)、5型AAV(AAV5)、6型AAV(AAV6)、7型AAV(AAV7)、8型AAV(AAV8)、9型AAV(AAV9)、9_hu14、鳥類AAV、ウシ(bovine)AAV、イヌAAV、ウシAAV、霊長類AAV、非霊長類AAV、およびウシ(ovine)AAVが含まれる。「霊長類AAV」は、霊長類に感染することができるAAVを指し、「非霊長類AAV」は、非霊長類哺乳動物に感染することができるAAVを指し、「ウシAAV」は、ウシ哺乳動物に感染することができるAAVを指すなどである。
本発明のAAVベクターは、多くの特徴を有する。いくつかの実施形態では、ベクターは、変異AAVキャプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含む。そのようなAAVベクターおよびそれらの特徴は、以下に詳細に説明される。
a)変異AAVキャプシドポリペプチド遺伝子のライブラリーを生成することであって、上記変異AAVキャプシドポリペプチド遺伝子は、2つ以上の非変異親キャプシドポリペプチド由来の配列を含む複数の変異AAVキャプシドポリペプチド遺伝子を含むことと、
b)上記変異AAVキャプシドポリペプチド遺伝子ライブラリーをAAVベクターにクローニングすることによってAAVベクターライブラリーを生成することであって、上記AAVベクターが複製能を有するAAVベクターであることと、
c)非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、ヒト膵臓組織またはヒト膵島において増加した形質導入またはトロピズムを示す変異AAVキャプシドポリペプチドをコードするb)の上記AAVベクターライブラリーをスクリーニングすることと、
d)c)の上記変異AAVキャプシドポリペプチドを選択することと、を含む、方法を提供する。
核酸挿入物(異種ヌクレオチド配列とも称される)は、インビボでヌクレオチド配列におけるその転写または発現を指示する制御要素に動作可能に連結することができる。そのような制御要素は、選択された遺伝子(例えば、内因性細胞制御要素と通常関連する制御配列を含むことができる。あるいは、異種制御配列を用いることができる。有用な異種対照配列は、一般的に、哺乳動物またはウイルス遺伝子をコードする配列に由来するものを含む。例には、SV40初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス長い末端反復(LTR)プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター(Ad MLP)、単純ヘルペスウイルス(HSV)プロモーター、目的遺伝子に対して異種である内因性細胞プロモーター、CMV即時型初期プロモーター領域(CMVIE)などのサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーターなどが含まれるが、これらに限定されない。さらに、マウスメタロチオネイン遺伝子などの非ウイルス遺伝子由来の配列も使用することができる。そのようなプロモーター配列は、例えば、Stratagene(San Diego,Calif.)から市販されている。
宿主細胞は、感染性AAVベクターを生成するため、および開示されたAAVベクターに基づいてAAVビリオンを生成するために必要である。したがって、本発明は、本発明のAAVベクターに基づいてAAVビリオンを生成およびパッケージングするための宿主細胞を提供する。様々な宿主細胞が、当該技術分野で既知であり、本発明の方法に用途を見出される。本明細書に記載されるまたは当該技術分野において既知の任意の宿主細胞を、本明細書に記載の組成物および方法で用いることができる。
様々な実施形態では、本発明は、核酸およびポリペプチドを含む様々な治療用分子をパッケージングすることができるキャプシドを形成することができる、変異AAVキャプシドポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、治療用分子はワクチンである。様々な実施形態では、本発明は、例えば、導入遺伝子挿入物または他の核酸挿入物を含む、核酸挿入物を含むことができるAAVベクターを提供する。これにより、ベクターがポリペプチドを発現することが可能になる。そのような核酸は、異種核酸、核酸遺伝子産物、およびポリペプチド遺伝子産物を含むことができる。核酸挿入物の特徴は、以下に記載される。
様々な実施形態では、本発明は、本発明のAAVビリオンを生成するための方法を提供する。AAVビリオンを生成するための様々な方法は、当該技術分野で既知であり、本明細書に記載のAAVベクターを含むAAVビリオンを生成するために使用することができる。一般的に、本方法は、本発明のAAVベクターを、AAVベクターをAAVビリオンにパッケージングすることができる宿主細胞に挿入または形質導入することを含む。例示的な方法が以下に記載され、参照されるが、当業者に既知の任意の方法を用いて、本発明のAAVビリオンを生成することができる。
本発明は、本明細書に記載される本発明の方法による対象の処置に有用な医薬組成物を提供する。さらに、本発明は、記載される医薬組成物を投与するための投与レジメンを提供する。本発明は、a)本明細書に記載の対象AAVベクターまたはAAVビリオン、および本明細書に記載の変異ポリペプチドを含むキャプシドによってパッケージングされるかまたは該キャプシド内にパッケージングされる治療分子、ならびにb)薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、または緩衝剤を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、または緩衝剤は、ヒトにおける使用に好適である。
本発明はまた、本発明のAAVベクターおよび/または核酸を投与することによって対象の疾患の処置方法を提供し、ここで、本明細書に記載のAAVベクターおよび/または核酸は、機能的AAVキャプシド内にパッケージングされ、機能的AAVキャプシドは、本発明の1つ以上の変異AAVキャプシドポリペプチドを含む。例示的な実施形態では、本発明は、それを必要とする対象に本発明の医薬組成物を投与して、対象の疾患を処置する方法を提供する。様々な実施形態では、対象は、本発明の組成物の投与を他に必要としない。いくつかの実施形態では、本発明は、ワクチン投与のための方法を提供する。
例として、血友病に関して、治療効果を得るためには、正常な個体に見出される因子濃度の1%超の血液凝固因子濃度が、重症疾患表現型を中等度の疾患表現型に変えるために必要であると考えられる。重症の表現型は、関節損傷および命に関わる出血によって特徴付けられる。中等度の疾患表現型を軽度の疾患表現型に変えるには、正常値の約5%超の血液凝固因子濃度が必要と考えられる。そのような血友病対象の処置に関して、所望の治療効果を達成するために、典型的な用量は、少なくとも1×1010のAAVベクターゲノム(vg)/対象の体重1kgあたり(vg/kg)、もしくは約1×1010〜約1×1011vg/対象の体重1kgあたり、もしくは約1×1011〜約1×1012vg/対象の体重1kgあたり、または約1×1012〜約1×1013vg/対象の体重1kgあたりである。
序論
アデノ随伴ウイルス(AAV)は、様々な細胞種への遺伝子移入の強力なビヒクルとして非常に関心が高い。AAVは、ヒト遺伝子治療のための有望なビヒクルとなるいくつかの特徴を有するが、その複雑性、導入遺伝子パッケージングサイズの制限、および一般集団における既存の中和抗体の高い発生率など、いくつかの欠点により、臨床用途のためのその使用が妨げられる。遺伝子治療の目的のために、形質導入は、効率的かつ高度に細胞種特異性の両方である必要がある。AAV細胞トロピズムおよび免疫原性は、構造キャプシドタンパク質VP1、VP2、およびVP3の配列によって決定される。
