WO2021246413A1 - 抗ｉｇｆ－１受容体ヒト化抗体 - Google Patents

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広志 江口
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Definitions

  • the present invention relates to an anti-IGF-1 receptor humanized antibody. Specifically, it relates to an anti-IGF-1 receptor humanized antibody that specifically binds to the IGF-1 receptor.
  • IGF-1 is an insulin-like growth factor that is secreted mainly from the liver and acts on the IGF-1 receptor through activation of GH receptors by growth hormone (GH) secreted from the pituitary gland. Therefore, various physiological functions are expressed in various organs. From this, IGF-1 is expected to be treated for various diseases. Since IGF-1 has a high homology of about 40% as compared with the amino acid sequence of proinsulin, it may also bind to the insulin receptor and exert an insulin-like action. In addition, since the IGF-1 receptor has a high homology of about 60% compared to the amino acid sequence of the insulin receptor, both receptors also exert a physiological effect by forming a heterodimer. Demonstrate. Insulin is used therapeutically as a hypoglycemic agent because it exerts a strong hypoglycemic effect by acting on the insulin receptor.
  • GH growth hormone
  • IGF-1 receptor The IGF-1 receptor is composed of ⁇ and ⁇ chains and contains six extracellular domains, transmembrane domains, and intracellular domains of L1, CR, L2, Fn1, Fn2, and Fn3. It is a penetrating protein.
  • the intracellular domain of the IGF-1 receptor has a tyrosine kinase.
  • the extracellular domain is involved in the activation of intracellular tyrosine kinases associated with changes in the conformation of IGF-1 when it binds to the IGF-1 receptor.
  • the IGF-1 receptor forms a homodimer complex (homotype), and when IGF-1 binds, it signals by activating the receptor kinase. It also forms a heterodimer complex (heterotype) with the insulin receptor, and when insulin or IGF-1 binds, it signals by activating the receptor kinase.
  • IGF-1 Physiological action of IGF-1 IGF-1 has been clarified to have a growth promoting action such as height and weight gain, and an insulin-like metabolic action such as glucose metabolism promoting action and blood glucose lowering action.
  • Mecasermin a human recombinant IGF-1, has been shown to improve symptoms of insulin receptor abnormalities such as hyperglycemia, hyperinsulinemia, acanthosis nigricans and hirsutism. It has also been found to improve growth failure in growth hormone-resistant short stature (Non-Patent Document 1).
  • IGF-1 is a major factor in promoting growth (Non-Patent Document 2 and Non-Patent Document 3).
  • mecasermin a human recombinant IGF-1
  • IGF-1 is known to enhance the DNA synthesis ability of human chondrocytes.
  • administration of IGF-1 increases the body weight of pituitary-excised rats and prolongs the length of the femoral bone.
  • IGF-1 Muscle mass-increasing action of IGF-1
  • the enhancement of cell proliferation activity mediated by IGF-1 requires continuous activation of the IGF-1 receptor. Muscle mass is increased in animals that overexpress the IGF-1 receptor.
  • continuous administration of IGF-1 / IGFBP3 enhances grip strength in patients with proximal femoral fractures and improves their ability to stand up from a sitting position without assistance. It is known that the IGF-1 concentration in the muscles of aged humans and mice is lower than that of young mice, but in aged mice in which IGF-1 is forcibly expressed in a muscle tissue-specific manner, it is wild. Compared with the type mouse, the muscle mass was improved (Non-Patent Document 4).
  • Anamorelin an agonist of the predecessor ghrelin receptor that increases muscle mass, increased lean body mass in a clinical trial of disuse muscular atrophy, Kakexia.
  • Myostatin is a negative regulator of skeletal muscle formation that acts on activin receptor II (ActRII) and inhibits Akt / mTOR.
  • ActRII activin receptor II
  • the anti-myostatin antibody LY2495655 increases muscle mass in patients and the elderly who have undergone total hip arthroplasty.
  • Vimaglumab an anti-ActRII antibody, also increases muscle mass in patients with neuromuscular disease.
  • IGF-1 As an insulin-like action of IGF-1, a hypoglycemic action is known. IGF-1 enhances glucose uptake in rat muscle-derived cells. In addition, administration of IGF-1 lowers blood glucose levels in rats. It has been reported that the hypoglycemic effect of IGF-1 causes hypoglycemic symptoms as a clinical side effect. Furthermore, since IGF-1 causes hypoglycemic symptoms when administered to humans, it is necessary to administer appropriate doses in order from the lowest dose at the start of treatment and observe various clinical findings including blood glucose level after administration. It becomes.
  • IGF-1 exerts a hypoglycemic effect through enhancement of Akt phosphorylation and the like. Active mutants of Akt enhance glucose uptake in 3T3-L1 cells. On the other hand, the blood glucose level of the mice lacking Akt2 increased. In addition, in rat muscle-derived cells, Akt inhibitors inhibit insulin-stimulated glucose uptake. Furthermore, IGF-1 is known to activate insulin receptors involved in hypoglycemic action. From these facts, it is considered that the hypoglycemic effect of IGF-1 involves excessive activation of Akt and activation of insulin receptor.
  • IGF-1 Short half-life of IGF-1
  • mecasermin a human recombinant IGF-1
  • IGFBP3 The free form of IGF-1 exhibits bioactivity. Binding to IGFBP3 maintains the blood half-life of IGF-1 from about 10 hours to 16 hours.
  • IPLEX which is a combination drug of IGF-1 and IGFBP3, has a half-life in blood of about 21 to 26 hours, which is longer than that of IGF-1, and is a drug that can be administered once a day.
  • IPLEX has withdrawn from the market.
  • PEGylated IGF-1 which has improved the dynamics of IGF-1, has also been attempted to be developed, but no drug has been used for treatment.
  • IGF-1 acts on various organs and its physiological functions are diverse. For example, IGF-1 has been reported to have a neuroprotective effect on mitochondrial protection and antioxidant activity in the central nervous system through activation of the IGF-1 receptor. IGF-1 promotes the formation of neurites after injury. IGF-1 is also believed to be useful in the treatment of liver cirrhosis. Cirrhosis is a disease that progresses from liver disorder or chronic liver disease and is accompanied by liver fibrosis. In liver cirrhosis model animals, administration of IGF-1 suppressed liver fibrosis. Furthermore, IGF-1 is known to be involved in the development and function of the kidney. In renal mesangial cells, IGF-1 has a protective effect against oxidative stress and apoptosis due to glycotoxicity. IGF-1 is expected as a therapeutic agent for nephropathy.
  • IGF-1 Diseases expected to be improved by administration of IGF-1 include sarcopenia, disused muscular atrophy, caquexia, short stature, laronosis, liver cirrhosis, liver fibrosis, aging, intrauterine fetal growth retardation (IUGR), Neurological disorders, stroke, spinal cord injury, cardiovascular protection, diabetes, insulin resistance, metabolic syndrome, nephropathy, osteoporosis, sarcopenia, wound healing, muscular tonic dystrophy, AIDS muscle atrophy, fat associated with HIV There are redistribution syndrome, burns, Crohn's disease, Werner's syndrome, X-chain complex immunodeficiency, hearing loss, neurological appetite and premature infant retinopathy. As described above, IGF-1 is expected as a therapeutic agent for various diseases due to its various physiological actions. However, the side effects of lowering blood glucose and multiple administrations with a short half-life are challenges for clinical use.
  • Anti-IGF-1 receptor agonist antibody antibody preparations generally have a long half-life and show efficacy when administered once or twice a month.
  • Anti-IGF-1 receptor agonist antibodies have been reported to have some receptor-activating effects in short-term treatment in vitro.
  • antibody 3B7 and antibody 2D1 promoted DNA synthesis in recombinant IGF-1 receptor-expressing cells cultured for 5 hours in vitro (Non-Patent Document 5).
  • anti-IGF-1 receptor antagonist antagonists 11A1, 11A4, 11A11, and 24-57 which have antiproliferative activity in cancer cell lines, are extremely weak in vitro but phosphorylate tyrosine of the IGF-1 receptor. Increased (Non-Patent Document 6).
  • Non-Patent Document 7 antibodies 16-13, 17-69, 24-57, 24-60, and 24-31 have been shown to have an effect of enhancing cellular DNA synthesis and glucose uptake in a short period of time in vitro. These antibodies may have a hypoglycemic effect (Non-Patent Document 7).
  • Non-Patent Documents 5 to 5 It cannot be an index of an agonist antibody having cell proliferation activity.
  • Non-Patent Documents 5 to 8 Furthermore, there were no reports of antibodies showing agonist activity against the IGF-1 receptor in vivo. In addition, since IGF-1 exerts both hypoglycemic action and cell proliferation action, it is necessary to avoid the hypoglycemic action in order to administer the anti-IGF-1 receptor agonist antibody as a therapeutic agent to humans. However, there have been no reports of such anti-IGF-1 receptor agonist antibodies so far.
  • the antibody has a large molecular weight and low tissue transferability, and the intracerebral transferability is about 0.1% and the muscle tissue transferability is about 2%. Therefore, in order to exert an action in a tissue having low transferability of the antibody, an antibody showing sufficient pharmacological activity in an extremely low concentration range (pM order) is required.
  • pM order pharmacological activity in an extremely low concentration range
  • Anti-IGF-1 receptor monoclonal mouse antibody We have succeeded in producing IGF11-16. Furthermore, it has been confirmed that the obtained monoclonal mouse antibody induces a muscle mass increasing action and a growth plate stretching action in vivo without causing hypoglycemic symptoms (Patent Document 1).
  • Anti-IGF-1 receptor antagonist antibody An antibody that binds to the IGF-1 receptor can be applied to the treatment of malignant tumors, etc. by utilizing the antagonistic action that inhibits the binding between IGF-1 and the IGF-1 receptor. Attempted.
  • the existing anti-IGF-1 receptor antagonist antibody not only has many side effects such as hyperglycemia in monotherapy (Non-Patent Document 9), but also increases the incidence of hyperglycemia when used in combination with other anticancer agents. (Non-Patent Document 10), its application to treatment is considered to be limited.
  • Teprotumumab has been approved for the indication of ophthalmopathy in hyperthyroidism (Non-Patent Document 11).
  • Musaro, A., et al. Localized Igf-1 transgene expression sustains hypertrophy and regeneration in senescent skeletal muscle, Nature Genetics, 2001, Vol.27, No.2, pp.195-200 Xiong, L., et al., Growth-stimulatory monoclonal antibody antibodies against human insulin-like growth factor I receptor. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992. 89 (12): p. 5356-60. Runnels, H.A., et al., Human monoclonal antibody to the insulin-like growth factor 1 receptor inhibitor receptor activation and tumor growth in precursor clinical studies. Adv Ther, 2010. 27 (7): p.
  • Soos, MA, et al. A panel of monoclonal antibody for the type I insulin-like growth factor receptor. Epitope mapping, effects on ligand binding, and biological activity. J Biol Chem, 1992. 267 (18): p -63.
  • Kato, H., et al. Role of tyrosine kinase activity in signal transduction by the insulin-like growth factor-I (IGF-I) receptor.
  • the present invention is an anti-IGF-1 receptor humanized antibody or an anti-IGF-1 receptor humanized antibody thereof having a specificity equal to or higher than that of the previously reported anti-IGF-1 receptor mouse antibody IGF11-16 (Patent Document 1) and binding affinity or activity.
  • Patent Document 1 One of the purposes thereof is to provide a fragment, a derivative thereof, or a method for producing them.
  • the specific object of the present invention is not limited to these, but is, for example, specificity equal to or higher than that of the previously reported anti-IGF-1 receptor mouse antibody IGF11-16 (Patent Document 1), and binding.
  • Patent Document 1 In order to obtain humanized antibodies having affinity or activity, (1) provision of amino acids essential for the design of human framework, (2) CDR sequence which is an antigen binding site (identified by the Kabat method in the present invention). Examples thereof include provision of amino acid sites essential for maintaining activity, (3) provision of amino acid substitutions for reducing immunogenicity, and (4) provision of amino acid substitutions for avoiding the risk of deamidation.
  • an anti-IGF-1 receptor humanized antibody capable of increasing muscle mass via the human IGF-1 receptor without inducing hypoglycemic symptoms.
  • an anti-IGF-1 receptor that can be administered to a human for the purpose of ameliorating or treating a pathological condition or disease associated with an IGF-1 receptor signal, such as sarcopenia, disused muscular atrophy, or Kakexia.
  • Humanized antibodies can be obtained.
  • the present invention relates to the following.
  • CDRs heavy chain and light chain complementarity determining regions
  • FR heavy chain and light chain framework regions
  • CDR-1 CDR-H1
  • CDR-2 CDR-H2
  • amino acid sequence of the heavy chain variable region amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 amino acid sequence in which any one or two amino acid residues of SEQ ID NO: 7 are substituted.
  • CDR-1 CDR-L1 sequence of the light chain variable region
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 amino acid sequence in which any one or two amino acid residues of SEQ ID NO: 9 are substituted
  • CDR-2 CDR-L2 sequence of the light chain variable region
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 or the amino acid sequence in which any one of the amino acid residues of SEQ ID NO: 11 is substituted.
  • a term comprising, as the CDR-3 (CDR-L3) sequence of the light chain variable region, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 or the amino acid sequence in which any one or two amino acid residues of SEQ ID NO: 13 are substituted.
  • the anti-IGF-1 receptor humanized antibody or fragment thereof according to [1] or [2], or a derivative thereof.
  • CDR-2 (CDR-H2) sequence of the heavy chain variable region an amino acid sequence having 82% or more homology with SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5
  • CDR-3 (CDR-H3) sequence of the heavy chain variable region an amino acid sequence having 75% or more homology with SEQ ID NO: 7
  • As the CDR-1 (CDR-L1) sequence of the light chain variable region an amino acid sequence having 81% or more homology with SEQ ID NO: 9
  • CDR-2 (CDR-L2) sequence of the light chain variable region an amino acid sequence having 85% or more homology with SEQ ID NO: 11.
  • CDR-1 (CDR-H1) sequence of the heavy chain variable region the amino acid sequence in which the Trp at position 3 of SEQ ID NO: 1 is maintained or replaced with a similar amino acid residue is the 3
  • An amino acid sequence in which any one amino acid residue other than the amino acid residue at the position is substituted or has 80% or more homology with SEQ ID NO: 1.
  • CDR-2 CDR-H2 sequence of the heavy chain variable region
  • CDR-H2 CDR-2 sequence of the heavy chain variable region
  • the amino acid residues at any one, two, or three positions other than the amino acid residues at the 1st, 3rd, and 6th positions are substituted, or the amino acid residue is 82% or more homologous with SEQ ID NO: 3.
  • Amino acid sequence having sex or An amino acid sequence in which Glu at position 1 and Asn at position 3 of SEQ ID NO: 5 are maintained or replaced with similar amino acid residues, and Ser at position 6 is maintained or replaced with Asn or Gln, respectively.
  • the amino acid residues at any one, two, or three positions other than the amino acid residues at the 1, 3, and 6 positions are substituted, or the amino acid residue is 82% or more homologous with SEQ ID NO: 5.
  • Amino acid sequence with sex As the CDR-3 (CDR-H3) sequence of the heavy chain variable region, the amino acid sequence in which Arg at the 4-position of SEQ ID NO: 7 is maintained or substituted with a similar amino acid residue is the amino acid at the 4-position.
  • the amino acid sequence in which the Trp at position 9 of SEQ ID NO: 9 is maintained or substituted with a similar amino acid residue as the CDR-1 (CDR-L1) sequence of the light chain variable region is the amino acid at position 9.
  • CDR-3 (CDR-L3) sequence of the light chain variable region an amino acid residue at any one or two sites of SEQ ID NO: 13 is substituted, or an amino acid having 77% or more homology with SEQ ID NO: 13
  • the heavy chain variable region one or several places in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43, 47, 49, 53, 55, or 59, or the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43, 47, 49, 53, 55, or 59.
  • the anti-IGF-1 receptor humanized antibody according to any one of Items [1] to [6], which comprises an amino acid sequence having 90% or more homology with SEQ ID NO: 65, 67, or 69. Or a fragment thereof, or a derivative thereof. [8] Any one of items [1] to [7], wherein the constant region of the heavy chain and / or the light chain includes the constant region of the heavy chain and / or the light chain of any class of human immunoglobulin.
  • the anti-IGF-1 receptor humanized antibody or fragment thereof according to the above, or a derivative thereof.
  • KD equilibrium dissociation constant
  • the anti-IGF-1 receptor according to any one of Items [1] to [15], which can induce growth plate cartilage elongation action without inducing hypoglycemic symptoms in a pituitary excision model animal. Humanized antibodies or fragments thereof, or derivatives thereof. [17] Any of the items [1] to [16], which does not lower the blood glucose level of the vertebrate when administered to the vertebrate at a dose that induces an increase in muscle mass and / or length of the vertebrate.
  • the anti-IGF-1 receptor humanized antibody or fragment thereof according to paragraph 1, or a derivative thereof.
  • the humanized antibody or fragment thereof according to any one of the above, or a derivative thereof.
  • a pharmaceutical composition comprising the recombinant cell according to item [27] as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition according to item [29] which is used for the treatment of amyotrophic disease or short stature.
  • the pharmaceutical composition according to item [30] wherein the amyotrophic disease is disuse muscular atrophy, sarcopenia, or cachexia.
  • the pharmaceutical composition according to item [28], wherein the short stature is Laron-type short stature or growth hormone-resistant short stature.
  • the pharmaceutical composition according to item [29] which is used for treating a disease associated with an IGF-1 receptor.
  • IGF-I receptor-related diseases include liver cancer, neuroblastoma, rhabdomyomyoma, osteosarcoma, pediatric cancer, apical giant disease, ovarian cancer, pancreatic cancer, and benign prostate enlargement.
  • Antibodies of the invention or fragments thereof, or derivatives thereof, can be used for the treatment or prevention of diseases acting via the human IGF-1 receptor by binding to the human IGF-1 receptor, anti-IGF-.
  • One receptor humanized antibody can be obtained.
  • 1A to 1F are graphs showing the human myoblast proliferation activity of various humanized antibodies of the present invention in comparison with the mouse parent antibody IGF11-16. Same as above. Same as above. Same as above. Same as above. Same as above. Same as above. Same as above. Same as above. Same as above. Same as above. Same as above.
  • FIG. 2 shows the reactivity of the humanized antibodies hIGF13_PS and hIGF25_PS of the present invention against IGF-1R of each animal species, measured by ELISA using HEK293T cells expressing IGF-1R of each animal species, in a human mouse chimera. It is a graph which shows the comparison with the antibody IGF11-16.
  • FIG. 3A is a graph showing changes in blood glucose level when the humanized antibody hIGF13_PS of the present invention is administered to a guinea pig.
  • FIG. 3B is a graph showing changes in blood glucose level when the humanized antibody hIGF25_PS of the present invention is administered to a guinea pig.
  • FIG. 4 is a graph showing changes in blood concentration when the humanized antibodies hIGF13_PS and hIGF25_PS of the present invention are administered to guinea pigs in comparison with those when the mouse parent antibody IGF11-16 is administered.
  • FIG. 5 shows changes in the mass of the extensor digitorum longus muscle after 2 weeks when the humanized antibody hIGF13_PS of the present invention was intravenously administered to a normal guinea pig by continuous subcutaneous administration of IGF-1 and the mouse parent antibody IGF11-16. It is a graph which shows the comparison with the single intravenous administration of.
  • FIG. 6 shows changes in the epiphyseal line thickness of the proximal tibia after 2 weeks when the humanized antibody hIGF13_PS of the present invention was intravenously administered to a pituitary gland excised guinea pig by continuous subcutaneous administration of IGF-1. It is a graph which shows the comparison with the subcutaneous continuous administration of the GH preparation.
  • FIG. 7 is a graph showing changes in blood glucose level when the humanized antibody hIGF13_PS of the present invention is administered to cynomolgus monkeys in comparison with the time of administration of IGF-1.
