CN115605594A - 抗igf-1受体人源化抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供：抗IGF‑1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其包含来自小鼠亲本抗体IGF11‑16的重链和轻链的CDR和来自人抗体的重链和轻链的各FR，同时至少1个CDR相对于小鼠亲本抗体对应的CDR包含至少1处的氨基酸残基的取代。

Description

抗IGF-1受体人源化抗体
技术领域
本发明涉及抗IGF-1受体人源化抗体。具体而言，涉及特异性地与IGF-1受体结合的抗IGF-1受体人源化抗体。
背景技术
1. IGF-1
IGF-1是胰岛素样生长因子，通过由下垂体分泌的生长激素(GH)激活GH受体，而主要由肝脏分泌，与IGF-1受体作用，从而在各种脏器中体现各种生理功能。因此，IGF-1被期待治疗各种疾病。IGF-1与胰岛素原的氨基酸序列相比具有高达约40%的同源性，因此有时还与胰岛素受体结合而体现胰岛素样作用。另外，IGF-1受体与胰岛素受体的氨基酸序列相比具有高达约60%的同源性，因此这两种受体形成异二聚体，也因而发挥生理作用。需要说明的是，胰岛素通过与胰岛素受体作用而体现强效的降血糖作用，因此作为降血糖药被用于治疗。
2. IGF-1受体
IGF-1受体是跨膜蛋白，该跨膜蛋白由α链和β链构成，包含L1、CR、L2、Fn1、Fn2和Fn3这6个胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。IGF-1受体的胞内结构域具有酪氨酸激酶。胞外结构域参与IGF-1与IGF-1受体结合时的该受体的立体结构的变化所伴随的细胞内的酪氨酸激酶的激活。若IGF-1受体形成同二聚体复合物(同型)、且IGF-1与之结合，则通过激活受体激酶来传递信号。另外，若与胰岛素受体形成异二聚体复合物(异型)、且胰岛素或IGF-1与之结合，则通过激活受体激酶来传递信号。
3. IGF-1的生理作用
已明确了IGF-1的增加身长或体重等的生长促进作用、和促进糖代谢或降血糖作用等的胰岛素样代谢作用。已确认到作为人重组IGF-1的美卡舍明(Mecasermin)会改善胰岛素受体异常症的高血糖、高胰岛素血症、黑色表皮瘤和多毛等症状。另外，还确认到其会改善生长激素抵抗性侏儒症(Dwarfism)的生长障碍(非专利文献1)。
4. IGF-1的生长促进作用
IGF-1是生长促进的主要因子(非专利文献2、非专利文献3)。实际上，作为人重组IGF-1的美卡舍明在临床上被用作侏儒症的治疗药。另外，已知IGF-1使人软骨细胞的DNA合成能力亢进。另外，给予IGF-1会使摘除了下垂体的大鼠的体重增加，使大腿骨(股骨)骨长伸长。
5. IGF-1的肌肉量增加作用
由IGF-1介导的细胞增殖活性的亢进需要IGF-1受体的持续激活。在使IGF-1受体过度表达的动物中肌肉量增加。另外，IGF-1/IGFBP3的持续给药会使大腿骨近端骨折患者的握力亢进，使无辅助下的从座位站起的能力改善。已知高龄的人和小鼠的肌肉中的IGF-1浓度较低龄者下降，但在使IGF-1在肌肉组织中特异性地强制表达的高龄小鼠中，与野生型小鼠相比肌肉量有所改善(非专利文献4)。
6. 使肌肉量增加的现有品
作为生长激素释放肽受体激动剂的阿拉莫林(Anamorelin)在废用性肌肉萎缩症即恶病质(Cachexia)的临床试验中使瘦体重增加。另一方面，作为副作用，确认到恶心和血糖值的上升。肌肉生长抑制素(Myostatin)是与激活素受体II (ActRII)作用以抑制Akt/mTOR的骨骼肌形成的负向调控因子。作为抗肌肉生长抑制素抗体的LY2495655使实施了全人工股关节置换术的患者和高龄者的肌肉量增加。另外，作为抗ActRII抗体的比玛格鲁单抗(Bimagrumab)使神经肌肉疾病患者的肌肉量增加。然而，可促进骨骼肌的形成并用于治疗的药物目前尚不存在。
7. IGF-1的降血糖作用
作为IGF-1的胰岛素样作用，已知有降血糖作用。IGF-1在来自大鼠肌肉的细胞中使葡萄糖摄取作用亢进。另外，给予IGF-1会使大鼠的血糖值降低。据报道，IGF-1的降血糖作用会引起低血糖症状，这成为临床上的副作用。而且，IGF-1通过对人给药而引起低血糖症状，因此在开始治疗时从低剂量起依次给予适当量，并需要观察给药后的包括血糖值等在内的各种临床所见。
IGF-1经由Akt的磷酸化的亢进来体现降血糖作用。Akt的活性型突变体使3T3-L1细胞的葡萄糖摄取亢进。另一方面，Akt2缺损的小鼠的血糖值上升。另外，在来自大鼠肌肉的细胞中，Akt抑制剂会抑制基于胰岛素刺激的葡萄糖摄取。而且，已知IGF-1会激活参与降血糖作用的胰岛素受体。由这些结果认为：Akt的过度激活和胰岛素受体的激活参与IGF-1的降血糖作用。
8. IGF-1的短的血中半衰期
由于IGF-1的血中半衰期短，所以在治疗中需要频繁给药。实际上，作为人重组IGF-1的美卡舍明的血中半衰期为约11小时～16小时，在侏儒症的治疗中需要1天给药1次～2次。血中的IGF-1的约70～80%与IGFBP3结合。IGF-1的游离体显示生理活性。与IGFBP3的结合使IGF-1的血中半衰期维持约10小时～16小时。作为IGF-1与IGFBP3的复方制剂的IPLEX与IGF-1相比血中半衰期长达约21小时～26小时，是可1天给予1次的药剂。然而，IPLEX正退出市场。还尝试开发了IGF-1的动力学得到改善的PEG化IGF-1，但用于治疗的药剂并不存在。
9. 通过IGF-1的作用而期待的治疗效果
已知IGF-1与多种脏器作用，其生理功能涉及多方面。例如，据报道IGF-1在中枢神经系统中经由IGF-1受体的激活而具有线粒体的保护和基于抗氧化作用的神经保护作用。IGF-1促进受伤后的神经突的形成。另外，认为IGF-1对肝硬化的治疗有效。肝硬化是从肝损伤或慢性肝病开始病情进展而形成的疾病，是伴有肝脏的纤维化的疾病。在肝硬化模型动物中，IGF-1的给予抑制了肝脏的纤维化。而且，已知IGF-1还参与肾脏的发育、功能。在肾脏的系膜细胞中，IGF-1对糖毒性所引起的氧化应激和细胞凋亡具有保护作用。IGF-1被期待作为肾病的治疗药。
通过给予IGF-1而期待改善的病态包括：肌肉减少症(Sarcopenia)、废用性肌肉萎缩症、恶病质、侏儒症、Laron症、肝硬化、肝纤维化、衰老、子宫内胎儿发育迟缓(IUGR)、神经疾病、中风、脊髓损伤、心血管保护、糖尿病、胰岛素抵抗、代谢综合征、肾病、骨质疏松症、囊性纤维化、伤口愈合、肌强直性营养不良、爱滋病肌肉衰减症、HIV所伴随的脂肪重新分布综合征、烧伤、克罗恩病、Werner综合征、X-连锁性复合免疫缺陷、听力下降、神经性厌食症和早产儿视网膜病变。这样，IGF-1因其丰富多彩的生理作用，而被期待作为各种疾病的治疗药。然而，作为副作用的降血糖作用、和因半衰期短而导致的多次给药成为其在临床应用上的课题。
10. 抗IGF-1受体激动剂抗体
抗体制剂通常半衰期长，每月给药1次～2次即显示有效性。关于抗IGF-1受体激动剂抗体，报道了若干其在体外(in vitro)短时间处理中的受体激活作用。例如，抗体3B7和抗体2D1促进了在体外培养5小时的重组IGF-1受体表达细胞的DNA合成(非专利文献5)。另外，具有癌细胞株的增殖抑制活性的抗IGF-1受体拮抗剂抗体11A1、11A4、11A11和24-57在体外使IGF-1受体的酪氨酸的磷酸化亢进，但极其微弱(非专利文献6)。另外，研究显示抗体16-13、17-69、24-57、24-60和24-31具有在体外短时间内的细胞的DNA合成、和葡萄糖摄取的亢进作用，这些抗体有可能具有降血糖作用(非专利文献7)。
然而，在具有癌细胞增殖抑制作用的αIR-3等抗IGF-1受体拮抗剂抗体中也观察到了IGF-1受体酪氨酸磷酸化，其不能成为激动剂作用的指标(非专利文献5、6、8)。另外，在以胸苷或BrdU的摄取等DNA合成为指标的细胞增殖测定中，在具有癌细胞增殖抑制作用的抗IGF-1受体拮抗剂抗体中也观察到了胸苷摄取(非专利文献5～8)，其无法成为具有细胞增殖活性的激动剂抗体的指标。而且，这是24小时以内的短时间的评价，尚无关于在数日的培养中的细胞增殖促进的IGF-1受体激动剂抗体的报道(非专利文献5～8)。更不用说没有在体内(in vivo)显示出对IGF-1受体的激动剂活性的抗体的报道。另外，由于IGF-1发挥降血糖作用和细胞增殖作用这两者，因此，为了对人给予抗IGF-1受体激动剂抗体作为治疗药，需要避免降血糖作用，但迄今为止尚无这种抗IGF-1受体激动剂抗体的报道。另外，已知抗体的分子量大、组织迁移性低，脑内迁移性为0.1%左右、肌肉组织迁移性为2%左右。因此，为了在抗体的迁移性低的组织中发挥作用，需要在极低的浓度范围(pM级)显示充分的药理活性的抗体。然而，迄今为止尚无可在这样的极低浓度下起作用的抗IGF-1受体激动剂抗体的报道。
在这样的背景下，本发明人等成功地制作了在体外以极低的浓度发挥成肌细胞增殖作用、并且在这种浓度下不会诱导分化骨骼肌细胞的糖摄取的抗IGF-1受体单克隆小鼠抗体IGF11-16。进一步确认了：所得到的该单克隆小鼠抗体在体内诱导肌肉量增加作用和生长板伸长作用，但不会引起低血糖症状(专利文献1)。
11. 抗IGF-1受体拮抗剂抗体
关于与IGF-1受体结合的抗体，利用其抑制IGF-1与IGF-1受体的结合的拮抗剂作用，试着将其用于恶性肿瘤等的治疗。然而，现有的IGF-1受体拮抗剂抗体不仅在单独治疗中高血糖等的副作用多(非专利文献9)，而且通过与其他抗癌药并用还使高血糖的出现率上升(非专利文献10)，因此认为其在治疗中的适用受限。近年来，替妥木单抗(Teprotumumab)被批准用于甲状腺功能亢进症的眼病适应症(非专利文献11)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2018/221521号；
非专利文献
非专利文献1：Human somatomedin C “Somazon®Formulation for Injection10mg,” Drug interview form, 2015年5月修订, 第5版；
非专利文献2：Abuzzahab, M.J.等人, IGF-1 receptor mutations resultingin intrauterine and postnatal growth retardation. N Engl J Med, 2003. 349(23): 第2211-22页；
非专利文献3：Woods, K.A.等人, Intrauterine growth retardation andpostnatal growth failure associated with deletion of the insulin-like growthfactor I gene. N Engl J Med, 1996. 335(18): 第1363-7页；
非专利文献4：Musaro, A.等人, Localized Igf-1 transgene expressionsustains hypertrophy and regeneration in senescent skeletal muscle, NatureGenetics, 2001, 第27卷, No.2, 第195-200页；
非专利文献5：Xiong, L.等人, Growth-stimulatory monoclonal antibodiesagainst human insulin-like growth factor I receptor. Proc Natl Acad Sci U SA, 1992. 89(12): 第5356-60；
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非专利文献7：Soos, M.A.等人, A panel of monoclonal antibodies for thetype I insulin-like growth factor receptor. Epitope mapping, effects onligand binding, and biological activity. J Biol Chem, 1992. 267(18): 第12955-63页；
非专利文献8：Kato, H.等人, Role of tyrosine kinase activity in signaltransduction by the insulin-like growth factor-I (IGF-1) receptor.Characterization of kinase-deficient IGF-1 receptors and the action of anIGF-1-mimetic antibody (alpha IR-3). J Biol Chem, 1993. 268(4): 第 2655-61页；
非专利文献9：Atzori, F.等人, A Phase I Pharmacokinetic andPharmacodynamic Study of Dalotuzumab (MK-0646), an Anti-Insulin-like GrowthFactor-1 Receptor Monoclonal Antibody, in Patients with Advanced SolidTumors. Clin Cancer Res., 2011. 17(19): 第6304-12页；
非专利文献10：de Bono J.S.等人, Phase II randomized study offigitumumab plus docetaxel and docetaxel alone with crossover formetastaticcastration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res., 2014. 20(7): 第1925-34页；
非专利文献11：Markham. A, Teprotumumab: First Approval. Drugs, 2020.80(5): 第509-512页；
非专利文献12：Riechman, L., Clark, M., Waldmann, H., Winter, G.:Reshaping human antibodies for therapy. Nature, 1988. 332: 第323-327页；
非专利文献13：Kabat等人, The Journal of Immunology, 1991, 第147卷,No.5, 第1709-1719页；
非专利文献14：Al-Lazikani等人, Journal of Molecular Biology, 1997, 第273卷, No.4, 第927-948页；
非专利文献15：Abhinandan, K.R.等人, Molecular Immunology, 2008, 第45卷, 第3832-3839页；
非专利文献16：Jian, Y.等人, Nucleic Acids Research, 2013, 第41卷, W34-W40；
非专利文献17：Yamada, T.等人, Therapeutic monoclonal antibodies. KeioJournal of Medicine, 2011, 第60卷, No.2, 第37-46页；
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非专利文献19：Dumet, C.等人, MAbs, 2019, 第11卷, No.8, 第1341-1350页；
非专利文献20：Saunders, K. O., Frontiers in Immunology, 2019, 第10卷,Article 1296；
非专利文献21：Walle等人, Expert Opin. Biol. Ther., 2007, 第7卷, No.3,第405-418页；
非专利文献22：Silva, J-P.等人, The Journal of Biological Chemistry,2015, 第290卷, No.9, 第5462-5469页。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的之一在于：提供具有与已报道的抗IGF-1受体小鼠抗体IGF11-16(专利文献1)同等以上的特异性和结合亲和性或活性的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物、或它们的制作方法。
作为本发明的具体目的，并不限定于这些，例如可列举：为了获得具有与已报道的抗IGF-1受体小鼠抗体IGF11-16 (专利文献1)同等以上的特异性和结合亲和性或活性的人源化抗体，(1) 提供人构架的设计所必需的氨基酸、(2) 提供在作为抗原结合位点的CDR序列(在本发明中，通过Kabat法来鉴定)中维持活性所必需的氨基酸位点、(3) 提供用于降低免疫原性的氨基酸取代、以及(4) 提供用于避免脱酰胺化风险的氨基酸取代等。
通过利用/应用本发明，例如可获得抗IGF-1受体人源化抗体，该抗体可经由人IGF-1受体使肌肉量增加，但不会诱导低血糖症状。由此，可获得抗IGF-1受体人源化抗体，可对人给予该抗体以达到例如改善或治疗肌肉减少症、废用性肌肉萎缩或恶病质等与IGF-1受体信号相关的病态或疾病的目的。另外，可提供可对人给药的、确保了低免疫原性或物性稳定性的人源化抗体。
用于解决课题的手段
即，本发明涉及以下内容。
[1] 抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其包含：来自小鼠亲本抗体IGF11-16的重链和轻链的各互补性决定区(CDR)、以及来自人抗体的重链和轻链的各构架区(FR)，同时至少1个CDR相对于小鼠亲本抗体IGF11-16的对应的CDR包含至少1处的氨基酸残基的取代。
[2] 项[1]所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其中，重链可变区的构架区1 (FR-H1)的第25位的氨基酸残基为脯氨酸。
[3] 项[1]或[2]所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其包含：
作为重链可变区的CDR-1 (CDR-H1)序列的SEQ ID NO: 1的氨基酸序列、或SEQ IDNO: 1的任意1处的氨基酸残基被取代而得的氨基酸序列；
作为重链可变区的CDR-2 (CDR-H2)序列的SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5的氨基酸序列、或SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5的任意1处、2处或3处的氨基酸残基被取代而得的氨基酸序列；
作为重链可变区的CDR-3 (CDR-H3)序列的SEQ ID NO: 7的氨基酸序列、或SEQ IDNO: 7的任意1处或2处的氨基酸残基被取代而得的氨基酸序列；
作为轻链可变区的CDR-1 (CDR-L1)序列的SEQ ID NO: 9的氨基酸序列、或SEQ IDNO: 9的任意1处或2处的氨基酸残基被取代而得的氨基酸序列；
作为轻链可变区的CDR-2 (CDR-L2)序列的SEQ ID NO: 11的氨基酸序列、或SEQID NO: 11的任意1处的氨基酸残基被取代而得的氨基酸序列；以及
作为轻链可变区的CDR-3 (CDR-L3)序列的SEQ ID NO: 13的氨基酸序列、或SEQID NO: 13的任意1处或2处的氨基酸残基被取代而得的氨基酸序列。
[4] 项[1]或[2]所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其包含：
作为重链可变区的CDR-1 (CDR-H1)序列的、与SEQ ID NO: 1具有80%以上的同源性的氨基酸序列；
作为重链可变区的CDR-2 (CDR-H2)序列的、与SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5具有82%以上的同源性的氨基酸序列；
作为重链可变区的CDR-3 (CDR-H3)序列的、与SEQ ID NO: 7具有75%以上的同源性的氨基酸序列；
作为轻链可变区的CDR-1 (CDR-L1)序列的、与SEQ ID NO: 9具有81%以上的同源性的氨基酸序列；
作为轻链可变区的CDR-2 (CDR-L2)序列的、与SEQ ID NO: 11具有85%以上的同源性的氨基酸序列；以及
作为轻链可变区的CDR-3 (CDR-L3)序列的、与SEQ ID NO: 13具有77%以上的同源性的氨基酸序列。
[5] 项[1]或[2]所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其包含：
作为重链可变区的CDR-1 (CDR-H1)序列的SEQ ID NO: 1的第3位的Trp被维持或被取代成类似的氨基酸残基而得的氨基酸序列，其中,除该第3位的氨基酸残基以外的任意1处的氨基酸残基被取代，或者与SEQ ID NO: 1具有80%以上的同源性；
作为重链可变区的CDR-2 (CDR-H2)序列的下述氨基酸序列：
SEQ ID NO: 3的第1位的Glu和第3位的Asn分别被维持或被取代成类似的氨基酸残基、同时第6位的Asn被维持或被取代成Ser或Gln而得的氨基酸序列，其中，除该第1位、第3位和第6位的氨基酸残基以外的任意1处、2处或3处的氨基酸残基被取代，或者与SEQ IDNO: 3具有82%以上的同源性，或者
SEQ ID NO: 5的第1位的Glu和第3位的Asn分别被维持或被取代成类似的氨基酸残基、同时第6位的Ser被维持或被取代成Asn或Gln而得的氨基酸序列，其中，除该第1位、第3位和第6位的氨基酸残基以外的任意1处、2处或3处的氨基酸残基被取代，或者与SEQ IDNO: 5具有82%以上的同源性；
作为重链可变区的CDR-3 (CDR-H3)序列的SEQ ID NO: 7的第4位的Arg被维持或被取代成类似的氨基酸残基而得的氨基酸序列，其中，除该第4位的氨基酸残基以外的任意1处或2处的氨基酸残基被取代，或者与SEQ ID NO: 7具有75%以上的同源性；
作为轻链可变区的CDR-1 (CDR-L1)序列的SEQ ID NO: 9的第9位的Trp被维持或被取代成类似的氨基酸残基而得的氨基酸序列，其中，除该第9位的氨基酸残基以外的任意1处或2处的氨基酸残基被取代，或者与SEQ ID NO: 9具有81%以上的同源性；
作为轻链可变区的CDR-2 (CDR-L2)序列的SEQ ID NO: 11的任意1处的氨基酸残基被取代、或与SEQ ID NO: 11具有85%以上的同源性的氨基酸序列；以及
作为轻链可变区的CDR-3 (CDR-L3)序列的SEQ ID NO: 13的任意1处或2处的氨基酸残基被取代、或与SEQ ID NO: 13具有77%以上的同源性的氨基酸序列。
[6] 权利要求1～5中任一项所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其特异性地与具有SEQ ID NO: 71的氨基酸序列的人IGF-1受体的胞外结构域结合。
[7] 项[1]～[6]中任一项所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其包含：
作为重链可变区的氨基酸序列，即SEQ ID NO: 43、47、49、53、55或59的氨基酸序列、在SEQ ID NO: 43、47、49、53、55或59的氨基酸序列中有1处或数处的氨基酸残基被取代、缺失或添加而得的氨基酸序列、或与SEQ ID NO: 43、47、49、53、55或59具有90%以上的同源性的氨基酸序列；以及
作为轻链可变区的氨基酸序列，即SEQ ID NO: 65、67或69的氨基酸序列、在SEQID NO: 65、67或69的氨基酸序列中有1处或数处的氨基酸残基被取代、缺失或添加而得的氨基酸序列、或与SEQ ID NO: 65、67或69具有90%以上的同源性的氨基酸序列。
[8] 项[1]～[7]中任一项所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其包含作为重链和/或轻链的恒定区的人免疫球蛋白的任何类的重链和/或轻链的恒定区。
[9] 项[1]～[8]中任一项所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其中，重链恒定区为人IgG4类的重链恒定区或其1～10处的氨基酸被取代而得的恒定区。
[10] 项[1]～[8]中任一项所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其中，重链恒定区为人IgG1类的重链恒定区或其1～10处的氨基酸被取代而得的恒定区。
[11] 项[1]～[10]中任一项所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其以平衡解离常数(KD)为1×10-7M以下的亲和性与IGF-1受体结合。
[12] 项[1]～[11]中任一项所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其具有IGF-1受体信号激活能力。
[13] 项[1]～[12]中任一项所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其在成肌细胞增殖试验中具有增殖活性。
[14] 项[1]～[13]中任一项所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其在基于BIACORE的与重组可溶性IGF-1受体的结合性试验中，具有与小鼠亲本抗体IGF11-16同等以上的结合亲和性。
[15] 项[1]～[14]中任一项所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其在正常哺乳动物中可诱导肌肉量增加作用，但不会诱导低血糖症状。
[16] 项[1]～[15]中任一项所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其在摘除了下垂体的模型动物中可诱导生长板软骨伸长作用，但不会诱导低血糖症状。
[17] 项[1]～[16]中任一项所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其在以诱导脊椎动物的肌肉量和/或身长的增加的剂量对该脊椎动物给药的情况下，不会降低该脊椎动物的血糖值。
[18] 项[1]～[16]中任一项所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其即使在相对于诱导脊椎动物的肌肉量和/或身长的增加的有效剂量为10倍以上的血中暴露量下，也不会降低该脊椎动物的血糖值。
[19] 项[1]～[18]中任一项所述的人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其具有IGF-1受体信号激活抑制能力。
[20] 项[1]～[18]中任一项所述的人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其在成肌细胞增殖试验中抑制可激活IGF-1受体的配体即IGF-1、IGF-2和胰岛素的至少一者的增殖活性。
[21] 项[1]～[20]中任一项所述的人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其在癌细胞增殖试验中具有抑制细胞增殖的活性。
[22] 项[1]～[21]中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段、或它们的衍生物，其中，抗IGF-I受体抗体或其片段、或它们的衍生物具有下述1)～4)的至少一个特征：
1) 抑制由IGF-I受体激活配体引起的来自脊椎动物的细胞的增殖；
2) 抑制脊椎动物中的由IGF-I受体激活配体引起的细胞增殖性疾病中的细胞增殖；
3) 在抑制由IGF-I受体激活配体引起的来自脊椎动物的细胞的增殖的剂量下，对分化肌细胞中的葡萄糖摄取没有影响；
4) 在抑制脊椎动物中的由IGF-I受体激活配体引起的细胞增殖性疾病中的细胞增殖的剂量下，不会使该脊椎动物的血糖值发生变化。
[23] 项[1]～[22]中任一项所述的人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其在携带癌症的模型动物中可诱导癌细胞增殖抑制作用，但对血糖值没有影响。
[24] 项[23]中任一项所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其在携带癌症的模型动物中，即使在相对于可诱导癌细胞增殖抑制作用的有效剂量为10倍以上的血中暴露量下，对该模型动物的血糖值也没有影响。
[25] 核酸分子，其包含编码项[1]～[24]中任一项所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物的多核苷酸序列。
[26] 克隆载体或表达载体，其包含至少一个项[25]所述的核酸分子。
[27] 重组体细胞，其是在宿主细胞中导入有[26]所述的载体而得的。
[28] 制造项[1]～[24]中任一项所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物的方法，该方法包括以下工序：培养项[27]所述的重组体细胞，纯化由上述重组体细胞产生的该抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物。
[29] 药物组合物，其包含项[1]～[24]中任一项所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物、项[25]所述的核酸分子、项[26]所述的载体或项[27]所述的重组体细胞作为有效成分。
[30] 项[29]所述的药物组合物，其用于治疗肌肉萎缩性疾病或侏儒症。
[31] 项[30]所述的药物组合物，其中，肌肉萎缩性疾病为废用性肌肉萎缩、肌肉减少症(Sarcopenia)或恶病质。
[32] 项[28]所述的药物组合物，其中，侏儒症为Laron型侏儒症或生长激素抵抗性侏儒症。
[33] 项[29]所述的药物组合物，其用于治疗与IGF-1受体相关的疾病。
[34] 项[33]所述的药物组合物，其中，与IGF-I受体相关的疾病为选自肝癌、成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、儿童癌症、肢端肥大症、卵巢癌、胰腺癌、良性前列腺肥大、乳腺癌、前列腺癌、骨癌、肺癌、结肠直肠癌、颈部癌、滑膜肉瘤、膀胱癌、胃癌、维尔姆斯氏瘤、与转移性类癌和血管活性肠肽分泌肿瘤相关的腹泻、血管活性肠肽瘤、Verner-Morrison综合征、Beckwith-Wiedemann综合征、肾癌、肾细胞癌、移行上皮细胞癌、尤文氏肉瘤、白血病、急性成淋巴细胞白血病、脑肿瘤、胶质母细胞瘤、非胶质母细胞瘤性脑肿瘤、脑脊膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原始神经外胚层肿瘤、成神经管细胞瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、脉络丛乳头状瘤、巨人症、干癣、动脉粥样硬化、血管平滑肌再狭窄、不适当的微血管生长、糖尿病性视网膜病变、格雷夫斯病、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、重症肌无力、自身免疫性甲状腺炎、桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、甲状腺眼病、甲状腺功能亢进以及白塞病(Behcet’s disease)的疾病。
发明效果
本发明的抗体或其片段、或它们的衍生物通过与人IGF-1受体结合，可获得可用于治疗或预防经由人IGF-1受体起作用的疾病的抗IGF-1受体人源化抗体。另外，还可提供可对人给药的、确保了低免疫原性或物性稳定性的人源化抗体。
附图说明
[图1A] 图1A～F是将本发明的各种人源化抗体所具有的人成肌细胞增殖活性与小鼠亲本抗体IGF11-16作比较而显示的曲线图。
[图1B] 同上。
[图1C] 同上。
[图1D] 同上。
[图1E] 同上。
[图1F] 同上。
[图2] 图2是将通过ELISA测定的本发明的人源化抗体hIGF13_PS和hIGF25_PS对各动物物种的IGF-1R的反应性与人小鼠嵌合抗体IGF11-16作比较而显示的曲线图，所述ELISA使用了表达各动物物种的IGF-1R的HEK293T细胞。
[图3A] 图3A是显示在对豚鼠给予本发明的人源化抗体hIGF13_PS的情况下的血糖值的变化的曲线图。
[图3B] 图3B是显示在对豚鼠给予本发明的人源化抗体hIGF25_PS的情况下的血糖值的变化的曲线图。
[图4] 图4是将对豚鼠给予本发明的人源化抗体hIGF13_PS和hIGF25_PS的情况下的血中浓度的变化与小鼠亲本抗体IGF11-16给药时作比较而显示的曲线图。