本研究の目的は、糖尿病研究の分野における遺伝子治療用途のためのAAVベクターを生成することである。ハイスループット配列決定のための特有のバーコードで標識付けされたシャフリングされたキャプシド配列を含む高度に複雑なAAVライブラリーを生成し、一次ヒト膵島において多数回の継代ラウンドを行うことによる膵島形質導入の改善についてスクリーニングした。
様々なAAV野生型血清型および前述の変異体(図2)由来のキャプシド遺伝子をDNaseシャフリング法(W.P.Stemmer.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91,10747−10751(1994))を使用してシャフリングし、キャプシドポリA(cap polyA)の下流にバーコード配列を含むAAV骨格ライブラリーにクローニングした(図3)。各AAV変異体を特有のバーコードで標識付けすることにより、ハイスループット配列決定による継代ラウンド間の変異体の濃縮の追跡が可能になる。10個の親ライブラリーをより詳細に分析し、Sanger配列決定による良好な交差率を有することが見出された(図4)(W.Huang.Biotechniques,60,91−94(2016))。PacBio配列決定技術を使用してハイスループットキャプシド+BC配列決定を行い、10個の親キャプシド配列の同様の寄与レベル(図5)ならびに良好なキャプシド−BC結合を明らかにした(例えば、図1を参照のこと)。
目的
本発明の目的は、ヒト膵島細胞に形質導入するための増強された能力を有するrAAVベクターを見出すことであった。これは、内分泌障害特異的1型および2型糖尿病の新規な処置に有用である。
AAVキャプシドライブラリーを使用して、分離されたヒト膵島またはインタクトなヒト膵島のいずれかを選択的に形質導入したAAVを選択した。これらのキャプシド配列をバーコード特異的リバースプライマーを使用して増幅し、導入遺伝子としてGFPを有するrAAVを生成した(図18)。Accumaxを使用して膵島を分離し、37℃、MOI=1Kまたは10Kvg/細胞で48時間形質導入し(10%FBS/CMRL)、プレーティングし、形質導入の48時間後にフローサイトメトリーによって分析した。インタクトなヒト膵島を、氷上、MOI=10Kvg/細胞で1〜2時間形質導入し(2%FBS/CMRL)、続いて、形質導入後2日目の培地交換を伴って、3日間懸濁培養し、次いでフローサイトメトリーによって分析した。2B4(膵島表面マーカー)および8G12(α細胞表面マーカー)に対するモノクローナル抗体を使用して、フローサイトメトリーを行った。数回継代した後、最も多く見られるキャプシドを単離し、配列決定した。GFPレポーターを発現するrAAVベクターを、ヒト膵島の形質導入において現在最も強固であると考えられる以前に単離したrAAVと比較した。
一次ヒト膵島細胞への形質導入効率をFACSによって評価した。いくつかのキャプシド変異体は、最良の親LK03と比較した場合に、改善された形質導入を示した(図19、20、22〜28、30、31、33、および34)。インスリンおよびグルカゴンについての細胞内染色により、変異体のいずれかがα細胞またはβ細胞に対する選択性を示すかどうかが明らかになる。それらの相対的形質導入効率を比較し、上位候補は、これまでの至適基準の約10倍強固であった。
要約
ランゲルハンス膵島への安全かつ有効な遺伝子移入は、糖尿病の処置に有望な手法である。膵島への組換えAAV媒介遺伝子の移入は、それらの細胞を高い効率で形質導入するAAV血清型の欠如によって妨げられる。ヒト膵島について改善されたトロピズムを有する新規なAAV血清型を同定するために、2つの高度に複雑なバーコード化された複製能を有するキャプシドライブラリーを構築し、多様性を単分子DNA配列決定によって検証し、連続的な選択をヒト膵島で行った。濃縮されたバーコードを、ハイスループット配列決定によって追跡し、以前に同定した最良のキャプシドと比較して5〜10倍の効率を有する、分離された膵島およびインタクトな膵島に形質導入することができる3つのキャプシド変異体を同定した。インタクトなヒト膵島に浸透することができるこれらの新規なAAVキャプシド変異体は、糖尿病を有する患者の処置のための強力な遺伝子治療ツールを表す。キャプシドのうちの1つはまた、ヒト化キメラマウスモデルにおけるマウスおよびヒト肝細胞の両方への形質導入において強固であり、したがって、ヒト臨床試験での使用前の臨床前試験のための代用キャプシドを使用する必要性のない多機能ベクターを提供する。
ウイルス遺伝子移入ベクターの開発は、依然として積極的な調査分野である1。組換えAAVベクターは、臨床前および臨床試験における生物全体への遺伝子移入の安全なビヒクルとして現れているが、依然として重要な制限がある2。rAAVの主な欠点は、約5kbの制限されたパッケージングサイズ、既存の中和抗体による迅速なウイルス除去、天然に存在する血清型の制限された宿主トロピズム、およびAAVのエピソーム性による分裂細胞で発現する導入遺伝子の喪失である。VP1、VP2、およびVP3タンパク質からなるキャプシドは、様々な受容体および共受容体の認識に基づく細胞トロピズムの主な決定因子を有する3。さらに、キャプシド変異体は、キャプシド脱脱殻(uncoating)4、細胞内輸送、および核侵入5などの様々な侵入後事象を示し得、これらは、組織および種の間の形質導入の差異をもたらす。天然および非天然AAVキャプシド変異体は、バイオマイニング(bio−mining)、すなわち、天然に存在するAAVの単離および特徴付け6、キャプシドペプチドディスプレイライブラリーのスクリーニング7〜9、細胞特異的設計アンキリンリピートタンパク質(Designed Ankyrin Repeat Proteins)(DARPins)を示すライブラリー10、およびランダムDNAシャフリング11によって得られるキャプシドライブラリーのスクリーニングを使用して単離されており、これまでに最も徹底的に探索されてきた経路である。最近、祖先AAVキャプシド配列からなるライブラリーの作成およびスクリーニングは、非常に特異的な細胞標的化を有するAAVを得るための貴重なツールとして記載されている12。
ヒト膵島形質導入効率についての親キャプシドの評価
最初の工程は、AAV−DJおよびAAV−LK03が、密接に関連する天然血清型AAV−2およびAAV3Bよりも高いヒト膵島形質導入効率を有することを示す以前のデータを確認することであった72。異なるキャプシドによりパッケージングした一本鎖(ss)および自己相補的(sc)GFP発現ベクターをヒト膵島に形質導入し、フローサイトメトリーを用いて形質導入効率を測定した(図62A)。予測した通り、AAV−DJおよびAAV−LK03は、AAV2およびAAV3Bよりも、ヒト膵島において高い形質導入率を有した。この結果を確認することにより、シャフリングされたキャプシドライブラリーでスクリーニングを行う前の検証研究の基礎が提供された。本研究のために、各々がキャプシドコード配列の直ぐ下流に特有のバーコード(BC)配列を有する親AAVを含む対照AAVプールを生成した。等しいコピー数の18個の親AAVの各々を混合した後、プールを精製し、バーコードのハイスループット配列決定によってその組成を分析した(図50C)。親AAVのうちのいくつかは、プール中で低い割合または高い割合を占めていたが、18個の親プールは、キャプシド選択スクリーニングにおけるバーコード配列決定に使用するための最初の検証としてのパイロット(pilot)ライブラリースクリーニングにおいて有用であることが見出された。