  • FIG. 8 is a graph showing changes in blood concentration when the humanized antibody hIGF13_PS of the present invention is administered to cynomolgus monkeys.
  • FIG. 9 is a graph showing the concentration-dependent effect of the mouse parent antibody IGF11-16 on HepG2 cell proliferation.
  • M indicating the concentration is a unit synonymous with "mol / L” indicating the molar concentration.
  • the present invention is an anti-IGF-1 receptor humanized antibody that specifically binds to the IGF-1 receptor.
  • the antibody of the present invention has an action of increasing muscle mass via the human IGF-1 receptor without inducing hypoglycemic symptoms. This makes it possible to ameliorate or treat conditions or diseases involving IGF-1 receptor signals such as sarcopenia, disuse muscular atrophy, and Kakexia. Further, the antibody of the present invention is a humanized antibody that ensures low immunogenicity and physical stability.
  • IGF insulin-like Growth Factor
  • IGF-1 and IGF-2 are present. IGF-1 and IGF-2 bind to the IGF-1 receptor (Insulin-like Growth Factor-I Receptor) described later, and signal intracellular cell division and metabolism. It is an in vivo ligand that has an agonistic activity to enter. IGF-1 and IGF-2 are also known to weakly and cross-link to the insulin receptor (INSR), which is structurally similar to the IGF-1 receptor. In the present specification, IGF-1 whose physiological function is better known is mainly dealt with, but when examining the action or disease through the binding between the IGF-1 receptor and the ligand, IGF is used. The effects of both -1 and IGF-2 may be included.
  • IGF-1 and IGF-2 may be included.
  • IGF-1 is also called somatomedin C and is a hormone of a single polypeptide consisting of 70 amino acids.
  • the sequence of human IGF-1 can be obtained by referring to NCBI Reference Sequence No .: NP_000609, or EMBL-EBI UniProt KB-Axon No. P05019 and the like.
  • the amino acid sequence of mature human IGF-1 is shown in SEQ ID NO: 83, and an example of the corresponding nucleic acid base sequence is shown in SEQ ID NO: 84.
  • This 70-amino acid sequence is conserved in many species. In the present invention, when only "IGF-1" is described, it means an IGF-1 protein having hormonal activity unless otherwise specified.
  • IGF-1 is produced in various cells in the living body including liver cells, and is also present in blood and other body fluids. Therefore, the natural form of IGF-1 can be obtained by purifying from the body fluid of an animal or a culture obtained by culturing primary cultured cells or cell lines separated from the animal. In addition, since IGF-1 is induced to be produced in cells by growth hormone, body fluids of animals to which growth hormone was administered, primary cultured cells separated from animals, established cells, etc. were cultured in the presence of growth hormone. It can also be obtained by purifying IGF-1 from the culture.
  • a nucleic acid molecule encoding the amino acid sequence of IGF-1 was incorporated into an expression vector and introduced into a host of prokaryotes such as Escherichia coli and eukaryotic cells such as yeast, insect cells or cultured cells derived from mammals. It is also possible to produce IGF-1 using recombinant cells, transgenic animals into which the IGF-1 gene has been introduced, transgenic plants, and the like.
  • human IGF-1 is a research reagent (Enzo Life Sciences, catalog: ADI-908-059-0100; Abnova, catalog: P3452, etc.), pharmaceuticals (Somazon (registered trademark) , mecasermin, INCRELEX (registered trademark), etc.).
  • IGF-1 used is 1 international unit / microgram of activity on the IGF-1 standard material of the NIBSC code: 91/554 of the World Health Organization's National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC).
  • the specific activity can be evaluated by comparing with.
  • IGF-1 in the present invention shall be treated as having a specific activity equivalent to that of IGF-1 of the NIBSC code: 91/554.
  • IGF-1 receptor refers to an insulin-like Growth Factor-I Receptor.
  • IGF-1 receptor means an IGF-1 receptor protein unless otherwise specified.
  • the IGF-1 receptor is a protein with a structure in which two subunits consisting of an ⁇ chain and a ⁇ chain are associated.
  • SEQ ID NO: 71 the portion of the amino acid sequence consisting of the amino acid sequences at positions 31 to 735 corresponds to the ⁇ chain, and the ⁇ chain is the sequence after position 740. Corresponds to.
  • the ⁇ chain of the IGF-1 receptor has a binding portion of IGF-1, and the ⁇ chain has a transmembrane structure and functions to transmit a signal into the cell.
  • the ⁇ chain of the IGF-1 receptor is divided into L1, CR, L2, FnIII-1 and FnIII-2a / ID / FnIII-2b domains.
  • the portion from position 31 to 179 is the L1 domain
  • the portion from position 180 to position 328 is the CR domain
  • the portion from position 329 to position 491 is the L2 domain.
  • the portion from position 492 to position 607 corresponds to the FnIII-1 domain, and the portion from position 608 to position 735 corresponds to the FnIII-2a / ID / FnIII-2b domain.
  • the amino acid sequence of the human IGF-1 receptor can be referred to from UniProtKB-Axon No. P08069 of EMBL-EBI, etc., and is also shown in SEQ ID NO: 71 of the sequence listing.
  • the IGF-1 receptor is expressed in a wide range of tissues and cells in the living body, and is stimulated by IGF-1 such as induction of cell proliferation and activation of intracellular signals.
  • myoblasts can use the IGF-1 receptor-mediated action of IGF-1 for evaluation using the cell proliferation activity as an index. This makes myoblasts useful for analyzing the action of antibodies that bind to the IGF-1 receptor.
  • a recombinant in which a nucleic acid molecule encoding the amino acid sequence of the IGF-1 receptor of humans and other vertebrates is incorporated into an expression vector and introduced into a host of eukaryotic cells such as insect cells or cultured cells derived from mammals.
  • the IGF-1 receptor-expressing cells can be used for analysis of antibody binding and examination of intracellular signal transduction.
  • mouse parent antibody IGF11-16 The mouse parent antibody IGF11-16 is disclosed in Patent Document 1.
  • the amino acid sequence of CDR-H1 of IGF11-16 is SEQ ID NO: 85
  • the nucleic acid sequence of CDR-H2 is SEQ ID NO: 86
  • the amino acid sequence of CDR-H3 is SEQ ID NO: 87
  • the amino acid sequence of CDR-L1 is SEQ ID NO: 88
  • CDR- CDR-.
  • the amino acid sequence of L2 is SEQ ID NO: 89
  • the amino acid sequence of CDR-L3 is SEQ ID NO: 90
  • the amino acid sequence of the heavy chain variable region is SEQ ID NO: 39 (an example of the corresponding nucleic acid base sequence is SEQ ID NO: 40), and the light chain variable region.
  • the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 41 (an example of the corresponding nucleic acid base sequence is SEQ ID NO: 42).
  • the full-length amino acid sequence of the light chain of IGF11-16 is SEQ ID NO: 91 (an example of the corresponding nucleobase sequence, SEQ ID NO: 92), and the full-length amino acid sequence of the heavy chain is SEQ ID NO: 93 (an example of the corresponding nucleobase sequence).
  • All antibodies comprising the expression IGF11-16 mean this mouse parent antibody IGF11-16.
  • an “antibody” is a glycoprotein containing at least two heavy (H) chains and two light (L) chains interconnected by disulfide bonds.
  • Each heavy chain contains a heavy chain variable region (abbreviated as VH) and a heavy chain constant region, and the heavy chain constant region contains three domains, CH1, CH2 and CH3.
  • Each light chain contains a light chain variable region (abbreviated as VL) and a light chain constant region.
  • the light chain constant region contains one domain, CL.
  • VHs and VLs are further referred to as framework regions (FRs), four more conserved regions (FR-1 (FR1), FR-2 (FR2), FR-3 (FR3), FR-4. (FR4)) and three hypervariable regions (CDR-1 (CDR1), CDR-2 (CDR2), CDR-3 (CDR3)) called complementarity determining regions (CDRs). ..
  • VH is from the amino terminus to the carboxy terminus, FR-1 (FR-H1), CDR-1 (CDR-H1), FR-2 (FR-H2), CDR-2 (CDR-H2), FR-3 ( It contains 3 CDRs and 4 FRs arranged in the order of FR-H3), CDR-3 (CDR-H3), FR-4 (FR-H4).
  • VL is from the amino terminus to the carboxy terminus, FR-1 (FR-L1), CDR-1 (CDR-L1), FR-2 (FR-L2), CDR-2 (CDR-L2), FR-3 ( It contains 3 CDRs and 4 FRs arranged in the order of FR-L3), CDR-3 (CDR-L3), FR-4 (FR-L4).
  • the variable regions of the heavy and light chains contain binding domains that interact with the antigen.
  • the antibody of the present invention may be a fragment and / or a derivative of the antibody.
  • the antibody fragment include F (ab') 2 , Fab, Fv and the like.
  • the antibody derivative an antibody in which an amino acid mutation is artificially introduced into the constant region portion, an antibody in which the composition of the constant region domain is modified, an antibody having two or more Fc per molecule, a heavy chain only or light chain Chain-only antibodies, sugar chain-modified antibodies, bispecific antibodies, antibodies or antibody fragment compounds or antibody conjugates bound to proteins other than antibodies, antibody enzymes, nanobodies, tandem scFv, bispecific Examples include tandem scFv, Diabody, VHH and the like.
  • the term "antibody” also includes an antibody fragment and / or a derivative unless otherwise specified.
  • a monoclonal antibody is classically an antibody molecule obtained from a clone derived from a single antibody-producing cell, but is a single type of antibody molecule containing a combination of VH and VL having a specific amino acid sequence. It means that.
  • a monoclonal antibody it is possible to obtain a nucleic acid molecule having a gene sequence encoding an amino acid of the protein of the antibody, and it is also possible to prepare an antibody by genetic engineering using such a nucleic acid molecule.
  • genetic information such as H chain, L chain, their variable regions and CDR sequences can be used to modify the antibody to improve the binding property and specificity, and from animal antibodies such as mice to human type.
  • Producing an antibody having a structure suitable for use as a therapeutic agent by modifying it into an antibody is a technique well known to those skilled in the art in this field. It is also possible to obtain a human monoclonal antibody by using a non-human-transgenic animal into which a human antibody gene has been introduced as an animal that sensitizes the antigen. In addition, as a method that does not require sensitization to animals, a phage library (human antibody phage display) that expresses the antigen-binding region of a human antibody or a part thereof is used and specifically with the corresponding antigen.
  • a phage library human antibody phage display
  • a person skilled in the art can appropriately perform a technique for obtaining a phage clone consisting of an antibody to be bound or a specific amino acid sequence and producing a human antibody from the information (see, for example, Non-Patent Document 17 and the like). Further, when designing an antibody to be administered to an animal other than human, a person skilled in the art can design it by appropriately using the amino acid sequence information of CDR and the variable region, as in the technique of humanization. ..
  • the antibodies of the invention are the complementarity determining regions (CDRs) of the heavy and light chains derived from the mouse parent antibody IGF11-16 and the frames of the heavy and light chains derived from the human antibody.
  • CDRs complementarity determining regions
  • Anti-IGF-1 receptor humanization comprising working regions (FRs) and at least one CDR containing at least one amino acid residue substitution against the corresponding CDR of the mouse parent antibody IGF11-16. It is an antibody.
  • the heavy and light chain complementarity determining regions are derived from the corresponding CDRs of the mouse parent antibody IGF11-16, respectively.
  • the mouse parent antibody "IGF11-16” is an anti-IGF-1 receptor monoclonal mouse antibody previously produced by the present inventors as described above (Patent Document 1).
  • "derived" from the CDR of the mouse parent antibody means that the amino acid sequence of each CDR of the antibody of this embodiment is usually 75% or more of the amino acid sequence of the corresponding CDR of the mouse parent antibody IGF11-16.
  • the antibody of this embodiment requires that at least one of the CDRs comprises the substitution of at least one amino acid residue with respect to the corresponding CDR of the mouse parent antibody IGF11-16.
  • the amino acid sequence of the heavy chain CDR-2 (CDR-H2)
  • they are homologous (preferably the same) except for the difference of 3 amino acid residues or less, and further 2 amino acid residues or less.
  • each framework region (FR) of heavy and light chains is derived from the corresponding FR of each class of human immunoglobulin.
  • "derived" from the FR of a human immunoglobulin means that the amino acid sequence of each FR of the antibody of this embodiment is usually 80% or more, particularly 85, with the amino acid sequence of the corresponding FR of the human immunoglobulin. % Or more, and even 90% or more homology (preferably identity), and / or usually 4 amino acid residues or less, especially 3 amino acid residues or less, and further excluding the difference of 2 amino acid residues or less. Means that they are homologous (preferably the same).
  • Human immunoglobulin frameworks are available from public databases, and frameworks that are highly homologous to the mouse immunoglobulin framework can be selected.
  • IgBLAST can be used for identification of amino acid sequences having homology (Non-Patent Document 16).
  • the amino acid residue at position 25 of the heavy chain FR1 is preferably proline.
  • the amino acid residue at position 25 of the heavy chain FR1 of the mouse parent antibody IGF11-16 is substituted with proline in the same manner as the mouse parent antibody IGF11-16.
  • the activity is equal to or higher than that of the mouse parent antibody IGF11-16 ( It is preferable because the activity ratio can be exhibited within ⁇ 20% to the same extent.
  • an evolutionary engineering method of an antibody can be used using the sequence of the heavy chain and the light chain derived from the humanized antibody of the present invention as a template.
  • methods such as a site-specific mutagenesis method for CDR, a random mutagenesis method, chain shuffling, and CDR walking are used.
  • Random mutagenesis is a method of introducing a random mutation into a specific gene DNA to prepare a mutant.
  • a base mutation is introduced by selecting a condition with low replication strictness at the time of DNA amplification (error-prone PCR). Mutations are introduced at arbitrary sites for the entire area of DNA amplified by the PCR method.
  • the target gene can be first cut into pieces, and then the mutation can be introduced in the same manner by the PCR method.
  • Chain shuffling is to construct a library in which one of the VH or VL genes in the antibody variable region is immobilized and the other is bound to the V gene library, expressed on phage, and the original antigen is expressed. It is a method of screening a combination of antibody variable regions having high specificity for. It is the method of choice for in vitro affinity maturation of antibodies obtained from naive / non-immune libraries.
  • CDR walking introduces random mutations into each CDR of the VH and VL genes, selects antibodies with strong binding by adjusting the selection conditions from the population of the mutants, and combines the selected CDRs. It is a method to obtain a clone with a very high binding force. In general, random mutations are often introduced and examined only in CDR3.
  • the antibody of the present invention has a specific amino acid sequence as each CDR sequence. Specifically, it is as follows.
  • identity of an amino acid sequence means the ratio of matching amino acid residues
  • similarity means the ratio of matching or similar amino acid residues. do. Homology and identity can be determined, for example, by the BLAST method (the default condition of NCBI's BLAST).
  • similar amino acid residue as used herein means an amino acid residue having a side chain having similar chemical properties (eg, charge or hydrophobicity). Examples of similar amino acid residues include the following groups. For example, according to the following group, substituting alanine for a similar amino acid residue means substituting for a valine, leucine, isoleucine or methionine residue.
  • Amino acid residues having an aliphatic side chain alanine (Ala or A), valine (Val or V), leucine (Leu or L), isoleucine (Ile or I) and methionine (Met or M) residues.
  • Amino acid residues having an aliphatic hydroxyl side chain serine (Ser or S) and threonine (Thr or T) residues.
  • Amino acid residues having an amide-containing side chain asparagine (Asn or N) and glutamine (Gln or Q) residues.
  • Amino acid residues having an aromatic side chain phenylalanine (Phe or F), tyrosine (Tyr or Y), tryptophan (Trp or W) and histidine (His or H) residues.
  • Amino acid residues having a basic side chain lysine (Lys or K), arginine (Arg or R) and histidine (His or H) residues.
  • Amino acid residues having an acidic side chain aspartic acid (Asp or D) and glutamic acid (Glu or E) residues.
  • Amino acid group having a sulfur-containing side chain cysteine (Cys or C), and methionine (Met or M) residue.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence in which any one of the amino acid residues of SEQ ID NO: 1 is substituted is preferable.
  • the CDR-H1 sequence preferably has 80% or more homology (preferably identity) with SEQ ID NO: 1.
  • the CDR-H1 sequence is an amino acid sequence in which the Trp at position 3 of SEQ ID NO: 1 is maintained or substituted with a similar amino acid residue, and any one other than the amino acid residue at position 3 is 1
  • the amino acid residue at the site is substituted or that the amino acid sequence has an amino acid sequence having 80% or more homology (preferably identity) with SEQ ID NO: 1.
  • An example of the nucleic acid base sequence corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the CDR-2 (CDR-H2) sequence of the heavy chain variable region includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5, or any one, two, or three locations of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5. Amino acid sequences substituted with amino acid residues are preferred. Alternatively, the CDR-H2 sequence preferably has 82% or more homology (preferably identity) with SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5.
  • Glu at position 1 and Asn at position 3 of SEQ ID NO: 3 are maintained or replaced with similar amino acid residues, and Asn at position 6 is maintained, or An amino acid sequence substituted with Ser or Gln, wherein any one, two, or three amino acid residues other than the amino acid residues at the 1, 3, and 6 positions are substituted or replaced. It is preferable to have an amino acid sequence having 82% or more homology with SEQ ID NO: 3.
  • Glu at position 1 and Asn at position 3 of SEQ ID NO: 5 are maintained, respectively, or are replaced with similar amino acid residues, and Ser at position 6 is maintained, or An amino acid sequence substituted with Asn or Gln, wherein any one, two, or three amino acid residues other than the amino acid residues at the 1, 3, and 6 positions are substituted or replaced. It is preferable to have an amino acid sequence having 82% or more homology with SEQ ID NO: 5. Examples of nucleic acid base sequences corresponding to the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 3 and 5 are shown in SEQ ID NOs: 4 and 6, respectively.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 or the amino acid sequence in which any one or two amino acid residues of SEQ ID NO: 7 are substituted is preferable.
  • the CDR-H3 sequence preferably has 75% or more homology (preferably identity) with SEQ ID NO: 7.
  • the CDR-H3 sequence is an amino acid sequence in which Arg at position 4 of SEQ ID NO: 7 is maintained or substituted with a similar amino acid residue, and any one other than the amino acid residue at position 4 is 1 It is preferable that the amino acid residue at one or two sites is substituted, or that the amino acid sequence has 75% or more homology (preferably identity) with SEQ ID NO: 7.
  • An example of the nucleic acid base sequence corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 is shown in SEQ ID NO: 8.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 or the amino acid sequence in which any one or two amino acid residues of SEQ ID NO: 9 are substituted is preferable.
  • the CDR-L1 sequence preferably has 81% or more homology (preferably identity) with SEQ ID NO: 9.
  • the CDR-L1 sequence is an amino acid sequence in which the Trp at position 9 of SEQ ID NO: 9 is maintained or is substituted with a similar amino acid residue, and any one other than the amino acid residue at position 9 is 1 It is preferable that the amino acid residue at one or two sites is substituted, or that the amino acid sequence has 81% or more homology (preferably identity) with SEQ ID NO: 9.
  • An example of the nucleic acid base sequence corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 is shown in SEQ ID NO: 10.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 or the amino acid sequence in which any one amino acid residue of SEQ ID NO: 11 is substituted is preferable.
  • the CDR-L2 sequence preferably has 85% or more homology (preferably identity) with SEQ ID NO: 11.
  • An example of the nucleic acid base sequence corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 is shown in SEQ ID NO: 12.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 or the amino acid sequence in which any one or two amino acid residues of SEQ ID NO: 13 are substituted is preferable.
  • the CDR-L3 sequence preferably has 77% or more homology (preferably identity) with SEQ ID NO: 13.
  • An example of the nucleic acid base sequence corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 is shown in SEQ ID NO: 14.
  • the antibody of the present invention preferably has the following combination of CDR sequences. That is, as the CDR-H1 sequence, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, as the CDR-H2 sequence, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5, as the CDR-H3 sequence, as the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and as the CDR-L1 sequence.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, the CDR-L2 sequence is preferably a combination of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 and the CDR-L3 sequence is preferably a combination of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13.