[图5] 图5是将对正常豚鼠静脉内单次给予本发明的人源化抗体hIGF13_PS的情况下2周后的趾长伸肌质量的变化与IGF-1的皮下持续给药和小鼠亲本抗体IGF11-16的静脉内单次给药作比较而显示的曲线图。
[图6] 图6是将对摘除了下垂体的豚鼠静脉内单次给予本发明的人源化抗体hIGF13_PS的情况下2周后的胫骨近端的骨骺线厚度的变化与IGF-1的皮下持续给药和GH制剂的皮下持续给药作比较而显示的曲线图。
[图7] 图7是将对食蟹猴给予本发明的人源化抗体hIGF13_PS的情况下的血糖值的变化与IGF-1给药时作比较而显示的曲线图。
[图8] 图8是显示在对食蟹猴给予本发明的人源化抗体hIGF13_PS的情况下的血中浓度的变化的曲线图。
[图9] 图9是显示小鼠亲本抗体IGF11-16给HepG2细胞增殖带来的浓度依赖性作用的曲线图。
具体实施方式
以下，根据具体的实施方式来说明本发明，但本发明并不受这些实施方式的任何限定。需要说明的是，本说明书中引用的包括专利公报、专利申请公开公报和非专利公报在内的所有文献在一切目的下其整体均通过引用而被纳入本说明书。
需要说明的是，在本说明书中，表示浓度的“M”是与表示摩尔浓度的“mol/L”同义的单位。
本发明为特异性地与IGF-1受体结合的抗IGF-1受体人源化抗体。本发明的抗体具有经由人IGF-1受体使肌肉量增加的作用，但不会诱导低血糖症状。由此，可改善或治疗肌肉减少症、废用性肌肉萎缩、恶病质等IGF-1受体信号参与的病态或疾病。另外，本发明的抗体是确保了低免疫原性和物性稳定性的人源化抗体。
[IGF]
本公开中，“IGF”是指胰岛素样生长因子(Insulin-like Growth Factor)，存在IGF-1和IGF-2。IGF-1和IGF-2是具有激动剂活性的生物体内的配体，与后述的IGF-1受体(胰岛素样生长因子-I受体：Insulin-like Growth Factor-I Receptor)结合，向细胞内传递细胞分裂或代谢的信号。已知IGF-1和IGF-2还微弱地与胰岛素受体(INSR)交叉结合，该INSR与IGF-1受体在结构上具有类似性。在本说明书中，虽然主要阐述生理功能等更为熟知的IGF-1，但在对由IGF-1受体与配体的结合介导的作用或疾病等进行研究的情况下，有时也包含IGF-1与IGF-2两者的作用进行记载。
IGF-1也称为生长调节素(Somatomedin) C，是由70个氨基酸构成的单一多肽的激素。人的IGF-1的序列可参照NCBI参考序列号：NP_000609或EMBL-EBI的UniProtKB-登录号P50919等获取。成熟型人IGF-1的氨基酸序列见SEQ ID NO: 83，对应的核酸碱基序列的一例见SEQ ID NO: 84。由70个氨基酸构成的该序列在多个物种中保守。本发明中，在仅记载为“IGF-1”的情况下，只要没有特别说明，则意思是指具有激素活性的IGF-1蛋白。
IGF-1在以肝细胞为首的生物体内的各种细胞中产生，也存在于血液或其他体液中。因此，天然型的IGF-1可由动物的体液、或培养了由动物分离的原代培养细胞或株化细胞等的培养物进行纯化而得到。另外，IGF-1通过生长激素诱导在细胞内的产生，因此还可由给予了生长激素的动物的体液、或在生长激素存在下培养了由动物分离的原代培养细胞或株化细胞等的培养物纯化IGF-1而得到。另外，作为其他方法，还可使用重组体细胞或导入了IGF-1基因的转基因动物或转基因植物等制造IGF-1，上述重组体细胞是将编码IGF-1的氨基酸序列的核酸分子插入到表达载体中，再导入到大肠杆菌等原核生物或酵母、昆虫细胞或来自哺乳类的培养细胞等真核细胞的宿主中而得的。而且，人IGF-1还可作为研究用试剂(Enzo Life Sciences, catalog: ADI-908-059-0100; Abnova, catalog: 第3452页等)、药品(Somazon (注册商标)、美卡舍明、INCRELEX (注册商标)等)来获取。使用的IGF-1在体内和体外的活性可通过以世界卫生组织的英国国家生物制品检定所(National Institute forBiological Standards and Control (NIBSC))的NIBSC代码：91/554的IGF-1标准物质中的活性作为1个国际单位/微克进行比较来评价其比活性。本发明中的IGF-1作为与该NIBSC代码：91/554的IGF-1具有同等的比活性的IGF-1来阐述。
[IGF-1受体]
本公开中，“IGF-1受体”或“IGF-1R”是指胰岛素样生长因子-1受体(Insulin-likeGrowth Factor-1 Receptor)。在本说明书中，只要没有特别说明，则“IGF-1受体”意思是指IGF-1受体蛋白。IGF-1受体是2个由α链和β链构成的亚基缔合而成的结构的蛋白。在SEQ IDNO: 71所示的人IGF-1受体的氨基酸序列中，其氨基酸序列中的由第31位～第735位的氨基酸序列构成的部分相当于α链，β链相当于第740位以后的序列。IGF-1受体的α链具有IGF-1的结合部分，β链是跨膜型结构，起到向细胞内传递信号的作用。IGF-1受体的α链分为L1、CR、L2、FnIII-1和FnIII-2a/ID/FnIII-2b的结构域。在SEQ ID NO: 71所示的人IGF-1受体的氨基酸序列中，第31位～第179位的部分相当于L1结构域，第180位～第328位的部分相当于CR结构域，第329位～第491位的部分相当于L2结构域，第492位～第607位的部分相当于FnIII-1结构域，第608位～第735位相当于FnIII-2a/ID/FnIII-2b结构域。人的IGF-1受体的氨基酸序列可参照EMBL-EBI的UniProtKB-登录号P08069等，也显示在序列表的SEQ IDNO: 71中。
已知IGF-1受体在生物体内的组织或细胞的广泛范围内表达，接受基于IGF-1的细胞增殖的诱导或细胞内信号的激活等的刺激。特别是，成肌细胞可用于以细胞增殖活性为指标评价IGF-1的由IGF-1受体介导的作用。由此可知：成肌细胞在分析与IGF-1受体结合的抗体的作用方面有效。另外，在将编码人或其他脊椎动物的IGF-1受体的氨基酸序列的核酸分子插入到表达载体中，再导入到昆虫细胞或来自哺乳类的培养细胞等真核细胞的宿主中而得的重组体细胞中，通过使导入至其细胞膜上的核酸所编码的IGF-1受体表达，可人工制造表达人或其他脊椎动物的IGF-1受体的细胞。该IGF-1受体表达细胞可用于分析抗体的结合性或研究向细胞内的信号传递等。
[小鼠亲本抗体IGF11-16]
小鼠亲本抗体IGF11-16公开在专利文献1中。IGF11-16的CDR-H1的氨基酸序列见SEQ ID NO: 85、CDR-H2的氨基酸序列见SEQ ID NO: 86、CDR-H3的氨基酸序列见SEQ IDNO: 87、CDR-L1的氨基酸序列见SEQ ID NO: 88、CDR-L2的氨基酸序列见SEQ ID NO: 89、CDR-L3的氨基酸序列见SEQ ID NO: 90、重链可变区的氨基酸序列见SEQ ID NO: 39(对应的核酸碱基序列的一例见SEQ ID NO: 40)、轻链可变区的氨基酸序列见SEQ ID NO: 41(对应的核酸碱基序列的一例见SEQ ID NO: 42)。IGF11-16的轻链的全长氨基酸序列见SEQID NO: 91 (对应的核酸碱基序列的一例见SEQ ID NO: 92)、重链的全长氨基酸序列见SEQID NO: 93 (对应的核酸碱基序列的一例见SEQ ID NO: 94)。包括IGF11-16的表达的抗体均指该小鼠亲本抗体IGF11-16。
[抗IGF-1受体人源化抗体]
根据本发明的一个方面，提供新型的抗IGF-1受体人源化抗体(以下，为方便起见，将其称为“本发明的抗体”。)。
本公开中，“抗体”是指包含通过二硫键相互结合的至少2个重(H)链和2个轻(L)链的糖蛋白。各重链包含重链可变区(简称为VH)和重链恒定区，重链恒定区包含3个结构域即CH1、CH2和CH3。各轻链包含轻链可变区(简称为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含1个结构域即CL。在轻链的恒定区中，存在称为λ链和κ链的2种。在重链的恒定区中存在γ链、μ链、α链、δ链和ε链，根据其重链的不同，分别存在IgG、IgM、IgA、IgD和IgE这样的抗体同种型。VH和VL进一步细分为：称为构架区(FR)的更保守的4个区(FR-1 (FR1)、FR-2 (FR2)、FR-3(FR3)、FR-4 (FR4))和称为互补性决定区(CDR)的超可变性的3个区(CDR-1 (CDR1)、CDR-2(CDR2)、CDR-3 (CDR3))。VH包含从氨基末端到羧基末端以FR-1 (FR-H1)、CDR-1 (CDR-H1)、FR-2 (FR-H2)、CDR-2 (CDR-H2)、FR-3 (FR-H3)、CDR-3 (CDR-H3)、FR-4 (FR-H4)的顺序排列的3个CDR和4个FR。VL包含从氨基末端到羧基末端以FR-1 (FR-L1)、CDR-1 (CDR-L1)、FR-2 (FR-L2)、CDR-2 (CDR-L2)、FR-3 (FR-L3)、CDR-3 (CDR-L3)、FR-4 (FR-L4)的顺序排列的3个CDR和4个FR。重链和轻链的可变区包含与抗原发生相互作用的结合结构域。
本发明的抗体可以是抗体的片段和/或衍生物。作为抗体的片段，可列举：F(ab’)2、Fab、Fv等。作为抗体的衍生物，可列举：向恒定区部分人工导入氨基酸突变而得的抗体、修饰恒定区的结构域的构成而得的抗体、每1个分子具有2个以上的Fc的形式的抗体、仅由重链或仅由轻链构成的抗体、糖链修饰抗体、双特异性抗体、与抗体或抗体的片段化合物或除抗体以外的蛋白结合而得的抗体缀合物、抗体酶、纳米抗体、串联scFv、双特异性串联scFv、双抗体(Diabody)、VHH等。需要说明的是，本发明中，在简称为“抗体”的情况下，只要没有额外说明，则还包括抗体的片段和/或衍生物。
另外，在传统上单克隆抗体是指由来自单一的抗体产生细胞的克隆得到的抗体分子，但亦指包含由特定的氨基酸序列构成的VH和VL的组合的单一种类的抗体分子。单克隆抗体也可获得核酸分子，该核酸分子具有编码其抗体的蛋白的氨基酸的基因序列，也可使用这样的核酸分子以基因工程学方式制作抗体。另外，利用H链、L链、它们的可变区或CDR序列等的基因信息进行用于提高抗体的结合性或特异性的修饰等、或通过由小鼠等动物的抗体修饰为人型抗体来制作适用于治疗剂的结构的抗体，这是该领域的技术人员所熟知的技术。另外，通过使用导入有人抗体基因的非人转基因动物作为使抗原致敏的动物，也可获得人单克隆抗体。除此以外，作为无需对动物致敏的方法，本领域技术人员还可适当进行以下技术：使用表达人抗体的抗原结合区或其一部分的噬菌体文库(人抗体噬菌体展示)，获得特异性地与对应的抗原结合的抗体或由特定的氨基酸序列构成的噬菌体克隆，根据其信息制作人抗体(例如参照非专利文献17等)。另外，在设计对除人以外的动物给药的抗体的情况下，与人源化技术同样，本领域技术人员可适宜地利用CDR或可变区的氨基酸序列信息进行设计。
根据一个方案，本发明的抗体为抗IGF-1受体人源化抗体，其包含来自小鼠亲本抗体IGF11-16的重链和轻链的各互补性决定区(CDR)和来自人抗体的重链和轻链的各构架区(FR)，同时至少1个CDR相对于小鼠亲本抗体IGF11-16的对应的CDR包含至少1处的氨基酸残基的取代。
具体而言，在本方案中，重链和轻链的各互补性决定区(CDR)分别来自小鼠亲本抗体IGF11-16的对应的CDR。这里，如上所述，小鼠亲本抗体“IGF11-16”是指本发明人等以前制作的抗IGF-1受体单克隆小鼠抗体(专利文献1)。另外，本公开中，“来自”小鼠亲本抗体的CDR是指本方案的抗体的各CDR的氨基酸序列与小鼠亲本抗体IGF11-16的对应的CDR的氨基酸序列具有通常为75%以上、其中80%以上、或85%以上、进一步为90%以上的同源性(优选同一性)、和/或除通常为4个氨基酸残基以下、其中3个氨基酸残基以下、进一步为2个氨基酸残基以下的不同之外均同源(优选相同) (非专利文献18)。然而，本方案的抗体以其至少1个CDR相对于小鼠亲本抗体IGF11-16的对应的CDR包含至少1处的氨基酸残基的取代为要件。另外，关于重链CDR-2 (CDR-H2)的氨基酸序列，只要与小鼠亲本抗体IGF11-16的CDR-H2的氨基酸序列或后述的由小鼠亲本抗体IGF11-16诱导的人源化抗体hIGF13_PS的CDR-H2的任一者具有通常为75%以上、其中80%以上、或85%以上、进一步为90%以上的同源性(优选同一性)、和/或除通常4个氨基酸残基以下、其中3个氨基酸残基以下、进一步为2个氨基酸残基以下的不同之外均同源(优选相同)即可。
另外，重链和轻链的各构架区(FR)分别来自人的各类的免疫球蛋白的对应的FR。本公开中，“来自”人的免疫球蛋白的FR意思是指本方案的抗体的各FR的氨基酸序列与人的免疫球蛋白的对应的FR的氨基酸序列具有通常为80%以上、其中85%以上、进一步为90%以上的同源性(优选同一性)、和/或除通常4个氨基酸残基以下、其中3个氨基酸残基以下、进一步为2个氨基酸残基以下的不同之外均同源(优选相同)。人免疫球蛋白的构架可由公共数据库获取，可选出与小鼠免疫球蛋白的构架的同源性高的构架。需要说明的是，具有同源性的氨基酸序列的鉴定例如可使用IgBLAST (非专利文献16)。
这里，重链FR1的第25位的氨基酸残基优选为脯氨酸。虽然在小鼠亲本抗体IGF11-16的重链FR1与人源化抗体的重链FR1之间存在几个不同的氨基酸残基，但如实施例3所述，根据本发明人等的研究，在人源化抗体中，通过将作为丝氨酸的重链FR1的第25位的氨基酸残基与小鼠亲本抗体IGF11-16同样取代成脯氨酸，可发挥与小鼠亲本抗体IGF11-16同等以上的活性(作为同等的程度，活性比为±20%以内)，因此优选。
作为上述的具有同源性的重链和轻链的获取方法，例如可将来自本发明的人源化抗体的重链和轻链的序列作为模板，采用抗体的进化工程学方法。具体而言，采用对CDR的位点特异性诱变法或随机诱变法、链改组、CDR步行(CDR walking)等方法。
“随机诱变法(random mutagenesis)”是向特定的基因DNA中导入随机突变来制作突变体的方法。在基于PCR法的诱变法中，在DNA扩增时选择复制的严格性低的条件，导入碱基的突变(error-prone PCR：易错PCR)。对通过PCR法扩增的DNA的整个区域在任意位点导入突变。另外，在DNA混编法中，可首先将对象基因杂乱切割后，通过PCR法同样地导入突变。而且，也可在DNA合成时在特定的合成步骤中混合几个碱基，从而在所期望的区域或位点特异性地进行随机诱变。
“链改组(chain shuffling)”是指下述方法：将抗体可变区的VH或VL基因中的一个固定化、并使另一个与V基因文库结合来构建文库，使其在噬菌体上表达，筛选对原始抗原的特异性高的抗体可变区的组合。在由天然/非免疫文库等获得的抗体的体外亲和性成熟中，该方法是首选的方法。
“CDR步行”是指下述方法：向VH和VL基因的各CDR中导入随机突变，通过调节选择条件从其突变体群中选择结合强的抗体，组合其所选择的CDR以得到具有非常高的结合力的克隆。通常，往往是仅向CDR3中导入随机突变来进行研究。
这样，一旦获得具有活性的人源化亲本抗体，就可将其作为模板，基本上确立了修饰为保持活性的新的人源化抗体的方法，可向CRO等委托。
根据一个方案，本发明的抗体优选具有特定的氨基酸序列作为各CDR序列。具体如下。需要说明的是，在本发明中，氨基酸序列的“同一性”(identity)意思是指一致的氨基酸残基的比例，“同源性”(similarity)意思是指一致或类似的氨基酸残基的比例。同源性和同一性例如可通过BLAST法(NCBI的PBLAST的默认条件)来确定。另外，这里，“类似的氨基酸残基”意思是指具有具同样的化学性质(例如，电荷或疏水性)的侧链的氨基酸残基。作为类似的氨基酸残基，例如可列举以下各组。例如，在按照以下各组将丙氨酸取代成类似的氨基酸残基的情况下，意思是指取代成缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或蛋氨酸残基。
(1) 具有脂肪族侧链的氨基酸残基：丙氨酸(Ala或A)、缬氨酸(Val或V)、亮氨酸(Leu或L)、异亮氨酸(Ile或I)和蛋氨酸(Met或M)残基。
(2) 具有脂肪族羟基侧链的氨基酸残基：丝氨酸(Ser或S)和苏氨酸(Thr或T)残基。
(3) 具有含酰胺的侧链的氨基酸残基：天冬酰胺(Asn或N)和谷氨酰胺(Gln或Q)残基。
(4) 具有芳族侧链的氨基酸残基：苯丙氨酸(Phe或F)、酪氨酸(Tyr或Y)、色氨酸(Trp或W)和组氨酸(His或H)残基。
(5) 具有碱性侧链的氨基酸残基：赖氨酸(Lys或K)、精氨酸(Arg或R)和组氨酸(His或H)残基。
(6) 具有酸性侧链的氨基酸残基：天冬氨酸(Asp或D)和谷氨酸(Glu或E)残基。
(7) 具有含硫侧链的氨基酸基：半胱氨酸(Cys或C)和蛋氨酸(Met或M)残基。
作为重链可变区的CDR-1 (CDR-H1)序列，优选SEQ ID NO: 1的氨基酸序列、或SEQID NO: 1的任意1处的氨基酸残基被取代而得的氨基酸序列。或者，CDR-H1序列优选与SEQID NO: 1具有80%以上的同源性(优选同一性)。其中，作为CDR-H1序列，优选具有SEQ IDNO: 1的第3位的Trp被维持或被取代成类似的氨基酸残基而得的氨基酸序列，其中，除该第3位的氨基酸残基以外的任意1处的氨基酸残基被取代，或者与SEQ ID NO: 1具有80%以上的同源性(优选同一性)。SEQ ID NO: 1的氨基酸序列所对应的核酸碱基序列的一例见SEQID NO: 2。
作为重链可变区的CDR-2 (CDR-H2)序列，优选SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5的氨基酸序列、或者SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5的任意1处、2处或3处的氨基酸残基被取代而得的氨基酸序列。或者，CDR-H2序列优选与SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5具有82%以上的同源性(优选同一性)。其中，作为CDR-H2序列，优选具有SEQ ID NO: 3的第1位的Glu和第3位的Asn分别被维持或被取代成类似的氨基酸残基、同时第6位的Asn被维持或被取代成Ser或Gln而得的氨基酸序列，其中，除该第1位、第3位和第6位的氨基酸残基以外的任意1处、2处或3处的氨基酸残基被取代，或者与SEQ ID NO: 3具有82%以上的同源性。或者，作为CDR-H2序列，优选具有SEQ ID NO: 5的第1位的Glu和第3位的Asn分别被维持或被取代成类似的氨基酸残基、同时第6位的Ser被维持或被取代成Asn或Gln而得的氨基酸序列，其中，除该第1位、第3位和第6位的氨基酸残基以外的任意1处、2处或3处的氨基酸残基被取代，或者与SEQID NO: 5具有82%以上的同源性。SEQ ID NO: 3和5的氨基酸序列所对应的核酸碱基序列的一例分别见SEQ ID NO: 4和6。
作为重链可变区的CDR-3 (CDR-H3)序列，优选SEQ ID NO: 7的氨基酸序列、或SEQID NO: 7的任意1处或2处的氨基酸残基被取代而得的氨基酸序列。或者，CDR-H3序列优选与SEQ ID NO: 7具有75%以上的同源性(优选同一性)。其中，作为CDR-H3序列，优选具有SEQID NO: 7的第4位的Arg被维持或被取代成类似的氨基酸残基而得的氨基酸序列，其中，除该第4位的氨基酸残基以外的任意1处或2处的氨基酸残基被取代，或者与SEQ ID NO: 7具有75%以上的同源性(优选同一性)。SEQ ID NO: 7的氨基酸序列所对应的核酸碱基序列的一例见SEQ ID NO: 8。
作为轻链可变区的CDR-1 (CDR-L1)序列，优选SEQ ID NO: 9的氨基酸序列、或SEQID NO: 9的任意1处或2处的氨基酸残基被取代而得的氨基酸序列。或者，CDR-L1序列优选与SEQ ID NO: 9具有81%以上的同源性(优选同一性)。其中，作为CDR-L1序列，优选具有SEQID NO: 9的第9位的Trp被维持或被取代成类似的氨基酸残基而得的氨基酸序列，其中，除该第9位的氨基酸残基以外的任意1处或2处的氨基酸残基被取代，或者与SEQ ID NO: 9具有81%以上的同源性(优选同一性)。SEQ ID NO: 9的氨基酸序列所对应的核酸碱基序列的一例见SEQ ID NO: 10。
作为轻链可变区的CDR-2 (CDR-L2)，优选SEQ ID NO: 11的氨基酸序列、或SEQ IDNO: 11的任意1处的氨基酸残基被取代而得的氨基酸序列。或者，CDR-L2序列优选与SEQ IDNO: 11具有85%以上的同源性(优选同一性)。SEQ ID NO: 11的氨基酸序列所对应的核酸碱基序列的一例见SEQ ID NO: 12。
作为轻链可变区的CDR-3 (CDR-L3)序列，优选SEQ ID NO: 13的氨基酸序列、或SEQ ID NO: 13的任意1处或2处的氨基酸残基被取代而得的氨基酸序列。或者，CDR-L3序列优选与SEQ ID NO: 13具有77%以上的同源性(优选同一性)。SEQ ID NO: 13的氨基酸序列所对应的核酸碱基序列的一例见SEQ ID NO: 14。
特别是，本发明的抗体优选具有以下的CDR序列的组合。即，优选具有：作为CDR-H1序列的SEQ ID NO: 1的氨基酸序列、作为CDR-H2序列的SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5的氨基酸序列、作为CDR-H3序列的SEQ ID NO: 7的氨基酸序列、作为CDR-L1序列的SEQ ID NO:9的氨基酸序列、作为CDR-L2序列的SEQ ID NO: 11的氨基酸序列、以及作为CDR-L3序列的SEQ ID NO: 13的氨基酸序列的组合。
需要说明的是，作为鉴定抗体中的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3的各序列的方法，例如可列举：Kabat法(非专利文献13)或Chothia法(非专利文献14)、或将这些方法进一步改良而得的方法(非专利文献15)等。这些方法对于该领域的技术人员而言是技术常识，例如还可由Dr. Andrew C.R. Martin团队的互联网主页(http://www.bioinf.org.uk/abs/)获悉概要。
而且，如实施例4中所示，通过进行丙氨酸扫描，可在CDR的氨基酸序列中鉴定对结合活性较为重要的位点。由该结果判明：后述的表7和表8所示的氨基酸残基非常重要。认为若至少该位点的氨基酸残基被取代成除具有类似性质的氨基酸以外的氨基酸，则导致结合性降低。反之，通过取代成具有同样性质的氨基酸，还有可能实现亲和性的提高。另一方面，在进行了丙氨酸取代的CDR区的54个位点中，44个位点在丙氨酸取代后仍显示出80%以上的结合活性。由此暗示：这些位点中的氨基酸取代对结合活性没有大的影响。这样，通过检索CDR区的氨基酸序列以鉴定参与结合的位点，可保持结合性不变而降低免疫原性、或者改善物性、或者提高结合性。
本发明的抗体优选具有特定的氨基酸序列作为重链可变区和轻链可变区。具体如下。需要说明的是，在本公开中，只要没有特别说明，则“1处或数处”是指1处、2处、3处、4处、5处、6处、7处、8处、9处或10处中的任一者。
本发明的抗体优选具有SEQ ID NO: 47的氨基酸序列、或在SEQ ID NO: 47的氨基酸序列中有1处或数处的氨基酸残基被取代、缺失或添加而得的氨基酸序列作为重链可变区。或者，优选具有与SEQ ID NO: 47具有90%以上的同源性(优选同一性)的氨基酸序列作为重链可变区。其中，优选具有VH13_PN (SEQ ID NO: 43)、VH13_PS (SEQ ID NO: 47)、VH23_PN (SEQ ID NO: 49)、VH23_PS (SEQ ID NO: 53)、VH25_PN (SEQ ID NO: 55)或VH25_PS (SEQ ID NO: 59)的氨基酸序列作为重链可变区。SEQ ID NO: 43、47、49、53、55和59的氨基酸序列所对应的核酸碱基序列的一例分别见SEQ ID NO: 44、48、50、54、56和60。
本发明的抗体优选具有作为轻链可变区的氨基酸序列，该氨基酸序列包含SEQ IDNO: 67的氨基酸序列、或在SEQ ID NO: 67的氨基酸序列中有1处或数处的氨基酸残基被取代、缺失或添加而得的氨基酸序列。或者，优选具有与SEQ ID NO: 67具有90%以上的同源性(优选同一性)的氨基酸序列作为轻链可变区。其中，优选具有VL13 (SEQ ID NO: 61)、VL14(SEQ ID NO: 63)、VL22 (SEQ ID NO: 65)、VL23 (SEQ ID NO: 67)或VL24 (SEQ ID NO:69)的氨基酸序列作为轻链可变区。更优选为VL22 (SEQ ID NO: 65)、VL23 (SEQ ID NO:67)或VL24 (SEQ ID NO: 69)的氨基酸序列。SEQ ID NO: 61、63、65、67和69的氨基酸序列所对应的核酸碱基序列的一例分别见SEQ ID NO: 62、64、66、68和70。
其中，本发明的抗体优选分别具有上述的任何氨基酸序列作为重链可变区和轻链可变区。特别优选的本发明的抗体如下：具有VH13_PS(SEQ ID NO: 47)的氨基酸序列作为重链可变区、并具有VL23 (SEQ ID NO: 67)的氨基酸序列作为轻链可变区的抗体(以下，有时称为“hIGF13_PS”)；或者，具有VH25_PS(SEQ ID NO: 59)的氨基酸序列作为重链可变区、并具有VL23 (SEQ ID NO: 67)的氨基酸序列作为轻链可变区的抗体(以下，有时称为“hIGF25_PS”)。
本发明的抗体的重链和轻链的各恒定区的氨基酸序列例如可选自：人的IgG、IgA、IgM、IgE和IgD的各类的氨基酸序列、以及它们的突变体的氨基酸序列。根据一个方案，本发明的抗体的重链恒定区的氨基酸序列优选为人IgG4类的重链恒定区的氨基酸序列、或其1～10处的氨基酸被取代而得的氨基酸序列(非专利文献19、20)。根据一个方案，本发明的抗体的重链恒定区的氨基酸序列优选为人IgG1类的重链恒定区的氨基酸序列、或其1～10处的氨基酸被取代而得的氨基酸序列(非专利文献19、20)。
本发明的抗体是与人IGF-1受体发生抗原抗体反应的抗体。本公开中，“抗原抗体反应”是指抗体以平衡解离常数(KD)为1×10-7M以下的亲和性与IGF-1受体结合。本发明的抗体优选通常以1×10-7M以下、其中以1×10-8M以下、进一步以1×10-9M以下的KD与IGF-1受体结合。最优选1×10-10M以下。
本发明的抗体优选特异性地与具有SEQ ID NO: 71的氨基酸序列的人IGF-1受体的胞外结构域结合。本公开中，抗体对抗原具有“特异性”是指在抗体与其抗原之间发生高的抗原抗体反应。特别是，本公开中，“IGF-1受体特异性抗体”是指在对表达了IGF-1受体的细胞明显地显示抗原抗体反应的浓度下，对与IGF-1受体的高级结构具有高类似性的INSR的抗原抗体反应性为百分之一以下的抗体。
关于抗原抗体反应的测定，如果是本领域技术人员，则可适当选择固相或液相体系中的结合测定来进行。作为这样的方法，可列举：酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbent assay：ELISA)、酶免疫测定法(enzyme immunoassay：EIA)、表面等离子体共振法(surface plasmon resonance：SPR)、荧光共振能量转移法(fluorescenceresonance energy transfer：FRET)、发光共振能量转移法(luminescence resonanceenergy transfer：LRET)等，但并不限于这些。另外，在测定这样的抗原抗体结合时，还可使用酶、荧光物质、发光物质、放射性同位素等对抗体和/或抗原进行标记，采用适合于其标记的物质的物理和/或化学特性的测定方法来检测抗原抗体反应。
根据一个方案，本发明的抗体优选具有与小鼠亲本抗体IGF11-16同等以上的IGF-1受体信号激活能力。本公开中，IGF-1受体信号激活能力“同等”意思是指EC50值为2倍以内、和/或Emax值为±20%以内。
根据一个方案，本发明的抗体优选具有与小鼠亲本抗体IGF11-16同等以上的增殖活性。本公开中，增殖活性“同等”意思是指在成肌细胞增殖试验中EC50值为10倍以内、Emax值为90%以上。
根据一个方案，本发明的抗体优选对重组可溶性IGF-1受体的结合亲和性与小鼠亲本抗体IGF11-16为同等以上。本公开中，对重组可溶性IGF-1受体的结合亲和性为“同等”意思是指在基于BIACORE的对重组可溶性IGF-1受体的结合亲和性分析中，在与小鼠亲本抗体IGF11-16进行比较的情况下，KD值为三分之一以上～3倍以内的范围。
根据一个方案，本发明的抗体优选血中半衰期长，通过对动物单次给药显示肌肉量增加作用。实际上，根据本发明人等的研究，如后述的实施例所示，本发明的抗IGF-1受体人源化抗体在对豚鼠或食蟹猴进行单次给药时显示与持续给予IGF-1时同等程度的肌肉量增加作用。
根据一个方案，本发明的抗体优选在正常哺乳动物中可诱导肌肉量增加作用，但不会诱导低血糖症状。根据一个方案，本发明的抗体优选在摘除了下垂体的模型动物中可诱导生长板软骨伸长作用，但不会诱导低血糖症状。本公开中，在人的情况下，“血糖症状”意思是指伴随低血糖而产生的冷汗、心悸、意识障碍、痉挛、手足颤抖等症状。在猴等脊椎动物中，自发运动减少被视为初期症状，若症状严重，则几乎没有运动，若血糖值进一步降低，则发生意识障碍，直至死亡。
若将IGF-1以显示肌肉量增加作用这样的剂量对脊椎动物进行给药，则获得显著的降血糖作用，通常会诱导低血糖症状。然而，根据一个方案，本发明的抗体即使在以诱导脊椎动物的肌肉量和/或身长的增加的剂量、更优选与其剂量相比为10倍以上的高剂量对脊椎动物进行给药的情况下，也不具有降低该脊椎动物的血糖值的作用。另外，根据一个方案，本发明的抗体即使在以相对于诱导脊椎动物的肌肉量和/或身长的增加的有效剂量为10倍以上的血中暴露量的方式对脊椎动物进行给药的情况下，也不具有降低该脊椎动物的血糖值的作用。实际上，根据本发明人等的研究，如后述的实施例所示，本发明的抗体即使在豚鼠和食蟹猴中以10mg/kg的剂量进行给药，也没有诱导低血糖症状。
根据以上结果，本发明的抗IGF-1受体人源化抗体有可能成为在IGF-1中期待的、废用性肌肉萎缩和侏儒症等与IGF-1受体相关的各种疾病的治疗药或预防药，有可能克服作为IGF-1的问题的降血糖作用，延长血中半衰期。
认为本发明的抗体通过与IGF-1受体的胞外结构域结合来激活下述受体：IGF-1受体形成二聚体而得的同型受体、或者IGF-1受体与INSR形成二聚体而得的异型受体。
[免疫原性评价]
抗药物抗体(Anti-Drug Antibody：ADA)对治疗用抗体的效果和药物动力学产生影响，有时会带来严重的副作用，因此治疗用抗体在临床上的有效性和药效因ADA的产生而受到限制。有多种因素对治疗用抗体的免疫原性产生影响，报道了许多存在于治疗用蛋白中的效应T细胞表位的重要性。作为用于预测T细胞表位的in silico工具，开发了Epibase(Lonza)、iTope/TCED (Antitope)和EpiMatrix (EpiVax)等。通过使用这些in silico工具，可预测各氨基酸序列中的T细胞表位的存在(非专利文献21)，可评价潜在的免疫原性。关于本发明的抗IGF-1受体人源化抗体，使用Epibase (Lonza)来评价潜在的免疫原性。
[脱酰胺化风险]
在构成蛋白的氨基酸序列中，作为容易发生脱酰胺化的氨基酸序列，可列举：NG、NT、NS和NN。若具有这些序列，则发生天冬酰胺的脱酰胺化，转变成天冬氨酸。由此，抗体的活性有可能降低，同时品质不均匀。因此，为了在制造工序或保管中保持品质，通过将存在脱酰胺化风险的氨基酸取代成其他氨基酸，可防止活性降低，保持均匀性。在本发明的抗体中，由于在小鼠亲本抗体IGF11-16的重链CDR-2 (CDR-H2)区存在NS序列(重链第55位和第56位)，所以考虑到重链第55位的天冬酰胺(N)发生脱酰胺化而转变成天冬氨酸(D)的风险，将该天冬酰胺(N)取代成丝氨酸(S)。
[物性稳定性评价]
为了保证抗体的活性被长期地稳定保持，通过升高温度或改变pH来进行物性稳定性的分析。在本发明的抗IGF-1受体人源化抗体中，使用本抗体的PBS溶液，使用温度设定为37℃、且温育了1个月的样品，通过确认纯度为95%以上、以及没有产生凝聚物，确认了物性稳定性。
[抗IGF-1受体人源化抗体的表位]
根据一个方案，本发明的抗体以IGF-1受体的CR结构域为表位。优选的是，本发明的抗体与包含肽的表位或其附近结合，该肽具有与人IGF-1受体的氨基酸序列(SEQ ID NO:71)中氨基酸编号308～319相当的氨基酸序列(ProSerGlyPheIleArgAsnGlySerGlnSerMet)。认为本发明的抗体通过与IGF-1受体的CR结构域结合来激活下述受体：IGF-1受体形成二聚体而得的同型受体、或者IGF-1受体与INSR形成二聚体而得的异型受体。
[抗IGF-1受体人源化激动剂抗体]