どのキャプシドがヒト膵島のインタクトな形質導入に最も適していたかを評価するために、インタクトなヒト膵島および分離されたヒト膵島を18個の親プールに感染させ、ヒトアデノウイルス5に重感染させて、AAVを複製した。中央の膵島細胞が周辺の膵島細胞よりも感染しにくいことが推論されたため、インタクトな膵島の感染では分離した膵島の感染よりも10倍高い感染多重度(MOI)を使用した。連続した3回の選択ラウンドを行い、AAV複製(図51)およびウイルスプールの組成(図52)を各ラウンドにおいて評価した。ラウンド1およびラウンド2の選択では、インタクトな膵島での増殖後、投入量と比較して、より低いコピー数のウイルスゲノムを回収したが、ラウンド3では複製物が増した。2000の低いMOIを使用して、分離された膵島細胞に感染させたとき、膵島培養後に得られるウイルスの量は、各選択ラウンドでの投入量よりも高かった。BC配列の次世代配列決定(NGS)を使用して、各ラウンドでのAAVの組成を評価した。各試料について400,000〜1,000,000個の配列読み取りを得た。1回の選択ラウンド後、特にインタクトな膵島を使用したときに、プールの多様性がすでに減少していたため、特定の親AAVは、他のものよりも明らかな利点を有していた(図52)。AAV2、AAV3B、ならびにシャフリングされた変異体DJおよびLK03は、第1の継代後にすでに濃縮された。インタクトな膵島における第3の継代後、予測した通り、AAV−DJおよびAAV−LK03は等しく存在し、AAV2およびAAV3Bはより低い程度で存在した。分離された膵島細胞での18個の親プールの継代により、AAV−DJの早期の濃縮が明らかとなり、AAV2、LK03、AAV3B、およびAAV−アカゲザル10の割合はより低かった。この実験は、AAV−DJおよびAAV−LK03が一次ヒト膵島を強固に形質導入することを示した以前の形質導入研究を確認したため、該実験により、我々の選択スクリーニング手法の正当性が立証された。
シャフリングされたAAVライブラリーを生成する前に、多様性の高いAAVバーコード(BC)ライブラリーを作成した。この目的のために、20ヌクレオチド(nt)長のリンカーによって分離された2つの12ヌクレオチド(nt)長のランダムバーコード配列からなる断片を、AAV2 p5プロモーターおよびrep遺伝子を含むがキャプシド配列は含まないAAVベクターを含むITRにクローニングした。バーコード断片を、キャプシドポリA配列の直ぐ3’側にクローニングし、したがって、ハイスループット配列決定により、選択プロセス全体にわたって変異体濃縮の追跡が可能となった。BCを有するまたは有しない野生型AAVの複製研究によって示されるように、BC配列の挿入は、ウイルス機能に悪影響を及ぼさなかった(データは示していない)。バーコードプラスミドライブラリーのハイスループット配列決定により、十分に高い多様性が示され、全BC読み取りの93%超が特有の配列を有していた(表6)。120万超の読み取りのうち、1つのBC配列のみが6回存在し、20個の異なるBC配列が5回繰り返し存在し、342個の異なるBC配列が各々4回見出され、4844個のBCが各々3回繰り返し存在していることが検出され、74,433個のBC配列(6%)が2回見出された。バーコードのハイスループット配列決定は増幅工程を伴うため、BCライブラリーにおける反復バーコードの実際の数がそれより低かった可能性が非常に高い。バーコードライブラリーのサイズは、形質転換反応物のアリコートから得られたコロニー数に基づいて1E07であると推定された。次いで、10個の関連するAAVまたは18個以上の多様なAAV由来の配列を使用してシャフリングされたキャプシドを生成し、BCライブラリーベクターにクローニングした。シャフリングに使用される親配列の系統分析を図58Aに示す。これらのキャプシド配列のうちの2つ、DJおよびLK03は、以前の生成ライブラリーを使用して当実験室で行われた以前のスクリーニングから得られ、DJについてはAAV2、AAV8、およびAAV9hu14のハイブリッドであり、またはLK03についてはAAV1、AAV3B、AAV4、AAV8、およびAAV9hu14のハイブリッドである(図58B)。図58Bは、DJおよびLK03キャプシドの組成物を示し、図58Cは、DJおよびLK03組み立て活性化タンパク質(assembly activating protein)(AAP)の組成物を示す。キャプシドは、バーコード化された10個の親ライブラリーをシャフリングし、18個の親ライブラリーは各々、ライブラリー形質転換反応物の小さなアリコートをプレーティングした後に寒天プレート上で増殖したコロニー数によって推定される、約5E06個の異なるクローンのサイズを有した。BC配列決定後の複製数が少ないことを考えると、複雑性は、ライブラリーの各々について少なくとも100万であると推定された。
対照AAVプールを、18個のバーコード化親AAVの各々の等量(ベクターゲノムコピー数に基づく)から生成し、次いで、2回のCsCl遠心分離によってこのプールを精製した。このプールの組成を、バーコードのハイスループット配列決定によって分析した(図50C)。親AAVのうちのいくつかは、プール中で幾分低い割合を占めていたが、等量の各ウイルスを精製前にプールした。これらの親AAVは、CsCl勾配において収集された画分外の密度でバンド付けが行われた可能性がある。それにも関わらず、殆どの親配列のプールにおいて非常に均等に存在していた。増幅キャプシド+BC配列のPacBioハイスループット配列決定によっても、親AAVプールを分析した(図50D)。PacBio配列決定を使用して、BC NGSデータと比較してプールの組成について同様であるが同一ではないデータを得た。これらの相違は、特定のBC配列またはキャプシド+BC配列のわずかな増幅の差異に起因し得る。その欠点にもかかわらず、18個の親プールは、キャプシド選択スクリーニングにおけるバーコード配列決定に使用するための最初の検証としてのパイロットライブラリースクリーニングにおいて有用であることが見出された。
まず、AAV−2の形質導入効率をAAV−DJおよびAAV−LK03と比較したが(図62A)、それは、後者の2つのベクターがヒト膵島において最も強固であることを示す以前の未公開の研究による(Song et al.,ASGCT abstract)。この結果(図62A)を確認することより、シャフリングキャプシドライブラリーによりスクリーニングを行う前の検証研究の基礎が提供された。AAVキャプシドの18個の親プールを、それぞれ20Kおよび2KのMOIでインタクトな膵島ならびに分離されたヒト膵島に感染させ、ヒトアデノウイルス5に重感染させて、AAVを複製した。連続した3回の選択ラウンドを行い、AAV複製(図51)およびウイルスプールの組成(図52)を各ラウンドにおいて評価した。ラウンド1およびラウンド2の選択では、インタクトな膵島での増殖後、投入量と比較して、より低いコピー数のウイルスゲノムを回収したが、ラウンド3では複製物が増した。2000の低いMOIを使用して、分離された膵島細胞に感染させたとき、膵島培養後に得られるウイルスの量は、各選択ラウンドでの投入量よりも高かった。BC配列のNGSを使用して、各ラウンドにおいてAAVの組成を評価した。各試料について400,000〜1,000,000の読み取りを得た。1回の選択ラウンド後、特にインタクトな膵島が使用されたときに、プールの多様性がすでに減少したため、特定の親AAVは、他の親AAVよりも明らかな利点を有していた(図52)。AAV2、AAV3B、ならびにシャフリングされた変異体DJおよびLK03は、第1の継代後にすでに濃縮された。インタクトな膵島における第3の継代後には、DJおよびLK03は等しく存在していたが、分離された膵島の第2の継代後には、DJは明らかにウイルスプールの大半を占め、我々の選択スクリーニング手法の正当性をさらに立証した。