  • Non-Patent Document 13 Kabat method
  • Non-Patent Document 14 Chothia method
  • Non-Patent Document 15 a method obtained by further improving these methods
  • These methods are common technical knowledge for those skilled in the art in this area, but for example, you can get an overview from the Internet homepage (http://www.bioinf.org.uk/abs/) of Dr. Andrew CR Martin's Group. It is also possible.
  • Example 4 by performing an alanine scan, it is possible to identify a site important for binding activity in the amino acid sequence of CDR. From the results, it is clear that the amino acid residues shown in Tables 7 and 8 described later are extremely important. Substitution of at least the amino acid residue at this site with an amino acid other than an amino acid having similar properties is considered to lead to a decrease in binding property. Conversely, it may be possible to achieve improved affinity by substituting for amino acids with similar properties. On the other hand, of the 54 regions of the CDR regions substituted with alanine, 44 sites showed 80% or more of the binding activity even after the substitution with alanine. This suggests that amino acid substitutions at these sites do not significantly affect binding activity. In this way, by searching the amino acid sequences of the CDR regions and identifying the sites involved in binding, immunogenicity can be reduced, physical properties can be improved, and binding can be improved while maintaining binding. It is possible to do.
  • the antibody of the present invention preferably has a specific amino acid sequence as a heavy chain variable region and a light chain variable region. Specifically, it is as follows. In the present disclosure, “one place or several places” means one place, two places, three places, four places, five places, six places, seven places, eight places, nine places, or ten places, unless otherwise specified. It shall refer to any of the locations.
  • the antibody of the present invention has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 47 or an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are substituted, deleted, or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47 as a heavy chain variable region. Is preferable. Alternatively, it is preferable to have an amino acid sequence having 90% or more homology (preferably identity) with SEQ ID NO: 47 as the heavy chain variable region.
  • VH13_PN SEQ ID NO: 43
  • VH13_PS SEQ ID NO: 47
  • VH23_PN SEQ ID NO: 49
  • VH23_PS SEQ ID NO: 53
  • VH25_PN SEQ ID NO: 55
  • VH25_PS SEQ ID NO: 59
  • nucleic acid base sequences corresponding to the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 43, 47, 49, 53, 55, and 59 are shown in SEQ ID NOs: 44, 48, 50, 54, 56, and 60, respectively.
  • the antibody of the present invention contains, as a light chain variable region, an amino acid sequence of SEQ ID NO: 67 or an amino acid sequence in which one or several amino acid residues are substituted, deleted, or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67. It preferably has an amino acid sequence. Alternatively, it is preferable to have an amino acid sequence having 90% or more homology (preferably identity) with SEQ ID NO: 67 as the light chain variable region.
  • the light chain variable region may have the amino acid sequence of VL13 (SEQ ID NO: 61), VL14 (SEQ ID NO: 63), VL22 (SEQ ID NO: 65), VL23 (SEQ ID NO: 67), or VL24 (SEQ ID NO: 69). preferable.
  • VL22 (SEQ ID NO: 65), VL23 (SEQ ID NO: 67), or VL24 (SEQ ID NO: 69).
  • Examples of nucleic acid base sequences corresponding to the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 61, 63, 65, 67, and 69 are shown in SEQ ID NOs: 62, 64, 66, 68, and 70, respectively.
  • the antibody of the present invention has any of the above-mentioned amino acid sequences as the heavy chain variable region and the light chain variable region, respectively.
  • a particularly preferable antibody of the present invention is an antibody having an amino acid sequence of VH13_PS (SEQ ID NO: 47) as a heavy chain variable region and an amino acid sequence of VL23 (SEQ ID NO: 67) as a light chain variable region (hereinafter referred to as "hIGF13_PS").
  • hIGF25_PS an antibody having the amino acid sequence of VH25_PS (SEQ ID NO: 59) as the heavy chain variable region and the amino acid sequence of VL23 (SEQ ID NO: 67) as the light chain variable region (hereinafter referred to as "hIGF25_PS"). There is.).
  • the amino acid sequence of each constant region of the heavy chain and the light chain of the antibody of the present invention is selected from, for example, the amino acid sequences of each class of human IgG, IgA, IgM, IgE, and IgD, and the amino acid sequences of variants thereof. It is possible to do.
  • the amino acid sequence of the heavy chain constant region of the antibody of the present invention is an amino acid sequence of the heavy chain constant region of the human IgG4 class, or an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids thereof are substituted. Is preferable (Non-Patent Documents 19 and 20).
  • the amino acid sequence of the heavy chain constant region of the antibody of the present invention is an amino acid sequence of the heavy chain constant region of the human IgG1 class, or an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids thereof are substituted. Is preferable (Non-Patent Documents 19 and 20).
  • the antibody of the present invention is an antibody that causes an antigen-antibody reaction with a human IGF-1 receptor.
  • antigen-antibody reaction means that an antibody binds to an IGF-1 receptor with an affinity of equilibrium dissociation constant (KD) of 1 ⁇ 10 -7 M or less.
  • KD equilibrium dissociation constant
  • the antibody of the present invention preferably binds to the IGF-1 receptor with a KD of usually 1 ⁇ 10 -7 M or less, particularly 1 ⁇ 10 -8 M or less, and further preferably 1 ⁇ 10 -9 M or less. .. Most preferably, it is 1 ⁇ 10 -10 M or less.
  • the antibody of the present invention preferably specifically binds to the extracellular domain of the human IGF-1 receptor having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 71.
  • an antibody having "specificity" to an antigen means that a high antigen-antibody reaction occurs between the antibody and the antigen.
  • IGF-1 receptor-specific antibody refers to a higher-order structure of the IGF-1 receptor at a concentration that exhibits a significant antigen-antibody reaction with cells expressing the IGF-1 receptor.
  • An antibody having an antigen-antibody reactivity to INSR having similarity of 1/100 or less.
  • the measurement of the antigen-antibody reaction can be carried out by a person skilled in the art by appropriately selecting the binding measurement in a solid phase or liquid phase system.
  • Such methods include enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), enzyme immunoassay (EIA), surface plasmon resonance (SPR), and fluorescence resonance energy transfer method.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA enzyme immunoassay
  • SPR surface plasmon resonance
  • fluorescence resonance energy transfer method Fluorescence resonance energy transfer: FRET
  • emission resonance energy transfer method luminescence resonance energy transfer: LRET
  • the antibody and / or antigen is labeled with an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, a radioactive isotope, or the like, and the physical and / or chemical properties of the labeled substance. It is also possible to detect an antigen-antibody reaction using a measurement method suitable for the above.
  • the antibody of the present invention has an IGF-1 receptor signal activating ability equal to or higher than that of the mouse parent antibody IGF11-16.
  • “equivalent” in the ability to activate the IGF-1 receptor signal means that the EC 50 value is within 2 times and / or the E max value is within ⁇ 20%.
  • the antibody of the present invention preferably has a proliferation activity equal to or higher than that of the mouse parent antibody IGF11-16.
  • “equivalent” in proliferative activity means that the EC 50 value is within 10 times and the E max value is 90% or more in the myoblast proliferation test.
  • the antibody of the present invention preferably has a binding affinity for the recombinant soluble IGF-1 receptor equal to or higher than that of the mouse parent antibody IGF11-16.
  • "equivalent" binding affinity to recombinant soluble IGF-1 receptor is compared to mouse parent antibody IGF11-16 in the binding affinity analysis to recombinant soluble IGF-1 receptor by BIACORE. If this is the case, it means that the KD value is in the range of 1/3 or more to 3 times or less.
  • the antibody of the present invention has a long half-life in blood and exhibits a muscle mass increasing effect by a single administration to an animal.
  • the anti-IGF-1 receptor humanized antibody of the present invention was administered once to a guinea pig or a crab monkey as shown in Examples described later, and the IGF-1 was obtained. It showed the same level of muscle mass-increasing effect as when it was continuously administered.
  • the antibody of the present invention can induce a muscle mass increasing action without inducing hypoglycemic symptoms in normal mammals. According to one aspect, it is preferable that the antibody of the present invention can induce a growth plate cartilage elongation action without inducing hypoglycemic symptoms in a pituitary excision model animal.
  • the "blood glucose symptom” means, in the case of humans, symptoms such as cold sweat, palpitation, consciousness disorder, convulsions, and tremors of limbs caused by hypoglycemia. In vertebrates such as monkeys, a decrease in locomotor activity appears as an initial symptom, and when the symptom is strong, there is almost no movement, and when the blood glucose level drops, consciousness disorder occurs, leading to death.
  • the antibody of the present invention is administered to a vertebrate at a dose that induces an increase in vertebrate muscle mass and / or length, more preferably at a dose that is 10-fold or more higher than that dose. Even it has no effect on lowering the blood glucose level of the vertebrate. Further, according to one aspect, the antibody of the present invention was administered to the vertebrate so as to have a blood exposure amount of 10 times or more the effective dose for inducing an increase in muscle mass and / or body length of the vertebrate.
  • the antibody of the present invention does not induce hypoglycemic symptoms even when administered at a dose of 10 mg / kg in guinea pigs and cynomolgus monkeys, as shown in Examples described later. rice field.
  • the anti-IGF-1 receptor humanized antibody of the present invention can be used for various diseases associated with IGF-1 receptors such as disused muscular atrophy and short stature, which are expected for IGF-1. It has the potential to be a therapeutic or prophylactic agent, overcomes the problem of IGF-1 and has a hypoglycemic effect, and can prolong the half-life in blood.
  • the antibody of the present invention is a homozygous receptor in which the IGF-1 receptor forms a dimer by binding to the extracellular domain of the IGF-1 receptor, or the IGF-1 receptor and INSR are dimeric. It is thought to activate the heteromorphic receptors that formed the body.
  • Anti-Drug Antibody affects the efficacy and pharmacokinetics of therapeutic antibodies and can sometimes lead to serious side effects, so the usefulness and efficacy of therapeutic antibodies in clinical practice is ADA. Can be limited by the production of. Although many factors affect the immunogenicity of therapeutic antibodies, the importance of effector T cell epitopes present in therapeutic proteins has been widely reported. Epibase (Lonza), iTope / TCED (Antitope), EpiMatrix (EpiVax) and the like have been developed as in silico tools for predicting T cell epitopes.
  • Non-Patent Document 21 the presence of T cell epitopes in each amino acid sequence can be predicted (Non-Patent Document 21), and potential immunogenicity can be evaluated.
  • the potential immunogenicity was evaluated using Epibase (Lonza).
  • the NS sequence (heavy chain positions 55 and 56) was present in the heavy chain CDR-2 (CDR-H2) region of the mouse parent antibody IGF11-16, so that asparagine (N) at the heavy chain position 55 was present.
  • the asparagine (N) was replaced with serine (S) in consideration of the risk of deamidation and conversion to aspartic acid (D).
  • the anti-IGF-1 receptor humanized antibody of the present invention has a purity of 95% or more using a sample obtained by using a PBS solution of the present antibody, setting the temperature to 37 ° C. and incubating for 1 month. The stability of the physical properties was confirmed by confirming that no agglomerates were formed.
  • the antibody of the present invention uses the CR domain of the IGF-1 receptor as an epitope.
  • the antibody of the present invention binds to an epitope or a vicinity thereof containing a peptide having an amino acid sequence (ProSerGlyPheIleArgAsnGlySerGlnSerMet) corresponding to amino acid numbers 308 to 319 in the amino acid sequence (SEQ ID NO: 71) of the human IGF-1 receptor. do.
  • the antibody of the present invention is a homozygous receptor in which the IGF-1 receptor forms a dimer by binding to the CR domain of the IGF-1 receptor, or a dimer of the IGF-1 receptor and INSR. It is thought to activate the heterozygous receptor that formed the.
  • the agonist antibody of the present invention is preferably a human IgG class or a variant thereof, and is preferably a human IgG4 subclass or a variant thereof, or a human IgG1 subclass or a variant thereof.
  • the stabilized IgG4 constant region contains proline at position 241 of the hinge region by Kabat's system (Non-Patent Document 22). This position corresponds to the position 228 of the hinge region by the EU numbering method (Non-Patent Document 13). In human IgG4, this residue is generally serine and the substitution of serin with proline can induce stabilization.
  • the N297A mutation can be incorporated into the constant region of IgG1 to minimize the ability to bind to Fc receptors and / or immobilize complement.
  • the binding to FcRn can be regulated and the half-life in blood can be lengthened by introducing an amino acid substitution into the constant region.
  • amino acid substitutions in the constant region are not limited to these examples.
  • the agonist antibody of the present invention specifically and strongly binds to the IGF-1 receptor, and has an action of enhancing myoblast proliferation from an extremely low concentration in vitro.
  • the agonist antibody of the present invention exhibits a muscle mass-increasing effect similar to that of continuous administration of IGF-1 when administered once to an animal.
  • the agonist antibody of the present invention has a long half-life in blood and can exhibit a muscle mass-increasing effect by a single administration to an animal.
  • the muscle mass-increasing effect and the muscle mass-increasing effect when IGF-1 is continuously administered are shown.
  • the agonist antibody of the present invention is characterized in that it does not have a hypoglycemic effect at a dose showing a muscle mass increasing effect.
  • IGF-1 has a significant hypoglycemic effect when administered at a dose showing a muscle mass increasing effect.
  • the agonist antibody of the present invention has no effect of lowering the blood glucose level of the vertebrate at a dose that induces an increase in vertebrate muscle mass and / or body length.
  • the agonist antibodies of the invention are vertebrate blood glucose, even when administered to a blood exposure of at least 10 times the effective dose that induces an increase in vertebrate muscle mass and / or length. It has no effect of lowering the value.
  • the agonist antibody of the present invention in fact, in guinea pigs or crab monkeys, even when the agonist antibody of the present invention is administered so as to have a blood exposure of 10 times or more the effective dose that induces an increase in muscle mass, hypoglycemia and No hypoglycemic symptoms were observed.
  • the agonist antibody of the present invention has the potential to be a therapeutic or prophylactic agent for various diseases related to the IGF-1 receptor such as sarcopenia, disuse muscular atrophy, Kakexia and short stature.
  • various diseases related to the IGF-1 receptor such as sarcopenia, disuse muscular atrophy, Kakexia and short stature.
  • the anti-IGF-1 receptor humanized antibody of the present invention is an anti-IGF-1 receptor antagonist antibody having excellent activity and specificity by utilizing the properties of the variable region having extremely high binding and specificity. can do. In that case, in addition to IgG, it is conceivable to use it in the form of Fab, Fv, scFv, VHH, but the present invention is not limited to this.
  • the anti-IGF-1 receptor antagonist antibody thus produced can be evaluated using, for example, suppressing the IGF-1-dependent cell proliferation activity in a cancer cell line as an index.
  • the anti-IGF-1 receptor antagonist antibody thus selected is expected as an anti-cancer agent and an ameliorating and therapeutic agent for diseases and pathological conditions associated with abnormal cell proliferation.
  • bispecific antibodies and multispecific antibodies can be constructed by fusing with various antibodies recognizing other antigens or epitopes directly or via a linker or the like.
  • IgG immunoglobulin G
  • Bispecific antibodies and multispecific antibodies containing anti-IGF-1 receptor antagonist antibodies thus prepared can suppress IGF-1-dependent cell proliferation activity in cancer cell lines, for example. It can be evaluated as an index. Bispecific antibodies and multispecific antibodies containing the anti-IGF-1 receptor antagonist antibody thus selected are expected to be anti-cancer agents and ameliorating and therapeutic agents for diseases and pathological conditions associated with abnormal cell proliferation. Will be done.
  • the anti-IGF-1 receptor antagonist antibody of the present invention is expected as a therapeutic agent for a disease in which a pathological condition is induced by activation of an IGF-I receptor signal.
  • the ligands capable of activating the IGF-I receptor mainly include IGF-1, IGF-2, Insulin and the like, and RTK (receptor type tyrosine kinase) formed into a heterodimer with the IGF-1 receptor. It also includes ligands (such as EGF) and ligands for other receptors that crosstalk (such as TSH).
  • the antibody of the present invention has an action of suppressing the IGF-1 receptor signal activated by these ligands (has an allosteric antagonist action.
  • the antibody of the present invention binds to the IGF-1 receptor. It suppresses over-induced IGF-1 receptor signal activity and can be used to treat or prevent diseases induced by abnormally activated IGF-1 receptor.
  • Signal activation inhibitory ability is mouse. It is preferable to have the same or higher level as the parent antibody IGF11-16.
  • the signal activation inhibitory ability "equivalent to the mouse antibody IGF11-16" is defined as IGF-1, IGF-2, or IGF- such as Insulin in myoblast proliferation. It means an activity that suppresses the maximum cell proliferation activity that can be induced by a ligand capable of activating an I receptor by 10% or more, preferably 25% or more, particularly preferably 35% or more.
  • diseases induced by abnormal activation of IGF-1 receptors include liver cancer, neuroblastoma, rhabdomyomyoma, osteosarcoma, pediatric cancer, apical giant disease, and ovary. Cancer, pancreatic cancer, benign prostatic hypertrophy, breast cancer, prostate cancer, bone cancer, lung cancer, colorectal cancer, cervical cancer, synovial sarcoma, bladder cancer, gastric cancer, Wilms tumor, metastatic cartinoids and Diarrhea associated with vasoactive intestinal peptide secretory tumors, bipoma, Werner-Morison syndrome, Beckwith-Wedemann syndrome, kidney cancer, renal cell cancer, transitional epithelial cancer, Ewing sarcoma, leukemia, acute lymphoblastic leukemia , Brain tumor, glioblastoma, non-glioblastic brain tumor, medullary tumor, pituitary adenoma, vestibular neurasemia, undifferentiated ectodermal tumor
  • Anti-IGF-1 receptor humanized antibody as a local delivery tool
  • Local delivery of drugs and antibodies to IGF-1 receptor-expressing cells, expression tissues, etc. is possible by utilizing the extremely high binding property and specificity of the anti-IGF-1 receptor antibody of the present invention.
  • the anti-IGF-1 receptor antibody of the present invention it is conceivable to use it in the form of Fab, Fv, scFv, VHH in addition to IgG, but the present invention is not limited thereto. ..
  • the drug can be delivered locally, so that the drug can exert its specific effect at a lower dose, which is a side effect. It also leads to the reduction of.
  • the drug or antibody to which the anti-IGF-1 receptor humanized antibody of the present invention thus prepared is ligated as a delivery tool is, for example, an IGF-1 receptor-expressing cancer cell when the drug is an apoptosis-inducing agent. It can be evaluated using the induction of apoptosis in the strain as an index.
  • the drug or antibody to which the anti-IGF-1 receptor antibody thus selected is ligated is expected as an anti-cancer drug or an ameliorating and therapeutic drug for diseases and pathological conditions associated with abnormal cell proliferation.
  • the anti-IGF-1 receptor antibody of the present invention and an antibody that competitively binds to the IGF-1 receptor are also included in the scope of the present invention.
  • “competitive binding” means a phenomenon in which when a plurality of types of monoclonal antibodies coexist with an antigen, the binding of one antibody to the antigen is inhibited by the binding of the other antibody to the antigen.
  • concentration concentration
  • concentration concentration of a monoclonal antibody
  • the monoclonal antibody that competitively binds to the anti-IGF-1 receptor antibody of the present invention has an IC 50 of usually 1000 nM or less when the antigen-antibody binding is detected using the anti-IGF-1 receptor antibody of the present invention at 10 nM. Above all, it refers to an antibody of 100 nM or less, and further 10 nM or less.
  • a part or all of the antibody to be used is labeled with an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, a radioactive isotope, etc., and the measurement is suitable for the physical and / or chemical properties of the labeled substance. It is also possible to make the measurement by detecting it using a method.
  • the antibodies of the invention have a cross-reactivity to the IGF-1 receptor of other vertebrates.
  • the cross-reaction means that the antibody exhibits binding property to an IGF-1 receptor of another animal species different from the animal species (for example, human) of the IGF-1 receptor that undergoes an antigen-antibody reaction.