本发明的激动剂抗体优选为人IgG类或其突变体，优选为人IgG4亚类或其突变体、或者人IgG1亚类或其突变体。在1个例子中，稳定化IgG4恒定区根据Kabat的系统在铰链区的位点241包含脯氨酸(非专利文献22)。根据EU编号方式(非专利文献13)，该位点对应于铰链区的位点228。在人IgG4中，该残基通常为丝氨酸，通过由丝氨酸取代成脯氨酸，可诱导稳定化。在1个例子中，可在IgG1的恒定区插入N297A突变，以尽量抑制与Fc受体的结合和/或固定补体的能力。另外，在另一方案中，还可通过向恒定区中导入氨基酸取代来调节与FcRn的结合，延长血中半衰期。然而，恒定区的氨基酸取代并不限定于这些示例。
本发明的激动剂抗体特异性地与IGF-1受体强力结合，在体外从极低浓度起具有成肌细胞增殖的亢进作用。
本发明的激动剂抗体在对动物单次给药的情况下，显示出与持续给予IGF-1时的肌肉量增加作用同等程度的肌肉量增加作用。另外，本发明的激动剂抗体的血中半衰期长，通过对动物单次给药，可显示肌肉量增加作用。实际上，本发明中，在对豚鼠或食蟹猴单次给药的情况下，显示出了与持续给予IGF-1时的肌肉量增加作用同等程度的肌肉量增加作用。
另外，本发明的激动剂抗体具有下述特征：在显示肌肉量增加作用的剂量下不具有降血糖作用。IGF-1在以显示肌肉量增加作用的剂量进行给药的情况下具有显著的降血糖作用。然而，本发明的激动剂抗体在诱导脊椎动物的肌肉量和/或身长的增加的剂量下不具有使该脊椎动物的血糖值降低的作用。优选的是，本发明的激动剂抗体即使在以达到诱导脊椎动物的肌肉量和/或身长的增加的有效剂量的10倍以上的血中暴露量的方式进行给药的情况下，也不具有使脊椎动物的血糖值降低的作用。实际上，本发明中，在豚鼠或食蟹猴中，即使在以达到诱导肌肉量增加的有效剂量的10倍以上的血中暴露量的方式给予本发明的激动剂抗体的情况下，也没有观察到降血糖和低血糖症状。
由以上可知：本发明的激动剂抗体有可能成为肌肉减少症、废用性肌肉萎缩、恶病质和侏儒症等与IGF-1受体相关的各种疾病的治疗药或预防药，可克服作为IGF-1的问题的降血糖作用，延长血中半衰期。
[抗IGF-1受体人源化拮抗剂抗体]
本发明的抗IGF-1受体人源化抗体利用其具有极高的结合性和特异性的可变区的性质，可成为具有优异的活性和特异性的抗IGF-1受体拮抗剂抗体。作为此时的方案，除IgG以外，还考虑以Fab或Fv、scFv、VHH这样的形式使用，但并不限定于此。
如此操作而制作的抗IGF-1受体拮抗剂抗体例如能够以抑制癌细胞株中的IGF-1依赖性的细胞增殖活性为指标进行评价。如此操作而选择的抗IGF-1受体拮抗剂抗体被期待作为抗癌药或伴有异常细胞增殖的疾病或病态的改善和治疗药。
而且，还可通过直接或经由接头等与识别其他的抗原或表位的各种抗体融合来构建双特异性抗体或多特异性抗体。作为此时的方案，除IgG以外，还考虑以Fab或Fv、scFv、VHH这样的形式使用，但并不限定于此。
如此操作而制作的含有抗IGF-1受体拮抗剂抗体的双特异性抗体或多特异性抗体例如能够以抑制癌细胞株中的IGF-1依赖性的细胞增殖活性为指标进行评价。如此操作而选择的含有抗IGF-1受体拮抗剂抗体的双特异性抗体或多特异性抗体被期待作为抗癌药或伴有异常细胞增殖的疾病或病态的改善和治疗药。
本发明的抗IGF-1受体拮抗剂抗体被期待作为因IGF-I受体信号被激活而诱导病态的疾病的治疗药。作为可激活IGF-I受体的配体，主要可列举：IGF-1、IGF-2、胰岛素等，还包括与IGF-1受体形成了异二聚体的RTK(受体型酪氨酸激酶)的配体(可列举EGF等)或相互作用的其他受体的配体(可列举TSH等)等。本发明的抗体具有抑制被这些配体激活的IGF-1受体信号的作用(变构拮抗剂作用)。即，本发明的抗体通过与IGF-1受体结合，抑制过度诱导的IGF-1受体信号活性，可用于治疗或预防因IGF-1受体被异常激活而诱导的疾病。优选具有与小鼠亲本抗体IGF11-16同等以上的信号激活抑制能力。信号激活抑制能力“与小鼠抗体IGF11-16同等”意思是指，通常将在成肌细胞增殖中可激活IGF-1、IGF-2或胰岛素等IGF-I受体的配体所能诱导的最大细胞增殖活性抑制10%以上、优选25%以上、特别优选35%以上的活性。
作为因IGF-1受体被异常激活而诱导的疾病的具体例子，可列举：肝癌、成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、儿童癌症、肢端肥大症、卵巢癌、胰腺癌、良性前列腺肥大、乳腺癌、前列腺癌、骨癌、肺癌、结肠直肠癌、颈部癌、滑膜肉瘤、膀胱癌、胃癌、维尔姆斯氏瘤、与转移性类癌和血管活性肠肽分泌肿瘤相关的腹泻、血管活性肠肽瘤、Verner-Morrison综合征、Beckwith-Wiedemann综合征、肾癌、肾细胞癌、移行上皮细胞癌、尤文氏肉瘤、白血病、急性成淋巴细胞白血病、脑肿瘤、胶质母细胞瘤、非胶质母细胞瘤性脑肿瘤、脑脊膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原始神经外胚层肿瘤、成神经管细胞瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、脉络丛乳头状瘤、巨人症、干癣、动脉粥样硬化、血管平滑肌再狭窄、不适当的微血管生长、糖尿病性视网膜病变、格雷夫斯病、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、重症肌无力、自身免疫性甲状腺炎、桥本甲状腺炎、甲状腺眼病、甲状腺功能亢进症和白塞病等。
这些作用可使用携带癌症的模型动物等来确认。
[作为局部递送工具的抗IGF-1受体人源化抗体]
利用本发明的抗IGF-1受体抗体的极高的结合性和特异性，可向IGF-1受体表达细胞或表达组织等进行药剂或抗体的局部递送。作为此时的本发明的抗IGF-1受体抗体的方案，除IgG以外，还考虑以Fab或Fv、scFv、VHH这样的形式使用，但并不限定于此。通过利用连接有本发明的抗IGF-1受体抗体和药剂的抗体药物复合物将药剂向局部递送，能以更低剂量特异性地发挥药效，还使副作用减少。
如此操作而制作的连接有本发明的抗IGF-1受体人源化抗体作为递送工具的药剂或抗体，例如在药剂为细胞凋亡诱导剂的情况下，能够以诱导IGF-1受体表达癌细胞株的细胞凋亡为指标进行评价。如此操作而选择的连接有抗IGF-1受体抗体的药剂或抗体被期待作为抗癌药或伴有异常细胞增殖的疾病或病态的改善和治疗药。
而且，还可使用以放射能或荧光化合物等标记的本发明的抗IGF-1受体抗体来检测表达IGF-1受体的癌细胞。通过使用这样的诊断技术，可有效地进行基于抗IGF-1受体拮抗剂抗体的治疗。
[竞争结合]
本发明的抗IGF-1受体抗体和对IGF-1受体竞争结合的抗体也包括在本发明的范围内。本发明中，“竞争结合”意思是指，当多种单克隆抗体与抗原共存时，一方抗体的与抗原的结合被另一方抗体与抗原的结合抑制的现象。通常，在相对于一定量(浓度)的单克隆抗体变更另一单克隆抗体的量(浓度)而加入的情况下，可通过测定前者的一定量的单克隆抗体与抗原的结合量下降的添加量(浓度)来测定。其抑制程度可用IC50或Ki的值表示。
与本发明的抗IGF-1受体抗体竞争结合的单克隆抗体是指，在使用10nM的本发明的抗IGF-1受体抗体来检测抗原抗体结合时，IC50通常为1000nM以下、其中为100nM以下、进一步为10nM以下的抗体。在进行竞争结合的测定的情况下，也可使用酶、荧光物质、发光物质、放射性同位素等对使用的一部分或全部抗体进行标记，采用适合于其标记的物质的物理和/或化学特性的测定方法进行检测，从而进行其测定。
[交叉反应]
本发明的抗体与其他脊椎动物的IGF-1受体具有交叉反应。交叉反应是指抗体对不同于其抗体进行抗原抗体反应的IGF-1受体的动物物种(例如人)的其他动物物种的IGF-1受体显示结合性。除人以外，本发明的抗IGF-1受体人源化抗体还与豚鼠、猴、兔等的IGF-1受体显示交叉反应性。另一方面，在小鼠和大鼠的IGF-1受体中不显示交叉反应性。
另外，通过使用不与本发明的抗体进行交叉反应的动物的物种，以基因工程学方式对其细胞或动物进行修饰，也可制作表达与本发明的抗体进行交叉反应的IGF-1受体的细胞或动物。
[结合亲和性评价]
本发明的抗IGF-1受体人源化抗体具有与小鼠亲本抗体IGF11-16(专利文献1)同等以上的水平的极强的结合亲和性。其结合亲和性的评价例如可使用重组IGF-1受体的胞外区作为抗原，通过SPR(表面等离子体共振)分析来进行。在实施例中，使用BIACORE将反应温度升至40℃以将抗原固定量抑制在低水平，从而对1价的结合亲和性进行分析，但并不限定于该方法，只要是可定量地评价强的结合亲和性的分析方法即可。
[IGF-1受体信号评价]
本发明的抗IGF-1受体人源化抗体是通过使用IGF-1受体信号激活作为1次评价系统，选择与小鼠亲本抗体IGF11-16(专利文献1)为同等以上的水平的人源化抗体而得到的。
IGF-1受体信号激活的评价使用市售的PathHunter(注册商标)IGF1R FunctionalAssay (DiscoverX公司制造)。在本系统中，可将IGF-1受体信号正下方的磷酸化作为酶活性来评价，使用化学发光物质作为底物，通过发光强度测定信号强度。
具体而言，使用了在HEK293细胞内强制表达具有与IGF-1受体和IGF-1受体的细胞内酪氨酸激酶结合的SH2结构域的衔接蛋白SHC1-酶受体(EA)融合蛋白的细胞株。该细胞株通过与IGF-1受体进行配体结合而发生受体的二聚体化，然后受体被磷酸化，从而募集具有SH2结构域的衔接蛋白，形成受体信号传递复合物，促进在空间上相邻的酪氨酸激酶与EA的结合，重构活性型β-半乳糖苷酶。通过测定基于该β-半乳糖苷酶活性的已水解的底物的化学发光信号的水平，可鉴定药剂对受体型酪氨酸激酶的作用。
选择具有与小鼠亲本抗体IGF11-16同等以上的信号诱导活性的人源化抗体变体后，进行了二次评价的人成肌细胞增殖评价。评价IGF-1受体信号的方法并不限定于该方法，只要是可直接或间接地且定量地检测IGF-1受体酪氨酸磷酸化的系统即可。
[来自脊椎动物的细胞的增殖诱导活性、肌肉量增加的诱导活性]
作为本发明的人源化抗体的2次评价系统，进行了人成肌细胞增殖评价，筛选与小鼠亲本抗体IGF11-16(专利文献1)在同等的浓度范围具有同等以上的激动剂活性的人源化抗体。如此操作而选择的本发明的人源化抗体被确认在体内(in vivo)具有肌肉量增加作用，但没有显示出降血糖作用。即，一个方案中的本发明的抗IGF-1受体人源化抗体具有来自脊椎动物的细胞的增殖诱导活性。
需要说明的是，在本公开中，“来自脊椎动物的细胞”优选为来自哺乳类、鸟类、爬行类、两栖类或鱼类的细胞，更优选为来自哺乳类或鸟类的细胞，更进一步优选为来自人、猴、兔、豚鼠、牛、猪、绵羊、马、狗、大鼠或小鼠的细胞。在来自这些物种的细胞中，如果是表达IGF-1受体、且本发明的抗体与该IGF-1受体进行交叉反应的细胞，则通过本发明的抗体可诱导细胞增殖。另外，本公开中的“来自脊椎动物的细胞”还包括：以表达与本发明的抗体具有交叉反应性的物种的IGF-1受体的方式进行了修饰的细胞或动物、或来自该修饰动物的细胞。
作为用于研究来自脊椎动物的细胞在体外的增殖诱导活性的细胞，可使用原代培养细胞、株化细胞、或这些细胞的转化体细胞等。
在本公开中，“原代培养细胞”是指由生物的脏器或组织分离的细胞，该细胞通常能以某种程度的传代数进行传代培养。来自脊椎动物的原代培养细胞可通过酶处理、基于物理方法的分散或外植体法等方法由脊椎动物的脏器或组织得到。另外，还可使用由脊椎动物得到的脏器或组织、或它们的片段。作为调制这些该原代细胞的脏器或组织，可优选列举：甲状腺、甲状旁腺或肾上腺等内分泌组织；阑尾、扁桃体、淋巴结或脾脏等免疫组织；气管或肺等呼吸器官；胃、十二指肠、小肠或大肠等消化器官；肾脏或膀胱等泌尿器官；输精管、睾丸或前列腺等雄性生殖器官；乳房或输卵管等雌性生殖器官；心肌或骨骼肌等肌肉组织等，更优选为肝脏、肾脏或消化器官或肌肉组织等，更进一步优选为肌肉组织。作为用于研究本发明的抗体的增殖诱导活性的该原代培养细胞，使用表达IGF-1受体、且通过与其IGF-1受体结合的IGF-1诱导增殖的细胞。作为其代表，使用作为由肌肉组织分离的原代培养细胞的骨骼肌成肌细胞等。作为来自人或动物的原代培养细胞，还可获取分售或市售的细胞进行使用。人原代培养细胞例如可从ATCC (注册商标)、ECACC、Lonza、Gibco (注册商标)、CellApplications、ScienCell research laboratories、PromoCell等机关或公司获取。
作为研究本发明的抗体在来自脊椎动物的细胞中诱导细胞增殖活性的方法，可列举：细胞数计测、DNA合成量的测定、代谢酶活性的变化量的测定等。细胞数计测的方法有使用血球计算盘的方法或使用库尔特计数器等细胞数计测装置的方法，作为测定DNA合成量的方法，有基于[3H]-胸苷或5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)的摄取的测定方法，作为观察代谢酶活性的变化量的方法，有MTT法、XTT法或WST法等比色定量法，本领域技术人员也可利用其他适当的方法等来实施。
细胞的增殖诱导活性可通过在使本发明的抗体与用于试验的培养细胞反应的情况下细胞的增殖较不使该抗体反应的情况下有所上升来判定。这种情况下，作为该诱导活性的对照，若在相同条件下进行使本来的IGF-1受体的配体即IGF-1反应的测定，则便于评价其活性。在变更本发明的抗体和IGF-1的各自的浓度后使之与进行试验的培养细胞反应时，将显示最大增殖诱导活性的50%时的浓度表示为EC50值。在使用人骨骼肌成肌细胞来评价增殖诱导活性的情况下，优选本发明的抗体的细胞增殖诱导活性为与IGF-1同等以上的EC50值，更优选本发明的抗体的EC50值为IGF-1的1/10以下，进一步优选为1/20以下，更进一步优选本发明的抗体的EC50值为IGF-1的1/50以下。另外，在使用人骨骼肌成肌细胞来评价增殖诱导活性的情况下，本发明的抗体的EC50值优选为0.5nM以下、更优选为0.3nM以下、进一步优选为0.1nM以下。
作为研究体内的增殖诱导活性的方法，可对脊椎动物给予本发明的抗体，计测被给药的整个个体或被给药的个体中的脏器或组织的质量、大小、细胞数等的变化，或者，使用移植有该脊椎动物细胞的动物，在接受了该移植的个体中计测包含该被移植的脊椎动物细胞的移植片的质量、大小、细胞数等的变化，从而进行研究。在整个个体的计测中，测定体重、身长、四肢周长等，或者根据阻抗法测定体组成，采用肌酸酐、身长系数等。关于个体中的脏器或组织、或移植片的计测，对于人以外的动物是直接回收目标脏器、组织或移植片，进行质量、大小或所含的细胞数的计算等。另外，作为非侵袭性地计测个体的脏器、组织或移植片的方法，采用DXA (Dual-energy X-ray absorptiometry：双能X射线吸收测量)法所代表的基于X射线摄影图像或CT、MRI的影像分析、使用基于同位素或荧光物质的示踪物的造影法等。在作为对象的组织为骨骼肌的情况下，肌肉力量的变化等成为指标。此外，如果是本领域技术人员，则可通过采用其他适当的方法研究本发明的抗体对来自脊椎动物的细胞在体内的增殖诱导活性的作用。为了研究本发明的抗体在体内对来自脊椎动物的细胞的增殖诱导活性，可在给予了本发明抗体的个体、与给予了除本发明抗体以外的抗体或其他对照物质的个体之间，按照以上所示的方法等进行计测等，比较所得的计测结果，从而进行评价。
关于抗体的血中动力学，在后述的实施例14中，对成为本发明的抗体的设计基础的小鼠抗体IGF11-16抗体(专利文献1)和作为本发明的抗体的hIGF13_PS和hIGF25_PS抗体的豚鼠血中动力学进行了比较，结果显示：与IGF11-16相比，血中动力学有所改善。
作为本发明的抗体在体内的效果之一，可列举：肌肉量和/或身长的增加效果。IGF-1在骨骼肌中除了对上述的成肌细胞的增殖或分化起作用以外，还具有加粗肌纤维的作用，作为这样的综合性作用，认为有增加肌肉量的效果。本发明的抗体也和IGF-1同样，通过对动物给药而具有增加该动物的肌肉量的效果。
作为计测本发明抗体的肌肉量的增加效果的方法，在整个个体的计测中，测定体重、身长、四肢周长等，或者根据阻抗法测定体组成，采用肌酸酐、身长系数等，另外还采用DXA (双能X射线吸收测量)法所代表的基于X射线摄影图像或CT、MRI的影像分析、使用基于同位素或荧光物质的示踪物的造影法等方法，除此之外，肌肉力量的变化等也成为指标。另外，在人以外的动物中，还可以是直接采集肌肉并计测其质量或大小的方法等。
肌肉量的增加效果可通过在给予了本发明抗体的个体与未给予该抗体的个体中比较肌肉量的增加、或者在一个个体中在给予本发明抗体之前和给药之后比较肌肉量来进行评价。关于肌肉量的增加效果，如果通过给予本发明的抗体而发现了肌肉量增加的差异，则可知晓其效果。IGF-1还参与骨的生长，还具有增加身长(在人的情况下为身高)的作用。因此，本发明的抗体也具有通过对动物给药而使身长增加的效果。本发明的抗体的身长增加效果可通过测定个体的体重、身长、四肢周长等来计测。
[对动物中的血糖值的作用]
根据一个方案，本发明的抗体具有下述特征：对脊椎动物中的血糖值没有影响。已知IGF-1会引起血糖值的降低作用，作为对IGF-1受体的激动剂作用的一部分。然而，作为抗IGF-1受体激动剂抗体起作用的本发明的激动剂抗体显示下述特征：即使在对动物进行胃肠外给药的情况下诱导肌肉量增加的有效剂量的进一步10倍以上的血中暴露量下也不会改变血糖值。
关于本发明的抗体所具有的、不诱导脊椎动物中的降血糖的作用，例如还可在体外进行评价。作为用于研究对来自脊椎动物的细胞在体外的向细胞内的葡萄糖摄取没有影响的特征的细胞，可使用原代培养细胞、株化细胞、或这些细胞的转化体细胞等。
作为研究在来自脊椎动物的细胞中本发明的抗体对葡萄糖摄取的影响的方法，可列举：细胞内葡萄糖浓度的测定、葡萄糖类似示踪物质的细胞内摄取量的测定、葡萄糖转运蛋白的变化的测定等。葡萄糖浓度的测定方法有酶法等吸光度测定法，作为测定葡萄糖类似示踪物质的细胞内摄取量的方法，例如有[3H]-2’-脱氧葡萄糖的摄取量的测定，作为观察葡萄糖转运蛋白的变化的方法，有细胞免疫染色法、蛋白质印迹法等，本领域技术人员也可通过其他适当的方法等来实施。对细胞内的葡萄糖摄取的影响可通过在使本发明的抗体与用于试验的培养细胞反应的情况下向细胞内的葡萄糖摄取与不使该抗体反应的情况下为同等程度来判定。这种情况下，作为该诱导活性的对照，若在相同条件下进行使本来的IGF-1受体的配体即IGF-1反应的测定，则便于评价其活性。
作为研究来自脊椎动物的细胞在体内的葡萄糖摄取的方法，可通过对该脊椎动物给予本发明的抗体，再计测被给药的个体中的脏器或组织中的葡萄糖含量等的变化来研究。在整个个体的计测中，采用血糖值等的测定、或以糖化蛋白为指标的血红蛋白A1C等。在个体中的脏器或组织中的葡萄糖摄取量等的测定中，对人以外的动物直接回收目标脏器或组织，进行葡萄糖含量或示踪物的计算等。另外，作为非侵袭性地测定个体的脏器或组织中的葡萄糖摄取的方法，采用X射线撮影图像或基于CT、MRI的影像分析、使用基于同位素或荧光物质的示踪物的造影法等。在作为对象的组织为骨骼肌的情况下，葡萄糖钳夹等也成为指标。此外，本领域技术人员可通过采用其他适当的方法，研究本发明的抗体对来自脊椎动物的细胞在体内的葡萄糖摄取的影响。
另外，本发明的抗体的特征还在于：在对脊椎动物给药的情况下，即使在相对于诱导该脊椎动物的肌肉量增加的有效剂量为同一剂量、优选10倍以上的剂量下，也不会改变该脊椎动物的血糖值。作为用于研究本发明的抗体在脊椎动物中的血糖值的变化的动物，优选为属于哺乳类、鸟类、爬行类、两栖类或鱼类的动物，更优选为属于哺乳类或鸟类的动物，更进一步优选为人、猴、兔、豚鼠、牛、猪、绵羊、马、狗、大鼠或小鼠。另外，用于研究本发明的抗体在脊椎动物中的血糖值的变化的动物还包括：以表达与本发明的抗体具有交叉反应性的物种的IGF-1受体的方式进行了修饰的动物。在血糖值的测定中，作为观血的方法，采用比色法或电极法等，用于检测的酶有葡萄糖氧化酶法(GOD法)、葡萄糖脱氢酶法(GDH法)等，作为非观血的方法，有光学测定法等，本领域技术人员还可选择其他适当的方法。在为人的血糖值的情况下，空腹时血糖值的正常范围是100mg/dL～109mg/dL。因给予药剂而对血糖值造成的不良事件(不良事件通用术语标准v4.0)定义如下：将血糖值为低于77mg/dL～55mg/dL的范围的值的情况定义为低血糖，将血糖值为高于109mg/dL～160mg/dL的范围的值的情况定义为高血糖。通过给予药剂对血糖值没有影响是指，给予药剂后的血糖值为大于55mg/dL且小于160mg/dL的范围内，更优选为大于77mg/dL且小于109mg/dL的范围内。然而，血糖值的正常值或其变动幅度根据给药的动物而不同，另外，即使是人，给药时的血糖值也未必限于正常值的范围，所以本公开中不改变脊椎动物的血糖值是指，与给予溶媒的对照组相比，给予了本发明抗体的脊椎动物的血糖值优选为30%以内、更优选为20%以内、进一步优选为10%以内的变化。
[抗IGF-1受体人源化抗体的制造方法]
本发明的抗体可通过将抗IGF-1受体的小鼠单克隆抗体IGF11-16(专利文献1)人源化而获得。使用由人以外的动物物种获得的单克隆抗体通过CDR接枝将其CDR区置换成人构架称为人源化(非专利文献12)。再通过三维结构分析导入用于在维持立体结构的同时使对人的免疫原性(T细胞抗原性)降低的氨基酸取代、或用于避免脱酰胺化或氧化等翻译后修饰风险的氨基酸取代，从而制作在维持活性的同时确保了制造性或临床上的安全性的人源化抗体。
为了维持活性，获得有关下述(1)和(2)的信息在人源化中非常重要：(1)哪种人构架的设计是必要的；以及(2) CDR序列中的哪个氨基酸是重要的。这样的人源化抗体的获得方法的例子记载于后述的实施例1～9，作为由此得到的人源化抗体，可列举：具有作为重链可变区的VH13_PN(SEQ ID NO: 43)、VH13_PS(SEQ ID NO: 47)、VH23_PN(SEQ ID NO: 49)、VH23_PS(SEQ ID NO: 53)、VH25_PN(SEQ ID NO: 55)或VH25_PS(SEQ ID NO: 59)、同时具有作为轻链可变区的VL13 (SEQ ID NO: 61)、VL14 (SEQ ID NO: 63)、VL22 (SEQ ID NO:65)、VL23 (SEQ ID NO: 67)或VL24 (SEQ ID NO: 69)的人源化抗体。更优选的是，具有VL22 (SEQ ID NO: 65)、VL23 (SEQ ID NO: 67)或VL24 (SEQ ID NO: 69)作为轻链可变区。然而，本发明的抗体并不限定于这些。
关于所得的抗IGF-1受体人源化抗体，还可得到具有编码其抗体的蛋白的氨基酸的核苷酸序列的核酸分子，也可使用这样的核酸分子以基因工程学方式制作抗体。对于该抗体的基因信息中的H链、L链、或它们的可变区，可参考CDR序列等的信息进行修饰等，以提高抗体的结合性或特异性。
作为制造本发明的抗体的方法，可分别培养导入了基因的哺乳细胞、昆虫细胞和大肠杆菌等，所述基因编码想要获取的抗体的蛋白的氨基酸，再通过常规方法从所得的培养上清中纯化抗体而获取。作为其具体方法，并不限于此，可例示如下所述的方法。
首先，使编码H链信号肽的核酸分子和编码H链恒定区的核酸分子与编码H链可变区的核酸分子结合来制作。使编码L链信号肽的核酸分子和编码L链恒定区的核酸分子与编码L链可变区的核酸分子结合来制作。
将这些H链基因和L链基因插入到适合在所选择的宿主细胞中表达的载体、例如克隆载体或表达用载体中。这里，H链基因和L链基因如果是两种基因进行表达的形式，则可插入到一个载体中，也可分别插入到不同的载体中。
接下来，插入有H链基因和L链基因的载体被导入到宿主细胞中。作为宿主细胞，例如可列举：哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、或植物细胞等真核细胞、或细菌细胞。作为向宿主细胞中导入基因的方法，可从下述方法中适当选择：磷酸钙或脂质转染法等化学方法、电穿孔法或粒子枪法等物理方法或基于病毒或噬菌体等感染的方法等。导入了H链基因和L链基因的宿主细胞可无需选择即用于培养，也可利用耐药性或营养需求性等性质选择性地浓缩导入了基因的重组体细胞、或者进一步用于培养由导入了基因的单一宿主细胞建立的克隆的重组体细胞。
导入了H链基因和L链基因的宿主细胞在适当的培养基和培养条件下进行培养。这里，在宿主细胞内表达的H链基因和L链基因的产物通常以抗体蛋白的形式分泌到培养基中，通过回收该培养基，可得到所产生的抗体蛋白。然而，利用基因与宿主的组合，在必要的情况下可选择破坏宿主细胞而回收细胞内蓄积的抗体蛋白，在原核细胞的情况下还可选择从周质组分中回收抗体蛋白。作为由包含所回收的抗体蛋白的培养基等样品纯化抗体的方法，通常采用盐沉淀法、基于透析或超滤法等的浓缩或溶媒的交换、使用固定有蛋白A、蛋白G或抗原等的载体的亲和层析等，此外，还可适当采用离子交换层析、疏水层析、混合模式层析或尺寸排阻层析等方法进行纯化。用于这些步骤的各种方法均为本领域技术人员所已知。
这里，对于编码免疫球蛋白的重链和/或轻链的基因，进行基因修饰以导入所期望的性状、或者采用免疫球蛋白的重链和/或轻链的可变区或CDR区的结构信息，从而制作抗体嵌合蛋白、低分子抗体、支架抗体等，这可由本领域技术人员利用已知的技术来实施。另外，为了提高抗体的性能或避免副作用，而向抗体恒定区的结构中引入修饰、或者进行在糖链部分的修饰，这也可利用本领域技术人员所熟知的技术适当进行。
[含有抗IGF-1受体人源化抗体的药物]
本发明的抗体可用作与IGF-1相关的状态或由对IGF-1受体的作用引起的疾病的治疗药或预防药或诊断药。以下，将治疗药、预防药或诊断药统称记为“药物”或“药剂”。
具体而言，作为与IGF-1相关的状态或使用抗IGF-1受体激动剂抗体进行治疗或预防的对象的疾病，可列举：肌肉萎缩性疾病(例如，废用性肌肉萎缩、肌肉减少症、恶病质等)、侏儒症(例如，Laron型侏儒症、生长激素抵抗性侏儒症等)、肝硬化、肝纤维化、糖尿病性肾病、慢性肾功能不全、衰老、子宫内胎儿发育迟缓(IUGR)、神经疾病、中风、脊髓损伤、心血管保护、糖尿病、胰岛素抵抗、代谢综合征、肾病、骨质疏松症、囊性纤维化、伤口愈合、肌强直性营养不良、爱滋病肌肉衰减症、HIV所伴随的脂肪重新分布综合征、烧伤、克罗恩病、Werner综合征、X-连锁性复合免疫缺陷、听力下降、神经性厌食症和早产儿视网膜病变、Turner综合征、Prader-Willi综合征、Silver-Russell综合征、特发性侏儒症、肥胖症、多发性硬化症、溃疡性大肠炎、低肌肉量、心肌缺血、低骨密度等，但并不限定于这些。
特别是，本发明的抗体优选用作肌萎缩性疾病(例如，废用性肌萎缩、肌肉减少症、恶病质等)和/或侏儒症(例如，Laron型侏儒症、生长激素抵抗性侏儒症等)的治疗药或预防药。另外，本发明的抗体不会因其给药而引起血糖值的变化，在这方面优异。作为利用以该抗IGF-1受体抗体的一部分或全部作为构成成分进行融合或连接而得的抗体药物或抗体药物复合物或诊断药进行治疗或预防或诊断的对象的疾病，可列举：成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、儿童癌症、肢端肥大症、卵巢癌、胰腺癌、良性前列腺肥大、乳腺癌、前列腺癌、骨癌、肺癌、结肠直肠癌、颈部癌、滑膜肉瘤、膀胱癌、胃癌、维尔姆斯氏瘤、与转移性类癌和血管活性肠肽分泌肿瘤相关的腹泻、血管活性肠肽瘤、Verner-Morrison综合征、Beckwith-Wiedemann综合征、肾癌、肾细胞癌、移行上皮细胞癌、尤文氏肉瘤、白血病、急性成淋巴细胞白血病、脑肿瘤、胶质母细胞瘤、非胶质母细胞瘤性脑肿瘤、脑脊膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原始神经外胚层肿瘤、成神经管细胞瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、脉络丛乳头状瘤、巨人症、干癣、动脉粥样硬化、血管平滑肌再狭窄、不适当的微血管生长、糖尿病性视网膜病变、格雷夫斯病、系统性红斑狼疮、重症肌无力、自身免疫性甲状腺炎、桥本甲状腺炎、甲状腺眼病、甲状腺功能亢进症和白塞病。
含有本发明的抗体的药物可以以药物组合物的形式制成制剂，该药物组合物除了含有本发明的抗体以外，还含有药学上可接受的载体和/或其他添加剂。使用了药学上可接受的载体和/或其他添加剂的制剂例如可按照University of the Sciences inPhiladelphia, “Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第20版”,Lippincott Williams & Wilkins, 2000中记载的方法进行实施。
作为这样的药剂的一种形式，以在无菌的水性溶液或油性溶液中溶解、悬浮或乳化而调制的液体制剂或冷冻干燥制剂的形式进行供应。作为这样的溶剂或溶解液，作为水性液体可列举注射用蒸馏水、生理盐水等，除此之外，在添加渗透压调节剂(例如，D-葡萄糖、D-山梨糖醇、D-甘露糖醇、氯化钠等)的情况下，有时也并用适当的助溶剂、例如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非离子性表面活性剂(例如，聚山梨醇酯80、聚氧乙烯氢化蓖麻油50)等。另外，作为溶剂或溶解液，有时还使用油性液体，作为该油性液体的例子，可列举：芝麻油、大豆油等，有时还并用苯甲酸苄酯、苄醇等作为助溶剂。在这样的制剂中，有时还适当使用缓冲剂(例如，磷酸盐类缓冲剂、乙酸盐类缓冲剂)、镇痛剂(例如，苯扎氯铵、盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(例如，人血清白蛋白、聚乙二醇等)、保存剂(例如，抗坏血酸、异抗坏血酸和它们的盐等)、着色剂(例如，叶绿素铜、β-胡萝卜素、红色2号、蓝色1号等)、防腐剂(例如，对羟基苯甲酸酯、苯酚、苄索氯铵、苯扎氯铵等)、增稠剂(例如，羟丙基纤维素、羧甲基纤维素和它们的盐等)、稳定化剂(例如，人血清白蛋白、甘露糖醇、山梨糖醇等)、矫味剂(例如，薄荷醇、柑橘香料等)等添加剂。
作为其他形式，还可列举：用于粘膜应用的药剂。在该制剂中，以对粘膜赋予吸附性、滞留性等为主要目的，有时还含有粘着剂、粘着增强剂、粘稠剂、粘稠化剂等(例如，粘蛋白、琼脂、明胶、果胶、角叉菜胶、海藻酸钠、刺槐豆胶、黄原胶、黄蓍胶、阿拉伯胶、壳聚糖、普鲁兰多糖(Pullulan)、蜡质淀粉、硫糖铝、纤维素、及其衍生物(例如，羟丙基甲基纤维素、聚甘油脂肪酸酯、丙烯酸(甲基)丙烯酸烷基酯共聚物、或其盐、聚甘油脂肪酸酯等)作为添加剂。然而，对生物体供给的治疗药或预防药的形式和溶剂或添加剂并不限于这些，本领域技术人员可适当选择。
含有本发明抗体的药物除了含有本发明的抗体以外，还可含有现有的其他药物(活性成分)。另外，也可像抗体药物复合物或双特异性抗体/多特异性抗体那样与其他药剂等融合或连接。另外，可将含有本发明抗体的药物与现有的其他药物组合制成试剂盒的形式。作为与抗IGF-1受体激动剂抗体组合的活性成分，可列举：生长激素或其类似物、胰岛素或其类似物、IGF-2或其类似物、抗肌肉生长抑制素抗体、肌肉生长抑制素拮抗剂、抗激活素IIB型受体抗体、激活素IIB受体拮抗剂、可溶性激活素IIB型受体或其类似物、生长素释放肽或其类似物、卵泡抑素或其类似物、β2激动剂和选择性雄激素受体调节剂。
另外，在包含该抗IGF-1受体抗体作为构成成分的抗体药物或抗体药物复合物的调制中，作为与该抗IGF-1受体抗体组合的活性成分、或与该抗IGF-1受体抗体一同含有的活性成分，可列举：皮质类固醇、止吐药、盐酸昂丹司琼、盐酸格拉司琼、甲氧氯普胺(metoclopramide)、多潘立酮、氟哌啶醇、赛克利嗪、劳拉西泮、丙氯拉嗪、地塞米松、左美丙嗪、托烷司琼、癌疫苗、GM-CSF抑制剂、GM-CSF DNA疫苗、基于细胞的疫苗、树状细胞疫苗、重组病毒疫苗、热休克蛋白(HSP)疫苗、同源肿瘤疫苗、自体肿瘤疫苗、镇痛药、布洛芬、萘普生、三水杨酸胆碱镁、盐酸羟考酮、抗血管生成药、抗血栓药、抗PD-1抗体、纳武利尤单抗(Nivolumab)、帕博利珠单抗(Pembrolizumab)、抗PD-L1抗体、阿替利珠单抗(Atezolizumab)、抗CTLA4抗体、伊匹木单抗(Ipilimumab)、抗CD20抗体、利妥昔单抗(Rituximab)、抗HER2抗体、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、抗CCR4抗体、莫加莫珠单抗(Mogamulizumab)、抗VEGF抗体、贝伐珠单抗(Bevacizumab)、抗VEGF受体抗体、可溶性VEGF受体片段、抗TWEAK抗体、抗TWEAK受体抗体、可溶性TWEAK受体片段、AMG 706、AMG 386、抗增殖药、法尼基蛋白转移酶抑制剂、αvβ3抑制剂、αvβ5抑制剂、p53抑制剂、Kit受体抑制剂、ret受体抑制剂、PDGFR抑制剂、生长激素分泌抑制剂、血管生成素抑制剂、肿瘤浸润巨噬细胞抑制剂、c-fms抑制剂、抗c-fms抗体、CSF-1抑制剂、抗CSF-1抗体、可溶性c-fms片段、培维索孟(Pegvisomant)、吉西他滨(Gemcitabine)、帕尼单抗(Panitumumab)、伊立替康(Irinotecan)和SN-38。作为所配合的除本发明抗体以外的药物的剂量，能够以用于通常治疗的剂量进行，也可根据状况进行增减。