両方のライブラリーを使用して、インタクトな膵島ならびに分離された膵島にそれぞれ20Kおよび2KのMOIで感染させ、Ad5を使用してAAVを複製した。各ラウンドのウイルス複製をqPCRによって評価した後(図51)、変異体濃縮をBC配列のNGSによって追跡した(図52)。NGS試料サイズは、400,000〜800,000の配列読み取りであった。18個の親プールとは対照的に、各選択ラウンドでのライブラリーの複製が観察され、これは、特定のキャプシド配列が、改善されたトロピズム、形質導入、および/または複製を提供することを示し得る。18個の親ライブラリーの場合には、別個のキャプシド変異体が早くもラウンド1で選択された。2つの異なるMOI(10Kおよび50K)を使用したインタクトな膵島に対する第2のライブラリースクリーニングセットを、10個の親ライブラリーについて2重で行った。さらに、50KのMOIを使用して、別の18個の親ライブラリースクリーニングを3重で行った。このライブラリースクリーニングの複製データを図61Aに示し、BC NGSデータを図61Bに示す。同様のレベルの複製および濃縮が、この第2のライブラリースクリーニングセット中に観察された。しかしながら、今回は、1つの変異体が、10個の親ライブラリーの2つの独立したスクリーニング(MOI10K BおよびMOI 50K B)で濃縮されることが見出され(変異体10B5、黄色で強調表示)、これは、この特定の変異体が膵島における有意な選択の利点を有し得ることを示している。18個の親ライブラリーの3重のスクリーニングのうちの2回において、異なる変異体が濃縮されることが見出された(18B2、マゼンタ色で強調表示)。
BC配列特異的リバースプライマー(図53A)を使用して、3回の選択ラウンド後に、異なるスクリーニングから合計17個の濃縮されたキャプシド配列を収集し(これらの変異体の濃縮データについては、図52および図61Bを参照)、TOPOクローニングし、配列決定した。各BCについてのいくつかのクローンを配列決定し、左のBC配列がBC NGSによって得られる配列と一致することを確かめた。いくつかのキャプシドでは、クローンのうちのいくつかで、特に5’末端において、キャプシド配列が異なることが観察された。これは、不完全な伸長後の鋳型スイッチングに起因する可能性が高く3〜5、PCR条件および酵素を最適化することによって改善され得る。投入したライブラリーの徹底的な分析を行って、低いレベルのライブラリークローンが同一のバーコードに連結された異なるキャプシドを含むことが見出されだけであるため、それが不十分なキャプシドBC連結に起因するとは考えられない。また、2つの密接に関連する親配列を使用した実験により、増幅中に鋳型スイッチングが実際に起こったことが明らかになった(データは図示せず)。コンセンサス配列と一致するキャプシドをベクター化することを決定した。濃縮されたキャプシドは全て、3’半分においてAAV3Bからの大きな寄与を有していたが、5’半分は非常により多様であることが見出された(データは示していない)。3’半分におけるAAV3B配列は、投入ライブラリーにおいて明確に大きな割合を占めたが、SangerおよびPacBio配列決定によって示されるように、依然として、他の親配列の非常に良好な寄与があった。DJおよびLK03キャプシドが、AAV2またはAAV3Bキャプシドよりも高い効率で膵島に形質導入することが以前の実験において確立されており(図62A)、したがって、新規なキャプシドをDJおよびLK03のみと比較した。17個全てのキャプシド変異体、および以前に確立した最良の膵島キャプシドのうちの1つ(LK03)を使用して、CAGプロモーターによって駆動される導入遺伝子としてGFPを有する自己相補的AAVベクターがパッケージングされた。キャプシドのうちの3つは、高力価のrAAVの生成に失敗し、さらなる評価から除外した。最初の事前スクリーニングでは、粗細胞溶解物由来のrAAVを使用して、分離された膵島細胞を低MOIで形質導入した。形質導入の2日後に、GFP発現細胞のフローサイトメトリーによって形質導入効率を決定した。多数のキャプシド変異体が、AAV−LK03よりも高い形質導入効率を示したが、他のものはほんのわずかしか改善されなかったか、または全く改善されなかった(図53B)。最も改善された3つのキャプシド(10A1、18A1、および10A3)は全て、ライブラリースクリーニングの第1のセットに由来し、以後、KP1、KP2、およびKP3と称する。これらのキャプシドを使用して、2回CsCl勾配精製された高力価rAAV調製物を生成した。分離された膵島細胞を、3つの異なるMOIを使用して、それらの変異体ならびにAAV−DJおよびAAV−LK03で形質導入し、形質導入についてFACSによって分析した。変異体は、最良の親よりもかなり高い効率で膵島細胞に形質導入することを確認した(図53C、図62A)。同じ画分の膵島細胞をAAV−DJまたはAAV−LK03で形質導入するためには、変異キャプシドAAVと比較して、少なくとも10倍の高い力価が必要であった。次の工程は、新規なキャプシドがα細胞またはβ細胞を特異的に標的化するかどうかを決定することであった。KP1およびKP2キャプシドがパッケージングされたscCAG−GFPベクターを高いMOIで形質導入した膵島の亜集団特異的染色により、AAV−DJおよびAAV−LK03と比較して改善されたβ細胞形質導入が明らかとなったが、α細胞形質導入はあまり改善されなかった(図53D)。さらに、インタクトな膵島をこの実験で使用したため、新規なAAVは、膵島に浸透することができ、十分に高いMOIが使用した場合にはα細胞およびβ細胞のほぼ全てに形質導入することが実証された。
いくつかの一次細胞ならびにヒトおよび動物供給源に由来する細胞株を、1KのMOIで、2つの親(DJ、LK03)および3つの進化したキャプシド(KP1、KP2、KP3)がパッケージングされた一本鎖ホタルルシフェラーゼrAAVベクターで形質導入し、ルシフェラーゼアッセイを使用して形質導入効率について分析した。AAV−LK03は、マウス細胞に効率的に形質導入されなかったが、AAV−DJは、高効率で全ての細胞株に形質導入された。新規な変異体は、ヒト膵島細胞293、Hela、HuH7、R7T1、αTC1、HepG2、CHO K1、ヒト筋肉幹細胞、マウス筋芽細胞、SNU 737、およびFRhK−4細胞では、AAV−DJと比較して改善された形質導入効率を示した(図55A、図64A)。AAV−KP1は、一般的に、最も高い増強度を示した。DJと比較した新規なキャプシド変異体の形質導入は、ヒトケラチノサイト、分化ヒト筋芽細胞、および一次マウス胚線維芽細胞では改善されなかったか、またはわずかに改善されただけであった。
新規なキャプシド変異体ならびにAAV−DJおよびAAV−LK03を、2つの異なるバッチのプールされたヒト免疫グロブリンによる中和に対する感受性について分析した(図55B)。実験は、各試料について、7つの生物学的複製物において行われ、これらを2つの独立した実験間で分けた。AAV−DJは、中和に対する最も高い耐性を示し、50%の阻害に約120μg/mLのIVIGを必要としたが、AAV−LK03は、非常に感受性であり、50%の中和はたった約15μg/mLで達成された。AAV−KP2は、AAV−LK03と同様の中和プロファイルを有した一方、AAV−KP1およびAAV−KP3は、中和するためにより多くのIVIG(KP3については45ug/ml、およびKP1については55ug/ml)が必要であった。要約すると、プールされたヒトIVIGを中和のために使用したとき、新規な変異キャプシドのうちの2つは、AAV−LK03よりも良好に作用したが、AAV−DJよりも好ましくなかった。