  • the anti-IGF-1 receptor humanized antibody of the present invention exhibits cross-reactivity with IGF-1 receptors such as guinea pigs, monkeys and rabbits in addition to humans. On the other hand, it does not show cross-reactivity with mouse and rat IGF-1 receptors.
  • cells and animals expressing the IGF-1 receptor with which the antibody of the present invention cross-reacts by genetically engineering the cells and animals using a species of animal that does not cross-react with the antibody of the present invention. It is also possible to make.
  • the anti-IGF-1 receptor humanized antibody of the present invention has an extremely strong binding affinity at a level equal to or higher than that of the mouse parent antibody IGF11-16 (Patent Document 1).
  • the binding affinity can be evaluated, for example, by using the extracellular region of the recombinant IGF-1 receptor as an antigen and performing SPR (surface plasmon resonance) analysis.
  • SPR surface plasmon resonance
  • BIACORE is used to raise the reaction temperature to 40 ° C. to keep the amount of antigen fixed low to analyze the monovalent binding affinity, but the method is not limited to this method. Any analysis method that can quantitatively evaluate the strong binding affinity may be used.
  • the anti-IGF-1 receptor humanized antibody of the present invention has a level equal to or higher than that of the mouse parent antibody IGF11-16 (Patent Document 1) by using IGF-1 receptor signal activation as a primary evaluation system. It was obtained by selecting a humanized antibody.
  • IGF-1 receptor signaling activation was a commercially available PathHunter (TM) IGF1R Functional Assay (DiscoverX Co.).
  • TM PathHunter
  • phosphorylation directly under the IGF-1 receptor signal can be evaluated as enzyme activity, a chemiluminescent substance is used as a substrate, and the signal intensity is measured by the luminescence intensity.
  • an adapter protein SHC1-EnzymeAcceptor (EA) fusion protein having an SH2 domain that binds to the intracellular tyrosine kinase of the IGF-1 receptor and the IGF-1 receptor was forcibly expressed in HEK293 cells.
  • a cell line was used. In this cell line, ligand binding to the IGF-1 receptor causes receptor dimerization, followed by phosphorylation of the receptor to recruit adapter proteins with SH2 domains and accept receptor signals.
  • a transduction complex is formed, facilitating the binding of EA to spatially adjacent tyrosine kinases and reconstitution of active ⁇ -galactosidase.
  • the method for evaluating the IGF-1 receptor signal is not limited to this method, and any system may be used as long as it can directly or indirectly and quantitatively detect IGF-1 receptor tyrosine phosphorylation.
  • Human myoblast proliferation was evaluated as a secondary evaluation system for the humanized antibody of the present invention, and humanized antibodies having the same or higher agonist activity in the same concentration range as the mouse parent antibody IGF11-16 (Patent Document 1) were narrowed down. is. It was confirmed that the humanized antibody of the present invention thus selected did not show a hypoglycemic effect in vivo and had a muscle mass increasing effect. That is, the anti-IGF-1 receptor humanized antibody of the present invention in one embodiment has a growth-inducing activity of vertebrate-derived cells.
  • the "vertebrate-derived cell” is preferably a cell derived from a mammal, a bird, a reptile, an amphibian or a fish, more preferably a cell derived from a mammal or a bird, and even more preferably.
  • cells and animals modified to express certain IGF-1 receptors that are cross-reactive with the antibody of the present invention, or cells derived from the modified animals are also referred to as "cells derived from vertebrates" in the present disclosure. "include.
  • primary cultured cells As cells for investigating the growth-inducing activity of vertebrate-derived cells in vitro, primary cultured cells, cell lines, or transformed cells of those cells can be used.
  • primary cultured cell refers to a cell isolated from an organ or tissue of an organism, which is usually capable of subculture with a certain number of subcultures.
  • Primary cultured cells derived from vertebrates can be obtained from vertebrate organs and tissues by a method such as enzymatic treatment, dispersion by a physical method, or an expand method. It is also possible to use organs and tissues obtained from vertebrates, or fragments thereof.
  • the organs and tissues that prepare these primary cells are preferably endocrine tissues such as thyroid gland, parathyroid gland and adrenal gland, immune tissues such as pits, tonsils, lymph nodes and spleen, respiratory organs such as trachea and lung, and stomach.
  • the primary cultured cells used for investigating the growth-inducing activity of the antibody of the present invention include cells that express the IGF-1 receptor and whose growth is induced by IGF-1 that binds to the IGF-1 receptor. Used.
  • skeletal myoblasts which are primary cultured cells isolated from muscle tissue, are used.
  • primary cultured cells derived from humans or animals it is also possible to obtain and use commercially available cells.
  • Human primary culture cells for example, ATCC (R), available ECACC, Lonza, Gibco (R), Cell Applications, ScienCell research laboratories , the organizations and companies such PromoCell.
  • Examples of the method for investigating the cell proliferation-inducing activity of the antibody of the present invention in vertebrate-derived cells include measurement of cell number measurement, measurement of DNA synthesis amount, measurement of change amount of metabolic enzyme activity, and the like.
  • a method for measuring the number of cells there are a method using a blood cell count board and a method using a cell number measuring device such as a coulter counter, and as a method for measuring the amount of DNA synthesis, [3H] -thymidine or 5-bromo-
  • a method for measuring by taking in 2'-deoxyuridine (BrdU) and a method for observing the amount of change in metabolic enzyme activity there are colorimetric quantitative methods such as MTT method, XTT method and WST method. It can also be carried out by other methods.
  • the cell proliferation-inducing activity was determined by the fact that the cell proliferation was increased when the antibody of the present invention was reacted with the cultured cells used in the test as compared with the case where the antibody was not reacted. can. In this case, it is convenient to evaluate the activity by reacting IGF-1, which is a ligand of the original IGF-1 receptor, under the same conditions as a control of the inducing activity.
  • the EC 50 value is the concentration at which 50% of the maximum growth-inducing activity is exhibited when the antibody of the present invention and IGF-1 are reacted with the cultured cells to be tested at different concentrations. ..
  • cell proliferation-inducing activity of the antibodies of the present invention are The EC 50 values equal to or larger than that of the IGF-1, more preferably antibodies of the present invention
  • the EC 50 value is 1/10 or less of IGF-1, more preferably 1/20 or less, and even more preferably the EC 50 value of the antibody of the present invention is 1/50 or less of IGF-1.
  • the EC 50 value of the antibody of the present invention was preferably 0.5 nM or less, more preferably 0.3 nM or less, still more preferable. Is 0.1 nM or less.
  • the antibody of the present invention is administered to a vertebrate, and changes in the mass, size, cell number, etc. of an organ or tissue in the whole administered individual or in the administered individual are observed.
  • To measure, or to use an animal transplanted with the vertebrate cell measure changes in the mass, size, number of cells, etc. of the transplant containing the transplanted vertebrate cell in the transplanted individual. You can find out at. In the measurement of the whole individual, measurement of body weight, body length, circumference of limbs, etc., body composition measurement by impedance method, creatinine, height coefficient, etc. are used.
  • the target organs, tissues, or grafts in an individual in animals other than humans, the target organs, tissues, or grafts are directly collected, and the mass, size, and number of cells contained are calculated.
  • an X-ray image typified by the DXA (Dual-energy X-ray absorptiometry) method, image analysis by CT and MRI, and isotopes Or a contrast method using a tracer using a fluorescent substance or the like is used.
  • DXA Direct-energy X-ray absorptiometry
  • those skilled in the art can investigate the effect of the antibody of the present invention on the in vivo proliferation-inducing activity of vertebrate-derived cells by using other methods as appropriate.
  • an individual to which the antibody of the present invention was administered and an individual to which an antibody other than the antibody of the present invention or another control substance was administered were used. It can be evaluated by comparing the results of measurement and the like by the method shown above.
  • Example 14 guinea pig blood of the mouse antibody IGF11-16 antibody (Patent Document 1) which was the basis of the design of the antibody of the present invention and the antibodies hIGF13_PS and hIGF25_PS of the present invention. The kinetics were compared, and it was shown that the kinetics in the blood was improved compared with IGF11-16.
  • One of the in vivo effects of the antibody of the present invention is the effect of increasing muscle mass and / or body length.
  • IGF-1 In addition to acting on the proliferation and differentiation of the above-mentioned myoblasts in skeletal muscle, IGF-1 also has an action of thickening muscle fibers, and it is considered that IGF-1 has an effect of increasing muscle mass as such a comprehensive action. There is.
  • the antibody of the present invention also has the effect of increasing the muscle mass of the animal when administered to the animal in the same manner as IGF-1.
  • body composition measurement by the impedance method creatinine, height coefficient, etc. are used in the measurement of the whole individual, such as body weight, body length, and limb circumference.
  • methods such as X-ray imaging images represented by the DXA (Dual-energy X-ray absorptiometry) method, image analysis by CT and MRI, and imaging methods using tracers using isotopes and fluorescent substances are used.
  • Changes in muscle strength, etc. are also indicators.
  • the effect of increasing muscle mass is to compare the increase in muscle mass between an individual who received the antibody of the present invention and an individual who did not receive the antibody, or administer the antibody of the present invention in one individual. It can be evaluated by comparing the muscle mass before and after administration.
  • the effect of increasing muscle mass can be known if a difference in the increase in muscle mass is observed by administration of the antibody of the present invention.
  • IGF-1 is also involved in bone growth and also has the function of increasing body length (height in the case of humans). Therefore, the antibody of the present invention also has an effect of increasing the body length when administered to an animal.
  • the effect of increasing the body length by the antibody of the present invention can be measured by measuring the body weight, body length, perimeter of limbs, etc. of an individual.
  • the antibody of the present invention is characterized in that it does not affect the blood glucose level in vertebrates.
  • IGF-1 is known to cause a blood glucose lowering effect as part of the agonistic action on the IGF-1 receptor.
  • the agonist antibody of the present invention which functions as an anti-IGF-1 receptor agonist antibody, has a blood exposure of 10 times or more the effective dose that induces an increase in muscle mass when administered parenterally to an animal. , Shows the feature that the blood glucose level does not fluctuate.
  • the effect of the antibody of the present invention on vertebrates that does not induce a decrease in blood glucose can be evaluated, for example, in vitro.
  • cells for investigating the feature of vertebrate-derived cells that do not affect the uptake of glucose into cells in vitro primary cultured cells, cell lines, or transformed cells of those cells can be used. It is possible.
  • the effect on intracellular glucose uptake is such that the intracellular glucose uptake when the antibody of the present invention is reacted with the cultured cells used in the test is the same as when the antibody is not reacted. It can be judged by the existence. In this case, it is convenient to evaluate the activity by reacting IGF-1, which is a ligand of the original IGF-1 receptor, under the same conditions as a control of the inducing activity.
  • the antibody of the present invention is administered to the vertebrate and the change in glucose content in an organ or tissue in the administered individual is measured. Can be done. In the measurement of the whole individual, measurement of blood glucose level and the like, hemoglobin A1C and the like using a glycated protein as an index are used. In the measurement of the amount of glucose uptake in an organ or tissue in an individual, in an animal other than human, the target organ or tissue is directly collected, and the glucose content or tracer is calculated.
  • an X-ray image, image analysis by CT or MRI, a contrast method using a tracer using an isotope or a fluorescent substance, or the like is used. ..
  • glucose clamp or the like is also an index.
  • those skilled in the art can investigate the effect of the antibody of the present invention on glucose uptake in vivo by vertebrate-derived cells by using other methods as appropriate.
  • the vertebrate when the antibody of the present invention is administered to a vertebrate, the vertebrate has the same dose, preferably 10 times or more the effective dose for inducing an increase in muscle mass of the vertebrate. It is characterized in that it does not fluctuate the blood glucose level.
  • the animal for investigating the change in the blood glucose level of the antibody of the present invention in a vertebrate is preferably an animal belonging to a mammal, a bird, a reptile, an amphibian or a fish, and more preferably an animal belonging to a mammal or a bird. Even more preferred are humans, monkeys, rabbits, guinea pigs, cows, pigs, sheep, horses, dogs, rats, or mice.
  • animals modified to express certain IGF-1 receptors that are cross-reactive with the antibody of the present invention can also be used as animals for examining changes in blood glucose levels of the antibody of the present invention in vertebrates. included.
  • the colorimetric method, the electrode method, etc. are used as the invasive method, and the enzymes for detection include the glucose oxidase method (GOD method), the glucose dehydrogenase method (GDH method), etc.
  • GOD method glucose oxidase method
  • GDH method glucose dehydrogenase method
  • an invasive method there is an optical measurement method and the like, but other methods can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • the blood glucose level is human, the normal range of the fasting blood glucose level is 100 mg / dL to 109 mg / dL.
  • Adverse events due to drug administration to blood glucose level are hypoglycemia when the blood glucose level is lower than the range of 77 mg / dL to 55 mg / dL, and 109 mg / dL to 160 mg / dL. If the value is higher than the range, it is defined as hyperglycemia.
  • No effect of drug administration on blood glucose level means that the blood glucose level after drug administration is in the range of above 55 mg / dL and below 160 mg / dL, more preferably above 77 mg / dL and below 109 mg / dL. Is to be within the range of.
  • the blood glucose level differs depending on the animal to which it is administered, and the range of fluctuation thereof differs, and even in humans, the blood glucose level at the time of administration is not always in the range of the normal value.
  • the blood glucose level of the vertebrate to which the antibody of the present invention was administered is preferably within 30%, more preferably within 20%, and even more preferably 10 as compared with the solvent administration control group. It means that the change is within%.
  • the antibody of the present invention can be obtained by humanizing the mouse monoclonal antibody IGF11-16 (Patent Document 1) against the IGF-1 receptor. Replacing the CDR regions with a human framework by CDR graphing using a monoclonal antibody obtained from a non-human animal species is called humanization (Non-Patent Document 12). Furthermore, by three-dimensional structural analysis, in order to avoid amino acid substitution to reduce immunogenicity (T cell antigenicity) to humans and post-translational modification risk such as deamidation and oxidation while maintaining the three-dimensional structure. By introducing the amino acid substitution of, we will produce a humanized antibody that ensures manufacturability and clinical safety while maintaining activity.
  • VH13_PN SEQ ID NO: 43
  • VH13_PS VH13_PS as heavy chain variable regions.
  • SEQ ID NO: 47 VH23_PN (SEQ ID NO: 49)
  • VH23_PS SEQ ID NO: 53
  • VH25_PN SEQ ID NO: 55
  • VH25_PS SEQ ID NO: 59
  • VL13 SEQ ID NO: 61
  • Examples thereof include humanized antibodies having VL14 (SEQ ID NO: 63), VL22 (SEQ ID NO: 65), VL23 (SEQ ID NO: 67), or VL24 (SEQ ID NO: 69).
  • the light chain variable region more preferably has VL22 (SEQ ID NO: 65), VL23 (SEQ ID NO: 67), or VL24 (SEQ ID NO: 69).
  • the antibodies of the invention are not limited to them.
  • the obtained anti-IGF-1 receptor humanized antibody it is also possible to obtain a nucleic acid molecule having a base sequence encoding the amino acid of the protein of the antibody, and the antibody is genetically engineered using such a nucleic acid molecule. It is also possible to produce.
  • the H chain, L chain, or variable regions thereof in the genetic information of the antibody can be modified to improve the binding property and specificity of the antibody by referring to the information such as the CDR sequences.
  • mammalian cells, insect cells, Escherichia coli, etc. into which a gene encoding the amino acid of the antibody of the antibody to be obtained is introduced are cultured, and the obtained culture supernatant is used by a conventional method.
  • the antibody can be purified and obtained.
  • the specific method is not limited to this, but the following methods are exemplified.
  • a nucleic acid molecule encoding an H chain variable region is bound to a nucleic acid molecule encoding an H chain signal peptide and a nucleic acid molecule encoding an H chain constant region. It is produced by binding a nucleic acid molecule encoding an L-chain signal peptide to a nucleic acid molecule encoding an L-chain variable region and a nucleic acid component encoding an L-chain constant region.
  • H-chain gene and L-chain gene into a vector suitable for expression in a selected host cell, for example, a cloning vector or an expression vector.
  • the H-chain gene and the L-chain gene may be integrated into one vector or may be integrated into different vectors as long as both genes are expressed.
  • the vector into which the H-chain gene and the L-chain gene are integrated is introduced into the host cell.
  • the host cell include eukaryotic cells such as mammalian cells, insect cells, yeast cells, or plant cells, or bacterial cells.
  • a method for introducing a gene into a host cell appropriately select from a chemical method such as calcium phosphate or lipofection method, a physical method such as electroporation method or particle gun method, or a method by infection with a virus or phage. Can be done.
  • Host cells into which the H-chain gene and L-chain gene have been introduced can be used for culture without selection, and recombinant cells into which the gene has been introduced using properties such as drug resistance and nutritional demand can be used. It is also possible to selectively concentrate or use a cloned recombinant cell established from a single host cell into which a gene has been introduced for culture.
  • Host cells into which the H-chain gene and L-chain gene have been introduced are cultured in an appropriate medium and culture conditions.
  • the products of the H chain gene and the L chain gene expressed in the host cell are usually secreted into the medium as an antibody protein, and the produced antibody protein can be obtained by recovering the medium.
  • the host cell may be destroyed and the antibody protein accumulated in the cell may be recovered if necessary, and the antibody protein may be recovered from the periplasmic fraction in the case of prokaryotic cells. You can choose.
  • concentration by salt precipitation method, dialysis, ultrafiltration, etc., exchange of solvent, protein A, protein G, antigen, etc. are immobilized.
  • Affinity chromatography and the like using the same carrier are generally used, but other methods such as ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, mixed mode chromatography and size exclusion chromatography can also be appropriately used for purification. All of the various techniques used in these procedures are well known to those of skill in the art.
  • the gene encoding the heavy chain and / or light chain of the immunoglobulin is genetically modified to introduce a desired trait, or the structure of the variable region or CDR region of the heavy chain and / or light chain of the immunoglobulin is performed. It is possible to produce an antibody chimeric protein, a small molecule antibody, a scaffold antibody, or the like by using information by using a technique known to those skilled in the art. Further, for the purpose of improving the performance of the antibody and avoiding side effects, it is also possible to modify the structure of the constant region of the antibody or to modify the sugar chain portion as appropriate by a technique well known to those skilled in the art. It can be carried out.
  • the antibody of the present invention can be used as a therapeutic agent, a prophylactic agent, or a diagnostic agent for a disease caused by an IGF-1 related condition or an action on an IGF-1 receptor.
  • the therapeutic / preventive drug or the diagnostic drug will be collectively referred to as “drug” or “drug”.
  • the IGF-1 related state or the disease to be treated or prevented with the anti-IGF-1 receptor agonist antibody includes muscular atrophy diseases (for example, disused muscular atrophy, sarcopenia, caquexia and the like). ), Short stature (eg Laron short stature, growth hormone resistant short stature, etc.), liver cirrhosis, liver fibrosis, diabetic nephropathy, chronic renal failure, aging, intrauterine fetal growth retardation (IUGR), nerves Diseases, strokes, spinal cord injuries, cardiovascular protection, diabetes, insulin resistance, metabolic syndrome, nephropathy, osteoporosis, cystic fibrosis, wound healing, muscular tonic dystrophy, AIDS muscle atrophy, fat relapse associated with HIV Distribution Syndrome, Burns, Crohn's Disease, Werner Syndrome, X-Chain Complex Immune Deficiency, Hearing, Neuropathic and Premature Infant Retinopathy, Turner Syndrome, Prader Willy Syndrome, Silver Russell Syndrome, Idiopathic Short Stature, Examples
  • the antibodies of the present invention treat muscular atrophy diseases (eg, disused muscular atrophy, sarcopenia, cahexia, etc.) and / or short stature (eg, laron-type short stature, growth hormone-resistant short stature, etc.). It is preferably used as a drug or a prophylactic agent.
  • the antibody of the present invention is excellent in that it does not cause fluctuations in blood glucose level by administration.