本发明中的药剂以改善症状为目的可进行胃肠外给药。在胃肠外给药的情况下，例如可制成经鼻剂，可选择液体制剂、悬浮剂、固体制剂等。另外，作为其他的胃肠外给药的形式，可制成注射剂，作为注射剂，可选择皮下注射剂、静脉注射剂、点滴注射剂、肌肉注射剂、脑室内注射剂或腹腔内注射剂等。另外，作为其他的用于胃肠外给药的制剂，还可列举：栓剂、舌下剂、经皮剂、除经鼻剂以外的经粘膜给药制剂等。而且，也能够以在支架或血管内栓塞剂中含有或涂布的方案进行血管内局部给药。
本发明中的治疗药或预防药的给药量根据患者的年龄、性别、体重、症状、治疗效果、给药方法、处理时间、或该药物组合物中所含的活性成分的种类等而不同，通常成人每人每次可按0.1mg～1g的范围、优选0.5mg～100mg的范围给予主剂，每1周～4周给药1次、或者每1个月～2个月给药1次。然而，由于给药量和给药次数根据各种条件而变化，因此也有以少于上述给药量和次数的量和次数即足够的情况，另外，也有需要超过上述范围的给药量和给药次数的情况。
实施例
以下，列举实施例以更详细地说明本发明。但本发明并不受以下实施例的束缚，在不脱离本发明宗旨的范围内，能够以任意的方式实施。
[实施例1]小鼠抗体IGF11-16的人源化抗体的设计：
・人构架的选择
将利用Kohler等人(Nature, (1975), 第256卷, 第495-497页)的杂交瘤法进行制作而得的抗IGF-1受体的小鼠单克隆抗体IGF11-16(专利文献1)的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)中的互补性决定区(CDR)氨基酸移植到模板人抗体中。作为成为移植目的地的模板人抗体，从相对于小鼠抗体IGF11-16(小鼠亲本抗体)的VH和VL的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO: 39和SEQ ID NO: 41)具有与它们的同源性高的氨基酸序列的人抗体的种系(germline)中选择作为重链序列的VH-1-46(SEQ ID NO: 95)和VH-1-e(SEQ ID NO: 96)、作为重链J-片段的JH4 (SEQ ID NO: 97)、作为轻链序列的VK1-L5(SEQ ID NO: 98)和VK1-A20(SEQ ID NO: 99)、作为轻链J-片段的JK2 (SEQ ID NO: 100)，使用将它们如以下的表1所示组合而成的2个人源化抗体构架。
[表1]
表1：
Figure 957318DEST_PATH_IMAGE001
・CDR区的接枝和FR氨基酸取代
将来自小鼠抗体IGF11-16的VH和VL的必需氨基酸序列移植到上述的模板人抗体VH和VL的FR中，制作了人源化抗体。
具体而言，关于VH，将上述的模板人抗体VH的CDR氨基酸序列和FR氨基酸的数处用小鼠抗体IGF11-16的VH中的对应的氨基酸序列取代，设计将小鼠抗体IGF11-16人源化而得的VH的氨基酸序列，再设计编码它们的氨基酸的DNA的核苷酸序列。
关于VL，将上述的模板人抗体VL的CDR氨基酸序列和FR氨基酸的数处取代成小鼠抗体IGF11-16的VL中的氨基酸序列，设计将小鼠抗体IGF11-16人源化而得的VL的氨基酸序列，再设计编码它们的氨基酸的DNA的核苷酸序列。
所设计的人源化抗体的重链和轻链的构成见下述表2。
需要说明的是，在本实施例的记载和附图中，对于连接所设计的人源化抗体重链可变区和重链恒定区而构成的人源化重链、连接所设计的人源化抗体轻链可变区和轻链恒定区而构成的人源化轻链、再将这些的人源化重链和人源化轻链组合而构成的完全人源化抗体，有时会根据使用的重链可变区和/或轻链可变区的名称来缩写。例如，图1A中的“VL22/VH13_PS”是指将以VL22为轻链可变区、并在其上连接人κ链恒定区而得的轻链和以VH13_PS为重链可变区、并在其上连接IgG4S228P重链恒定区而得的重链组合而构成的人源化抗体。另外，SEQ ID NO: 15、17、19、21、23、25和27的氨基酸序列所对应的核酸碱基序列的一例分别见SEQ ID NO: 16、18、20、22、24、26和28。
[表2]
表2：所设计的人源化抗体的构成
Figure 812141DEST_PATH_IMAGE002
※1：FW1轻链的氨基酸取代的导入
・复原取代成小鼠亲本抗体氨基酸：Y36C、A43I
・用于降低免疫原性的对人种系序列的氨基酸取代：K45R
※2：导入FW1重链的氨基酸取代
・用于降低免疫原性的对人种系序列的氨基酸取代
：N61A、E62Q、K65Q、S66G
・用于降低免疫原性的氨基酸取代：V93T
※3：FW2轻链的氨基酸取代的导入
・复原取代成小鼠亲本抗体氨基酸：V43I
※4：FW2重链的氨基酸取代的导入
・用于降低免疫原性的对人种系序列的氨基酸取代
：N61A、E62Q、K65Q、S66G
[实施例2]人源化抗体的调制：
分别合成编码所设计的人源化抗体的重链可变区的DNA和编码将人IgG4亚类稳定化而得的突变体即人IgG4S228P突变体的重链恒定区的DNA，插入到pcDNA3.4系表达载体中进行连接，作为表达人源化抗体重链的质粒。
关于所设计的人源化抗体的轻链可变区，合成编码连接有κ链恒定区的人源化抗体轻链区的DNA，插入到pcDNA3.4系表达载体中，作为表达人源化抗体轻链的质粒。
混合这些人源化抗体重链表达质粒和人源化抗体轻链表达质粒，并利用ExpiCHO(注册商标)表达系统(Thermo Fisher Scientific)导入至细胞中，从而使各种抗体表达。此时，将掺入有FW1_VH1的重链表达质粒与插入有FW1_VL1的轻链表达质粒组合表达而得的人源化抗体命名为FW1_var1抗体，将插入有FW2_VH1的重链表达质粒与插入有FW2_VL2的轻链表达质粒组合表达而得的人源化抗体命名为FW2_var2抗体。关于FW1_var9、FW1_var10和FW1_var14，也同样地实施和命名。通过使用蛋白A柱对导入了人源化抗体重链和人源化抗体轻链表达质粒的细胞的培养上清进行亲和纯化，获取人源化抗体。
关于以后的人源化抗体的调制，按照上述方法进行。
[实施例3] 利用PathHunter(注册商标)测得的IGF-1受体激活作用：
为了检测所设计的人源化抗体对IGF-1受体的激活作用，使用PathHunter(注册商标)IGF1R Functional Assay (DiscoverX)，通过以下步骤测定了IGF-1受体信号的激活。
将表达了IGF-1受体的细胞以90μL/孔(2×104个细胞/孔或5×103个细胞/孔)接种于聚-D-赖氨酸包被或胶原-I包被的96孔板(黑/透明或白/透明)，在37℃、5% CO2的条件下温育。第二天，以10μL/孔添加各种浓度的药剂，在37℃、5% CO2的条件下温育。其后的第二天，采集30μL培养上清，添加15μL底物溶液，反应60分钟，利用光度计(Tristar、(Tristar,Berthold)测定发光信号(RLU)。从添加12.5nM抗体而得的荧光强度中扣除作为背景的添加0.1nM抗体时的值，以所得值作为激活强度，以小鼠亲本抗体IGF11-16的值为1，算出人源化抗体的相对值。
结果见表3。由该结果可知：人源化抗体(FW1_var1、var9、var10、var14和FW2_var2)的IGF-1受体激活能力与小鼠亲本抗体IGF11-16相比减弱超过20%。
[表3]
表3：人源化抗体的基于PathHunter(注册商标)系统的IGF-1受体激活测定
Figure 28096DEST_PATH_IMAGE003
于是，关于作为人源化抗体的抗原结合区的CDR区，将不同于小鼠的序列部分即重链CDR2区的A61、Q62、Q65和G66分别氨基酸取代成N61、E62、K65和S66，制作了与小鼠亲本抗体相同的氨基酸取代人源化抗体(FW1_var10_NEKS、FW1_var14_NEKS)，使用小鼠亲本抗体IGF11-16、FW1_var1作为比较对象，与上述同样比较了IGF-1受体激活能力。
结果见表4。其结果，没有观察到活性强度的恢复。
[表4]
表4：小鼠CDR取代物人源化抗体的基于PathHunter(注册商标)系统的IGF-1受体激活测定
Figure 360989DEST_PATH_IMAGE004
根据以上的结果，即使将CDR区的氨基酸序列恢复成与小鼠亲本抗体IGF11-16的CDR相同的氨基酸序列，其活性强度也无法恢复到与小鼠亲本抗体IGF11-16同等的水平(活性强度比为±20%以内)。因此，推测不是CDR而是FR(构架区)对活性降低有影响。
于是，制作了将FR1、FR2和FR3分别取代成了小鼠的FR的人源化抗体。所制作的人源化抗体的小鼠FR取代体见表5。如上所述，通过PathHunter(注册商标)的系统评价这些取代体的IGF-1受体信号激活。以小鼠亲本抗体IGF11-16的可变区与人IgG4 (S228P)的恒定区融合而得的人嵌合IGF11-16抗体(Chimera)作为阳性对照，与上述同样比较了抗体浓度为16.7nM时的信号强度。结果见表5。另外，SEQ ID NO: 29、31、33、35和37的氨基酸序列所对应的核酸碱基序列的一例分别见SEQ ID NO: 30、32、34、36和38。
[表5]
表5：人源化抗体小鼠FR取代体和信号强度比
Figure 113044DEST_PATH_IMAGE005
由以上的结果判明：信号强度与人嵌合IGF11-16同等(值为±20%以内)的取代体是FW1_var9_mFR-H1，小鼠重链FR1对于保持人源化抗体的活性较为重要。
于是，接下来，在小鼠重链FR1中对保持活性所必需的氨基酸进行鉴定。由于小鼠亲本抗体IGF11-16与人源化抗体的重链FR1的氨基酸存在7处不同，所以一处一处地取代成小鼠亲本抗体的氨基酸。制作的小鼠FR1氨基酸取代人源化抗体见表6。对于这些人源化抗体小鼠FR1氨基酸取代体，利用PathHunter(注册商标)的系统测定IGF-1受体激活信号强度，将抗体浓度16.7nM下的信号强度与小鼠亲本抗体IGF11-16进行比较。其结果，只有将第25位的丝氨酸取代成了脯氨酸的人源化抗体与小鼠亲本抗体IGF11-16同等(活性比为±20%以内)。结果见表6。
[表6]
表6：小鼠FR1氨基酸取代人源化抗体的信号强度
Figure 669927DEST_PATH_IMAGE006
由以上的结果判明：重链FR1区的第25位的脯氨酸对保持活性较为重要。以后的人源化抗体的重链均使用第25位的P(脯氨酸、Pro)取代体。
[实施例4]通过丙氨酸取代鉴定对活性维持重要的CDR区氨基酸：
为了在CDR区鉴定保持活性所必需的氨基酸，在小鼠亲本抗体IGF11-16中对各氨基酸进行丙氨酸取代，以EC50值和Emax值比较其取代体的信号激活能力，通过抗原ELISA评价结合活性。将与小鼠亲本抗体IGF11-16相比EC50值为2倍以内、Emax值为±20%以内定义为同等的活性。
IGF-1受体信号激活能力通过实施例3中记载的PathHunter(注册商标)的系统进行评价。EC50值和Emax使用分析软件GraphPad Prism来计算。关于结合活性，利用固定有作为抗原的重组IGF-1受体胞外区的抗原ELISA进行测定。具体而言，使用PBS(磷酸缓冲生理盐水)将人重组IGF-1R(R＆D公司制造)调制成0.5μg/mL。在固层化板上以50μL/孔添加所调制的人重组IGF-1R溶液。在4℃下反应一夜，置换成3% BSA/PBS(含0.02%叠氮化钠)。在用于ELISA之前于4℃下保存。在固层化板上以50μL/孔添加受试物质溶液(浓度为5nM的抗体溶液)。在室温下反应1小时后，用洗涤液(PBST(含有0.05% Tween20的磷酸缓冲生理盐水))洗涤2次。以50μL/孔添加碱性磷酸酶标记抗小鼠IgG抗体(用3% BSA/PBS稀释了2000倍)。在室温下反应45分钟，用洗涤液洗涤3次后，添加底物(pNPP(对硝基苯基磷酸))，以引发反应。在室温下反应1小时后，测定405和550nm的吸光度，算出吸光度405nm-吸光度550nm的差值。将该值作为结合活性进行分析。
所制作的IGF11-16抗体CDR取代体和信号激活及结合活性的测定结果见表7和表8。由所得结果判定：在CDR区中，通过进行丙氨酸取代而结合活性降低至约1～2成的氨基酸部分、即CDR-L1的第32位的色氨酸、CDR-H1的第33位的色氨酸、CDR-H2的第50位的谷氨酸、CDR-H2的第52位的天冬酰胺和CDR-H3的第102位的精氨酸这5个氨基酸对保持活性极为重要。另外，CDR-H1的第35位的组氨酸、CDR-H2的第54位的丝氨酸、CDR-H2的第55位的天冬酰胺、CDR-H2的第56位的丝氨酸、CDR-H2的第59位的天冬酰胺、以及CDR-H2的第64位的苯丙氨酸通过Ala取代而活性降低，由此认为有助于活性保持。
另一方面，在进行了丙氨酸取代的CDR区的54个位点的氨基酸残基中，位点44在丙氨酸取代后仍显示出80%以上的结合活性。
[表7]
表7：轻链CDR区的丙氨酸取代体的信号激活评价结果
（仅显示通过丙氨酸取代而活性降低的氨基酸残基）
Figure 373179DEST_PATH_IMAGE007
*通过丙氨酸取代使结合活性降低至约1～2成的氨基酸残基。
[表8]
表8：重链CDR区的丙氨酸取代体的信号激活评价结果
（仅显示通过丙氨酸取代而活性降低的氨基酸残基）
Figure 509762DEST_PATH_IMAGE009
*通过丙氨酸取代使结合活性降低至约1～2成的氨基酸残基。
[实施例5]人源化重链可变区的设计：
由实施例3的结果判明：重链的第25位的脯氨酸对维持活性较为重要，因此将重链的第25位设为P，以人源化重链可变区FW1_VH1和FW2_VH1为基本骨架进行设计。由于是以FW1_VH1的FR1为基础研究氨基酸取代体，所以为了使FW2-VH1的FR1部分与FW1_FR1相同，进行了S16A的氨基酸取代。另外，用于降低免疫原性的氨基酸取代的导入根据Epibase(注册商标)(Lonza公司)的免疫原性分值分析结果来实施。所设计的重链可变区列表见以下的表9。
[表9]
表9：人源化重链可变区设计
人源化重链可变区 氨基酸取代 SEQ ID NO
FW1_VH1 基本骨架 15
VH13_PN S25P(FR-H1)、V93T(FR-H3) 43
FW2_VH1 基本骨架 19
VH23_PN S16A (FR-H1)、S25P(FR-H1) 49
VH25_PN S16A (FR-H1),S25P(FR-H1)、K74T(FR-H3) 55
备注：V93T和K74T是用于降低免疫原性的取代。
[实施例6]人源化轻链可变区的设计：
关于人源化轻链可变区，以FW1_VL1和FW2_VL2为基本骨架进行设计。用于降低免疫原性分值的氨基酸取代的导入根据Epibase(注册商标)(Lonza公司)的分析结果来实施。所设计的轻链可变区列表见下表。
[表10]
表10：人源化轻链可变区设计
人源化轻链可变区 氨基酸取代 SEQ ID NO
FW1_VL1 基本骨架 21
VL13 C36Y(FR-L2)、I43A(FR-L2) 61
VL14 C36Y(FR-L2)、I43A (FR-L2)、K45R(FR-L2) 63
FW2_VL2 基本骨架 27
VL22 与FW2_VL2相同 65
VL23 I43V(FR-L2) 67
VL24 I43V(FR-L2)、L54R(CDR-L2) 69
备注：C36Y、I43A和I43V是用于降低免疫原性的对人构架序列的复原氨基酸取代。K45R是用于降低免疫原性的人种系序列氨基酸取代。L54R是用于降低免疫原性的氨基酸取代。
[实施例7]基于脱酰胺化风险氨基酸取代体的人源化抗体设计：
在制造人源化抗体时，若发生脱酰胺化，则难以进行品质管理。因此，需要事先将存在脱酰胺化风险的氨基酸取代成不影响活性的其他氨基酸。通常，作为存在脱酰胺化风险的序列，可列举：NG、NT、NS和NN。在该人源化抗体的重链的CDR-H2区存在NS序列。因而，考虑到第55位的天冬酰胺(N)发生脱酰胺化而转变成天冬氨酸(D)的风险，进行了氨基酸取代。取代的重链的列表见表11。另外，SEQ ID NO: 45、51和57的氨基酸序列所对应的核酸碱基序列的一例分别见SEQ ID NO: 46、52和58。
[表11]
表11：人源化重链的脱酰胺化风险氨基酸取代体
人源化重链可变区 氨基酸取代 SEQ ID NO
VH13_PN 基本骨架 43
VH13_PQ N55Q(CDR-H2) 45
VH13_PS N55S(CDR-H2) 47
VH23_PN 基本骨架 49
VH23_PQ N55Q(CDR-H2) 51
VH23_PS N55S(CDR-H2) 53
VH25_PN 基本骨架 55
VH25_PQ N55Q(CDR-H2) 57
VH25_PS N55S(CDR-H2) 59
[实施例8]基于IGF-1受体信号激活作用选择人源化抗体：
根据IGF-1受体的激活作用对人源化抗体进行评价，选择与小鼠亲本抗体IGF11-16具有同等活性的人源化抗体。
为了检测抗IGF-1受体激动剂抗体对IGF-1受体的激活作用，使用PathHunter(注册商标)IGF1R Functional Assay (DiscoverX)测定IGF-1受体信号的激活。
在聚-D-赖氨酸包被或胶原-I包被的96孔板(黑/透明或白/透明)上以90μL/孔(2×104个细胞/孔或5×103个细胞/孔)接种表达了IGF-1受体的细胞，在37℃、5% CO2的条件下温育。第二天，以10μL/孔添加各种浓度的药剂，在37℃、5% CO2的条件下温育。其后的第二天，采集30μL培养上清，添加15μL底物溶液，反应60分钟，利用光度计(Tristar、Berthold)测定发光信号(RLU)。
测定的结果，确认到了与小鼠亲本抗体IGF11-16同等(与小鼠亲本抗体IGF11-16相比，EC50值为2倍以内、Emax值为±20%以内)活性的人源化抗体见表12。
[表12]
表12：通过PathHunter(注册商标)系统确认到了与小鼠亲本抗体IGF11-16同等的激活的人源化抗体列表
Figure 116324DEST_PATH_IMAGE010
[实施例9]基于人成肌细胞增殖活性选择人源化抗体：
根据人成肌细胞增殖活性对人源化抗体进行评价，选择了与小鼠亲本抗体IGF11-16具有同等活性的人源化抗体。
为了研究抗IGF-1受体人源化抗体对人成肌细胞的增殖活性，在人成肌细胞中添加药剂，测定4天后的细胞内的ATP量。
使用在SkBM-2 (Lonza、CC-3246)中包含1% BSA的培养基，将正常人骨骼肌成肌细胞(Human Skeletal Muscle Myoblast Cells、HSMM、Lonza)以0.1mL/孔(2×103个细胞/孔)接种于96孔板(I型胶原包被)，在37℃、5% CO2的条件下温育。在细胞接种的第二天以25μL/孔添加各种药剂，在37℃、5% CO2的条件下温育4天。采用CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay (Promega)测定细胞内的ATP量，作为细胞增殖的指标。对温育了4天的96孔板去除上清，使培养液达到50μL/孔，在室温下静置30分钟以上。以50μL/孔添加CellTiter-Glo(注册商标)试剂，反应10分钟以上，之后使用光度计(Tristar、Berthold)测定发光信号。
其结果，确认到了与小鼠亲本抗体IGF11-16同等(与小鼠亲本抗体IGF11-16相比，EC50值为10倍以内、Emax为90%以上)活性的人源化抗体见表13。另外，测定结果的曲线图见图1A～F。
[表13]
表13：通过成肌细胞增殖评价系统确认到了与小鼠亲本抗体IGF11-16同等的激活的人源化抗体列表
Figure 781792DEST_PATH_IMAGE011
[实施例10]免疫原性评价：
为了分析人源化抗体的免疫原性，使用Lonza的Epibase(注册商标)in Silico算出免疫原性分值。Lonza的Epibase(注册商标)in Silico平台是一种免疫原性预测方法，其同时利用已通过实验确定的十聚体肽与HLA II类受体的结合亲和性和HLA II类受体的结构特性，预测抗体中所含的氨基酸序列中存在的T细胞的激活所必需的条件即潜在的肽/HLA结合，以免疫原性分值的形式算出。通过进行85种HLA II类同种异型(43种DRB1、8种DRB3/4/5、22种DQ、12种DP)中的评价，可覆盖总人口的99%以上。除了同种异型的结合亲和性以外，免疫原性分值还考虑出现频率等进行评分。
结果见表14和表15。结果判明：与同样评价的小鼠亲本抗体IGF11-16和小鼠/人嵌合抗体(具有小鼠亲本抗体IGF11-16的可变区和人IgG4 (S228P)的恒定区的抗体)的免疫原性分值相比，人源化抗体的免疫原性低。
[表14]
表14：人源化重链/轻链和人源化抗体的免疫原性分值
Figure 972339DEST_PATH_IMAGE012
[表15]
表15：人源化抗体与小鼠抗体和嵌合抗体的免疫原性分值比较
Figure 443772DEST_PATH_IMAGE013
[实施例11] 对哺乳动物IGF-1受体的结合活性评价：
为了研究抗IGF-1受体激动剂抗体对人(SEQ ID NO: 71)、食蟹猴(SEQ ID NO:73)、兔(SEQ ID NO: 75)、豚鼠(SEQ ID NO: 77)、大鼠(SEQ ID NO: 79)和小鼠(SEQ IDNO: 81)的IGF-1受体的结合活性，使用表达了各种IGF-1受体的细胞实施基于细胞的ELISA。
利用脂质转染法向HEK293T细胞中导入插入有人(SEQ ID NO: 72)、食蟹猴(SEQID NO: 74)、兔(SEQ ID NO: 76)、豚鼠(SEQ ID NO: 78)、大鼠(SEQ ID NO: 80)和小鼠(SEQ ID NO: 82)的IGF-1受体基因的pEF1表达载体(Thermo fisher)。将在脂质转染后培养了一夜以上的HEK293T细胞以4×104个细胞/孔添加在96孔板(聚-D-赖氨酸包被)中，使用10%缓冲福尔马林(Mildform(注册商标)10NM、Wako)固定，用含有3% BSA的磷酸缓冲液封闭后用于ELISA。
在ELISA中，向各孔中添加100μL用1%BSA/1%FBS/PBS调制成5nM的各人源化抗体溶液，在37℃下反应约1小时。用洗涤液洗涤3次。向各孔中添加100μL用1%BSA/1%FBS/PBS调制成各浓度的抗人IgG抗体HRP缀合物溶液，在37℃下反应约1小时，用洗涤液洗涤3次。在各孔中添加100μL底物(TMB)，以引发反应。在约30分钟后，向各孔中添加100μL的1M硫酸，测定450nm和650nm的吸光度，算出吸光度450nm-吸光度650nm的差值。与未导入IGF-1受体基因的HEK293T细胞(Mock)的吸光度450-650nm的差值的值进行比较，分析结合活性。
图2显示对人、豚鼠、食蟹猴和兔的各IGF-R的反应性的结果。其结果，在表达了人、豚鼠、食蟹猴和兔的IGF-1受体的细胞中，人源化抗体hIGF13_PS和hIGF25_PS与Mock细胞相比结合活性上升2倍左右，呈现与人小鼠嵌合抗体IGF11-16同等的反应性。另一方面，表达了大鼠和小鼠的IGF-1受体的细胞的结合活性与Mock细胞为同等程度。由此判明：人源化抗体hIGF13_PS和hIGF25_PS与人、豚鼠、食蟹猴和兔的IGF-1受体结合，但不与大鼠和小鼠的IGF-1受体结合。
[实施例12]基于表面等离子体共振法的对IGF-1受体的结合亲和性：
为了研究药剂对IGF-1受体的结合特性(结合速率和解离速率)，通过表面等离子体共振(SPR)法进行测定。
测定系统使用BIACORE T200系统。利用胺偶联试剂盒(BR-1000-50、GE)和His捕获试剂盒(28-9950-56、GE)，将约3000RU的抗组氨酸标签单克隆抗体固定于传感器芯片CM3(BR-1005-36、GE)的所有流动池后使用。运行缓冲液使用HBS-EP+(BR-1006-69、GE)。配体是将重组人IGF-1受体组氨酸标签(305-GR-050、R＆D SYSTEMS，以下记作IGF-1R-His)捕获到测定系统中使用。分析物使用各浓度的药剂。配体阴性对照使用未捕获IGF-1R-His的流动池。药剂阴性对照使用PBS(PBS pH7.4 (1x)、#10010049、Gibco)。
测定系统的测定温度设为40℃。使IGF-1R-His(＜2×10-8M)以达到100RU以下的方式与流动池(2和4)的抗组氨酸标签单克隆抗体反应。流速设为30μL/分钟，使10nM的纯化小鼠IgG2a、κ、同种型对照、克隆：MG2a-53 (401502、BioLegend，以下记作对照IgG2a)反应1分钟，使HBS-EP+流动10分钟以上。将分析物用HBS-EP+进行阶段稀释(0.5～8×10-10M)，与所有流动池进行反应。
测定条件采用单循环动力学法。使各浓度的分析物分别反应600秒，得到结合曲线，之后使HBS-EP+反应1200秒，得到解离曲线。反应结束后，使再生用缓冲液1 (0.2%SDS)、再生用缓冲液2 (100mM Tris-HCl(pH8.5)、1M NaCl、15mM MgCl2)和再生用缓冲液3 (10mM甘氨酸-HCl(pH1.5))分别反应1分钟，去除测定系统的IGF-1R-His，进行洗涤。使用BiacoreT200评估软件(2.0版)，在1：1结合模型下进行分析，算出解离速率常数(ka，1/Ms)、结合速率常数(kd，1/s)和解离常数(KD，M)。结果见表16。
[表16]
表16：人源化抗体和小鼠亲本抗体IGF11-16的结合亲和性
配体 分析物 Ka(1/Ms) Kd(1/s) KD(M)
IGF-1受体 IGF11-16 2.67E+06 7.72E-05 3.14E-11
IGF-1受体 hIGF13_PS 2.85E+06 1.58E-04 5.78E-11
IGF-1受体 hIGF25_PS 2.87E+06 1.35E-04 5.10E-11
hIGF13_PS和hIGF25_PS对人IGF-1受体的KD值为E-10以下，可知满足了抗IGF-1受体激动剂人源化抗体的最优选的标准。
[实施例13]体内降血糖作用(在豚鼠中的降血糖作用)：
为了确认抗IGF-1受体激动剂抗体在体内有无降血糖作用，对豚鼠单次给予hIGF13_PS和hIGF25_PS，经时性地测定血糖值，研究有无降血糖作用。降血糖作用是指使血糖值下降至50mg/dL以下、或者产生低血糖症状的作用。
使豚鼠禁食12小时，将各人源化抗体：hIGF13_PS和hIGF25_PS以10mg/kg进行单次静脉内给药。使豚鼠禁食至给药24小时后。对清醒状态的豚鼠于给药前(0小时)、给药1、2、4、8、24、48、72和144小时后进行采血，使用Glutest传感器(三和化学研究所)测定血糖值。结果见图3A、B。
各人源化抗体与只给予了溶媒的溶媒对照组相比在血糖值上没有确认到显著差异，给药后的血糖值均为50mg/dL以上。由此可知：各人源化抗体不具有IGF-1那样的显著的降血糖作用，对血糖值没有影响，因此显示出作为克服IGF-1的副作用即低血糖的药剂的可能性。
[实施例14]人源化抗体在豚鼠中的血中动力学：
使豚鼠禁食12小时，将人源化抗体hIGF13_PS和hIGF25_PS或IGF11-16 (小鼠亲本抗体)以1和10mg/kg进行单次静脉内给药。使豚鼠禁食至给药24小时后，在24小时后重新喂食。对清醒状态的豚鼠于给药前(0小时)、给药2、4、8、24、48、72、96、120和144小时后进行采血，通过ELISA测定血浆中的人源化抗体浓度。
具体而言，使用重组IGF-1R(R＆D公司制造)，通过抗原ELISA进行测定。定量时的标准曲线是将对豚鼠给药的浓度已知的抗体用豚鼠血浆进行阶段稀释后作为标准物质。标准物质和血浆均稀释10倍～1000倍再实施测定。
将重组IGF-1R的0.5μg/mL的PBS溶液添加在96孔板(MaxiSorp(NUNC))中，在4℃下固定一整夜。再用3% BSA/PBS进行封闭，制作了重组IGF-1R固定板。另一方面，使用未给予抗体的豚鼠血浆对给药后的抗体进行阶段稀释，作为标准物质。将血浆和标准物质稀释10倍，以50μL/孔添加在重组IGF-1R固定板中。在室温下反应1小时30分钟，之后用PBS-T(PBS、0.025% Tween20)进行洗涤操作。之后，以50μL/孔添加将碱性磷酸酶标记抗人IgG (H+L)多克隆抗体(Southern Biotechnology Associates公司，Cat#2087-04)用3% BSA/PBS稀释2000倍而得的溶液，在室温下反应1小时。之后，用PBS-T进行洗涤操作，以100μL/孔添加pNpp(WAKO公司，Cat#149-02342)作为显色底物，在室温下温育1小时。之后，使用读板仪测定405nm和550nm的吸光度，算出吸光度405nm-550nm的差值。根据作为标准物质的抗体浓度绘制标准曲线，算出血浆中的抗体浓度。
结果见图4。血浆中的人源化抗体浓度依赖于给药剂量而上升，即使在低剂量组，直至给药第144小时的血浆中人源化抗体浓度与给药24小时后相比仍维持约50%以上。结果显示：与小鼠亲本抗体IGF11-16相比，人源化抗体的血中动力学在持续性方面优异。
[实施例15]正常豚鼠中的人源化抗体的肌肉量增加作用：
对正常豚鼠静脉内单次给予hIGF13_PS，测定2周后的肌肉量，与IGF-1的持续给药和小鼠亲本抗体IGF11-16的静脉内给药时的肌肉质量增加作用进行比较。
将hIGF13_PS和小鼠亲本抗体IGF11-16以0.1mg/kg对正常豚鼠的静脉内单次给药。使用渗透压泵(Alzette)将作为阳性对照的人IGF-I (美卡舍明)埋入皮下，以1mg/kg/天的方式持续给药。作为对照，仅将溶媒进行静脉内给药。给药2周后，将豚鼠在麻醉下放血致死，摘除趾长伸肌，测定肌肉质量。
其结果见图5。与仅用溶媒处置的对照组相比，在以0.1mg/kg静脉内给予hIGF13_PS的组中肌肉量显著增加。另外，其药效与将人IGF-I以1mg/kg/天持续给药的组或将小鼠亲本抗体IGF11-16进行静脉内给药的药效强度为同等程度。
由以上的结果显示：hIGF13_PS通过单次给药可期待与人IGF-1的2周持续给药同等的药效。
[实施例16]人源化抗体在摘除了下垂体的豚鼠中的生长板软骨伸长作用：
作为hIGF13_PS的生长板软骨增殖作用评价，使用摘除了下垂体(HPX)的豚鼠模型，对胫骨近端的骨骺线厚度(Epiphyseal line thicknes)进行评价。摘除了下垂体(HPX)的豚鼠模型因摘除了下垂体而抑制生长激素的产生，所以成为低IGF-1状态。
对摘除了下垂体的豚鼠以0.3mg/kg和1.0mg/kg单次皮下给予hIGF13_PS，2周后采集右下肢。制作胫骨近端的生长板软骨的组织标本。利用甲苯胺蓝测定生长板软骨的厚度(骨骺线厚度)。利用渗透压泵将作为阳性对照的IGF-1 (美卡舍明)制剂以1mg/kg/天进行皮下持续给药，同时将GH (somatropin)制剂以1mg/kg/天、1天1次进行皮下给药。
其结果见图6。在IGF-1制剂给药组和GH制剂给药组中发现了骨骺线厚度的增加，认为这是由于：因HPX而降低的血中IGF-1得到了补充、或者因HPX而损失的GH得到了补充。结果显示：在hIGF13_PS抗体组中，剂量依赖性地使骨骺线厚度变厚，但没有使摘除了下垂体(HPX)的个体的血中IGF-1浓度上升。
根据以上的结果，显示了hIGF13_PS抗体具有以下作用：因下垂体摘除(HPX)处理导致的IGF-1浓度降低所伴随的骨骺线的闭合通过由IGF-1R介导的信号激活而恢复。
[实施例17]人源化抗体在食蟹猴中的降血糖作用：
为了确认抗IGF-1受体激动剂抗体在食蟹猴中有无降血糖作用，对食蟹猴单次给予hIGF13_PS，经时性地测定血糖值，与IGF-1 (1mg/kg)单次给药时的降血糖作用进行比较。降血糖作用是指与溶媒给药组相比下降至小于50%、或者产生低血糖症状的作用。
对食蟹猴以10mg/kg单次静脉内或皮下给予人源化抗体。在给药前(0小时)、给药后5分钟、30分钟、1、2、4、8和24小时后进行采血，使用Medisafe Fit (Terumo株式会社)测定血糖值。
结果见图7。各人源化抗体与仅给予溶媒的溶媒对照组相比血糖值未见差异，给药后的血糖值均与溶媒对照组为同等水平。另一方面，IGF-1给药组在2小时后呈低血糖，显示出低血糖症状，因此给予葡萄糖使其恢复。
[实施例18]人源化抗体在食蟹猴中的血中动力学：
将人源化抗体hIGF13_PS以1和10mg/kg对食蟹猴进行单次静脉内或皮下给药。在给药前(0小时)、给药2、4、8、24、48、72和144小时后进行采血，通过ELISA测定血浆中的人源化抗体浓度。
具体而言，使用重组IGF-1R(R＆D公司制造，Cat#305-GR-050)，利用抗原ELISA进行测定。定量时的标准曲线是将对猴给药的浓度已知的抗体用猴血浆进行阶段稀释后作为标准物质。标准物质和血浆均稀释10倍～1000倍再实施测定。
将重组IGF-1R的0.5μg/mL的PBS溶液添加在96孔板(MaxiSorp(NUNC))中，在4℃下固定一整夜。再用3% BSA/PBS进行封闭，制作了重组IGF-1R固定板。另一方面，使用未给予抗体的猴血浆对给药后的抗体进行阶段稀释，作为标准物质。将血浆和标准物质稀释10倍，以50μL/孔添加在重组IGF-1R固定板中。在室温下反应1小时30分钟，之后用PBS-T(PBS、0.025% Tween20)进行洗涤操作。之后，以50μL/孔添加将碱性磷酸酶标记抗人IgG (H+L)多克隆抗体(Southern Biotechnology Associates公司，Cat#2087-04)用3% BSA/PBS稀释2000倍而得的溶液，在室温下反应1小时。之后，用PBS-T进行洗涤操作，以100μL/孔添加pNpp(WAKO公司，Cat#149-02342)作为显色底物，在室温下温育1小时。之后，使用读板仪测定405nm和550nm的吸光度，算出吸光度405nm-550nm的差值。根据作为标准物质的抗体浓度绘制标准曲线，算出血浆中的抗体浓度。