マウスに、AAV8、AAV−DJ、ならびにAAV−KP1、KP2、およびKP3キャプシドがパッケージングされたホタルルシフェラーゼベクターrAAVをマウス1匹あたり2E10vgで静脈内注射し、ライブ画像化によって、導入遺伝子発現を数週間にわたってモニタリングした(図56、図64A)。AAVの大部分は肝臓を標的とすることが見出された。AAV−KP1は、AAV−DJよりも急速にマウス肝臓に形質導入するようであったが、定常状態の発現がその後の時点で達成されると、発現レベルはわずかに高いだけであった。注射から35日後、各マウスからいくつかの臓器を採取し、ルシフェラーゼ発現について分析した。肝臓を除いて、各マウス群内での高い変動性を伴って、非常に低い発現レベルが検出された(図64B)。AAV−KP2およびAAV−KP3注射マウスは、心臓組織では、AAV−DJまたはAAV8注射マウスよりも高いルシフェラーゼ発現を有し、3つの変異体は全て、DJまたはAAV8よりも高い効率で脾臓を形質導入した。KP変異AAV注射マウス由来の腎臓組織はまた、AAV−DJ注射マウス由来の腎臓組織よりも高いルシフェラーゼ発現を有したが、AAV−8注射マウスと比較して、レベルは有意に高くなかった。qPCRを使用して、ベクターゲノムを臓器において定量化した。しかしながら、明らかにバックグラウンドを超えるベクターゲノムコピーは、肝臓試料でのみ検出された(図64C)。AAV−KP1を注射したマウスは、AAV−DJまたはAAV−8パッケージングベクターを受けたマウスよりも高いベクターコピー数を含んでいた。AAV−KP3注射マウスは、AAV8注射マウスよりも有意に多くのベクターゲノムを肝臓に含んでいた。しかしながら、AAV−KP2注射マウスは、AAV8注射マウスと同様のレベルのrAAVゲノムを含んでいた。
ヒト化FRG異種移植マウスを形質導入して、シャフリングしたキャプシドのうちの1つの機能的ヒト肝臓形質導入能力を適切なインビボ環境で評価した。高レベルのヒトアルブミン(5.6〜8mg/mL)の発現によって示されるように、マウスにおいて、ヒト肝細胞を高度に再増殖させた。ヒト化マウスに、DJ、LK03、またはKP1キャプシドがパッケージングされたrAAVを発現するTomato Redを1E11vg/マウスの用量で静脈内注射により投与し、AAV投与の14日後に、ヒトおよびマウス肝細胞におけるTomato Redタンパク質の発現について評価した(図57)。LK03は、ヒト肝細胞では高い形質導入効率を有するが、マウス肝細胞ではそうではなく、DJによる形質導入はヒト細胞に特異的ではないことが観察された。KP1はまた、ヒトおよびマウスの肝細胞の両方に形質導入することが見出されたが、DJで見出されたものよりもレベルが高かった。4つのAAV−KP1注射マウスのうちの3つにおいて、ヒト肝細胞への形質導入効率は、AAV−LK03注射マウスに見出されるものと同様であった。しかしながら、AAV−LK03とは異なり、AAV−KP1は、マウスおよびヒト細胞の両方を形質導入したため、AAV−KP1注射マウスでは、総形質導入はより高かった。
本研究で同定された新規なキャプシドは、ヒト膵島細胞、特にβ細胞への形質導入において少なくとも10倍超の効率であった。変異体のうちの1つを、hESC由来のβ細胞への形質導入効率について試験したときに、同様のレベルの改善が達成された。さらに、キャプシド変異体AAV−DJおよびAAV−LK03が、AAV2またはAAV3Bと同等またはより良好な効率で一次ヒト膵島に形質導入することができるという従前の観察が確認された。しかしながら、高MOIは、膵島中心内の細胞を効率的に標的化するために必要であり、β細胞形質導入はα細胞よりも効率的ではなかった。
特有のバーコード配列のライブラリーを含むAAVベクターの生成。キャプシドコード配列をPacIおよびAscI含有リンカー断片と置き換えた野生型AAV2ベクター(ハイデルベルク大学(独国)のD.GrimmおよびS.Grosse,Germanyによって親切に提供された)を、バーコード化AAVライブラリーの構築のための出発材料として使用した。2つの特有の制限部位(AgeIおよびEagI)を、元の配列における2つのヌクレオチドを変異させることによって、キャプシドポリアデニル化シグナルの直ぐ下流に導入した(キャプシドポリアAシグナルの最後のヌクレオチドを出発点としてカウントした場合に、6位および24位において、AをTとし、TをCとした)。20nt長のスペーサー配列によって分離された12個のランダムヌクレオチドの2つのストレッチからなるバーコードを、前述のようにして生成した73。簡単に述べると、5’末端のAgeI制限部位配列を有するオリゴヌクレオチド、これに続く12個のランダムヌクレオチドおよび20nt長のスペーサー配列(CTA AAC CGG TNN NNN NNN NNN NAC GGA AAT ACG ATG TCG GGA)を、5’末端にEagI部位を含むオリゴヌクレオチド、これに続く12個のランダムヌクレオチド、およびアンチセンスペーサー配列(TTC TCG GCC GNN NNN NNN NNN NTC CCG ACA TCG TAT TTC CGT)にアニールし、エキソヌクレアーゼ活性(NEB)を欠いたKlenowポリメラーゼを使用して延長した。断片を、Qiaquick PCR精製キット(Qiagen)を使用して精製し、その後、AgeIおよびEagIで消化し、Qiaquick PCR精製カラムを使用して精製した。ベクターを同じ制限酵素で消化し、脱リン酸化し、フェノール−クロロホルム精製し、エタノール沈殿させた。最初にいくつかのライゲーション反応を設定し、プライマーrightF(CGC GCC ACT AGT AAT AAA C)およびQSeqRev(TAG AGC AAC TAG AGT TCG)を使用してコロニーPCRを行うことによって可能な多数のバーコード挿入物について試験することにより、最適なベクターと挿入物との比を評価した。スケールアップ反応のために、バーコードを、1〜2.5のベクターとベクターとのモル比で、合計体積30μLでライゲーションして、指示書(Agilent Technologies)に従ってStrataclean樹脂を使用して脱塩し、2μLのアリコートでDH10B−MegaX細胞(Thermo Fisher)にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションした細胞をプールし、500mlのLB−Amp培地に接種するために使用した。ライブラリーサイズおよび多様性を評価するために、アリコートをプレーティングした。37℃のシェーカー細菌中で16時間後、細菌を採取し、Megaprepキット(Qiagen)を使用してプラスミドDNAを単離した。ITRの完全性は、XmaIおよびAhdIによる消化によって確認された。バーコード多様性を評価するために、試験プレートからのいくつかの個々のクローンを配列決定した。
ヒト膵島培養。死亡した非糖尿病臓器ドナー由来のヒト膵臓膵島は、Integrated Islet Distribution Program(IIDP)またはStanford Islet Research Coreを通じてアルバータ大学によって提供され、10% FBS、ペニシリン−ストレプトマイシン、1%インスリントランスフェリンセレニウム(Thermo Fisher)、1mMピルビン酸ナトリウム、2mM Glutamax、2.5mM HEPESを含むCMRL−1066中で培養した。全ての膵島細胞培養実験において超低付着表面ディッシュ(ultra−low attachment dish)を使用した。