  • Neuroblastoma is a disease to be treated, prevented, or diagnosed with an antibody drug, an antibody drug complex, or a diagnostic drug fused or linked with a part or all of this anti-IGF-1 receptor antibody as a component.
  • the drug containing the antibody of the present invention may be formulated in the form of a pharmaceutical composition containing a pharmaceutically acceptable carrier and / or other additives in addition to the antibody of the present invention.
  • Formulations using pharmaceutically acceptable carriers and / or other additives include, for example, University of the Sciences in Philadelphia, “Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th EDITION”, Lippincot Williams & Wilkins, 2000. It can be carried out by the method described.
  • a solution or lyophilizer prepared by dissolving, suspending, or emulsifying in a sterile aqueous or oily solution.
  • a solvent or solution include distilled water for injection, physiological saline and the like as an aqueous solution, and in addition, an osmotic pressure regulator (for example, D-glucose, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride).
  • Etc. suitable solubilizing agents such as alcohols (eg ethanol), polyalcohols (eg propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg polysorbitol 80, polyoxyethylene hydrogenated castor oil 50). ) Etc.
  • an oily liquid may be used as the solvent or the dissolution liquid, and examples of the oily liquid include sesame oil, soybean oil and the like, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as the dissolution aid.
  • buffers eg, phosphate buffers, acetate buffers
  • painkillers eg, benzalkonium chloride, prokine hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin
  • preservatives eg, ascorbic acid, erythorbic acid and salts thereof, etc.
  • colorants eg, copper chlorophyll, ⁇ -carotene, red No. 2, blue No. 1, etc.
  • preservatives eg, paraoxy.
  • thickeners eg, hydroxypropyl cellulose, carboxymethyl cellulose and their salts, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, mannitol, sorbitol, etc.
  • odor Additives of agents eg, menthol, citrus fragrance, etc.
  • Another form is a drug for mucosal adaptation.
  • the main purpose is to impart adsorptivity, retention, etc. to the mucous membrane, and as additives, a pressure-sensitive adhesive, a pressure-sensitive adhesive, a thickening agent, a thickening agent, etc. (for example, mutin, canten, etc.)
  • a pressure-sensitive adhesive for example, mutin, canten, etc.
  • Gelatin pectin, carrageenan, sodium alginate, locust bin gum, xanthan gum, tragant gum, gum arabic, chitosan, purulan, waxy starch, scralfate, cellulose, and derivatives thereof (eg, hydroxypropylmethylcellulose, polyglycerin fatty acid ester, acrylic acid (meth).
  • Alkyl acrylate copolymer or a salt thereof, polyglycerin fatty acid ester, etc. may be contained.
  • the form, solvent and additive of the therapeutic agent or preventive agent provided to the living body are limited to these. It is not a product, and any person in the art can select it as appropriate.
  • the drug containing the antibody of the present invention may contain other existing drugs (active ingredients) in addition to the antibody of the present invention. Further, it may be fused or linked with other drugs such as antibody drug conjugates, bispecific antibodies and multispecific antibodies. Further, the drug containing the antibody of the present invention may be combined with other existing drugs to form a kit.
  • anti-IGF-1 receptor agonist antibodies growth hormone or its analog, insulin or its analog, IGF-2 or its analog, anti-myostatin antibody, myostatin antagonist, anti-activin type IIB receptor antibody, activin IIB receptor Included are body antagonists, soluble activin type IIB receptors or analogs thereof, grelin or analogs thereof, follistatin or analogs thereof, beta 2 agonists, and selective androgen receptor modulators.
  • the active ingredient combined with the anti-IGF-1 receptor antibody or the anti-IGF-1 receptor antibody is used together with the antibody drug or the antibody drug complex.
  • the active ingredients contained include corticosteroids, anti-antibodies, ondancetron hydrochloride, granisetron hydrochloride, metoclopramide, donperidone, haloperidol, cyclidine, lorazepam, prochlorperazine, dexamethasone, levomepromazine, tropicetron, and cancer.
  • Vaccines GM-CSF inhibitors, GM-CSF DNA vaccines, cell-based vaccines, dendritic cell vaccines, recombinant virus vaccines, heat shock protein (HSP) vaccines, allogeneic tumor vaccines, autologous tumor vaccines, analgesics, ibprofen, Naproxene, choline magnesium trisalicylate, oxycodon hydrochloride, anti-angiogenic drug, anti-thrombotic drug, anti-PD-1 antibody, nibolumab, pembrolizumab, anti-PD-L1 antibody, atezolizumab, anti-CTLA4 antibody, ipilimumab, anti-CD20 antibody, rituximab, anti HER2 antibody, trussumab, anti-CCR4 antibody, mogamurizumab, anti-VEGF antibody, bevasizumab, anti-VEGF receptor antibody, soluble VEGF receptor fragment, anti-TWEAK antibody, anti-TWEAK receptor antibody,
  • the agent of the present invention can be administered parenterally for the purpose of improving symptoms.
  • parenteral administration for example, it can be a nasal agent, and a liquid agent, a turbid agent, a solid preparation and the like can be selected.
  • Another form of parenteral administration may be an injection, and the injection may be a subcutaneous injection, an intravenous injection, a drip injection, an intramuscular injection, an intraventricular injection, an intraperitoneal injection, or the like. Can be selected.
  • other preparations used for parenteral administration include suppositories, sublingual agents, transdermal agents, transmucosal agents other than nasal agents, and the like. Further, it can be locally administered intravascularly by containing or applying it to a stent or an intravascular embolic agent.
  • the dose of the therapeutic or prophylactic agent in the present invention varies depending on the age, sex, body weight, symptom, therapeutic effect, administration method, treatment time, type of active ingredient contained in the pharmaceutical composition, and the like of the patient.
  • the main ingredient is in the range of 0.1 mg to 1 g, preferably 0.5 mg to 100 mg, once every 1 to 4 weeks, or 1 to 1 to 2 months.
  • a dose and the number of doses may be sufficient, and a dose and the number of doses exceeding the above range may be required. be.
  • Example 1 Design of humanized antibody of mouse antibody IGF11-16: -Selection of human framework IGF11-16, a mouse monoclonal antibody against the IGF-1 receptor, obtained by the hybridoma method of Kohler et al. (Nature, (1975), Vol.256, pp.495-497) (Patent Document 1). ) Complementarity determining region (CDR) amino acids in the heavy chain variable region (VH) and light chain variable region (VL) were transplanted into a template human antibody.
  • CDR complementarity determining region
  • an amino acid sequence having high homology to the VH and VL amino acid sequences (SEQ ID NO: 39 and SEQ ID NO: 41, respectively) of the mouse antibody IGF11-16 (mouse parent antibody) is used. From the germline of the human antibody having, VH-1-46 (SEQ ID NO: 95) and VH-1-e (SEQ ID NO: 96) as the heavy chain sequence, and JH4 (SEQ ID NO:) as the heavy chain J-segment.
  • VK1-L5 SEQ ID NO: 98
  • VK1-A20 SEQ ID NO: 99
  • JK2 SEQ ID NO: 100
  • Humanized antibodies were prepared by transplanting the necessary amino acid sequences from VH and VL of mouse antibodies IGF11-16 into the FRs of the above template human antibodies VH and VL.
  • VH the CDR amino acid sequence of the template human antibody VH described above and several FR amino acids were replaced with the corresponding amino acid sequences in the VH of the mouse antibody IGF11-16 to humanize the mouse antibody IGF11-16.
  • the amino acid sequence of the VH was designed, and the base sequence of the DNA encoding those amino acids was further designed.
  • VL the CDR amino acid sequence of the template human antibody VL and several FR amino acids were replaced with the amino acid sequences in the VL of the mouse antibody IGF11-16, and the amino acid sequence of the humanized mouse antibody IGF11-16 was designed. Then, the base sequence of the DNA encoding those amino acids was designed.
  • the composition of the heavy chain and light chain of the designed humanized antibody is shown in Table 2 below.
  • a humanized heavy chain composed by connecting a designed humanized antibody heavy chain variable region and a heavy chain constant region, and a designed humanized antibody light chain variable region.
  • VL22 is a light chain variable region and a human ⁇ chain constant region is linked thereto
  • VH13_PS is a heavy chain variable region
  • IgG4S228P heavy chain constant is used therein.
  • a humanized antibody constructed in combination with a heavy chain in which regions are linked.
  • Example 2 Preparation of humanized antibody: DNA encoding the heavy chain variable region of the designed humanized antibody and the heavy chain constant region of the human IgG4S228P mutant, which is a mutant stabilized by the human IgG4 subclass, were synthesized and integrated into the pcDNA3.4 system expression vector. Then, a plasmid expressing the humanized antibody heavy chain was used.
  • DNA encoding the humanized antibody light chain region linked to the ⁇ chain constant region was synthesized and incorporated into a pcDNA3.4 system expression vector to express the humanized antibody light chain. It was made into a plasmid to be used.
  • Various antibodies were expressed by mixing these humanized antibody heavy chain expression plasmids and humanized antibody light chain expression plasmids and introducing them into cells using ExpiCHO (registered trademark) Expression System (Thermo Fisher Scientific). ..
  • ExpiCHO registered trademark
  • a humanized antibody expressed by combining a heavy chain expression plasmid incorporating FW1_VH1 and a light chain expression plasmid incorporating FW1_VL1 was incorporated into a FW1_var1 antibody, and a heavy chain expression plasmid incorporating FW2_VH1 and FW2_VL2 were incorporated.
  • the humanized antibody expressed in combination with the light chain expression plasmid was named FW2_var2 antibody, respectively.
  • FW1_var9, FW1_var10, and FW1_var14 were similarly implemented and named.
  • the humanized antibody was obtained by affinity purification of the culture supernatant of the cells into which the humanized antibody heavy chain and the humanized antibody light chain expression plasmid were introduced using a protein A column. Subsequent preparation of humanized antibody was performed according to the above method.
  • PathHunter by (R) IGF-1 agonism To detect activation activity IGF-1 receptor designed humanized antibody, PathHunter (TM) IGF1R Functional using Assay (DiscoverX), activation of IGF-1 receptor signaling by the following steps was measured.
  • Cells expressing the IGF-1 receptor were placed in a poly-D-lysine-coated or collagen-I-coated 96-well plate (Black / clear or White / clear) at 90 ⁇ L / well (2 ⁇ 10 4 cells / well). Or seeded at 5 ⁇ 10 3 cells / well) and incubated at 37 ° C. and 5% CO 2 conditions. The next day, each concentration of drug was added at 10 ⁇ L / well and incubated at 37 ° C. and 5% CO 2 conditions.
  • the next day 30 ⁇ L of the culture supernatant was taken, 15 ⁇ L of the substrate solution was added, the reaction was carried out for 60 minutes, and the luminescence signal (RLU) was measured with a luminometer (Tristar, Berthold).
  • the relative value of the humanized antibody was calculated with the value obtained by subtracting the value at the time of adding the antibody 0.1 nM from the fluorescence intensity due to the addition of the 12.5 nM antibody as the activation intensity and the value of the mouse parent antibody IGF11-16 as 1. ..
  • A61, Q62, Q65, and G66 of the heavy chain CDR2 region which is a sequence portion different from that of the mouse, are replaced with N61, E62, K65, and S66, respectively, in mice.
  • Amino acid-substituted humanized antibodies (FW1_var10_NEKS, FW1_var14_NEKS) made the same as the parent antibody were prepared, and the mouse parent antibodies IGF11-16 and FW1_var1 were used as comparison targets to compare the IGF-1 receptor activation ability in the same manner as described above. did.
  • humanized antibodies in which FR1, FR2, and FR3 were replaced with mouse FRs were prepared.
  • the mouse FR substitutes of the prepared humanized antibody are shown in Table 5.
  • the IGF-1 receptor signaling activation of these substituents were evaluated by a system of previously described PathHunter (registered trademark).
  • PathHunter registered trademark
  • human chimeric IGF11-16 antibody (Chimera) which is a fusion of the variable region of mouse parent antibody IGF11-16 and the constant region of human IgG4 (S228P)
  • S228P human chimeric IGF11-16 antibody
  • S228P constant region of human IgG4
  • the signal intensities at an antibody concentration of 16.7 nM were compared in the same manner as described above.
  • the results are shown in Table 5.
  • examples of nucleic acid base sequences corresponding to the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 29, 31, 33, 35, and 37 are shown in SEQ ID NOs: 30, 32, 34, 36, and 38, respectively
  • the substitute having the same signal intensity as human chimeric IGF11-16 (value within ⁇ 20%) is FW1_var9_mFR-H1, and the mouse heavy chain FR1 is important for maintaining the activity of the humanized antibody. I found out.
  • proline at position 25 in the heavy chain FR1 region is important for maintaining activity.
  • Subsequent heavy chains of humanized antibodies were all P (proline, Pro) substituted at position 25.
  • Example 4 Identification of CDR region amino acids important for maintaining activity by alanine substitution: For the purpose of identifying the amino acids required to retain activity in the CDR regions, each amino acid was replaced with alanine in the mouse parent antibody IGF11-16, and the signal activation ability of the substituted product was determined by EC 50 value and E max value. The binding activity was evaluated by the antigen ELISA. EC 50 value: within 2 times and E max value: within ⁇ 20% were defined as equivalent activity as compared with the mouse parent antibody IGF11-16.
  • IGF-1 receptor signaling activation ability was evaluated by a system of PathHunter (registered trademark) described in Example 3.
  • the EC 50 value and E max were calculated using the analysis software GraphPad Prism.
  • the binding activity was measured by the antigen ELISA in which the extracellular region of the recombinant IGF-1 receptor was immobilized as an antigen.
  • human recombinant IGF-1R manufactured by R & D
  • PBS phosphate buffered saline
  • the prepared human recombinant IGF-1R solution was added to the solidified plate at 50 ⁇ L / well. The reaction was carried out overnight at 4 ° C.
  • the reaction was carried out at room temperature for 45 minutes, washed three times with a washing solution, and then a substrate (pNPP (paranitrophenyl phosphate)) was added to initiate the reaction. After reacting at room temperature for 1 hour, the absorbances at 405 and 550 nm were measured, and the value of the difference between the absorbances of 405 nm and the absorbance of 550 nm was calculated. This value was used as the binding activity for analysis.
  • pNPP paranitrophenyl phosphate
  • Tables 7 and 8 show the prepared IGF11-16 antibody CDR substitutes and the measurement results of signal activation and binding activity. From the obtained results, in the CDR region, the amino acid moiety whose binding activity was reduced to about 10 to 20% by substitution with alanine, that is, tryptophan at position 32 of CDR-L1, tryptophan at position 33 of CDR-H1, and CDR- It has been identified that five amino acids, glutamic acid at position 50 of H2, asparagine at position 52 of CDR-H2 and arginine at position 102 of CDR-H3, are crucial for retention of activity.
  • histidine at position 35 of CDR-H1, serine at position 54 of CDR-H2, asparagine at position 55 of CDR-H2, serine at position 56 of CDR-H2, asparagine at position 59 of CDR-H2, and CDR Since the activity of phenylalanine at position 64 of -H2 decreased due to Ala substitution, it is considered that it contributes to the retention of activity. On the other hand, of the 54 amino acid residues in the alanine-substituted CDR regions, 44 showed 80% or more of the binding activity even after the alanine substitution.
  • Example 5 Design of humanized heavy chain variable region: Since it was found from the results of Example 3 that proline at the 25th position of the heavy chain is important for maintaining the activity, the design was performed with the 25th position of the heavy chain as P and the humanized heavy chain variable regions FW1_VH1 and FW2_VH1 as the basic skeleton. .. Since the amino acid substitution product was examined based on FR1 of FW1_VH1, the amino acid substitution of S16A was performed in order to make the FR1 portion of FW2-VH1 the same as FW1_FR1. The amino acid substitutions introduced for immunogenicity reduction was performed on the basis of Epibase (R) (Lonza, Inc.) immunogenic score analysis results. The designed heavy chain variable region list is shown in Table 9 below.
  • Example 6 Design of humanized light chain variable region: The humanized light chain variable region was designed with FW1_VL1 and FW2_VL2 as the basic skeletons. Amino acid substitutions introduced for immunogenicity score reduction was carried out based on the result of the analysis of Epibase (R) (Lonza, Inc.). A list of designed light chain variable regions is shown in the table.
  • Example 7 Humanized antibody design with deamidation risk amino acid substitution product: If deamidation occurs during the production of humanized antibodies, quality control becomes difficult. Therefore, it is necessary to replace the amino acid at risk of deamidation with another amino acid that does not affect the activity in advance. Sequences generally at risk of deamidation include NG, NT, NS, and NN. The NS sequence is present in the CDR-H2 region of the heavy chain of this humanized antibody. Therefore, amino acid substitution was performed in consideration of the risk that asparagine (N) at position 55 is deamidated and converted to aspartic acid (D). A list of replaced heavy chains is shown in Table 11. Further, examples of the nucleic acid base sequences corresponding to the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 45, 51, and 57 are shown in SEQ ID NOs: 46, 52, and 58, respectively.
  • Example 8 Selection of humanized antibody by IGF-1 receptor signal activating action: Humanized antibodies were evaluated based on the activating effect of the IGF-1 receptor, and humanized antibodies having the same activity as the mouse parent antibody IGF11-16 were selected.
  • IGF-1 receptor of the anti IGF-1 receptor agonist antibodies was determined the activation of IGF-1 receptor signaling using PathHunter (TM) IGF1R Functional Assay (DiscoverX) ..
  • Cells expressing the IGF-1 receptor were placed in a poly-D-lysine-coated or collagen-I-coated 96-well plate (Black / clear or White / clear) at 90 ⁇ L / well (2 ⁇ 10 4 cells / well). Or seeded at 5 ⁇ 10 3 cells / well) and incubated at 37 ° C. and 5% CO 2 conditions. The next day, each concentration of drug was added at 10 ⁇ L / well and incubated at 37 ° C. and 5% CO 2 conditions. The next day, 30 ⁇ L of the culture supernatant was taken, 15 ⁇ L of the substrate solution was added, the reaction was carried out for 60 minutes, and the luminescence signal (RLU) was measured with a luminometer (Tristar, Berthold).
  • RLU luminescence signal
  • the humanized antibody confirmed to have the same activity as the mouse parent antibody IGF11-16 (EC 50 value: within 2 times, E max value: within ⁇ 20% compared with the mouse parent antibody IGF11-16) is shown in the table. Shown in 12.
  • Example 9 Selection of humanized antibody by human myoblast proliferation activity: Humanized antibodies were evaluated based on human myoblast proliferation activity, and humanized antibodies having activity equivalent to that of mouse parent antibody IGF11-16 were selected.
  • the 96-well plate incubated for 4 days was allowed to stand at room temperature for 30 minutes or more after removing the supernatant so that the culture solution became 50 ⁇ L / well.
  • the emission signal was measured with a luminometer (Tristar, Berthold).
  • Table 13 shows the humanized antibodies confirmed to have the same activity as the mouse parent antibody IGF11-16 (EC 50 value: 10 times or less, E max : 90% or more as compared with the mouse parent antibody IGF11-16). show.
  • the graphs of the measurement results are shown in FIGS. 1A to 1F.
  • Example 10 Evaluation of immunogenicity: In order to analyze the immunogenicity of the humanized antibody, using Epibase (TM) in Silico of Lonza, it was calculated immunogenicity score. Lonza's Epibase (TM) in Silico platform, using structural characteristics of the HLA class II receptors previously with binding affinity of the peptide and HLA class II receptors 10-mer which is determined experimentally, the antibody It is an immunogenicity prediction method that predicts potential peptide / HLA binding, which is a condition necessary for activation of T cells present in the contained amino acid sequence, and calculates it as an immunogenicity score.
  • TM Epibase
  • siico platform using structural characteristics of the HLA class II receptors previously with binding affinity of the peptide and HLA class II receptors 10-mer which is determined experimentally, the antibody It is an immunogenicity prediction method that predicts potential peptide / HLA binding, which is a condition necessary for activation of T cells present in the contained amino acid sequence, and calculates it as an immunogenicity score.