结果见图8。由该结果确认到：hIGF13_PS在食蟹猴中的血中动力学良好。
[实施例19]人源化抗体在食蟹猴中的肌肉量增加作用：
将hIGF13_PS以1mg/kg对2只食蟹猴实施静脉内给药。在给药前和给药后3～4周后通过DXA (双能X射线吸收测量)法测定肌肉量。
具体而言，对于测定对象的猴，通过盐酸氯胺酮(Arevipharma GmbH、50mg/mL、0.2mL/kg)和盐酸美托咪啶水溶液(Domitor、Orion Corporation、1mg/mL、0.08mL/kg)的肌肉内给药(臀部)进行全身麻醉，使用双能X射线吸收测定装置(Discovery-A、HOLOGIC公司)进行脂肪量(Fat Mass，g)、非脂肪量(Lean Body Mass，g)、骨量(Bone Mineral Content(BMC)，g)的计测，以非脂肪量作为肌肉量进行分析。测定左右腕部(上肢)的BMC (骨盐量)和Lean+BMC (g)，算出肌肉量(g)，与给药前的肌肉量进行比较。
其结果，与给药前相比，2只均显示肌肉量增加，上肢的肌肉增加率与给药前相比分别为7.4%、10.9%。由该结果确认到了hIGF13_PS的肌肉增加作用。
再将hIGF13_PS以10mg/kg对2只食蟹猴实施皮下给药。在给药前和给药后3～4周后通过DXA (双能X射线吸收测量)法测定肌肉量。
具体而言，对于测定对象的猴，通过盐酸氯胺酮(Arevipharma GmbH、50mg/mL、0.2mL/kg)和盐酸美托咪啶水溶液(Domitor、Orion Corporation、1mg/mL、0.08mL/kg)的肌肉内给药(臀部)进行全身麻醉，使用双能X射线吸收测定装置(Discovery-A、HOLOGIC公司)进行脂肪量(Fat Mass，g)、非脂肪量(Lean Body Mass，g)、骨量(Bone Mineral Content(BMC)，g)的计测，以非脂肪量作为肌肉量进行分析。测定左右下肢的BMC (骨盐量)和Lean+BMC (g)，算出肌肉量(g)，与给药前的肌肉量进行比较。
其结果，与给药前相比，2只均显示肌肉量增加，下肢的肌肉增加率与给药前相比分别为3.3%、12.7%。由该结果确认到了hIGF13_PS的肌肉增加作用。
[实施例20] IGF11-16对HepG2细胞增殖的作用
通过细胞存活测定评价小鼠亲本抗体IGF11-16给HepG2细胞增殖带来的浓度依赖性作用。
使用在DMEM (Gibco，11995)中添加1% FBS而得的培养基悬浮HepG2细胞株，以0.25×104个细胞/孔接种于胶原-I包被96孔板(Corning，356650)。第二天，将BSA/PBS、IGF-1 (美卡舍明)、对照小鼠IgG1抗体(mIgG1)、IGF11-16抗体和西妥木单抗(Cixutumumab；IGF-1受体拮抗剂抗体)从50nM起以1/10的恒定比例稀释后添加。2天后，使用CellTiter-Glo(注册商标)Luminescent Cell Viability Assay (Promega，G7571)测定细胞内的ATP量作为细胞增殖指标，利用多检测模式酶标仪(SPARK、TECAN)测定发光信号。以对照小鼠IgG1抗体(mIgG1)的各浓度点的值为100%，算出对照的%，以曲线图的形式表示(图9)。
其结果，观察到了小鼠亲本抗体IGF11-16对HepG2细胞增殖显示抑制作用。根据该结果，认为IGF11-16至少可对某种癌细胞显示拮抗剂的作用。
[实施例21] IGF11-16对基于IGF-1的人乳癌细胞株(MCF7)的增殖活性的作用
为了评价IGF11-16对基于IGF-1的人乳癌细胞株(MCF7)增殖活性的作用，在共存有50nM IGF11-16的条件下，根据添加2天后的细胞内的ATP量测定hIGF-1 (美卡舍明)的浓度依赖性增殖活性。
使用含有10% FBS的DMEM/F12培养基培养人乳癌细胞株(MCF7)。第二天，使用含有10% FBS的DMEM/F12培养基，以0.1mL/孔(2.5×103个细胞/孔)接种于96孔板(I型胶原包被)，在37℃、5% CO2的条件下温育。在细胞接种的第二天，将培养基交换成含有1% BSA的DMEM/F12培养基，在37℃、5% CO2的条件下温育约8小时。之后，添加50nM的0.1% BSA/PBS或IGF11-16抗体后，添加从50nM起以1/10的恒定比例稀释的IGF-1，在37℃、5% CO2的条件下温育2天。使用CellTiter-Glo (注册商标) Luminescent Cell Viability Assay(Promega，G7571)测定细胞内的ATP量作为细胞增殖的指标，利用多检测模式酶标仪(SPARK、TECAN)测定发光信号。以各浓度的IGF-1添加组的0.1% BSA/PBS添加组的平均值为100%，通过算出对照的%，来表示在添加50nM IGF11-16时的变化。结果见表17。
[表17]
表17
IGF-1单独 50nM IGF11-16共存
0.5nM IGF-1 100% 67%
5nM IGF-1 100% 67%
50nM IGF-1 100% 74%
其结果显示：小鼠亲本抗体IGF11-16具有使基于IGF-1的人乳癌细胞株(MCF7)的最大活性降低的抑制作用。由该结果认为：IGF11-16具有变构拮抗剂的作用。
产业实用性
本发明可提供抗IGF-1受体人源化抗体，该抗IGF-1受体人源化抗体特异性地与脊椎动物的IGF-1受体结合，经由IGF-1受体使肌肉量增加，同时不会降低血糖值，因此可用于与IGF-1受体相关的疾病的治疗、预防或诊断。另外，本发明通过抑制IGF-1受体的过度信号，还可用于治疗、预防或诊断与细胞的异常增殖或激活有关的疾病，其在产业上的价值非常高。
<110> 帝人制药株式会社
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<220>
<223> CDR-L3
<400> 13
Leu Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-L3
<400> 14
ctccaaggcc agtcctaccc ttacaca 27
<210> 15
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FW1_VH1
<400> 15
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Thr Asn Pro Ser Asn Ser Val Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Arg Gly Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 16
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FW1_VH1
<400> 16
caagttcagc tggtgcagtc cggcgctgag gtgaagaagc ccggcgcctc cgtgaaggtg 60
tcttgtaagg cctccggcta caccttcacc tcctactgga tgcactgggt gaggcaagct 120
cccggtcaag gtttagagtg gatgggcgag accaacccct ccaactccgt gaccaactac 180
gcccagaagt tccaaggtcg tgtgacttta accgtggaca cctccacctc caccgcctac 240
atggagctgt cctctttaag gtccgaggac accgccgtgt actactgtac catcggtcgt 300
ggccggggct ttgcttattg gggacaaggt actttagtga ccgtgagcag c 351
<210> 17
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FW1_VH2
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Thr Asn Pro Ser Asn Ser Val Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Arg Gly Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FW1_VH2
<400> 18
caagttcagc tggtgcagtc cggcgctgag gtgaagaagc ccggcgcctc cgtgaaggtg 60
tcttgtaagg cctccggcta caccttcacc tcctactgga tgcactgggt gaggcaagct 120
cccggtcaag gtttagagtg gatgggcgag accaacccct ccaactccgt gaccaactac 180
gcccagaagt tccaaggtcg tgtgacttta accgtggaca cctccacctc caccgcctac 240
atggagctgt cctctttaag gtccgaggac accgccacct actactgtac catcggtcgt 300
ggccggggct ttgcttattg gggacaaggt actttagtga ccgtgagcag c 351
<210> 19
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FW2_VH1
<400> 19
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Thr Asn Pro Ser Asn Ser Val Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Arg Gly Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 20
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FW2_VH1
<400> 20
caagttcagc tggtgcagtc cggcgctgag gtgaagaagc ccggctcctc cgtgaaggtg 60
tcttgtaagg cctccggcta caccttcacc tcctactgga tgcactgggt gaggcaagct 120
cccggtcaag gtttagagtg gatgggcgag accaacccct ccaactccgt gaccaactac 180
gcccagaagt tccaaggtcg tgtgacttta accgtggaca agtccacctc caccgcctac 240
atggagctgt cctctttaag gtccgaggac accgccgtgt actactgtac catcggtcgt 300
ggccggggct ttgcttattg gggacaaggt actttagtga ccgtgagcag c 351
<210> 21
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FW1_VL1
<400> 21
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Phe Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Cys Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ile Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 22
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FW1_VL1
<400> 22
gacatccaga tgacacagtc ccccagctcc gtgtccgcta gcgtgggaga ccgggtgacc 60
attacttgtc gggcctccca gaacatcaac ttctggctga gctggtgtca gcagaagccc 120
ggcaagatcc ccaagttatt aatctacaag gccagcaatt tacacaccgg agtgccttct 180
cgtttctccg gcagcggcag cggaaccgac ttcactttaa ccatctcctc tttacagccc 240
gaggacttcg ccacctacta ttgtttacaa ggtcagtcct atccctacac cttcggcggc 300
ggaaccaagt tagaaatcaa g 321
<210> 23
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FW1_VL3
<400> 23
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Phe Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 24
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FW1_VL3
<400> 24
gacatccaga tgactcagag cccttcctcc gtcagcgctt ccgtgggaga tagggtgact 60
atcacttgta gggcctccca gaacatcaac ttctggctga gctggtatca gcagaagccc 120
ggcaaagccc ctaagctgct gatctacaag gctagcaatc tgcacactgg cgtcccttcc 180
agattcagcg gctccggcag cggcactgac ttcactctca caatcagctc tctgcagcca 240
gaggacttcg ctacatacta ctgcctccaa ggccagtcct atccttacac attcggaggc 300
ggcacaaagc tggagatcaa g 321
<210> 25
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FW1_VL4
<400> 25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Phe Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 26
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FW1_VL4
<400> 26
gacatccaga tgactcagag cccttcctcc gtcagcgctt ccgtgggaga tagggtgact 60
atcacttgta gggcctccca gaacatcaac ttctggctga gctggtatca gcagaagccc 120
ggcaaagccc ctaggctgct gatctacaag gctagcaatc tgcacactgg cgtcccttcc 180
agattcagcg gctccggcag cggcactgac ttcactctca caatcagctc tctgcagcca 240
gaggacttcg ctacatacta ctgcctccaa ggccagtcct atccttacac attcggaggc 300
ggcacaaagc tggagatcaa g 321
<210> 27
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FW2_VL2
<400> 27
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Phe Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ile Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 28
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FW2_VL2
<400> 28
gatatccaga tgactcagag cccaagctct ctgagcgcta gcgtcggaga tagggtcaca 60
atcacttgta gggcctccca gaacatcaac ttctggctca gctggtacca gcagaaaccc 120
ggcaagatcc ctaagctgct gatctacaag gccagcaacc tccacactgg agtcccatct 180
aggtttagcg gatccggcag cggaactgac ttcactctca caatcagctc tctgcagcca 240
gaggacgtgg ctacatacta ctgcctccaa ggccagtcct acccttacac attcggcggc 300
ggcacaaaac tggagatcaa g 321
<210> 29
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FW1_VH1_mH1
<400> 29
Gln Ile Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Pro Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Thr Asn Pro Ser Asn Ser Val Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Arg Gly Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 30
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FW1_VH1_mH1
<400> 30
cagattcagc tgcagcagcc cggcgctgaa ctggtgaaac ccggcgcctc cgtgaaactc 60
agctgtaagg cccccggcta cactttcaca tcctactgga tgcactgggt gagacaagcc 120
cccggccaag gactggagtg gatgggcgag acaaacccta gcaactccgt cactaactac 180
gcccagaagt tccaaggaag ggtgactctc acagtggaca ctagcacatc cacagcctac 240
atggaactgt ccagcctcag atccgaggac actgctgtgt actactgcac aatcggcaga 300
ggaaggggat tcgcttactg gggccaaggc acactcgtga ctgtcagctc c 351
<210> 31
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FW1_VH1_mH2
<400> 31
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Thr Asn Pro Ser Asn Ser Val Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Arg Gly Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 32
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FW1_VH1_mH2
<400> 32
caagtgcagc tcgtccaaag cggcgctgaa gtgaagaaac ccggcgccag cgtgaaggtc 60
agctgcaaag cctccggcta cacattcaca tcctactgga tgcactgggt caagcagagg 120
cccggccaag gactggagtg gatcggcgaa acaaaccctt ccaacagcgt cactaactac 180
gcccagaagt ttcaaggaag ggtgacactg actgtcgaca ctagcactag cactgcctat 240
atggagctga gctctctgag gagcgaggac actgccgtct attactgcac tatcggaagg 300
ggcagaggat tcgcctactg gggccaaggc actctcgtga cagtcagcag c 351
<210> 33
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FW1_VH1_mH3
<400> 33
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Thr Asn Pro Ser Asn Ser Val Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Arg Gly Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 34
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FW1_VH1_mH3
<400> 34
caagtgcaac tggtgcagtc cggcgccgag gtgaagaagc ccggcgccag cgtgaaggtg 60
agctgtaaag ccagcggcta cacattcaca tcctactgga tgcactgggt gagacaagcc 120
cccggccaag gactggagtg gatgggcgaa actaaccctt ccaacagcgt cacaaattat 180
gctcagaaat tccagggaag ggtgacactg acagtcgaca aaagcagcag cacagcctat 240
atgcagctga gctctctgac tagcgaggac tccgccgtgt actactgcac aattggaagg 300
ggcagaggat tcgcctactg gggacaaggc actctggtga cagtcagcgc c 351
<210> 35
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FW1_VL3_mL1
<400> 35
Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Phe Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 36
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FW1_VL3_mL1
<400> 36
gacatccaga tgaatcagag cccttcctcc ctctccgctt ctctgggcga cacaatcaca 60
atcacttgta gggccagcca gaacatcaac ttctggctga gctggtacca gcaaaagccc 120
ggcaaagccc ctaagctgct gatttacaag gcctccaacc tccacactgg agtgcctagc 180
agattctccg gcagcggcag cggaacagac ttcactctca caatcagctc tctgcagcca 240
gaggacttcg ctacatacta ctgcctccaa ggccagtcct atccttacac attcggcggc 300
ggcactaagc tggagatcaa g 321
<210> 37
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FW1_VL3_mL2+L3
<400> 37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Phe Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 38
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FW1_VL3_mL2+L3
<400> 38
gacattcaga tgacacagtc cccaagctcc gtgtccgcta gcgtcggaga cagagtgaca 60
atcacatgta gggctagcca gaacatcaac ttctggctga gctggtacca gcagaagccc 120
ggcaacatcc ctaagctgct gatctacaag gcctccaatc tgcacactgg cgtgcctagc 180
agattcagcg gatccggctc cggaactgac ttcactctca caatcagctc tctgcagcca 240
gaggacatcg ctacatacta ctgcctccaa ggccagagct atccttacac attcggaggc 300
ggcacaaagc tggagatcaa g 321
<210> 39
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGF11-16_VH
<400> 39
Gln Ile Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Pro Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Thr Asn Pro Ser Asn Ser Val Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Arg Gly Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 40
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IGF11-16_VH
<400> 40
cagatccagc tgcagcagcc cggtgctgag ctggtgaagc ccggtgccag cgtgaagctg 60
tcttgtaagg cccccggtta cactttcaca agctactgga tgcactgggt caagcagaga 120
cccggtcaag gtttagaatg gatcggcgaa acaaatcctt ccaacagcgt gacaaactat 180
aacgagaagt tcaagagcaa ggctactctg actgtggaca agagcagcag cactgcctat 240
atgcagctgt cctctttaac aagcgaggac agcgccgtgt actactgtac aatcggtcgt 300
ggtcgtggat ttgcctactg gggacaaggt acactggtga cagtgtccgc c 351
<210> 41
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGF11-16_VL
<400> 41
Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Ile Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Phe Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Cys Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 42
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IGF11-16_VL
<400> 42
gacatccaga tgaatcagag ccctagctct ttaagcgcct ctttaggaga cactatcact 60
atcacttgta gggccagcca gaacatcaac ttctggctga gctggtgcca gcagaagccc 120
ggtaacatcc caaagctgct gatctacaaa gccagcaatt tacacactgg tgtcccttct 180
cgttttagcg gctccggcag cggcacagac ttcactctga caatctcctc tttacagcca 240
gaggacatcg ccacttacta ctgtttacaa ggtcagagct acccttacac ttttggcggc 300
ggcactaaac tggagatcaa g 321
<210> 43
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH13_PN
<400> 43
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Pro Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Thr Asn Pro Ser Asn Ser Val Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Ile Gly Arg Gly Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 44
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VH13_PN
<400> 44
caagtgcagc tggtccagag cggagccgaa gtgaaaaagc ccggcgcctc cgtcaaagtc 60
agctgcaagg cccctggcta caccttcacc tcctactgga tgcactgggt gaggcaagct 120
cccggtcaag gtttagagtg gatgggcgag accaacccct ccaactccgt gaccaactac 180
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65 70 75 80
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100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 351
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<213> 人工序列
<220>
<223> VH25_PS
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caagtccaac tggtccagtc cggagccgaa gtgaagaaac ccggcgctag cgtcaaggtc 60
agctgtaagg cccccggcta cacattcact agctactgga tgcactgggt gaggcaagcc 120
cccggccaag gactggagtg gatgggcgaa acaaacccaa gcagctccgt cactaactac 180
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ggaaggggat tcgcttactg gggccaaggc acactggtca cagtcagctc c 351
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL13
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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Phe Trp