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Claims (79)
- 変異アデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドポリペプチドであって、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、ヒト膵臓組織またはヒト膵島において増加した形質導入またはトロピズムを示す、変異AAVキャプシドポリペプチド。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、分離されたヒト膵島またはインタクトなヒト膵島のいずれかに形質導入される、請求項1に記載の変異AAVキャプシドポリペプチド。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、増加した形質導入を示す、請求項1に記載の変異AAVキャプシドポリペプチド。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、増加したトロピズムを示す、請求項1に記載の変異AAVキャプシドポリペプチド。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、ヒト膵島内の1種以上の細胞において増加した形質導入またはトロピズムをさらに示す、請求項1〜4のいずれかに記載の変異AAVキャプシドポリペプチド。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、インビボでヒト膵臓組織またはヒト膵島の増加した形質導入を示す、請求項1〜5のいずれかに記載の変異AAVキャプシドポリペプチド。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、インビトロでヒト膵臓組織またはヒト膵島の増加した形質導入を示す、請求項1〜6のいずれかに記載の変異AAVキャプシドポリペプチド。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、エクスビボでヒト膵臓組織またはヒト膵島の増加した形質導入を示す、請求項1〜7のいずれかに記載の変異AAVキャプシドポリペプチド。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、増強された中和プロファイルを示す、請求項1〜8のいずれかに記載の変異AAVキャプシドポリペプチド。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、プールされたヒト免疫グロブリンに対する増強された中和プロファイルを示す、請求項1〜9のいずれかに記載の変異AAVキャプシドポリペプチド。
- 増強された中和プロファイルを示す前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、AAV−10A1(配列番号1)およびAAV−10A3(配列番号2)からなる群から選択される、請求項1〜10のいずれかに記載の変異AAVキャプシドポリペプチド。
- 増強された中和プロファイルを示す前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、AAV−10A1(配列番号1)である、請求項1〜11のいずれかに記載の変異AAVキャプシドポリペプチド。
- 増強された中和プロファイルを示す前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、AAV−10A3(配列番号3)である、請求項1〜12のいずれかに記載の変異AAVキャプシドポリペプチド。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、機能的AAVキャプシドの一部であり、前記機能的AAVキャプシドが、非コードRNA、タンパク質コード配列、発現カセット、多重発現カセット、相同組換えのための配列、ゲノム遺伝子標的化カセット、および治療用発現カセットからなる群から選択される核酸配列をパッケージングしている、請求項1〜13のいずれかに記載の変異AAVキャプシドポリペプチド。
- 前記核酸配列が、AAVベクター内に含まれる、請求項14に記載の変異AAVキャプシドポリペプチド。
- 前記発現カセットが、CRISPR/CAS発現系である、請求項14に記載の変異AAVキャプシドポリペプチド。
- 前記治療用発現カセットが、治療用タンパク質または抗体をコードする、請求項14に記載の変異AAVキャプシドポリペプチド。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチド配列が、AAV−10A1(配列番号1)、AAV−10A3(配列番号2)、AAV−10A4(配列番号3)、AAV−10A5(配列番号4)、AAV−18A1(配列番号5)、AAV−10B1(配列番号6)、AAV−10B3(配列番号7)、AAV−10B5(配列番号8)、AAV−10B6(配列番号9)、AAV−10B7(配列番号10)、AAV−18B2(配列番号12)、およびAAV−18B3(配列番号13)からなる群から選択される、請求項1〜17のいずれかに記載の変異AAVキャプシドポリペプチド。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチド配列が、AAV−10A1(配列番号1)、AAV−10A3(配列番号2)、およびAAV−18A1(配列番号5)からなる群から選択される、請求項1〜18のいずれかに記載の変異AAVキャプシドポリペプチド。
- 治療用処置レジメンまたはワクチンにおける、請求項1〜19のいずれかに記載の変異AAVキャプシドポリペプチドの使用方法。
- 内分泌障害の治療的処置における、請求項1〜20のいずれかに記載の変異AAVキャプシドポリペプチドの使用方法。
- I型またはII型を含む糖尿病の処置における、請求項1〜21のいずれかに記載の変異AAVキャプシドポリペプチドの使用方法。
- 対象に投与される核酸の総量を減少させるように、請求項1〜22のいずれかに記載の変異AAVキャプシドポリペプチドを使用する方法であって、前記方法は、変異AAVキャプシドポリペプチドを使用して前記核酸が形質導入されるときに、同様の治療効果を得るために、非変異親キャプシドポリペプチドを使用して前記核酸が形質導入されるときに前記対象に投与される核酸の量と比較して、より少ない総核酸量を前記対象に投与することを含む、方法。
- 変異AAVキャプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含むアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターであって、前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、ヒト膵臓組織またはヒト膵島において増加した形質導入またはトロピズムを示す、AAVベクター。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、増加した形質導入を示す、請求項24に記載のAAVベクター。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、増加したトロピズムを示す、請求項25に記載のAAVベクター。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、インビボでヒト膵臓組織またはヒト膵島の増加した形質導入を示す、請求項24〜26のいずれかに記載のAAVベクター。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、インビトロでヒト膵臓組織またはヒト膵島の増加した形質導入を示す、請求項24〜26のいずれかに記載のAAVベクター。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、エクスビボでヒト膵臓組織またはヒト膵島の増加した形質導入を示す、請求項24〜27のいずれかに記載のAAVベクター。