  • HLA class II allotypes 43 types of DRB1, 8 types of DRB3 / 4/5, 22 types of DQ, 12 types of DP
  • the immunogenicity score was scored by taking into account the frequency of appearance in addition to the binding affinity of allotypes.
  • Example 11 Evaluation of binding activity to mammalian IGF-1 receptor: Anti-IGF against IGF-1 receptors in humans (SEQ ID NO: 71), crab monkeys (SEQ ID NO: 73), rabbits (SEQ ID NO: 75), guinea pigs (SEQ ID NO: 77), rats (SEQ ID NO: 79) and mice (SEQ ID NO: 81). In order to examine the binding activity of the -1 receptor agonist antibody, Cell-based ELISA was performed using cells expressing various IGF-1 receptors.
  • HEK293T cells After lipofection was added to HEK293T cells were incubated over night in 96 well plates at 4 ⁇ 10 4 cells / well (poly -D- lysine-coated), 10% buffered formalin (Mildform (registered trademark) 10 nm, Wako) The one that was fixed using and blocked with a phosphate buffer solution containing 3% BSA was used for ELISA.
  • ELISA was prepared by adding 100 ⁇ L of each humanized antibody solution prepared to 5 nM with 1% BSA / 1% FBS / PBS to each well and reacting at 37 ° C. for about 1 hour. It was washed 3 times with a washing solution. 100 ⁇ L of anti-human IgG antibody HRP conjugated solution prepared at each concentration with 1% BSA / 1% FBS / PBS was added to each well, reacted at 37 ° C. for about 1 hour, and washed 3 times with a washing solution. .. 100 ⁇ L of substrate (TMB) was added to each well to initiate the reaction.
  • TMB substrate
  • FIG. 2 shows the results of reactivity of humans, guinea pigs, cynomolgus monkeys, and rabbits with each IGF-R.
  • the humanized antibodies hIGF13_PS and hIGF25_PS increased the binding activity of human, guinea pig, cynomolgus monkey, and rabbit IGF-1 receptors by about twice as much as those of Mock cells, and the human mouse chimera. It was as reactive as antibody IGF11-16.
  • the binding activity to cells expressing the IGF-1 receptor in rats and mice was similar to that of Mock cells.
  • Binding affinity for IGF-1 receptor by surface plasmon resonance method To examine the binding properties (binding rate and dissociation rate) of the drug to the IGF-1 receptor, it was measured by the surface plasmon resonance (SPR) method.
  • the measurement system used was the BIACORE T200 system.
  • Anti-histidine-tagged monoclonal antibody was applied to all flow cells of the sensor chip CM3 (BR-1005-36, GE) with AmineCouplingKit (BR-1000-50, GE) and HisCaptureKit (28-9950-56, GE). , Approximately 3000 RU fixed and used.
  • HBS-EP + (BR-1006-69, GE) was used as the running buffer.
  • IGF-1R-His a recombinant human IGF-1 receptor histidine tag (305-GR-050, R & D SYSTEMS, hereinafter IGF-1R-His) was captured and used in the measurement system.
  • Analite used each concentration of drug.
  • a flow cell that did not capture IGF-1R-His was used as a ligand negative control.
  • PBS PBS pH 7.4 (1x), # 10010049, Gibco
  • the measurement temperature of the measurement system was set to 40 ° C.
  • the anti-histidine-tagged monoclonal antibody of Frocel (2 and 4) was reacted with IGF-1R-His ( ⁇ 2 ⁇ 10 -8 M) so as to be 100 RU or less.
  • IGF-1R-His ⁇ 2 ⁇ 10 -8 M
  • 10 nM purified mice IgG2a, ⁇ , isotype Ctrl, Clone: MG2a-53 (401502, BioLegend, hereinafter ctrl IgG2a) were reacted for 1 minute, and HBS-EP + was allowed to flow for 10 minutes or longer.
  • Analite was serially diluted with HBS-EP + (0.5-8 ⁇ 10 -10 M) and reacted with all flow cells.
  • Example 13 In vivo hypoglycemic action (hypoglycemic action in guinea pigs): In order to confirm the presence or absence of the in vivo hypoglycemic effect of the anti-IGF-1 receptor agonist antibody, hIGF13_PS and hIGF25_PS were administered once to guinea pigs, and the blood glucose level was measured over time to determine the hypoglycemic effect. The presence or absence was examined. The hypoglycemic action is an action of lowering the blood glucose level to 50 mg / dL or less or causing hypoglycemic symptoms.
  • the guinea pig was fasted for 12 hours, and each humanized antibody: hIGF13_PS and hIGF25_PS was intravenously administered at 10 mg / kg in a single dose.
  • Guinea pigs were fasted until 24 hours after dosing.
  • Wakeful guinea pigs were collected before administration (0 hours), 1, 2, 4, 8, 24, 48, 72, and 144 hours after administration, and used with a glutest sensor (Sanwa Chemical Laboratory). The blood glucose level was measured. The results are shown in FIGS. 3A and 3B.
  • each humanized antibody does not have a remarkable hypoglycemic effect like IGF-1, and does not affect the blood glucose level. Therefore, as a drug for overcoming hypoglycemia, which is a side effect of IGF-1. The possibility of was shown.
  • Example 14 Blood kinetics of humanized antibody in guinea pigs: The guinea pigs were fasted for 12 hours and a single intravenous dose of 1 and 10 mg / kg of humanized antibodies hIGF13_PS and hIGF25_PS or IGF11-16 (mouse parent antibody) was administered. Guinea pigs were fasted until 24 hours after dosing and re-fed 24 hours later. Awake guinea pigs were collected before administration (0 hours), 2, 4, 8, 24, 48, 72, 96, 120, and 144 hours after administration, and the plasma humanized antibody concentration was measured by ELISA. ..
  • the antibody having a known concentration administered to the guinea pig was serially diluted with guinea pig plasma to obtain a standard substance.
  • the standard substance and plasma were diluted 10 to 1000 times and measured.
  • a 0.5 ⁇ g / mL PBS solution of recombinant IGF-1R was added to a 96-well plate (MaxiSorp (NUNC)) and fixed at 4 ° C. overnight. Further blocking was performed with 3% BSA / PBS to prepare a recombinant IGF-1R fixation plate.
  • guinea pig plasma to which no antibody was administered was used, and the administered antibody was serially diluted to obtain a standard substance. Plasma and standard material were diluted 10-fold and added to recombinant IGF-1R fixation plates at 50 ⁇ L / well.
  • the reaction was carried out at room temperature for 1 hour and 30 minutes, and then a washing operation was carried out with PBS-T (PBS, 0.025% Tween 20). Then, a solution of alkaline phosphatase-labeled anti-human IgG (H + L) polyclonal antibody (Southern Biotechnology Associates, Cat # 2087-04) diluted 2000 times with 3% BSA / PBS was added at 50 ⁇ L / well, and the mixture was added at room temperature for 1 hour. It was reacted.
  • PBS-T PBS, 0.025% Tween 20
  • H + L alkaline phosphatase-labeled anti-human IgG polyclonal antibody
  • the results are shown in Fig. 4.
  • the plasma humanized antibody concentration increased depending on the dose, and even in the low dose group, the plasma humanized antibody concentration up to 144 hours after administration was maintained at about 50% or more as compared with 24 hours after administration.
  • the blood kinetics of the humanized antibody was shown to be superior in sustainability as compared with the mouse parent antibody IGF11-16.
  • Example 15 Muscle mass increasing action of humanized antibody in normal guinea pigs: A single dose of hIGF13_PS was intravenously administered to normal guinea pigs, and the muscle mass was measured 2 weeks later. did.
  • hIGF13_PS and mouse parent antibody IGF11-16 was intravenously administered to normal guinea pigs at 0.1 mg / kg.
  • human IGF-I (mecasermin) was subcutaneously implanted using an osmotic pump (Arzet) and continuously administered at 1 mg / kg / day.
  • osmotic pump As a control, only the solvent was administered intravenously.
  • the guinea pig was exsanguinated under anesthesia, the extensor digitorum longus muscle was removed, and the muscle mass was measured.
  • the results are shown in Fig. 5.
  • the drug efficacy was similar to that of the group in which human IGF-I was continuously administered at 1 mg / kg / day and the drug efficacy intensity in which the mouse parent antibody IGF11-16 was intravenously administered.
  • hIGF13_PS can be expected to have the same efficacy as the continuous administration of human IGF-1 for 2 weeks by a single dose.
  • Example 16 Growth plate cartilage elongation action in pituitary excised guinea pigs of humanized antibody: The epiphyseal line thickness of the proximal tibia was evaluated using a guinea pig pituitary excision (HPX) model as an evaluation of the growth plate cartilage proliferation effect of hIGF13_PS.
  • HPX guinea pig pituitary gland removal
  • HIGF13_PS was subcutaneously administered once to pituitary excised guinea pigs at 0.3 mg / kg and 1.0 mg / kg, and the right lower limb was collected 2 weeks later.
  • a tissue specimen of the growth plate cartilage in the proximal part of the tibia was prepared, and the thickness of the growth plate cartilage (epiphyseal plate thickness) was measured by Truisin Blue.
  • the IGF-1 (mecasermin) preparation was continuously subcutaneously administered at 1 mg / kg / day with an osmotic pump, and the GH (somatropin) preparation was subcutaneously administered at 1 mg / kg / day once daily.
  • the hIGF13_PS antibody has an effect of recovering the obstruction of the epiphyseal line due to the decrease in IGF-1 concentration due to the pituitary excision (HPX) treatment by activating the signal mediated by IGF-1R.
  • HPX pituitary excision
  • Example 17 Hypoglycemic effect of humanized antibody in cynomolgus monkey: In order to confirm the presence or absence of the hypoglycemic effect of the anti-IGF-1 receptor agonist antibody in cynomolgus monkeys, hIGF13_PS was administered once to cynomolgus monkeys, and the blood glucose level was measured sequentially to measure IGF-1 (1 mg / kg). ) was compared with the hypoglycemic effect of a single dose.
  • the hypoglycemic action is an action that lowers the blood glucose to less than 50% or causes hypoglycemic symptoms as compared with the solvent-administered group.
  • Humanized antibody was administered to cynomolgus monkeys at 10 mg / kg once intravenously or subcutaneously. Blood was collected before (0 hours), 5 minutes, 30 minutes, 1, 2, 4, 8, and 24 hours after administration, and the blood glucose level was measured using Medisafe Fit (Terumo Corporation).
  • Example 18 Blood kinetics of humanized antibody in cynomolgus monkeys: The humanized antibody hIGF13_PS was administered once intravenously or subcutaneously to cynomolgus monkeys at 1 and 10 mg / kg. Blood was collected before administration (0 hours), 2, 4, 8, 24, 48, 72, and 144 hours after administration, and the concentration of humanized antibody in plasma was measured by ELISA.
  • the calibration curve for quantification was a standard substance obtained by serially diluting an antibody of known concentration administered to monkeys with monkey plasma. The standard substance and plasma were diluted 10 to 1000 times and measured.
  • a 0.5 ⁇ g / mL PBS solution of recombinant IGF-1R was added to a 96-well plate (MaxiSorp (NUNC)) and fixed at 4 ° C. overnight. Further blocking was performed with 3% BSA / PBS to prepare a recombinant IGF-1R fixation plate.
  • monkey plasma to which no antibody was administered was used, and the administered antibody was serially diluted to obtain a standard substance. Plasma and standard material were diluted 10-fold and added to recombinant IGF-1R fixation plates at 50 ⁇ L / well. The reaction was carried out at room temperature for 1 hour and 30 minutes, and then a washing operation was carried out with PBS-T (PBS, 0.025% Tween 20).
  • the absorbance at 405 nm and 550 nm was measured with a plate reader, and the value of the difference between the absorbances of 405 nm and 550 nm was calculated.
  • a calibration curve was drawn with the antibody concentration as the standard substance, and the antibody concentration in plasma was calculated.
  • Muscle mass increasing action of humanized antibody in cynomolgus monkey Two cynomolgus monkeys were intravenously administered with hIGF13_PS at 1 mg / kg. Muscle mass was measured by the DXA (Dual Energy X-ray Absorptiomyomy) method before administration and 3 to 4 weeks after administration.
  • DXA Direct Energy X-ray Absorptiomyomy
  • ketamine hydrochloride (Arevipharma GmbH, 50 mg / mL, 0.2 mL / kg) and an aqueous solution of medetomidine hydrochloride (domitol, Orion Corporation, 1 mg / mL, 0.08 mL / kg) were used.
  • General anesthesia is performed by intramuscular administration (buttock), and using a dual energy X-ray absorption measuring device (Discovery-A, HOLOGIC), fat mass (Fat Mass, g) and non-fat mass (Lean Body Mass, g) are used.
  • Bone mass Bone Mineral Content (BMC), g) was measured, and non-fat mass was analyzed as muscle mass.
  • BMC bone mineral content
  • Lean + BMC g
  • muscle mass g was calculated, and compared with the muscle mass before administration.
  • hIGF13_PS was subcutaneously administered to 2 cynomolgus monkeys at 10 mg / kg. Muscle mass was measured by the DXA (Dual Energy X-ray Absorptiomyomy) method before administration and 3 to 4 weeks after administration.
  • DXA Direct Energy X-ray Absorptiomyomy
  • ketamine hydrochloride (Arevipharma GmbH, 50 mg / mL, 0.2 mL / kg) and an aqueous solution of medetomidine hydrochloride (domitol, Orion Corporation, 1 mg / mL, 0.08 mL / kg) were used.
  • General anesthesia is performed by intramuscular administration (buttock), and using a dual energy X-ray absorption measuring device (Discovery-A, HOLOGIC), fat mass (Fat Mass, g) and non-fat mass (Lean Body Mass, g) are used.
  • Bone mass Bone Mineral Content (BMC), g) was measured, and non-fat mass was analyzed as muscle mass.
  • BMC bone mineral content
  • Lean + BMC g
  • Example 20 Effect of IGF11-16 on HepG2 cell proliferation The concentration-dependent effect of the mouse parent antibody IGF11-16 on HepG2 cell proliferation was evaluated by a cell survival assay.
  • HepG2 cell lines were suspended in DMEM (Gibco, 11995) with 1% FBS and seeded in collagen-I coated 96-well plates (Corning, 356650) at 0.25 ⁇ 10 4 cells / well. The next day, BSA / PBS, IGF-1 (mecasermin), control mouse IgG1 antibody (mIgG1), IGF11-16 antibody, and Sixtumumab (IGF-1 receptor antagonist antibody) were diluted from 50 nM at a ratio of 1/10. And added.
  • the mouse parent antibody IGF11-16 showed an inhibitory effect on HepG2 cell proliferation. From this result, it was considered that IGF11-16 could exhibit an antagonistic effect on at least certain cancer cells.
  • Example 21 Effect of IGF11-16 on the proliferative activity of human breast cancer cell line (MCF7) by IGF-1 to evaluate the effect of IGF11-16 on the proliferative activity of human breast cancer cell line (MCF7) by IGF-1, 50 nM The concentration-dependent proliferative activity of hIGF-1 (mechaselmin) under the condition of coexistence of IGF11-16 was measured by the amount of intracellular ATP 2 days after the addition.
  • Human breast cancer cell lines were cultured in DMEM / F12 medium containing 10% FBS. The next day, using DMEM / F12 medium containing 10% FBS, seeded in 96-well plates (Collagen-type I coated) at 0.1 mL / well (2.5 ⁇ 10 3 cells / well) at 37 ° C. Incubated under 5% CO 2 conditions. The day after cell seeding, the medium was replaced with DMEM / F12 medium containing 1% BSA, and the cells were incubated at 37 ° C. and 5% CO 2 for about 8 hours.
  • the mouse parent antibody IGF11-16 has an inhibitory effect on reducing the maximum activity of the human breast cancer cell line (MCF7) by IGF-1. From this result, it was considered that IGF11-16 has the action of an allosteric antagonist.
  • the present invention provides an anti-IGF-1 receptor humanized antibody that specifically binds to the IGF-1 receptor in vertebrates and does not lower blood glucose levels while increasing muscle mass via the IGF-1 receptor. It can be used for the treatment, prevention, or diagnosis of diseases associated with the IGF-1 receptor. The present invention can also be used for the treatment, prevention, or diagnosis of diseases associated with cell overgrowth or activation by suppressing the excessive signal of the IGF-1 receptor, and is industrially available. The value is extremely high.