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<220>
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<220>
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<400> 63
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Phe Trp
20 25 30
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50 55 60
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<212> PRT
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<220>
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<400> 65
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Phe Trp
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Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ile Pro Lys Leu Leu Ile
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL22
<400> 66
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<213> 人工序列
<220>
<223> VL23
<400> 67
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Phe Trp
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<211> 321
<212> DNA
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<220>
<223> VL23
<400> 68
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ggcacaaaac tggagatcaa g 321
<210> 69
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL24
<400> 69
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Phe Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 70
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VL24
<400> 70
gatatccaga tgactcagag cccaagctct ctgagcgcta gcgtcggaga tagggtcaca 60
atcacttgta gggcctccca gaacatcaac ttctggctca gctggtacca gcagaaaccc 120
ggcaaggtcc ctaagctgct gatctacaag gccagcaaca ggcacactgg agtcccatct 180
aggtttagcg gatccggcag cggaactgac ttcactctca caatcagctc tctgcagcca 240
gaggacgtgg ctacatacta ctgcctccaa ggccagtcct acccttacac attcggcggc 300
ggcacaaaac tggagatcaa g 321
<210> 71
<211> 1367
<212> PRT
<213> 人(Homo sapiens)
<220>
<223> 人 IGF-I受体
<400> 71
Met Lys Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Trp Gly Leu
1 5 10 15
Leu Phe Leu Ser Ala Ala Leu Ser Leu Trp Pro Thr Ser Gly Glu Ile
20 25 30
Cys Gly Pro Gly Ile Asp Ile Arg Asn Asp Tyr Gln Gln Leu Lys Arg
35 40 45
Leu Glu Asn Cys Thr Val Ile Glu Gly Tyr Leu His Ile Leu Leu Ile
50 55 60
Ser Lys Ala Glu Asp Tyr Arg Ser Tyr Arg Phe Pro Lys Leu Thr Val
65 70 75 80
Ile Thr Glu Tyr Leu Leu Leu Phe Arg Val Ala Gly Leu Glu Ser Leu
85 90 95
Gly Asp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile Arg Gly Trp Lys Leu Phe
100 105 110
Tyr Asn Tyr Ala Leu Val Ile Phe Glu Met Thr Asn Leu Lys Asp Ile
115 120 125
Gly Leu Tyr Asn Leu Arg Asn Ile Thr Arg Gly Ala Ile Arg Ile Glu
130 135 140
Lys Asn Ala Asp Leu Cys Tyr Leu Ser Thr Val Asp Trp Ser Leu Ile
145 150 155 160
Leu Asp Ala Val Ser Asn Asn Tyr Ile Val Gly Asn Lys Pro Pro Lys
165 170 175
Glu Cys Gly Asp Leu Cys Pro Gly Thr Met Glu Glu Lys Pro Met Cys
180 185 190
Glu Lys Thr Thr Ile Asn Asn Glu Tyr Asn Tyr Arg Cys Trp Thr Thr
195 200 205
Asn Arg Cys Gln Lys Met Cys Pro Ser Thr Cys Gly Lys Arg Ala Cys
210 215 220
Thr Glu Asn Asn Glu Cys Cys His Pro Glu Cys Leu Gly Ser Cys Ser
225 230 235 240
Ala Pro Asp Asn Asp Thr Ala Cys Val Ala Cys Arg His Tyr Tyr Tyr
245 250 255
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260 265 270
Gly Trp Arg Cys Val Asp Arg Asp Phe Cys Ala Asn Ile Leu Ser Ala
275 280 285
Glu Ser Ser Asp Ser Glu Gly Phe Val Ile His Asp Gly Glu Cys Met
290 295 300
Gln Glu Cys Pro Ser Gly Phe Ile Arg Asn Gly Ser Gln Ser Met Tyr
305 310 315 320
Cys Ile Pro Cys Glu Gly Pro Cys Pro Lys Val Cys Glu Glu Glu Lys
325 330 335
Lys Thr Lys Thr Ile Asp Ser Val Thr Ser Ala Gln Met Leu Gln Gly
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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420 425 430
Asp Trp Asp His Arg Asn Leu Thr Ile Lys Ala Gly Lys Met Tyr Phe
435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
Asn Asn Gly Glu Arg Ala Ser Cys Glu Ser Asp Val Leu His Phe Thr
485 490 495
Ser Thr Thr Thr Ser Lys Asn Arg Ile Ile Ile Thr Trp His Arg Tyr
500 505 510
Arg Pro Pro Asp Tyr Arg Asp Leu Ile Ser Phe Thr Val Tyr Tyr Lys
515 520 525
Glu Ala Pro Phe Lys Asn Val Thr Glu Tyr Asp Gly Gln Asp Ala Cys
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Gly Ser Asn Ser Trp Asn Met Val Asp Val Asp Leu Pro Pro Asn Lys
545 550 555 560
Asp Val Glu Pro Gly Ile Leu Leu His Gly Leu Lys Pro Trp Thr Gln
565 570 575
Tyr Ala Val Tyr Val Lys Ala Val Thr Leu Thr Met Val Glu Asn Asp
580 585 590
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<212> DNA
<213> 人
<220>
<223> 人 IGF-I受体
<400> 72
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gagatgacca atctcaagga tattgggctt tacaacctga ggaacattac tcggggggcc 420
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ctggatgcgg tgtccaataa ctacattgtg gggaataagc ccccaaagga atgtggggac 540
ctgtgtccag ggaccatgga ggagaagccg atgtgtgaga agaccaccat caacaatgag 600
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<220>
<223> 食蟹猴IGF-I受体
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Asn Asn Gly Glu Arg Ala Ser Cys Glu Ser Asp Val Leu His Phe Thr
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565 570 575
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His Ile Arg Gly Ala Lys Ser Glu Ile Leu Tyr Ile Arg Thr Asn Ala
595 600 605
Ser Val Pro Ser Ile Pro Leu Asp Val Leu Ser Ala Ser Asn Ser Ser
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Ser Gln Leu Ile Val Lys Trp Asn Pro Pro Ser Leu Pro Asn Gly Asn
625 630 635 640
Leu Ser Tyr Tyr Ile Val Arg Trp Gln Arg Gln Pro Gln Asp Gly Tyr
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Leu Tyr Arg His Asn Tyr Cys Ser Lys Asp Lys Ile Pro Ile Arg Lys
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<212> DNA
<213> 食蟹猴
<220>
<223> 食蟹猴IGF-I受体
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aacaacgggg aaagagcctc ctgtgaaagt gacgtcctgc atttcacctc caccaccacg 1500
tggaagaatc gcatcatcat aacctggcac cggtaccggc cccctgacta cagggatctc 1560
atcagcttca ccgtttacta caaggaagca ccttttaaga atgtcacgga gtatgatggg 1620
caggatgcct gcggctccaa cagctggaac atggtggacg tggacctccc gcccaacaag 1680
gacgtggagc ccggcatctt actgcatggg ctgaagccct ggactcagta cgccgtttac 1740
gtcaaggctg tgaccctcac catggtggag aacgaccata tccgtggggc caagagtgag 1800
atcttgtaca ttcgcaccaa tgcttcagtt ccttccattc ccttggacgt tctttcagca 1860
tcgaactcct cttctcagtt aatcgtgaag tggaaccctc cctctctgcc caacggcaac 1920
ctgagttact acattgtgcg ctggcagcgg cagcctcagg acggctacct ttaccggcac 1980
aattactgct ccaaagacaa aatccccatc aggaagtatg ccgacggcac cattgacatt 2040
gaggaggtca cagagaaccc gaagactgag gtgtgtggtg gagagaaagg gccttgctgc 2100
gcctgcccca aaactgaagc tgagaagcag gccgagaagg aggaggctga gtaccgcaaa 2160
gtctttgaga atttcctgca caactccatc tttgtgccca gacctgaaag gaagcggaga 2220
gatgtcatgc aagtggccaa caccaccatg tccagccgaa gcaggaacac cacggtggca 2280
gacacctaca acatcacaga tctggaagag ctagagacag agtacccttt ctttgagagc 2340
agagtggata ataaggagag aactgtcatt tctaaccttc ggcctttcac attgtaccgc 2400
attgatatcc acagctgcaa ccacgaggct gagaaactgg gctgcagcgc ctccaacttt 2460
gtctttgcaa ggactatgcc tgcagaagga gcagatgaca ttcctgggcc agtgacctgg 2520
gagccaaggc ctgaaaactc catcttttta aagtggccag aacctgagaa tcccaatgga 2580
ttgattctaa tgtatgaaat aaaatacgga tcacaagttg aggatcagcg agaatgtgtg 2640
tccagacagg aatacaggaa gtatggaggg gccaagctaa accggctaaa cccggggaac 2700
tacacagccc ggattcaggc tacatctctc tctgggaatg ggtcgtggac agatcctgtg 2760
ttcttctatg tccaggccaa aacaggatac gaaaacttca tccatctgat catcgctctg 2820
cccgtcgctg tcctgttgat cgtgggaggg ttggtgatca tgctgtacgt cttccataga 2880
aagagaaata acagcaggct ggggaatgga gtgctgtacg cgtctgtgaa cccggagtac 2940
ttcagcgctg cggatgtgta cgttcctgat gagtgggagg tggctcggga gaagatcacc 3000
atgagccggg aacttgggca ggggtcgttt gggatggtct atgaaggagt tgccaagggt 3060
gtggtgaaag acgaacctga aaccagagtg gccattaaaa cagtgaacga ggccgcgagc 3120
atgcgtgaaa ggatcgagtt tctcaacgag gcttctgtga tgaaggagtt caattgtcac 3180
catgtggtgc ggttgctggg tgtggtgtcc cagggccagc caacgctggt catcatggaa 3240
ctgatgacgc ggggcgatct caaaagttat ctccggtctc tgaggccaga aatggagaat 3300
aatccagtcc tagcacctcc aagcctaagc aagatgattc agatggctgg agagattgca 3360
gacggcatgg catacctcaa cgccaacaag ttcgtccaca gagaccttgc tgcccggaat 3420
tgcatggtag ccgaggattt cacagtcaaa attggagatt ttgggatgac gcgagatatc 3480
tatgagacag actattaccg gaaaggaggg aaagggctgt tgcccgtgcg ctggatgtct 3540
cccgagtccc tcaaggatgg agtcttcacc acttactcgg acgtctggtc cttcggggtt 3600
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gtccttcgct tcgtcatgga gggcggcctt ctggacaagc cagacaactg ccccgacatg 3720
ctgtttgaat tgatgcgcat gtgctggcag tacaacccca agatgaggcc ttccttcctg 3780
gagatcatca gcagcatcaa agacgagatg gagcctggct tccgggaggt ctccttctac 3840
tacagtgagg agaacaagct gcccgagccg gaggagctgg acctggagcc agagaacatg 3900
gagagcgtcc ccctggaccc ctcggcctcc tcgtcctccc tgccactgcc cgacagacac 3960
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gatgagagac agccttacgc acacatgaac ggtggccgca agaacgagcg ggccttgccg 4080
ctgccccagt cttcgacctg ctga 4104
<210> 75
<211> 1425
<212> PRT
<213> 穴兔(Oryctolagus cuniculus)
<220>
<223> 穴兔IGF-I受体
<400> 75
Met Lys Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Arg Thr Ser Ala Trp Gly Leu
1 5 10 15
Leu Phe Leu Ser Ala Ala Leu Ser Val Trp Pro Thr Ser Gly Glu Ile
20 25 30
Cys Gly Pro Gly Ile Asp Ile Arg Asn Asp Phe Gln Gln Leu Lys Arg
35 40 45
Leu Glu Asn Cys Thr Val Ile Glu Gly Phe Leu His Ile Leu Leu Ile
50 55 60
Ser Lys Ala Glu Asp Tyr Arg Asn Tyr Arg Phe Pro Lys Leu Thr Val
65 70 75 80
Ile Thr Glu Tyr Leu Leu Leu Phe Arg Val Ala Gly Leu Glu Ser Leu
85 90 95
Gly Asp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile Arg Gly Trp Lys Leu Phe
100 105 110
Tyr Asn Tyr Ala Leu Val Ile Phe Glu Met Thr Asn Leu Lys Asp Ile
115 120 125
Gly Leu Tyr Asn Leu Arg Asn Ile Thr Arg Gly Ala Ile Arg Ile Glu
130 135 140
Lys Asn Ala Asp Leu Cys Tyr Leu Ser Thr Val Asp Trp Ser Leu Ile
145 150 155 160
Leu Asp Ala Val Ser Asn Asn Tyr Ile Val Gly Asn Lys Ser Pro Lys
165 170 175
Glu Cys Gly Asp Met Cys Pro Gly Thr Leu Glu Glu Lys Pro Leu Cys
180 185 190
Glu Lys Thr Ala Ile Asn Asn Glu Tyr Asn Tyr Arg Cys Trp Thr Thr
195 200 205
Asn Arg Cys Gln Lys Met Cys Pro Ser Ala Cys Gly Lys Arg Ala Cys
210 215 220
Thr Glu Asn Asn Glu Cys Cys His Pro Glu Cys Leu Gly Ser Cys His
225 230 235 240
Ala Pro Asp Asp Asp Thr Ala Cys Val Ala Cys Arg His Tyr Tyr Phe
245 250 255
Ser Gly Val Cys Val Pro Ala Cys Pro Pro Asn Thr Tyr Arg Phe Glu
260 265 270
Gly Trp Arg Cys Val Asp Arg Asp Phe Cys Ala Asn Ile Pro Asn Ala
275 280 285
Asp Gly Gly Asp Ser Glu Gly Phe Val Ile His Asp Gly Glu Cys Met
290 295 300
Gln Glu Cys Pro Ser Gly Phe Ile Arg Asn Gly Ser Gln Ser Met Phe
305 310 315 320
Cys Ile Pro Cys Glu Gly Pro Cys Pro Lys Val Cys Glu Glu Asp Lys
325 330 335
Lys Thr Lys Thr Ile Asp Ser Val Asn Ser Ala Gln Met Leu Gln Gly
340 345 350
Cys Thr Ile Phe Lys Gly Asn Leu Leu Ile Asn Ile Arg Arg Gly Asn
355 360 365
Asn Ile Ala Ser Glu Leu Glu Asn Phe Met Gly Leu Ile Glu Val Val
370 375 380
Thr Gly Tyr Val Lys Ile Ser His Ser His Ala Leu Val Ser Leu Ser
385 390 395 400
Phe Leu Lys Asn Leu Arg Gln Ile Leu Gly Glu Glu Gln Leu Glu Gly
405 410 415
Asn Tyr Ser Phe Tyr Val Leu Asp Asn Gln Asn Leu Gln Gln Leu Trp
420 425 430
Asp Trp Asp His Arg Asn Leu Thr Ile Lys Ala Gly Lys Met Tyr Phe
435 440 445
Ala Phe Asn Pro Lys Leu Cys Val Ser Glu Ile Tyr Arg Met Glu Asp
450 455 460
Val Thr Gly Thr Lys Gly Arg Gln Ser Lys Gly Asp Ile Asn Thr Arg
465 470 475 480
Asn Asn Gly Glu Arg Ala Ser Cys Glu Ser Asp Ile Leu His Phe Thr
485 490 495
Ser Thr Asn Thr Trp Lys Asn Arg Ile Ile Leu Thr Trp His Arg Tyr
500 505 510
Arg Pro Pro Asp Tyr Arg Asp Leu Ile Ser Phe Thr Val Tyr Tyr Lys
515 520 525
Glu Ala Pro Phe Lys Asn Val Thr Glu Tyr Asp Gly Gln Asp Ala Cys
530 535 540
Gly Ser Asn Ser Trp Asn Met Val Asp Val Asp Leu Pro Pro Asn Lys
545 550 555 560
Asp Leu Glu Pro Gly Ile Leu Leu Gln Gly Leu Lys Pro Trp Thr Gln
565 570 575
Tyr Ala Val Tyr Val Lys Ala Val Thr Leu Thr Met Val Glu Asn Asp
580 585 590
His Ile Arg Gly Ala Lys Ser Glu Ile Leu Tyr Ile Arg Thr Asn Ala
595 600 605
Ser Val Pro Ser Ile Pro Leu Asp Ile Leu Ser Ala Ser Asn Ser Ser
610 615 620
Ser Gln Leu Ile Val Lys Trp Ser Pro Pro Ser Leu Pro Asn Gly Asn
625 630 635 640
Leu Ser Tyr Tyr Ile Val Arg Trp Gln Arg Gln Pro Gln Asp Gly Tyr
645 650 655
Leu Tyr Arg His Asn Tyr Cys Ser Lys Asp Lys Ile Pro Ile Arg Lys
660 665 670
Tyr Ala Asp Gly Thr Ile Asp Val Glu Glu Val Thr Glu Asn Pro Lys
675 680 685
Thr Glu Val Cys Gly Gly Glu Lys Gly Pro Cys Cys Ala Cys Pro Lys
690 695 700
Thr Glu Ala Glu Lys Gln Ala Glu Lys Glu Glu Ala Glu Tyr Arg Lys
705 710 715 720
Val Phe Glu Asn Phe Leu His Asn Ser Ile Phe Val Pro Arg Pro Glu
725 730 735
Arg Lys Arg Arg Asp Val Ala Gln Val Ala Asn Thr Thr Leu Ser Gly
740 745 750
Arg Gly Arg Asn Gly Thr Ala Val Asp Met Tyr Asn Ser Thr Asp Leu
755 760 765
Glu Glu Leu Glu Thr Glu Tyr Pro Phe Phe Glu Thr Arg Val Asp Lys
770 775 780
Glu Ile Thr Val Ile Ser Asn Leu Arg Pro Phe Thr Ser Tyr Arg Ile
785 790 795 800
Asp Ile His Ser Cys Asn His Glu Ala Glu Lys Leu Gly Cys Ser Ala
805 810 815
Ser Asn Phe Val Phe Ala Arg Thr Lys Pro Ala Glu Gly Ala Asp Asp
820 825 830
Ile Pro Gly Pro Val Thr Trp Glu Ala Arg Pro Glu Asn Ser Ile Phe
835 840 845
Leu Lys Trp Pro Glu Pro Glu Asn Pro Asn Gly Leu Ile Leu Met Tyr
850 855 860
Glu Ile Lys Tyr Gly Ser Gln Ile Glu Asp Gln Arg Glu Cys Val Ser
865 870 875 880
Arg Gln Gln Tyr Arg Lys Tyr Gly Gly Ala Lys Leu Asn Arg Leu Asn
885 890 895
Pro Gly Asn Tyr Thr Ala Arg Ile Gln Ala Thr Ser Leu Ser Gly Asn
900 905 910
Gly Ser Trp Thr Glu Pro Val Phe Phe Tyr Val Pro Ala Lys Ala Thr
915 920 925
Tyr Glu Ser Phe Met His Leu Ile Ile Ala Leu Pro Val Ala Ile Leu
930 935 940
Leu Ile Val Gly Gly Leu Leu Ile Val Leu Tyr Val Phe His Arg Lys
945 950 955 960
Arg Ser Asn Ser Arg Leu Gly Asn Gly Val Leu Tyr Ala Ser Val Asn
965 970 975
Pro Glu Tyr Phe Ser Ala Ala Asp Val Tyr Val Pro Asp Glu Trp Glu
980 985 990
Val Ala Arg Glu Lys Ile Thr Met Ser Arg Glu Leu Gly Gln Gly Ser
995 1000 1005
Phe Gly Met Val Tyr Glu Gly Val Ala Lys Gly Val Val Lys Asp
1010 1015 1020
Glu Pro Glu Thr Arg Val Ala Ile Lys Thr Val Asn Glu Ala Ala
1025 1030 1035
Ser Met Arg Glu Arg Ile Glu Phe Leu Asn Glu Ala Ser Val Met
1040 1045 1050
Lys Glu Phe Asn Cys His His Val Val Arg Leu Leu Gly Val Val
1055 1060 1065
Ser Gln Gly Gln Pro Thr Leu Val Ile Met Glu Leu Met Thr Arg
1070 1075 1080
Gly Asp Leu Lys Ser Tyr Leu Arg Ser Leu Arg Pro Glu Val Glu
1085 1090 1095
Ala Glu Leu Gln Arg Glu Arg Gln Arg Gln Arg Gln Asn Phe Ile
1100 1105 1110
Arg Arg Phe Ala Pro Arg Met Ala Ala Thr Ala Arg Ala Gly Pro
1115 1120 1125
Gly Arg Ser Gln Gln Pro Gly Ala Ser Ser Gly Ser Pro Thr Arg
1130 1135 1140
Val Gln Gly Pro Lys Asp Leu Gly His Leu Pro Leu Pro Ser Gln