- 前記ベクターが、非コードRNA、コード配列、発現カセット、多重発現カセット、相同組換えのための配列、ゲノム遺伝子標的化カセット、および治療用発現カセットからなる群から選択される核酸配列をさらに含む、請求項24〜28のいずれかに記載のAAVベクター。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと同様の核酸発現を可能にする、請求項30に記載のAAVベクター。
- 前記発現カセットが、CRISPR/CAS発現系である、請求項30に記載のAAVベクター。
- 前記治療用発現カセットが、治療用タンパク質または抗体をコードする、請求項30に記載のAAVベクター。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチド配列が、AAV−10A1(配列番号1)、AAV−10A3(配列番号2)、AAV−10A4(配列番号3)、AAV−10A5(配列番号4)、AAV−18A1(配列番号5)、AAV−10B1(配列番号6)、AAV−10B3(配列番号7)、AAV−10B5(配列番号8)、AAV−10B6(配列番号9)、AAV−10B7(配列番号10)、AAV−18B2(配列番号12)、およびAAV−18B3(配列番号13)からなる群から選択される、請求項24〜33のいずれかに記載のAAVベクター。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチド配列が、AAV−10A1(配列番号1)、AAV−10A3(配列番号2)、およびAAV−18A1(配列番号5)からなる群から選択される、請求項24〜34のいずれかに記載のAAVベクター。
- 治療用処置レジメンまたはワクチンにおける、請求項24〜35のいずれかに記載のAAVベクターの使用方法。
- 内分泌障害の治療用処置における、請求項24〜35のいずれかに記載のAAVベクターの使用方法。
- I型またはII型を含む糖尿病の治療用処置における、請求項24〜35のいずれかに記載のAAVベクターの使用方法。
- 対象に投与される総AAVベクターの量を減少させるように、請求項1〜38のいずれかに記載の変異AAVキャプシドポリペプチドを使用する方法であって、前記方法は、前記AAVベクターが変異AAVキャプシドポリペプチドによって形質導入されるときに、同様の治療効果を得るために、前記AAVベクターが非変異親キャプシドポリペプチドによって形質導入されるときに、前記対象に投与されるAAVベクターの量と比較して、より少ない総AAVベクター量を前記対象に投与することを含む、方法。
- 変異AAVキャプシドポリペプチドを生成するための方法であって、前記変異AAVキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、ヒト膵臓組織またはヒト膵島において増加した形質導入またはトロピズムを示し、前記方法は、
a)変異AAVキャプシドポリペプチド遺伝子のライブラリーを生成することであって、前記変異AAVキャプシドポリペプチド遺伝子が、2つ以上の非変異親キャプシドポリペプチド由来の配列を含む複数の変異AAVキャプシドポリペプチド遺伝子を含むことと、
b)前記変異AAVキャプシドポリペプチド遺伝子ライブラリーをAAVベクターにクローニングすることによってAAVベクターライブラリーを生成することであって、前記AAVベクターが、複製能を有するAAVベクターであることと、
c)非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、ヒト膵臓組織またはヒト膵島において増加した形質導入またはトロピズムについて、変異AAVキャプシドポリペプチドをコードするb)の前記AAVベクターライブラリーをスクリーニングすることと、
d)c)の前記変異AAVキャプシドポリペプチドを選択することと、を含む、方法。 - 前記方法が、e)d)の前記変異AAVキャプシドポリペプチドの配列を決定することをさらに含む、請求項40に記載の方法。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、増加した形質導入を示す、請求項40または41に記載の方法。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、増加したトロピズムを示す、請求項40〜42のいずれかに記載の方法。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、増強された中和プロファイルをさらに示す、請求項40〜43のいずれかに記載の方法。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、プールされたヒト免疫グロブリンに対する増強された中和プロファイルをさらに示す、請求項40〜44のいずれかに記載の方法。
- 増強された中和プロファイルをさらに示す前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、AAV−10A1(配列番号1)およびAAV−10A3(配列番号2)からなる群から選択される、請求項40〜45のいずれかに記載の方法。
- 増強された中和プロファイルをさらに示す前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、AAV−10A1(配列番号1)である、請求項40〜45のいずれかに記載の方法。
- 増強された中和プロファイルをさらに示す前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、AAV−10A3(配列番号2)である、請求項40〜45のいずれかに記載の方法。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、インビボでヒト膵臓組織またはヒト膵島の増加した形質導入を示す、請求項40〜48のいずれかに記載の方法。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、インビトロでヒト膵臓組織またはヒト膵島の増加した形質導入を示す、請求項40〜49のいずれかに記載の方法。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、エクスビボでヒト膵臓組織またはヒト膵島の増加した形質導入を示す、請求項40〜50のいずれかに記載の方法。