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Abstract

マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６に由来する重鎖及び軽鎖のＣＤＲと、ヒト抗体に由来する重鎖及び軽鎖の各ＦＲとを含むと共に、少なくとも１つのＣＤＲが、マウス親抗体の対応するＣＤＲに対して、少なくとも１箇所のアミノ酸残基の置換を含む、抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。

Description

抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体
　本発明は、抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体に関する。具体的には、ＩＧＦ－１受容体に特異的に結合する抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体に関する。
１．ＩＧＦ－１
　ＩＧＦ－１は、インスリン様成長因子であり、下垂体から分泌される成長ホルモン（ＧＨ）によるＧＨ受容体の活性化を介して、主に肝臓から分泌され、ＩＧＦ－１受容体に作用することにより、各種臓器で種々の生理機能を発現する。このことからＩＧＦ－１は、種々の疾患への治療が期待される。ＩＧＦ－１は、プロインスリンのアミノ酸配列と比較して、約４０％と高い相同性を有することから、インスリン受容体にも結合して、インスリン様の作用を発現することがある。また、ＩＧＦ－１受容体は、インスリン受容体のアミノ酸配列と比較して、約６０％と高い相同性を有することから、両受容体はヘテロ二量体を形成することによっても、生理作用を発揮する。なお、インスリンは、インスリン受容体に作用することにより、強力な血糖低下作用を発現することから、血糖降下薬として治療に用いられている。
２．ＩＧＦ－１受容体
　ＩＧＦ－１受容体はα鎖及びβ鎖で構成され、Ｌ１、ＣＲ、Ｌ２、Ｆｎ１、Ｆｎ２、及びＦｎ３の６つの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む膜貫通タンパク質である。ＩＧＦ－１受容体の細胞内ドメインは、チロシンキナーゼを有する。細胞外ドメインは、ＩＧＦ－１がＩＧＦ－１受容体に結合した時の当該受容体の立体構造の変化に伴う、細胞内のチロシンキナーゼの活性化に関与する。ＩＧＦ－１受容体は、ホモ二量体複合体（ホモ型）を形成して、ＩＧＦ－１が結合すると、受容体キナーゼを活性化することにより信号を送る。また、インスリン受容体とのヘテロ二量体複合体（ヘテロ型）を形成して、インスリン又はＩＧＦ－１が結合すると、受容体キナーゼを活性化することにより信号を送る。
３．ＩＧＦ－１の生理作用
　ＩＧＦ－１は、身長や体重増加等の成長促進作用、及び、糖代謝促進や血糖低下作用等のインスリン様代謝作用が明らかにされている。ヒト組換えＩＧＦ－１であるメカセルミンは、インスリン受容体異常症の高血糖、高インスリン血症、黒色表皮腫及び多毛といった症状を改善することが認められている。また、成長ホルモン抵抗性低身長症の成長障害を改善することが認められている（非特許文献１）。
４．ＩＧＦ－１の成長促進作用
　ＩＧＦ－１は、成長促進の主要な因子である（非特許文献２、非特許文献３）。実際に、ヒト組換えＩＧＦ－１であるメカセルミンは、低身長症の治療薬として臨床で用いられている。また、ＩＧＦ－１はヒト軟骨細胞のＤＮＡ合成能を亢進させることが知られている。また、ＩＧＦ－１の投与は、下垂体摘出ラットの体重を増加させ、大腿骨骨長を伸長させる。
５．ＩＧＦ－１の筋肉量増加作用
　ＩＧＦ－１を介した細胞増殖活性の亢進は、ＩＧＦ－１受容体の持続的な活性化が必要である。ＩＧＦ－１受容体を過剰発現させた動物では筋肉量が増加している。また、ＩＧＦ－１／ＩＧＦＢＰ３の持続投与は、大腿骨近位部骨折患者の握力を亢進させ、介助なしでの座位からの立ち上がり能力を改善させる。高齢のヒト及びマウスの筋肉中のＩＧＦ－１濃度は、若齢と比較して低下することが知られているが、ＩＧＦ－１を筋組織特異的に強制発現させた高齢のマウスでは、野生型マウスと比較して、筋肉量が改善した（非特許文献４）。
６．筋肉量を増加させる先行品
　グレリン受容体の作動薬であるアナモレリンは、廃用性筋萎縮症であるカケキシアの臨床試験において、除脂肪量を増加させた。一方、副作用として、吐き気及び血糖値の上昇が認められる。ミオスタチンは、アクチビン受容体II（ＡｃｔＲII）に作用して、Ａｋｔ／ｍＴＯＲを阻害する、骨格筋形成の負の制御因子である。抗ミオスタチン抗体であるＬＹ２４９５６５５は、全人工股関節置換術を実施した患者及び高齢者の筋肉量を増加させる。また、抗ＡｃｔＲII抗体であるビマグルマブは、神経筋疾患患者の筋肉量を増加させる。しかし、骨格筋の形成を促進させ、治療のために使用できる薬は現在のところ存在しない。
７．ＩＧＦ－１の血糖低下作用
　ＩＧＦ－１のインスリン様作用として、血糖低下作用が知られている。ＩＧＦ－１は、ラット筋肉由来細胞においてグルコース取込み作用を亢進させる。また、ＩＧＦ－１の投与は、ラットの血糖値を低下させる。ＩＧＦ－１による血糖低下作用は、臨床上の副作用として低血糖症状を惹起させることが報告されている。更に、ＩＧＦ－１は、ヒトへの投与により低血糖症状を起こすことから、治療開始時は、低用量から順次適当量を投与し、投与後の血糖値等を含む各種臨床所見の観察が必要となる。
　ＩＧＦ－１は、Ａｋｔのリン酸化の亢進などを介して血糖低下作用を発現する。Ａｋｔの活性型変異体は、３Ｔ３－Ｌ１細胞のグルコース取込みを亢進させる。一方、Ａｋｔ２を欠損させたマウスは、血糖値が上昇した。また、ラット筋肉由来細胞においてＡｋｔ阻害剤は、インスリン刺激によるグルコース取込みを阻害する。更に、ＩＧＦ－１は、血糖低下作用に関与するインスリン受容体を活性化させることが知られている。これらのことから、ＩＧＦ－１による血糖低下作用には、Ａｋｔの過剰な活性化及びインスリン受容体の活性化が関与することが考えられる。
８．ＩＧＦ－１の短い血中半減期
　ＩＧＦ－１の血中半減期は、短いため治療では頻回投与が必要となる。実際に、ヒト組換えＩＧＦ－１であるメカセルミンは、血中半減期が約１１時間から１６時間であり、低身長症の治療では１日１回から２回の投与が必要である。血中のＩＧＦ－１の約７０から８０％はＩＧＦＢＰ３と結合している。ＩＧＦ－１の遊離体が生理活性を示す。ＩＧＦＢＰ３との結合は、ＩＧＦ－１の血中半減期を約１０時間から１６時間に維持している。ＩＧＦ－１とＩＧＦＢＰ３の配合剤であるＩＰＬＥＸは、血中半減期が約２１時間から２６時間とＩＧＦ－１と比較して長く、１日１回の投与を可能にした薬剤である。しかし、ＩＰＬＥＸは市場から撤退している。ＩＧＦ－１の動態を改善させたＰＥＧ化ＩＧＦ－１も開発が試みられたが、治療に用いられている薬剤は存在しない。
９．ＩＧＦ－１の作用により期待される治療効果
　ＩＧＦ－１は多種の臓器に作用し、その生理機能は多岐にわたることが知られている。例えば、ＩＧＦ－１は、中枢神経系において、ＩＧＦ－１受容体の活性化を介して、ミトコンドリアの保護及び抗酸化作用による神経保護作用があることが報告されている。ＩＧＦ－１は、傷害後の神経突起の形成を促進させる。また、ＩＧＦ－１は、肝硬変の治療に有用であると考えられている。肝硬変は、肝障害又は慢性肝疾患から病態進展したものであり、肝臓の線維化を伴う疾患である。肝硬変モデル動物において、ＩＧＦ－１の投与は、肝臓の線維化を抑制した。更に、ＩＧＦ－１は、腎臓の発達、機能にも関与することが知られている。腎臓のメサンギウム細胞において、ＩＧＦ－１は、糖毒性による酸化ストレス及びアポトーシスに対して保護作用がある。ＩＧＦ－１は、腎症の治療薬として期待される。
　ＩＧＦ－１の投与により改善が期待される病態には、サルコペニア、廃用性筋萎縮症、カケキシア、低身長症、ラロン症、肝硬変、肝線維化、老化、子宮内胎児発育遅延（ＩＵＧＲ）、神経疾患、脳卒中、脊髄損傷、心血管保護、糖尿病、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、腎症、骨粗しょう症、嚢胞性線維症、創傷治癒、筋強直性ジストロフィー、エイズ筋減弱症、ＨＩＶに伴う脂肪再分布症候群、火傷、クローン病、ウェルナー症候群、Ｘ連鎖性複合免疫不全症、難聴、神経性無食欲症及び未熟児網膜症がある。このように、ＩＧＦ－１は、その多彩な生理作用から、種々の疾患の治療薬として期待される。しかし、副作用である血糖低下作用、及び短い半減期による複数回の投与が臨床で用いるための課題である。
１０．抗ＩＧＦ－１受容体アゴニスト抗体
　抗体製剤は、一般的に半減期が長く、月に１回から２回の投与で有効性を示す。抗ＩＧＦ－１受容体アゴニスト抗体は、インビトロ（in vitro）における短時間処理での受容体活性化作用がいくつか報告されている。例えば、抗体３Ｂ７及び抗体２Ｄ１は、インビトロにおいて５時間培養した組換えＩＧＦ－１受容体発現細胞のＤＮＡ合成を促進した（非特許文献５）。また、がん細胞株の増殖抑制活性を有する抗ＩＧＦ－１受容体アンタゴニスト抗体１１Ａ１、１１Ａ４、１１Ａ１１、及び２４－５７は、インビトロにおいて極めて微弱であるがＩＧＦ－１受容体のチロシンのリン酸化を亢進した（非特許文献６）。また、抗体１６－１３、１７－６９、２４－５７、２４－６０、及び２４－３１は、インビトロにおいて短時間における細胞のＤＮＡ合成、及びグルコース取込みの亢進作用を有することが示されており、これらの抗体は血糖低下作用を有する可能性がある（非特許文献７）。
　しかしながら、ＩＧＦ－１受容体チロシンリン酸化は、がん細胞増殖抑制作用を有するαＩＲ－３などの抗ＩＧＦ－１受容体アンタゴニスト抗体でも観察されており、アゴニスト作用の指標にはならない（非特許文献５、６、８）。また、チミジンあるいはＢｒｄＵの取り込みなどＤＮＡ合成を指標とした細胞増殖アッセイにおいても、がん細胞増殖抑制作用を有する抗ＩＧＦ－１受容体アンタゴニスト抗体でもチミジン取り込みが観察されており（非特許文献５～８）、細胞増殖活性を有するアゴニスト抗体の指標とは成り得ない。さらに、２４時間以内の短時間の評価であり、数日間の培養における細胞増殖促進に関するＩＧＦ－１受容体アゴニスト抗体の報告は無かった（非特許文献５～８）。ましてや、インビボ（in vivo）においてＩＧＦ－１受容体に対するアゴニスト活性を示した抗体の報告は無かった。また、ＩＧＦ－１が血糖降下作用と細胞増殖作用の両方を発揮することから、抗ＩＧＦ－１受容体アゴニスト抗体を治療薬としてヒトへ投与するためには、血糖低下作用を回避することが必要であるが、これまでそのような抗ＩＧＦ－１受容体アゴニスト抗体の報告は無かった。また、抗体は分子量が大きく、組織移行性が低いことが知られており脳内移行性は０．１％程度、筋肉組織移行性は２％程度である。そのため、抗体の移行性が低い組織で作用を発揮するためには、極めて低濃度域(ｐＭオーダー)で十分な薬理活性を示す抗体が必要となる。しかしながら、そのような極めて低濃度で作用し得る抗ＩＧＦ－１受容体アゴニスト抗体の報告はこれまで無かった。
　斯かる背景の下、本発明者等は、インビトロにおいて極めて低濃度で筋芽細胞増殖作用を発揮し、斯かる濃度で分化骨格筋細胞の糖取り込みを誘導しない抗ＩＧＦ－１受容体モノクローナルマウス抗体ＩＧＦ１１－１６を作製することに成功している。更に、得られた該モノクローナルマウス抗体が、インビボにおいて低血糖症状を起こすことなく筋量増加作用及び成長板伸長作用を誘導することを確認している（特許文献１）。
１１．抗ＩＧＦ－１受容体アンタゴニスト抗体
　ＩＧＦ－１受容体に結合する抗体は、ＩＧＦ－１とＩＧＦ－１受容体との結合を阻害するアンタゴニスト作用を利用して、悪性腫瘍等の治療への応用が試みられている。しかしながら、既存の抗ＩＧＦ－１受容体アンタゴニスト抗体は単独治療において高血糖等の副作用が多いだけでなく（非特許文献９）、他の抗癌剤との併用により高血糖の発現率が上昇することから（非特許文献１０）、治療への適用は限定的なものになるものと考えられている。近年、甲状腺機能亢進症における眼症への適応でテプロツムマブ（Teprotumumab）が承認された（非特許文献１１）。
国際公開第２０１８／２２１５２１号
ヒト ソマトメジンＣ「製剤ソマゾン（登録商標）注射用１０ｍｇ」医薬品インタビューフォーム、２０１５年５月改訂、第５版 Abuzzahab, M.J., et al., IGF-I receptor mutations resulting in intrauterine and postnatal growth retardation. N Engl J Med, 2003. 349(23): p. 2211-22. Woods, K.A., et al., Intrauterine growth retardation and postnatal growth failure associated with deletion of the insulin-like growth factor I gene. N Engl J Med, 1996. 335(18): p. 1363-7. Musaro, A., et al., Localized Igf-1 transgene expression sustains hypertrophy and regeneration in senescent skeletal muscle, Nature Genetics, 2001, Vol.27, No.2, pp.195-200 Xiong, L., et al., Growth-stimulatory monoclonal antibodies against human insulin-like growth factor I receptor. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992. 89(12): p. 5356-60. Runnels, H.A., et al., Human monoclonal antibodies to the insulin-like growth factor １ receptor inhibit receptor activation and tumor growth in preclinical studies. Adv Ther, 2010. 27(7): p. 458-75. Soos, M.A., et al., A panel of monoclonal antibodies for the type I insulin-like growth factor receptor. Epitope mapping, effects on ligand binding, and biological activity. J Biol Chem, 1992. 267(18): p. 12955-63. Kato, H., et al., Role of tyrosine kinase activity in signal transduction by the insulin-like growth factor-I (IGF-I) receptor. Characterization of kinase-deficient IGF-I receptors and the action of an IGF-I-mimetic antibody (alpha IR-3). J Biol Chem, 1993. 268(4): p. 2655-61. Atzori, F., et al., A Phase I Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Study of Dalotuzumab (MK-0646), an Anti-Insulin-like Growth Factor-1 Receptor Monoclonal Antibody, in Patients with Advanced Solid Tumors. Clin Cancer Res., 2011.17(19):p.6304-12. de Bono J.S., et al., Phase II randomized study of figitumumab plus docetaxel and docetaxel alone with crossover for metastaticcastration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res., 2014.20(7):p.1925-34. Markham. A, Teprotumumab: First Approval. Drugs, 2020. 80(5): p.509-512. Riechman, L., Clark, M., Waldmann, H., Winter, G.: Reshaping human antibodies for therapy. Nature, 1988. 332：p.323-327. Kabat et al., The Journal of Immunology, 1991, Vol.147, No.5, pp.1709-1719 Al-Lazikani et al., Journal of Molecular Biology, 1997, Vol.273, No.4, pp.927-948 Abhinandan, K.R. et al., Molecular Immunology, 2008, Vol.45, pp.3832-3839 Jian, Y. et al., Nucleic Acids Research, 2013, Vol.41, W34-W40 Yamada, T. et al., Therapeutic monoclonal antibodies. Keio Journal of Medicine, 2011, Vol.60, No.2, pp37-46 Burks, E. A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, Vol.94, No.2, pp.412-417 Dumet, C., et al., MAbs, 2019, Vol.11, No.8, pp1341-1350 Saunders, K. O., Frontiers in Immunology, 2019, Vol.10, Article 1296 Walle et al., Expert Opin. Biol. Ther., 2007, Vol.7, No.3, pp.405-418 Silva, J-P., et al., The Journal of Biological Chemistry, 2015, Vol.290, No.9, pp.5462-5469
　本発明は、既報の抗ＩＧＦ－１受容体マウス抗体ＩＧＦ１１－１６（特許文献１）と同等以上の特異性、及び、結合親和性又は活性を有する、抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体、又はそれらの作製方法を提供することを、その目的の一つとする。
　本発明の具体的な目的としては、これらに限定される訳ではないが、例えば、既報の抗ＩＧＦ－１受容体マウス抗体ＩＧＦ１１－１６（特許文献１）と同等以上の特異性、及び、結合親和性又は活性を有するヒト化抗体を取得するための、（１）ヒトフレームワークのデザインに必須なアミノ酸の提供、（２）抗原結合部位であるＣＤＲ配列（本発明ではＫａｂａｔ法により同定）において活性維持に必須なアミノ酸部位の提供、（３）免疫原性低下のためのアミノ酸置換の提供、及び、（４）脱アミド化リスク回避のためのアミノ酸置換の提供、等が挙げられる。
　本発明を利用・応用することにより、例えば、ヒトＩＧＦ－１受容体を介して、低血糖症状を誘導すること無く、筋肉量を増加させることが可能な、抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体を得ることができる。これにより、例えばサルコペニア、廃用性筋萎縮、又はカケキシアなどの、ＩＧＦ－１受容体シグナルに関連する病態又は疾患を改善又は治療することを目的としてヒトへ投与し得る、抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体を得ることができる。また、ヒトへ投与し得る、低免疫原性や物性安定性を確保したヒト化抗体の提供が可能となる。
　即ち、本発明は以下に関する。
［１］マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６に由来する重鎖及び軽鎖の各相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体に由来する重鎖及び軽鎖の各フレームワーク領域（ＦＲ）とを含むと共に、少なくとも１つのＣＤＲが、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６の対応するＣＤＲに対して、少なくとも１箇所のアミノ酸残基の置換を含む、抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［２］重鎖可変領域のフレームワーク領域１（ＦＲ－Ｈ１）の２５位のアミノ酸残基がプロリンである、項［１］に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［３］重鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｈ１）配列として、配列番号１のアミノ酸配列、又は、配列番号１の何れか１箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列、
　重鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｈ２）配列として、配列番号３若しくは配列番号５のアミノ酸配列、又は、配列番号３若しくは配列番号５の何れか１箇所、２箇所、若しくは３箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列、
　重鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｈ３）配列として、配列番号７のアミノ酸配列、又は、配列番号７の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列、
　軽鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｌ１）配列として、配列番号９のアミノ酸配列、又は、配列番号９の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列、
　軽鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｌ２）配列として、配列番号１１のアミノ酸配列、又は、配列番号１１の何れか１箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列、
　軽鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｌ３）配列として、配列番号１３のアミノ酸配列、又は、配列番号１３の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列
を含む、項［１］又は［２］に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［４］重鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｈ１）配列として、配列番号１と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
　重鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｈ２）配列として、配列番号３又は配列番号５と８２％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
　重鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｈ３）配列として、配列番号７と７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
　軽鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｌ１）配列として、配列番号９と８１％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
　軽鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｌ２）配列として、配列番号１１と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
　軽鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｌ３）配列として、配列番号１３と７７％以上の相同性を有するアミノ酸配列
を含む、項［１］又は［２］に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［５］重鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｈ１）配列として、配列番号１の３位のＴｒｐが維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列であって、当該３位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号１と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
　重鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｈ２）配列として、
　　配列番号３の１位のＧｌｕ及び３位のＡｓｎが各々維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されると共に、６位のＡｓｎが維持され、又は、Ｓｅｒ若しくはＧｌｎに置換されたアミノ酸配列であって、当該１位、３位、及び６位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所、２箇所、若しくは３箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号３と８２％以上の相同性を有するアミノ酸配列、或いは、
　　配列番号５の１位のＧｌｕ及び３位のＡｓｎが各々維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されると共に、６位のＳｅｒが維持され、又は、Ａｓｎ若しくはＧｌｎに置換されたアミノ酸配列であって、当該１位、３位、及び６位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所、２箇所、若しくは３箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号５と８２％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
　重鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｈ３）配列として、配列番号７の４位のＡｒｇが維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列であって、当該４位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号７と７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
　軽鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｌ１）配列として、配列番号９の９位のＴｒｐが維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列であって、当該９位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号９と８１％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