1145 1150 1155
Asn Arg Ala Pro Ala Pro Pro Ser Leu Ser Lys Met Ile Gln Met
1160 1165 1170
Ala Gly Glu Ile Ala Asp Gly Met Ala Tyr Leu Asn Ala Asn Lys
1175 1180 1185
Phe Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Val Ala Glu
1190 1195 1200
Asp Phe Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met Thr Arg Asp Ile
1205 1210 1215
Tyr Glu Thr Asp Tyr Tyr Arg Lys Gly Gly Lys Gly Leu Leu Pro
1220 1225 1230
Val Arg Trp Met Ser Pro Glu Ser Leu Lys Asp Gly Val Phe Thr
1235 1240 1245
Thr His Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Val Leu Trp Glu Ile
1250 1255 1260
Ala Thr Leu Ala Glu Gln Pro Tyr Gln Gly Phe Ser Asn Glu Gln
1265 1270 1275
Val Leu Arg Phe Val Met Glu Gly Gly Leu Leu Asp Lys Pro Asp
1280 1285 1290
Asn Cys Pro Asp Met Leu Phe Glu Leu Met Arg Met Cys Trp Gln
1295 1300 1305
Tyr Asn Pro Lys Met Arg Pro Ser Phe Leu Glu Ile Ile Gly Ser
1310 1315 1320
Val Arg Asp Glu Met Glu Pro Gly Phe Arg Glu Val Ser Phe Tyr
1325 1330 1335
Tyr Ser Glu Glu Asn Lys Pro Pro Glu Ala Glu Glu Leu Asp Leu
1340 1345 1350
Glu Pro Glu Asn Met Glu Ser Val Pro Leu Asp Pro Ser Ala Asn
1355 1360 1365
Ala Ala Ala Ala Val Ala Ala Leu Gln Pro Asp Arg His Lys Ala
1370 1375 1380
Glu Asn Gly Pro Ser Ala Gly Ala Met Val Leu Arg Ala Ser Phe
1385 1390 1395
Asp Glu Arg Arg Pro Tyr Ala His Met Asn Gly Gly Arg Thr Asp
1400 1405 1410
Glu Arg Ala Leu Pro Leu Pro Gln Ser Ser Thr Cys
1415 1420 1425
<210> 76
<211> 4278
<212> DNA
<213> 穴兔
<220>
<223> 穴兔IGF-I受体
<400> 76
atgaagtctg gctccggagg agggtcccgg acctcggcgt gggggctcct gtttctctcc 60
gccgcgctct cggtctggcc gacgagtgga gaaatctgcg ggccgggcat cgacatccgc 120
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atcctgctca tctccaaggc cgaggactac cgcaactacc gcttccccaa gctcaccgtc 240
atcaccgagt acctgctgct gttccgcgtg gccggcctgg agagcctcgg ggacctgttc 300
cccaacctca cggtcatccg cggctggaag ctcttctaca actatgccct ggtcattttc 360
gagatgacta acctcaaaga catagggctc tataacctga ggaacatcac ccggggggcc 420
atcaggatcg agaagaacgc cgacctctgc tacctctcca cggtggactg gtctctcatc 480
ctggacgccg tgtccaacaa ctacattgtg gggaacaagt ccccaaagga gtgcggggac 540
atgtgtccag ggaccttgga ggagaagccg ttgtgcgaga agaccgccat caacaacgag 600
tacaactacc gctgctggac caccaaccgc tgccagaaaa tgtgccccag cgcgtgcggg 660
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gcgcctgacg acgacacggc ctgcgtcgcc tgccgccact actatttctc cggcgtctgc 780
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ttctgcgcca acatccctaa cgccgatggc ggcgactccg agggctttgt catccacgac 900
ggcgagtgca tgcaggagtg cccgtcgggc ttcatccgca acggcagcca gagcatgttc 960
tgcattccct gtgaaggtcc gtgccccaag gtctgtgagg aagacaagaa aacaaagacc 1020
attgattctg ttaattctgc tcaaatgctc caaggctgca ccatcttcaa ggggaatctg 1080
ctcattaaca tccgacgagg caataacatt gcctcggagc tggagaactt catggggctc 1140
atcgaggtgg tgacgggcta cgtgaagatc agccactcgc acgccttggt ctccttgtcc 1200
ttcctgaaga acctccgcca gatcctaggg gaggagcagc tggaagggaa ctactccttc 1260
tacgtcctgg acaaccagaa cttgcagcag ctctgggact gggaccaccg caacctgacc 1320
atcaaagctg ggaagatgta cttcgccttc aaccccaaac tgtgcgtgtc ggaaatttac 1380
cgcatggagg acgtgacggg gacgaaagga cgccagagca agggcgacat aaacaccagg 1440
aacaacgggg agagagcctc ctgtgagagc gacatcctgc atttcacctc caccaacacg 1500
tggaagaacc gcatcatcct aacctggcac cgctaccgcc cccctgacta cagggatctc 1560
atcagcttca ccgtctacta caaggaggca ccctttaaaa atgtgacgga gtatgatggg 1620
caggacgcct gcggctccaa cagctggaac atggtggacg tggacctccc tcccaacaag 1680
gacctagagc ctggtattct actgcaaggg ctgaagccct ggactcagta cgccgtctac 1740
gtcaaggccg tgaccctcac catggtggag aatgaccaca tccgaggggc caagagtgaa 1800
atcttgtaca ttcgcaccaa cgcctcagtt ccttccatcc ccttggacat cctctcggca 1860
tccaactcct cgtctcagct gatcgtgaag tggagccccc cgtccctgcc caacgggaac 1920
ctgagctact acatcgtgag gtggcagcgg cagccccagg acggctacct gtaccggcac 1980
aactactgct ccaaagacaa aattcccatc aggaagtatg cggacggcac catcgacgtg 2040
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gcgtgcccca agaccgaagc cgagaagcag gctgagaagg aggaggcgga gtaccgcaag 2160
gtgttcgaga acttcctgca caactccatc ttcgtgccca gacccgagag gaagcggaga 2220
gatgtcgccc aggtggccaa caccacgctg tccggccgag gcaggaacgg cacggcggtg 2280
gacatgtaca acagcacgga cctggaggag ctggagacag aatacccttt ctttgagacc 2340
agagtggaca aggagataac ggtcatatct aacctgcggc cgtttacttc ctaccgcatc 2400
gatatccaca gctgcaacca cgaggcggag aagctggggt gcagtgcctc caactttgtc 2460
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gcaaggcctg aaaactccat ctttctgaag tggccggaac ctgagaaccc caacggattg 2580
atcctaatgt atgagataaa atacgggtct cagatcgagg accagaggga atgtgtgtcc 2640
agacagcagt accgaaagta tggaggagcc aagctcaacc ggctaaaccc ggggaactat 2700
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gccgcaacag ccagggctgg gccaggccga agccaacagc caggagcttc ttctgggtct 3420
cccacgaggg tgcaggggcc caaggacctg ggccatcttc cgctgccttc ccagaatcgg 3480
gccccagccc ctccgagtct gagtaagatg atccaaatgg ccggggagat tgcagatggc 3540
atggcatacc tcaacgccaa caagttcgtg cacagagacc ttgctgcccg gaactgcatg 3600
gtggccgagg atttcacagt caagatcgga gatttcggaa tgacgcggga catctacgag 3660
acggactact accggaaagg ggggaaaggc ttgctgcccg tgcgctggat gtcccccgag 3720
tccctcaaag atggagtctt caccacccac tctgacgtct ggtccttcgg agtcgtcctc 3780
tgggagatcg ccacgctggc agagcagccg taccagggat tctccaacga gcaggtcctg 3840
cgcttcgtca tggagggcgg ccttctggac aagccggaca actgccccga catgctgttt 3900
gagctgatgc gcatgtgttg gcaatacaac cccaagatgc ggccttcctt cctggagatc 3960
atcggcagtg tcagagacga gatggagccc ggcttccgcg aggtctcctt ctactacagc 4020
gaggagaaca agccgcccga ggccgaggag ctcgacctgg agcccgagaa catggagagc 4080
gtgcccctgg acccctccgc gaacgccgct gccgccgtcg ccgccctgca gcccgacagg 4140
cacaaggccg agaacggccc gagtgcaggg gcgatggtcc tgcgagccag ctttgacgag 4200
aggcgaccct acgcgcacat gaatgggggc cgcacagacg agcgggccct gccgctgccg 4260
cagtcttcga cctgctga 4278
<210> 77
<211> 1367
<212> PRT
<213> 豚鼠(Cavia porcellus)
<220>
<223> 豚鼠IGF-I受体
<400> 77
Met Lys Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Trp Gly Leu
1 5 10 15
Leu Phe Leu Ser Ala Ala Leu Ser Leu Trp Pro Thr Ser Gly Glu Ile
20 25 30
Cys Gly Pro Gly Ile Asp Ile Arg Asn Asp Tyr Gln Gln Leu Lys Arg
35 40 45
Leu Glu Asn Cys Thr Val Ile Glu Gly Tyr Leu His Ile Leu Leu Ile
50 55 60
Ser Lys Ala Glu Asp Tyr Arg Ser Tyr Arg Phe Pro Lys Leu Thr Val
65 70 75 80
Ile Thr Glu Tyr Leu Leu Leu Phe Arg Val Ala Gly Leu Glu Ser Leu
85 90 95
Gly Asp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile Arg Gly Trp Lys Leu Phe
100 105 110
Tyr Asn Tyr Ala Leu Val Ile Phe Glu Met Thr Asn Leu Lys Asp Ile
115 120 125
Gly Leu Tyr Asn Leu Arg Asn Ile Thr Arg Gly Ala Ile Arg Ile Glu
130 135 140
Lys Asn Ala Asp Leu Cys Tyr Leu Ser Thr Val Asp Trp Ser Leu Ile
145 150 155 160
Leu Asp Ala Val Ser Asn Asn Tyr Ile Val Gly Asn Lys Ser Pro Lys
165 170 175
Glu Cys Gly Asp Leu Cys Pro Gly Thr Met Glu Glu Lys Pro Leu Cys
180 185 190
Glu Lys Thr Thr Ile Asn Asn Glu Tyr Asn Tyr Arg Cys Trp Thr Thr
195 200 205
Asn Arg Cys Gln Lys Met Cys Pro Ser Ala Cys Gly Lys Arg Ala Cys
210 215 220
Thr Glu Tyr Gln Glu Cys Cys His Pro Glu Cys Leu Gly Ser Cys His
225 230 235 240
Ala Pro Asp Asp Asp Thr Ala Cys Val Ala Cys Arg His Phe Tyr Tyr
245 250 255
Ala Gly Ile Cys Val Pro Ala Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Arg Phe Glu
260 265 270
Gly Trp Arg Cys Val His Arg Asp Phe Cys Ala Asn Ile Pro Asn Ala
275 280 285
Glu Ser Ser Asp Ser Glu Gly Phe Val Ile His Asp Gly Glu Cys Met
290 295 300
Gln Glu Cys Pro Ser Gly Phe Ile Arg Asn Gly Ser Gln Ser Met Tyr
305 310 315 320
Cys Ile Pro Cys Glu Gly Pro Cys Pro Lys Val Cys Glu Glu Glu Lys
325 330 335
Lys Thr Lys Thr Ile Asp Ser Val Thr Ser Ala Gln Met Leu Gln Gly
340 345 350
Cys Thr Ile Phe Lys Gly Asn Leu Leu Ile Asn Ile Arg Arg Gly Asn
355 360 365
Asn Ile Ala Ser Glu Leu Glu Asn Phe Met Gly Leu Ile Glu Val Val
370 375 380
Thr Gly Tyr Val Lys Ile Arg His Ser His Ala Leu Val Ser Leu Ser
385 390 395 400
Phe Leu Lys Asn Leu Arg Leu Ile Leu Gly Glu Glu Gln Leu Glu Gly
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420 425 430
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435 440 445
Ala Phe Asn Pro Lys Leu Cys Val Ser Glu Ile Tyr Arg Met Glu Glu
450 455 460
Val Thr Gly Thr Lys Gly Arg Gln Ser Lys Gly Asp Ile Asn Thr Arg
465 470 475 480
Asn Asn Gly Glu Arg Ala Ser Cys Glu Ser Asp Val Leu Arg Phe Thr
485 490 495
Ser Thr Thr Thr Ser Lys Asn Arg Ile Ile Ile Thr Trp His Arg Tyr
500 505 510
Arg Pro Pro Asp Tyr Arg Asp Leu Ile Ser Phe Thr Val Tyr Tyr Lys
515 520 525
Glu Ala Pro Phe Lys Asn Val Thr Glu Tyr Asp Gly Gln Asp Ala Cys
530 535 540
Gly Ser Asn Ser Trp Asn Met Val Asp Val Asp Leu Pro Pro Asn Lys
545 550 555 560
Asp Ala Glu Pro Gly Ile Leu Leu His Gly Leu Lys Pro Trp Thr Gln
565 570 575
Tyr Ala Val Tyr Val Lys Ala Val Thr Leu Thr Met Val Glu Asn Asp
580 585 590
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Ser Val Pro Ser Ile Pro Leu Asp Val Leu Ser Ala Ser Asn Ser Ser
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1055 1060 1065
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Ser Ser Val Lys Asp Glu Leu Glu Ala Gly Phe Arg Glu Val Ser
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<210> 78
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<212> DNA
<213> 豚鼠
<220>
<223> 豚鼠IGF-I受体
<400> 78
atgaagtctg gctccggagg agggtccccg acctcgctgt gggggctcct gtttctctct 60
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ccgaacctca ccgtcatccg cggctggaaa ctcttctata actacgccct ggtcatcttc 360
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ctgtgtccag ggaccatgga ggagaaacca ttgtgcgaga agaccaccat caacaatgag 600
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aagcgtgcgt gcaccgagta ccaggagtgc tgccatcctg agtgcctggg cagctgccat 720
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cgcatggaag aagtgacggg gacgaaaggg cgccagagca aaggggacat aaacaccagg 1440
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ttgattctaa tgtacgaaat aaaatacgga tcacaagttg aggatcagcg agaatgtgtg 2640
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tttttctatg tcccagccaa aacaacgtat gaaaacttca tccatctgat catcgctctg 2820
ccagtcgcca tcctgttgat tgtggcaggc ttggcgataa tgctgtacgt cttccatagg 2880
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ctgtttgagc tgatgcgcat gtgctggcag tacaacccca agatgaggcc ttccttcctg 3780
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<210> 79
<211> 1371
<212> PRT
<213> 褐家鼠(Rattus norvegicus)
<220>
<223> 褐家鼠IGF-I受体
<400> 79
Met Lys Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Ser Leu Trp Gly Leu
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Ile Thr Glu Tyr Leu Leu Leu Phe Arg Val Ala Gly Leu Glu Ser Leu
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Gly Asp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile Arg Gly Trp Lys Leu Phe
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Tyr Asn Tyr Ala Leu Val Ile Phe Glu Met Thr Asn Leu Lys Asp Ile
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Gly Leu Tyr Asn Leu Arg Asn Ile Thr Arg Gly Ala Ile Arg Ile Glu
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485 490 495
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515 520 525
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565 570 575
Gln Tyr Ala Val Tyr Val Lys Ala Val Thr Leu Thr Met Val Glu Asn
580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
Ser Ser Gln Leu Ile Val Lys Trp Asn Pro Pro Thr Leu Pro Asn Gly
625 630 635 640
Asn Leu Ser Tyr Tyr Ile Val Arg Trp Gln Arg Gln Pro Gln Asp Gly
645 650 655
Tyr Leu Phe Arg His Asn Tyr Cys Ser Lys Asp Lys Ile Pro Ile Arg
660 665 670
Lys Tyr Ala Asp Gly Thr Ile Asp Val Glu Glu Val Thr Glu Asn Pro
675 680 685
Lys Thr Glu Val Cys Gly Gly Asp Lys Gly Pro Cys Cys Ala Cys Pro
690 695 700
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770 775 780
Asn Lys Glu Arg Thr Val Ile Ser Asn Leu Arg Pro Phe Thr Leu Tyr
785 790 795 800
Arg Ile Asp Ile His Ser Cys Asn His Glu Ala Glu Lys Leu Gly Cys
805 810 815
Ser Ala Ser Asn Phe Val Phe Ala Arg Thr Met Pro Ala Glu Gly Ala
820 825 830
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850 855 860
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885 890 895
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900 905 910
Gly Asn Gly Ser Trp Thr Asp Pro Val Phe Phe Tyr Val Pro Ala Lys
915 920 925
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930 935 940
Ile Leu Leu Ile Val Gly Gly Leu Val Ile Met Leu Tyr Val Phe His
945 950 955 960
Arg Lys Arg Asn Asn Ser Arg Leu Gly Asn Gly Val Leu Tyr Ala Ser
965 970 975
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980 985 990
Trp Glu Val Ala Arg Glu Lys Ile Thr Met Asn Arg Glu Leu Gly Gln
995 1000 1005
Gly Ser Phe Gly Met Val Tyr Glu Gly Val Ala Lys Gly Val Val
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Leu Trp Glu Ile Ala Thr Leu Ala Glu Gln Pro Tyr Gln Gly Leu
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Glu Arg His Ser Gly His Lys Ala Glu Asn Gly Pro Gly Val Leu
1325 1330 1335
Val Leu Arg Ala Ser Phe Asp Glu Arg Gln Pro Tyr Ala His Met
1340 1345 1350
Asn Gly Gly Arg Ala Asn Glu Arg Ala Leu Pro Leu Pro Gln Ser
1355 1360 1365
Ser Thr Cys
1370
<210> 80
<211> 4116
<212> DNA
<213> 褐家鼠
<220>
<223> 褐家鼠IGF-I受体
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aacgactatc agcagctgaa gcgcctggaa aactgcacgg tgatcgaggg cttcctccac 180
atcctgctca tctccaaggc cgaggactac cgaagctacc gcttccccaa gctcacagtc 240
atcaccgagt acttgctgct gtttcgagtg gccggcctcg agagcctggg agacctcttc 300
ccgaacctca cagtcatccg tggctggaaa ctcttctaca attacgcact ggtcatcttc 360
gagatgacca atctcaagga tattgggctt tataatctga ggaacattac tcggggggcc 420
atcaggattg agaaaaacgc tgacctctgt tacctctcca ccatagactg gtctctcatc 480
ttggatgcgg tgtccaataa ctacattgtg gggaacaagc ccccaaagga atgtggggac 540
ctgtgtccag ggaccttgga ggagaagccc atgtgtgaga agaccaccat caacaatgag 600
tacaactacc gctgctggac cacaaatcgc tgccagaaaa tgtgcccaag tgtgtgtggg 660
aagcgagcct gcaccgagaa caatgagtgc tgccacccgg agtgcctagg cagctgccac 720
acaccggacg acaacacaac ctgcgtggcc tgccgacact actactacaa aggcgtgtgc 780
gtgcctgcct gcccgcctgg cacctacagg ttcgagggct ggcgctgtgt ggaccgggat 840
ttctgcgcca acatccccaa cgccgagagc agtgactcag atggcttcgt catccacgat 900
ggcgagtgca tgcaggagtg tccatcaggc ttcatccgca acagcaccca gagcatgtac 960
tgtatcccct gtgaaggccc ctgccccaag gtctgcggcg atgaagaaaa gaaaacgaaa 1020
accatcgatt ctgtgacgtc tgcccagatg ctccaagggt gcaccatttt gaagggcaat 1080
ctgcttatta acatccggcg aggcaataac attgcctcgg aattggagaa cttcatgggg 1140
ctcatcgagg tggtgactgg ctacgtgaag atccgccatt cccatgcctt ggtctccttg 1200
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ttctatgtcc tggacaacca gaacttgcag cagctgtggg actggaacca ccggaacctg 1320