- 変異AAVキャプシドポリペプチドをコードする核酸配列を含むアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターであって、前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、ヒト肝臓組織またはヒト肝細胞において増加した形質導入またはトロピズムを示す、AAVベクター。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、増加した形質導入を示す、請求項52に記載のAAVベクター。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、増加したトロピズムを示す、請求項53に記載のAAVベクター。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、インビボでヒト肝臓組織またはヒト肝細胞の増加した形質導入を示す、請求項52〜54のいずれかに記載のAAVベクター。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、インビトロでヒト肝臓組織またはヒト肝細胞の増加した形質導入を示す、請求項52〜54のいずれかに記載のAAVベクター。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、エクスビボでヒト肝臓組織またはヒト肝細胞の増加した形質導入を示す、請求項52〜55のいずれかに記載のAAVベクター。
- 前記ベクターが、非コードRNA、コード配列、発現カセット、多重発現カセット、相同組換えのための配列、ゲノム遺伝子標的化カセット、および治療用発現カセットからなる群から選択される核酸配列をさらに含む、請求項52〜56のいずれかに記載のAAVベクター。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと同様の核酸発現を可能にする、請求項58に記載のAAVベクター。
- 前記発現カセットが、CRISPR/CAS発現系である、請求項58に記載のAAVベクター。
- 前記治療用発現カセットが、治療用タンパク質または抗体をコードする、請求項58に記載のAAVベクター。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチド配列が、AAV−10A1(配列番号1)、AAV−10A3(配列番号2)、AAV−10A4(配列番号3)、AAV−10A5(配列番号4)、AAV−18A1(配列番号5)、AAV−10B1(配列番号6)、AAV−10B3(配列番号7)、AAV−10B5(配列番号8)、AAV−10B6(配列番号9)、AAV−10B7(配列番号10)、AAV−18B2(配列番号12)、およびAAV−18B3(配列番号13)からなる群から選択される、請求項52〜61のいずれかに記載のAAVベクター。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチド配列が、AAV−10A1(配列番号1)、AAV−10A3(配列番号2)、およびAAV−18A1(配列番号5)からなる群から選択される、請求項52〜62のいずれかに記載のAAVベクター。
- 治療用処置レジメンまたはワクチンにおける、請求項52〜63のいずれかに記載のAAVベクターの使用方法。
- 内分泌障害の治療用処置における、請求項52〜63のいずれかに記載のAAVベクターの使用方法。
- I型またはII型を含む糖尿病の治療用処置における、請求項52〜63のいずれかに記載のAAVベクターの使用方法。
- 対象に投与される総AAVベクターの量を減少させるように、請求項1〜66のいずれかに記載の変異AAVキャプシドポリペプチドを使用する方法であって、前記方法は、前記AAVベクターが変異AAVキャプシドポリペプチドによって形質導入されるときに、同様の治療効果を得るために、前記AAVベクターが非変異親キャプシドポリペプチドによって形質導入されるときに前記対象に投与されるAAVベクターの量と比較して、より少ない総AAVベクター量を前記対象に投与することを含む、方法。
- 変異AAVキャプシドポリペプチドを生成するための方法であって、前記変異AAVキャプシドポリペプチドは、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、ヒト肝臓組織またはヒト肝細胞において増加した形質導入またはトロピズムを示し、前記方法は、
a)変異AAVキャプシドポリペプチド遺伝子のライブラリーを生成することであって、前記変異AAVキャプシドポリペプチド遺伝子は、2つ以上の非変異親キャプシドポリペプチド由来の配列を含む複数の変異AAVキャプシドポリペプチド遺伝子を含むことと、
b)前記変異AAVキャプシドポリペプチド遺伝子ライブラリーをAAVベクターにクローニングすることによってAAVベクターライブラリーを生成することであって、前記AAVベクターは、複製能を有するAAVベクターであることと、
c)非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、ヒト膵臓組織またはヒト膵島において増加した形質導入またはトロピズムについて、変異AAVキャプシドポリペプチドをコードするb)の前記AAVベクターライブラリーをスクリーニングすることと、
d)c)の前記変異AAVキャプシドポリペプチドを選択することと、を含む、方法。 - 前記方法が、e)d)の前記変異AAVキャプシドポリペプチドの配列を決定することをさらに含む、請求項68に記載の方法。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、増加した形質導入を示す、請求項68または69に記載の方法。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、増加したトロピズムを示す、請求項68〜70のいずれかに記載の方法。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、増強された中和プロファイルをさらに示す、請求項68〜71のいずれかに記載の方法。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、プールされたヒト免疫グロブリンに対する増強された中和プロファイルをさらに示す、請求項68〜72のいずれかに記載の方法。
- 増強された中和プロファイルをさらに示す前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、AAV−10A1(配列番号1)およびAAV−10A3(配列番号2)からなる群から選択される、請求項68〜73のいずれかに記載の方法。
- 増強された中和プロファイルをさらに示す前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、AAV−10A1(配列番号1)である、請求項68〜73のいずれかに記載の方法。
- 増強された中和プロファイルをさらに示す前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、AAV−10A3(配列番号2)である、請求項68〜73のいずれかに記載の方法。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、インビボでヒト肝臓組織またはヒト肝細胞の増加した形質導入を示す、請求項68〜76のいずれかに記載の方法。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、インビトロでヒト膵臓組織またはヒト膵島の増加した形質導入を示す、請求項68〜77のいずれかに記載の方法。
- 前記変異AAVキャプシドポリペプチドが、非変異親キャプシドポリペプチドと比較して、エクスビボでヒト膵臓組織またはヒト膵島の増加した形質導入を示す、請求項68〜78のいずれかに記載の方法。
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