accgtcaggt cagggaaaat gtacttcgct ttcaatccca agctgtgtgt ctctgaaatt 1380
taccgaatgg aggaggtgac aggaacaaag ggacggcaga gcaaaggaga cataaacacc 1440
aggaacaacg gagagcgagc ttcctgtgaa agtgatgttc tccgtttcac ctccaccacc 1500
acctggaaga accgcatcat cataacgtgg caccggtacc ggccgccgga ctaccgggat 1560
ctcatcagtt tcacagtcta ctacaaggag gcacccttta aaaacgtcac ggaatacgac 1620
gggcaggatg cctgtggctc caacagctgg aacatggtgg acgtggacct gcctccgaac 1680
aaggaggggg agcctggcat tttgctgcat gggctgaagc cctggaccca gtatgcagtc 1740
tatgtcaagg ctgtgaccct caccatggtg gaaaacgacc acatccgtgg ggccaaaagt 1800
gaaatcttgt acattcgcac caacgcttca gttccttcca ttcctctaga tgtcctctcg 1860
gcatcaaact cctcctctca gctgatcgtg aagtggaacc ccccaactct gcccaatggt 1920
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tgtgcctgtc ctaaaaccga agctgagaag caggctgaga aggaggaggc tgagtaccgt 2160
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agagatgtcc tgcaggtggc taacaccacc atgtccagcc gaagcaggaa caccacggta 2280
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cagaataatc tagtcctgat tcctccgagc ttaagcaaga tgatccagat ggctggagag 3360
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<213> 小家鼠(Mus musculus)
<220>
<223> 小家鼠IGF-I受体
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Cys Gly Pro Gly Ile Asp Ile Arg Asn Asp Tyr Gln Gln Leu Lys Arg
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Leu Glu Asn Cys Thr Val Ile Glu Gly Phe Leu His Ile Leu Leu Ile
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Ser Lys Ala Glu Asp Tyr Arg Ser Tyr Arg Phe Pro Lys Leu Thr Val
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Ile Thr Glu Tyr Leu Leu Leu Phe Arg Val Ala Gly Leu Glu Ser Leu
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Gly Asp Leu Phe Pro Asn Leu Thr Val Ile Arg Gly Trp Lys Leu Phe
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Gly Leu Tyr Asn Leu Arg Asn Ile Thr Arg Gly Ala Ile Arg Ile Glu
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Lys Asn Ala Asp Leu Cys Tyr Leu Ser Thr Ile Asp Trp Ser Leu Ile
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Leu Asp Ala Val Ser Asn Asn Tyr Ile Val Gly Asn Lys Pro Pro Lys
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Thr Pro Asp Asp Asn Thr Thr Cys Val Ala Cys Arg His Tyr Tyr Tyr
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Arg Asn Asn Gly Glu Arg Ala Ser Cys Glu Ser Asp Val Leu Arg Phe
485 490 495
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500 505 510
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900 905 910
Gly Asn Gly Ser Trp Thr Asp Pro Val Phe Phe Tyr Val Pro Ala Lys
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<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<223> 小家鼠IGF-I受体
<400> 82
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Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly Gln
100 105 110
Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln
130 135 140
Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln
165 170 175
Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg
195 200 205
His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro
210 215 220
Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
225 230
<210> 92
<211> 705
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<223> IGF11-16轻链
<400> 92
atgaaactcc ttgctgagct cctggggctg ctgctgttct gctttttagg tgtgagatgt 60
gacatccaga tgaaccagtc tccatccagt ctgtctgcat ccctcggaga cacaattacc 120
atcacttgcc gtgccagtca gaacattaat ttttggttaa gctggtgcca gcagaaacca 180
ggaaatattc ctaaactatt gatctataag gcttccaact tgcacacagg cgtcccatca 240
aggtttagtg gcagtggatc tggaacagat ttcacattaa ccatcagcag tctgcagcct 300
gaagacattg ccacttacta ctgtctacag ggtcaaagtt atccgtacac gttcggaggg 360
gggaccaagc tggaaataaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 420
tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 480
cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 540
aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 600
ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 660
tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gttag 705
<210> 93
<211> 460
<212> PRT
<213> 小家鼠
<220>
<223> IGF11-16重链
<400> 93
Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Val Thr Asp
1 5 10 15
Val His Ser Gln Ile Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Pro Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Glu Thr Asn Pro Ser Asn Ser Val Thr Asn Tyr Asn
65 70 75 80
Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Arg Gly Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val
130 135 140
Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr
145 150 155 160
Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr
165 170 175
Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
180 185 190
Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser
195 200 205
Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala
210 215 220
Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys
225 230 235 240
Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe
245 250 255
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val
260 265 270
Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe
275 280 285
Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro
290 295 300
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro
305 310 315 320
Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val
325 330 335
Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr
340 345 350
Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys
355 360 365
Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp
370 375 380
Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Ala Gln Pro
385 390 395 400
Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser
405 410 415
Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala
420 425 430
Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His
435 440 445
His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys
450 455 460
<210> 94
<211> 1383
<212> DNA
<213> 小家鼠
<220>
<223> IGF11-16重链
<400> 94
atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag ttacagatgt ccactcccag 60
atccaactgc agcagcctgg ggctgagctt gtgaagcctg gggcttcagt gaagttgtcc 120
tgcaaggctc ccggctacac cttcaccagc tattggatgc actgggtgaa gcagaggcct 180
ggacaaggcc ttgagtggat tggagagact aatcctagca atagtgttac taactacaat 240
gagaagttca agagcaaggc cacactgact gtagacaaat cctccagcac agcctacatg 300
caactcagca gcctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtacaat agggagggga 360
cggggatttg cttactgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgcagc caaaacgaca 420
cccccatctg tctatccact ggcccctgga tctgctgccc aaactaactc catggtgacc 480
ctgggatgcc tggtcaaggg ctatttccct gagccagtga cagtgacctg gaactctgga 540
tccctgtcca gcggtgtgca caccttccca gctgtcctgc agtctgacct ctacactctg 600
agcagctcag tgactgtccc ctccagcacc tggcccagcg agaccgtcac ctgcaacgtt 660
gcccacccgg ccagcagcac caaggtggac aagaaaattg tgcccaggga ttgtggttgt 720
aagccttgca tatgtacagt cccagaagta tcatctgtct tcatcttccc cccaaagccc 780
aaggatgtgc tcaccattac tctgactcct aaggtcacgt gtgttgtggt agacatcagc 840
aaggatgatc ccgaggtcca gttcagctgg tttgtagatg atgtggaggt gcacacagct 900
cagacgcaac cccgggagga gcagttcaac agcactttcc gctcagtcag tgaacttccc 960
atcatgcacc aggactggct caatggcaag gagttcaaat gcagggtcaa cagtgcagct 1020
ttccctgccc ccatcgagaa aaccatctcc aaaaccaaag gcagaccgaa ggctccacag 1080
gtgtacacca ttccacctcc caaggagcag atggccaagg ataaagtcag tctgacctgc 1140
atgataacag acttcttccc tgaagacatt actgtggagt ggcagtggaa tgcgcagcca 1200
gcggagaact acaagaacac tcagcccatc atggacacag atggctctta cttcgtctac 1260
agcaagctca atgtgcagaa gagcaactgg gaggcaggaa atactttcac ctgctctgtg 1320
ttacatgagg gcctgcacaa ccaccatact gagaagagcc tctcccactc tcctggtaaa 1380
tga 1383
<210> 95
<211> 98
<212> PRT
<213> 人
<220>
<223> VH-1-46
<400> 95
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 96
<211> 98
<212> PRT
<213> 人
<220>
<223> VH-1-e
<400> 96
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 97
<211> 15
<212> PRT
<213> 人
<220>
<223> JH4
<400> 97
Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10 15
<210> 98
<211> 95
<212> PRT
<213> 人
<220>
<223> VK1-L5
<400> 98
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro
85 90 95
<210> 99
<211> 95
<212> PRT
<213> 人
<220>
<223> VK1-A20
<400> 99
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro
85 90 95
<210> 100
<211> 12
<212> PRT
<213> 人
<220>
<223> JK2
<400> 100
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10

Claims (34)

1.抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其包含：来自小鼠亲本抗体IGF11-16的重链和轻链的各互补性决定区(CDR)、以及来自人抗体的重链和轻链的各构架区(FR)，同时至少1个CDR相对于小鼠亲本抗体IGF11-16的对应的CDR包含至少1处的氨基酸残基的取代。
2.权利要求1所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其中，重链可变区的构架区1 (FR-H1)的第25位的氨基酸残基为脯氨酸。
3.权利要求1或2所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其包含：
作为重链可变区的CDR-1 (CDR-H1)序列的SEQ ID NO: 1的氨基酸序列、或SEQ ID NO:1的任意1处的氨基酸残基被取代而得的氨基酸序列；
作为重链可变区的CDR-2 (CDR-H2)序列的SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5的氨基酸序列、或SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5的任意1处、2处或3处的氨基酸残基被取代而得的氨基酸序列；
作为重链可变区的CDR-3 (CDR-H3)序列的SEQ ID NO: 7的氨基酸序列、或SEQ ID NO:7的任意1处或2处的氨基酸残基被取代而得的氨基酸序列；
作为轻链可变区的CDR-1 (CDR-L1)序列的SEQ ID NO: 9的氨基酸序列、或SEQ ID NO:9的任意1处或2处的氨基酸残基被取代而得的氨基酸序列；
作为轻链可变区的CDR-2 (CDR-L2)序列的SEQ ID NO: 11的氨基酸序列、或SEQ IDNO: 11的任意1处的氨基酸残基被取代而得的氨基酸序列；以及
作为轻链可变区的CDR-3 (CDR-L3)序列的SEQ ID NO: 13的氨基酸序列、或SEQ IDNO: 13的任意1处或2处的氨基酸残基被取代而得的氨基酸序列。
4.权利要求1或2所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其包含：
作为重链可变区的CDR-1 (CDR-H1)序列的、与SEQ ID NO: 1具有80%以上的同源性的氨基酸序列；
作为重链可变区的CDR-2 (CDR-H2)序列的、与SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 5具有82%以上的同源性的氨基酸序列；
作为重链可变区的CDR-3 (CDR-H3)序列的、与SEQ ID NO: 7具有75%以上的同源性的氨基酸序列；
作为轻链可变区的CDR-1 (CDR-L1)序列的、与SEQ ID NO: 9具有81%以上的同源性的氨基酸序列；
作为轻链可变区的CDR-2 (CDR-L2)序列的、与SEQ ID NO: 11具有85%以上的同源性的氨基酸序列；以及
作为轻链可变区的CDR-3 (CDR-L3)序列的、与SEQ ID NO: 13具有77%以上的同源性的氨基酸序列。
5.权利要求1或2所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其包含：
作为重链可变区的CDR-1 (CDR-H1)序列的SEQ ID NO: 1的第3位的Trp被维持或被取代成类似的氨基酸残基而得的氨基酸序列，其中,除该第3位的氨基酸残基以外的任意1处的氨基酸残基被取代，或者与SEQ ID NO: 1具有80%以上的同源性；
作为重链可变区的CDR-2 (CDR-H2)序列的下述氨基酸序列：
SEQ ID NO: 3的第1位的Glu和第3位的Asn分别被维持或被取代成类似的氨基酸残基、同时第6位的Asn被维持或被取代成Ser或Gln而得的氨基酸序列，其中，除该第1位、第3位和第6位的氨基酸残基以外的任意1处、2处或3处的氨基酸残基被取代，或者与SEQ ID NO: 3具有82%以上的同源性，或者
SEQ ID NO: 5的第1位的Glu和第3位的Asn分别被维持或被取代成类似的氨基酸残基、同时第6位的Ser被维持或被取代成Asn或Gln而得的氨基酸序列，其中，除该第1位、第3位和第6位的氨基酸残基以外的任意1处、2处或3处的氨基酸残基被取代，或者与SEQ ID NO: 5具有82%以上的同源性；
作为重链可变区的CDR-3 (CDR-H3)序列的SEQ ID NO: 7的第4位的Arg被维持或被取代成类似的氨基酸残基而得的氨基酸序列，其中，除该第4位的氨基酸残基以外的任意1处或2处的氨基酸残基被取代，或者与SEQ ID NO: 7具有75%以上的同源性；
作为轻链可变区的CDR-1 (CDR-L1)序列的SEQ ID NO: 9的第9位的Trp被维持或被取代成类似的氨基酸残基而得的氨基酸序列，其中，除该第9位的氨基酸残基以外的任意1处或2处的氨基酸残基被取代，或者与SEQ ID NO: 9具有81%以上的同源性；
作为轻链可变区的CDR-2 (CDR-L2)序列的SEQ ID NO: 11的任意1处的氨基酸残基被取代、或与SEQ ID NO: 11具有85%以上的同源性的氨基酸序列；以及
作为轻链可变区的CDR-3 (CDR-L3)序列的SEQ ID NO: 13的任意1处或2处的氨基酸残基被取代、或与SEQ ID NO: 13具有77%以上的同源性的氨基酸序列。
6.权利要求1～5中任一项所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其与具有SEQ ID NO: 71的氨基酸序列的人IGF-1受体的胞外结构域结合。
7.权利要求1～6中任一项所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其包含：
作为重链可变区的氨基酸序列，即SEQ ID NO: 43、47、49、53、55或59的氨基酸序列、在SEQ ID NO: 43、47、49、53、55或59的氨基酸序列中有1处或数处的氨基酸残基被取代、缺失或添加而得的氨基酸序列、或与SEQ ID NO: 43、47、49、53、55或59具有90%以上的同源性的氨基酸序列；以及
作为轻链可变区的氨基酸序列，即SEQ ID NO: 65、67或69的氨基酸序列、在SEQ IDNO: 65、67或69的氨基酸序列中有1处或数处的氨基酸残基被取代、缺失或添加而得的氨基酸序列、或与SEQ ID NO: 65、67或69具有90%以上的同源性的氨基酸序列。
8.权利要求1～7中任一项所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其包含作为重链和/或轻链的恒定区的人免疫球蛋白的任何类的重链和/或轻链的恒定区。
9.权利要求1～8中任一项所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其中，重链恒定区为人IgG4类的重链恒定区或其1～10处的氨基酸被取代而得的恒定区。
10.权利要求1～8中任一项所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其中，重链恒定区为人IgG1类的重链恒定区或其1～10处的氨基酸被取代而得的恒定区。
11.权利要求1～10中任一项所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其以平衡解离常数(KD)为1×10-7M以下的亲和性与IGF-1受体结合。
12.权利要求1～11中任一项所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其具有IGF-1受体信号激活能力。
13.权利要求1～12中任一项所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其在成肌细胞增殖试验中具有增殖活性。
14.权利要求1～13中任一项所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其在基于BIACORE的与重组可溶性IGF-1受体的结合性试验中，具有与小鼠亲本抗体IGF11-16同等以上的结合亲和性。
15.权利要求1～14中任一项所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其在正常哺乳动物中可诱导肌肉量增加作用，但不会诱导低血糖症状。
16.权利要求1～15中任一项所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其在摘除了下垂体的模型动物中可诱导生长板软骨伸长作用，但不会诱导低血糖症状。
17.权利要求1～16中任一项所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其在以诱导脊椎动物的肌肉量和/或身长的增加的剂量对该脊椎动物给药的情况下，不会降低该脊椎动物的血糖值。
18.权利要求1～16中任一项所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其即使在相对于诱导脊椎动物的肌肉量和/或身长的增加的有效剂量为10倍以上的血中暴露量下，也不会降低该脊椎动物的血糖值。
19.权利要求1～18中任一项所述的人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其具有IGF-1受体信号激活抑制能力。
20.权利要求1～18中任一项所述的人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其在成肌细胞增殖试验中抑制可激活IGF-1受体的配体即IGF-1、IGF-2和胰岛素的至少一者的增殖活性。
21.权利要求1～20中任一项所述的人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其在癌细胞增殖试验中具有抑制细胞增殖的活性。
22.权利要求1～21中任一项所述的抗IGF-I受体抗体或其片段、或它们的衍生物，其中，该抗IGF-I受体抗体或其片段、或它们的衍生物具有下述1)～4)的至少一个特征：
1) 抑制由IGF-I受体激活配体引起的来自脊椎动物的细胞的增殖；
2) 抑制脊椎动物中的由IGF-I受体激活配体引起的细胞增殖性疾病中的细胞增殖；
3) 在抑制由IGF-I受体激活配体引起的来自脊椎动物的细胞的增殖的剂量下，对分化肌细胞中的葡萄糖摄取没有影响；
4) 在抑制脊椎动物中的由IGF-I受体激活配体引起的细胞增殖性疾病中的细胞增殖的剂量下，不会使该脊椎动物的血糖值发生变化。
23.权利要求1～22中任一项所述的人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其在携带癌症的模型动物中可诱导癌细胞增殖抑制作用，但对血糖值没有影响。
24.权利要求23所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物，其在携带癌症的模型动物中，即使在相对于可诱导癌细胞增殖抑制作用的有效剂量为10倍以上的血中暴露量下，对该模型动物的血糖值也没有影响。
25.核酸分子，其包含编码权利要求1～24中任一项所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物的多核苷酸序列。
26.克隆载体或表达载体，其包含至少一个权利要求25所述的核酸分子。
27.重组体细胞，其是在宿主细胞中导入有权利要求26所述的载体而得的。
28.制造权利要求1～24中任一项所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物的方法，该方法包括以下工序：培养权利要求27所述的重组体细胞，纯化由上述重组体细胞产生的该抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物。
29.药物组合物，其包含权利要求1～24中任一项所述的抗IGF-1受体人源化抗体或其片段、或它们的衍生物、权利要求25所述的核酸分子、权利要求26所述的载体或权利要求27所述的重组体细胞作为有效成分。
30.权利要求29所述的药物组合物，其用于治疗肌肉萎缩性疾病或侏儒症。
31.权利要求30所述的药物组合物，其中，肌肉萎缩性疾病为废用性肌肉萎缩、肌肉减少症或恶病质。
32.权利要求28所述的药物组合物，其中，侏儒症为Laron型侏儒症或生长激素抵抗性侏儒症。
33.权利要求29所述的药物组合物，其用于治疗与IGF-1受体相关的疾病。
34.权利要求33所述的药物组合物，其中，与IGF-I受体相关的疾病为选自肝癌、成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨肉瘤、儿童癌症、肢端肥大症、卵巢癌、胰腺癌、良性前列腺肥大、乳腺癌、前列腺癌、骨癌、肺癌、结肠直肠癌、颈部癌、滑膜肉瘤、膀胱癌、胃癌、维尔姆斯氏瘤、与转移性类癌和血管活性肠肽分泌肿瘤相关的腹泻、血管活性肠肽瘤、Verner-Morrison综合征、Beckwith-Wiedemann综合征、肾癌、肾细胞癌、移行上皮细胞癌、尤文氏肉瘤、白血病、急性成淋巴细胞白血病、脑肿瘤、胶质母细胞瘤、非胶质母细胞瘤性脑肿瘤、脑脊膜瘤、垂体腺瘤、前庭神经鞘瘤、原始神经外胚层肿瘤、成神经管细胞瘤、星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、脉络丛乳头状瘤、巨人症、干癣、动脉粥样硬化、血管平滑肌再狭窄、不适当的微血管生长、糖尿病性视网膜病变、格雷夫斯病、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、重症肌无力、自身免疫性甲状腺炎、桥本甲状腺炎、甲状腺眼病、甲状腺功能亢进以及白塞病的疾病。
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