　軽鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｌ２）配列として、配列番号１１の何れか１箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号１１と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
　軽鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｌ３）配列として、配列番号１３の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号１３と７７％以上の相同性を有するアミノ酸配列
を含む、項［１］又は［２］に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［６］配列番号７１のアミノ酸配列を有するヒトＩＧＦ－１受容体の細胞外ドメインに特異的に結合する、請求項１～５の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［７］重鎖可変領域として、配列番号４３、４７、４９、５３、５５、若しくは５９のアミノ酸配列、配列番号４３、４７、４９、５３、５５、若しくは５９のアミノ酸配列において１若しくは数箇所のアミノ酸残基が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列、又は、配列番号４３、４７、４９、５３、５５、若しくは５９と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び、
　軽鎖可変領域として、配列番号６５、６７、若しくは６９のアミノ酸配列、配列番号６５、６７、若しくは６９のアミノ酸配列において１若しくは数箇所のアミノ酸残基が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列、又は、配列番号６５、６７、若しくは６９と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
を含む、項［１］～［６］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［８］重鎖及び／又は軽鎖の定常領域として、ヒト免疫グロブリンの何れかのクラスの重鎖及び／又は軽鎖の定常領域を含む、項［１］～［７］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［９］重鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ４クラスの重鎖定常領域又はその１～１０箇所のアミノ酸が置換された定常領域である、項［１］～［８］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１０］重鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ１クラスの重鎖定常領域又はその１～１０箇所のアミノ酸が置換された定常領域である、項［１］～［８］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１１］ＩＧＦ－１受容体に対して平衡解離定数（ＫＤ）１×１０-7Ｍ以下の親和性で結合する、項［１］～［１０］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１２］ＩＧＦ－１受容体シグナル活性化能を有する、項［１］～［１１］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１３］筋芽細胞増殖試験において、増殖活性を有する、項［１］～［１２］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１４］ＢＩＡＣＯＲＥによる組換え可溶性ＩＧＦ－１受容体への結合性試験において、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と同等以上の結合親和性を有する、項［１］～［１３］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１５］正常哺乳動物において、低血糖症状を誘導せず、筋量増加作用を誘導しうる、項［１］～［１４］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１６］下垂体摘出モデル動物において、低血糖症状を誘導せず、成長板軟骨伸長作用を誘導しうる、項［１］～［１５］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１７］脊椎動物の筋肉量及び／又は体長の増加を誘導する用量において当該脊椎動物に投与された場合に、当該脊椎動物の血糖値を低下させない、項［１］～［１６］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１８］脊椎動物の筋肉量及び／又は体長の増加を誘導する有効用量に対して１０倍以上の血中曝露量においても、当該脊椎動物の血糖値を低下させない、項［１］～［１６］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［１９］ＩＧＦ－１受容体シグナル活性化抑制能を有する、項［１］～［１８］の何れか一項に記載のヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［２０］筋芽細胞増殖試験において、ＩＧＦ－１受容体を活性化しうるリガンドであるＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、及びインスリンの少なくとも一つの増殖活性を抑制する、項［１］～［１８］の何れか一項に記載のヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［２１］がん細胞増殖試験において、細胞増殖を抑制する活性を有する、項［１］～［２０］の何れか一項に記載のヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［２２］抗ＩＧＦ－Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体が、１）～４）の少なくとも一つの特徴を有する、項［１］～［２１］のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ－Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
１）ＩＧＦ－Ｉ受容体活性化リガンドによる脊椎動物由来細胞の増殖を阻害する。
２）脊椎動物におけるＩＧＦ－Ｉ受容体活性化リガンドに起因する細胞増殖性疾患における細胞増殖を抑制する。
３）ＩＧＦ－Ｉ受容体活性化リガンドによる脊椎動物由来細胞の増殖を阻害する用量において、分化筋細胞でのグルコース取込みに影響しない。
４）脊椎動物におけるＩＧＦ－Ｉ受容体活性化リガンドに起因する細胞増殖性疾患における細胞増殖を抑制する用量において、当該脊椎動物の血糖値を変動させない。
［２３］担癌モデル動物において、血糖値に影響を与えることなく、がん細胞増殖抑制作用を誘導しうる、項［１］～［２２］の何れか一項に記載のヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［２４］担癌モデル動物において、がん細胞増殖抑制作用を誘導しうる有効用量に対して１０倍以上の血中曝露量においても、当該モデル動物の血糖値に影響を与えない、項［２３］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
［２５］項［１］～［２４］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子。
［２６］項［２５］に記載の核酸分子を少なくとも一つ含むクローニングベクター又は発現ベクター。
［２７］項［２６］に記載のベクターが宿主細胞に導入された組換え体細胞。
［２８］項［１］～［２４］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体を製造する方法であって、項［２７］に記載の組換え体細胞を培養し、前記組換え体細胞から産生される当該抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体を精製する工程を含む方法。
［２９］項［１］～［２４］の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体、項［２５］に記載の核酸分子、項［２６］に記載のベクター、或いは項［２７］に記載の組換え体細胞を有効成分として含む、医薬組成物。
［３０］筋萎縮性疾患又は低身長症の治療に用いられる、項［２９］に記載の医薬組成物。
［３１］筋萎縮性疾患が、廃用性筋萎縮、サルコペニア、又はカヘキシアである、項［３０］に記載の医薬組成物。
［３２］低身長症が、ラロン型低身長症又は成長ホルモン抵抗性低身長症である、項［２８］に記載の医薬組成物。
［３３］ＩＧＦ－１受容体に関連した疾患の治療に用いられる、項［２９］に記載の医薬組成物。
［３４］ＩＧＦ－Ｉ受容体に関連した疾患が、肝臓がん、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、小児がん、先端巨大症、卵巣がん、膵臓がん、良性前立腺肥大症、乳がん、前立腺がん、骨がん、肺がん、結腸直腸がん、頚部がん、滑膜肉腫、膀胱がん、胃がん、ウィルムス腫瘍、転移性カルチノイド及び血管作動性腸管ペプチド分泌腫瘍に関連する下痢、ビポーマ、ウェルナー－モリソン症候群、ベックウィズ－ヴィーデマン症候群、腎臓がん、腎細胞がん、移行上皮がん、ユーイング肉腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病、脳腫瘍、膠芽腫、非膠芽腫性脳腫瘍、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、未分化神経外胚葉性腫瘍、髄芽腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、脳室上衣腫、脈絡叢乳頭腫、巨人症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、血管の平滑筋再狭窄、不適切な微小血管増殖、糖尿病性網膜症、グレーヴズ病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、自己免疫性甲状腺疾患、橋本甲状腺炎、甲状腺眼症、甲状腺機能亢進症ならびにベーチェット病からなる群より選択される疾患である、項［３３］に記載の医薬組成物。
　本発明の抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体は、ヒトＩＧＦ－１受容体に結合することで、ヒトＩＧＦ－１受容体を介して作用する疾患の治療又は予防に使用しうる、抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体を得ることができる。また、ヒトへ投与し得る、低免疫原性や物性安定性を確保したヒト化抗体の提供が可能となる。
図１Ａ～Ｆは、本発明の各種ヒト化抗体が有するヒト筋芽細胞増殖活性を、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６との比較で示すグラフである。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図２は、各動物種のＩＧＦ－１Ｒを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いたＥＬＩＳＡにより測定された、各動物種のＩＧＦ－１Ｒに対する本発明のヒト化抗体ｈＩＧＦ１３＿ＰＳ及びｈＩＧＦ２５＿ＰＳの反応性を、ヒトマウスキメラ抗体ＩＧＦ１１－１６との比較で示すグラフである。
図３Ａは、本発明のヒト化抗体ｈＩＧＦ１３＿ＰＳをモルモットに投与した場合における血糖値の推移を示すグラフである。 図３Ｂは、本発明のヒト化抗体ｈＩＧＦ２５＿ＰＳをモルモットに投与した場合における血糖値の推移を示すグラフである。
図４は、本発明のヒト化抗体ｈＩＧＦ１３＿ＰＳ及びｈＩＧＦ２５＿ＰＳをモルモットに投与した場合における血中濃度の推移を、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６投与時との比較で示すグラフである。
図５は、本発明のヒト化抗体ｈＩＧＦ１３＿ＰＳを正常モルモットに静脈内単回投与した場合における２週間後の長趾伸筋質量の変化を、ＩＧＦ－１の皮下持続投与及びマウス親抗体ＩＧＦ１１－１６の静脈内単回投与との比較で示すグラフである。
図６は、本発明のヒト化抗体ｈＩＧＦ１３＿ＰＳを下垂体摘出モルモットに静脈内単回投与した場合における２週間後の脛骨近位部の骨端線厚の変化を、ＩＧＦ－１の皮下持続投与及びＧＨ製剤の皮下持続投与との比較で示すグラフである。
図７は、本発明のヒト化抗体ｈＩＧＦ１３＿ＰＳをカニクイザルに投与した場合における血糖値の推移を、ＩＧＦ－１投与時との比較で示すグラフである。
図８は、本発明のヒト化抗体ｈＩＧＦ１３＿ＰＳをカニクイザルに投与した場合における血中濃度の推移を示すグラフである。
図９は、ＨｅｐＧ２細胞増殖に対してマウス親抗体ＩＧＦ１１－１６が及ぼす濃度依存的な作用を示すグラフである。
　以下、本発明を具体的な実施形態に基づき説明するが、本発明はこれらの実施形態に何ら限定されない。なお、本明細書において引用する特許公報、特許出願公開公報、及び非特許公報を含む全ての文献は、あらゆる目的において、その全体が援用により本明細書に組み込まれる。
　なお、本明細書において、濃度を示す「Ｍ」は、モル濃度を示す「ｍｏｌ／Ｌ」と同義の単位である。
　本発明は、ＩＧＦ－１受容体に特異的に結合する、抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体である。本発明の抗体は、ヒトＩＧＦ－１受容体を介して、低血糖症状を誘導すること無く、筋肉量を増加させる作用を有する。これにより、サルコペニア、廃用性筋萎縮、カケキシアなどのＩＧＦ－１受容体シグナル関与の病態又は疾患を改善又は治療することが可能である。また、本発明の抗体は、低免疫原性及び物性安定性を確保したヒト化抗体である。
［ＩＧＦ］
　本開示において「ＩＧＦ」とは、インスリン様成長因子（Insulin-like Growth Factor）のことをいい、ＩＧＦ－１とＩＧＦ－２が存在する。ＩＧＦ－１及びＩＧＦ－２は、後述のＩＧＦ－１受容体（インスリン様成長因子－Ｉ受容体：Insulin-like Growth Factor-I Receptor）に結合して、細胞内に細胞分裂や代謝のシグナルを入れるアゴニスト活性を有する生体内のリガンドである。ＩＧＦ－１及びＩＧＦ－２は、ＩＧＦ－１受容体と構造的に類似性のあるインスリン受容体（ＩＮＳＲ）にも弱く交差的に結合することが知られている。本明細書では、生理的機能等がよりよく知られているＩＧＦ－１を主に扱うが、ＩＧＦ－１受容体とリガンドとの結合を介する作用や疾患等の検討を行う場合には、ＩＧＦ－１とＩＧＦ－２の両者の作用を含めて記載することがある。
　ＩＧＦ－１はソマトメジンＣとも呼ばれ、７０アミノ酸からなる単一ポリペプチドのホルモンである。ヒトのＩＧＦ－１の配列は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ番号：ＮＰ＿０００６０９、又は、ＥＭＢＬ－ＥＢＩのＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－アクセッション番号Ｐ０５０１９等を参照して入手できる。成熟型ヒトＩＧＦ－１のアミノ酸配列を配列番号８３に、対応する核酸塩基配列の一例を配列番号８４にそれぞれ示す。この７０アミノ酸からなる配列は、多くの種で保存されている。本発明においては、「ＩＧＦ－１」とのみ記載された場合は、特に断りがない限り、ホルモン活性を有するＩＧＦ－１タンパク質のことを意味する。
　ＩＧＦ－１は、肝臓細胞をはじめ生体内の種々の細胞で産生されていて、血液やその他の体液中にも存在する。従って、天然型のＩＧＦ－１は動物の体液や、動物から分離した初代培養細胞や株化細胞等を培養した培養物から精製して得ることができる。また、ＩＧＦ－１は成長ホルモンによって細胞での産生が誘導されるため、成長ホルモンが投与された動物の体液や、動物から分離した初代培養細胞や株化細胞等を成長ホルモン存在下で培養した培養物からもＩＧＦ－１を精製することで得られる。また、別の方法として、ＩＧＦ－１のアミノ酸配列をコードする核酸分子を発現ベクターに組み込んで大腸菌等の原核生物や酵母、昆虫細胞又は哺乳類由来の培養細胞等の真核細胞の宿主に導入した組換え体細胞や、ＩＧＦ－１遺伝子を導入したトランスジェニック動物やトランスジェニック植物等を用いて、ＩＧＦ－１を製造することも可能である。更に、ヒトＩＧＦ－１は研究用試薬（Enzo Life Sciences, catalog: ADI-908-059-0100; Abnova, catalog: P3452等）、医薬品（ソマゾン（登録商標）、メカセルミン、ＩＮＣＲＥＬＥＸ（登録商標）等）として入手することも可能である。用いるＩＧＦ－１のインビボ及びインビトロでの活性は、World Health OrganizationのNational Institute for Biological Standards and Control（ＮＩＢＳＣ）のＮＩＢＳＣ ｃｏｄｅ：９１／５５４のＩＧＦ－１標準物質での活性を１国際ユニット／マイクログラムとして比較することで、その比活性を評価することができる。本発明におけるＩＧＦ－１は、当該ＮＩＢＳＣ ｃｏｄｅ：９１／５５４のＩＧＦ－１と同等の比活性を有するものとして扱うものとする。
［ＩＧＦ－１受容体］
　本開示において「ＩＧＦ－１受容体」又は「ＩＧＦ－１Ｒ」とは、インスリン様成長因子－Ｉ受容体（Insulin-like Growth Factor-I Receptor）のことをいう。本明細書において「ＩＧＦ－１受容体」は、特に断りがない限り、ＩＧＦ－１受容体タンパク質を意味する。ＩＧＦ－１受容体はα鎖とβ鎖からなるサブユニットが２つ会合した構造のタンパク質である。配列番号７１に示したヒトＩＧＦ－１受容体のアミノ酸配列においては、そのアミノ酸配列のうち、３１位から７３５位のアミノ酸配列からなる部分がα鎖に相当し、β鎖は７４０位以降の配列に相当する。ＩＧＦ－１受容体のα鎖はＩＧＦ－１の結合部分を有し、β鎖は膜貫通型の構造であり、細胞内へのシグナルを伝える働きをする。ＩＧＦ－１受容体のα鎖は、Ｌ１、ＣＲ、Ｌ２、ＦｎIII－１及びＦｎIII－２ａ／ＩＤ／ＦｎIII－２ｂのドメインに分かれる。配列番号７１に示したヒトＩＧＦ－１受容体のアミノ酸配列においては、３１位から１７９位の部分がＬ１ドメイン、１８０位から３２８位の部分がＣＲドメイン、３２９位から４９１位の部分がＬ２ドメイン、４９２位から６０７位の部分がＦｎIII－１ドメイン及び６０８位から７３５位までがＦｎIII－２ａ／ＩＤ／ＦｎIII－２ｂドメインに相当する。ヒトのＩＧＦ－１受容体のアミノ酸配列は、ＥＭＢＬ－ＥＢＩのＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－アクセッション番号Ｐ０８０６９等から参照することが可能であるが、配列表の配列番号７１にも示す。
　ＩＧＦ－１受容体は生体内の組織や細胞の広い範囲で発現していることが知られており、ＩＧＦ－１による細胞増殖の誘導や細胞内シグナルの活性化等の刺激を受ける。特に筋芽細胞はＩＧＦ－１のＩＧＦ－１受容体を介する作用を、細胞増殖活性を指標として評価に用いることが可能である。このことから筋芽細胞は、ＩＧＦ－１受容体に結合する抗体の作用を解析する上で有用である。また、ヒトやその他の脊椎動物のＩＧＦ－１受容体のアミノ酸配列をコードする核酸分子を発現ベクターに組み込んで、昆虫細胞又は哺乳類由来の培養細胞等の真核細胞の宿主に導入した組換え体細胞において、その細胞膜上に導入された核酸がコードするＩＧＦ－１受容体を発現させることで、ヒトやその他の脊椎動物のＩＧＦ－１受容体を発現した細胞を人工的に製造することが可能である。当該ＩＧＦ－１受容体発現細胞は抗体の結合性の解析や細胞内へのシグナルの伝達等の検討に用いることができる。
［マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６］
　マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６は、特許文献１に開示されている。ＩＧＦ１１－１６のＣＤＲ－Ｈ１のアミノ酸配列は配列番号８５、ＣＤＲ－Ｈ２のアミノ酸配列は配列番号８６、ＣＤＲ－Ｈ３のアミノ酸配列は配列番号８７、ＣＤＲ－Ｌ１のアミノ酸配列は配列番号８８、ＣＤＲ－Ｌ２のアミノ酸配列は配列番号８９、ＣＤＲ－Ｌ３のアミノ酸配列は配列番号９０、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号３９（対応する核酸塩基配列の一例を配列番号４０）、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号４１（対応する核酸塩基配列の一例を配列番号４２）に示す。ＩＧＦ１１－１６の軽鎖の全長アミノ酸配列を配列番号９１（対応する核酸塩基配列の一例を配列番号９２）に、重鎖の全長アミノ酸配列を配列番号９３（対応する核酸塩基配列の一例を配列番号９４）に示す。ＩＧＦ１１－１６の表現を含む抗体は、全てこのマウス親抗体ＩＧＦ１１－１６を意味する。
［抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体］
　本発明の一側面によれば、新規な抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体が提供される（これを以下適宜「本発明の抗体」と称する。）。
　本開示において「抗体」とは、ジスルフィド結合により相互結合された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨと略される）及び重鎖定常領域を含み、重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬと略される）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬを含む。軽鎖の定常領域にはλ鎖及びκ鎖と呼ばれる２種類が存在する。重鎖の定常領域にはγ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖及びε鎖が存在し、その重鎖の違いによって、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥという抗体のアイソタイプが存在する。ＶＨ及びＶＬは、更にフレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存されている４つの領域（ＦＲ－１（ＦＲ１）、ＦＲ－２（ＦＲ２）、ＦＲ－３（ＦＲ３）、ＦＲ－４（ＦＲ４））と、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の３つの領域（ＣＤＲ－１（ＣＤＲ１）、ＣＤＲ－２（ＣＤＲ２）、ＣＤＲ－３（ＣＤＲ３））に細分される。ＶＨは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、ＦＲ－１（ＦＲ－Ｈ１）、ＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｈ１）、ＦＲ－２（ＦＲ－Ｈ２）、ＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｈ２）、ＦＲ－３（ＦＲ－Ｈ３）、ＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｈ３）、ＦＲ－４（ＦＲ－Ｈ４）の順番で配列された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲを含む。ＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、ＦＲ－１（ＦＲ－Ｌ１）、ＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｌ１）、ＦＲ－２（ＦＲ－Ｌ２）、ＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｌ２）、ＦＲ－３（ＦＲ－Ｌ３）、ＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｌ３）、ＦＲ－４（ＦＲ－Ｌ４）の順番で配列された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲを含む。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。
　本発明の抗体は、抗体の断片及び／又は誘導体であってもよい。抗体の断片としては、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ、Ｆｖ等が挙げられる。抗体の誘導体としては、定常領域部分に人工的にアミノ酸変異を導入した抗体、定常領域のドメインの構成を改変した抗体、１分子あたり２つ以上のＦｃを持つ形の抗体、重鎖のみ又は軽鎖のみで構成される抗体、糖鎖改変抗体、二重特異性抗体、抗体又は抗体の断片化合物や抗体以外のタンパク質と結合させた抗体コンジュゲート、抗体酵素、ナノボディ、タンデムｓｃＦｖ、二重特異性タンデムｓｃＦｖ、ダイアボディ（Diabody）、ＶＨＨ等が挙げられる。なお、本発明において単に「抗体」という場合には、別途明記しない限り、抗体の断片及び／又は誘導体も含むものとする。
　また、モノクローナル抗体とは、古典的には単一の抗体産生細胞に由来するクローンから得られた抗体分子をいうが、特定のアミノ酸配列からなるＶＨとＶＬの組み合わせを含む単一種類の抗体分子のことをいう。モノクローナル抗体は、その抗体のタンパク質のアミノ酸をコードする遺伝子配列を有する核酸分子を得ることも可能であり、そのような核酸分子を用いて遺伝子工学的に抗体を作製することも可能である。また、Ｈ鎖、Ｌ鎖、それらの可変領域やＣＤＲ配列等の遺伝子情報を用いて抗体の結合性や特異性の向上のための改変等を行うことや、マウス等の動物の抗体からヒト型抗体に改変することによって治療剤に用いるために適した構造の抗体を作製することは、この分野での当業者にはよく知られた技術である。また、抗原を感作する動物として、ヒト抗体遺伝子が導入された非ヒト－トランスジェニック動物を用いることによって、ヒトモノクローナル抗体を取得することも可能である。それ以外にも、動物への感作を必要としない方法として、ヒト抗体の抗原結合領域又はその一部を発現するファージライブラリー（ヒト抗体ファージディスプレイ）を用いて、対応する抗原と特異的に結合する抗体や特定のアミノ酸配列からなるファージクローンを取得し、その情報からヒト抗体を作製する技術も当業者であれば適宜行うことができる（例えば非特許文献１７等を参照）。また、ヒト以外の動物に投与する抗体をデザインする場合には、ヒト化の技術と同様に、適宜ＣＤＲや可変領域のアミノ酸配列情報を用いて、当業者であればデザインすることが可能である。
　一態様によれば、本発明の抗体は、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６に由来する重鎖及び軽鎖の各相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体に由来する重鎖及び軽鎖の各フレームワーク領域（ＦＲ）とを含むと共に、少なくとも１つのＣＤＲが、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６の対応するＣＤＲに対して、少なくとも１箇所のアミノ酸残基の置換を含む、抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体である。
　具体的に、本態様において、重鎖及び軽鎖の各相補性決定領域（ＣＤＲ）は、それぞれマウス親抗体ＩＧＦ１１－１６の対応するＣＤＲに由来する。ここで、マウス親抗体「ＩＧＦ１１－１６」とは、前述のように、本発明者等が以前作製した抗ＩＧＦ－１受容体モノクローナルマウス抗体である（特許文献１）。また、本開示において、マウス親抗体のＣＤＲに「由来する」とは、本態様の抗体の各ＣＤＲのアミノ酸配列が、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６の対応するＣＤＲのアミノ酸配列と、通常７５％以上、中でも８０％以上、又は８５％以上、更には９０％以上の相同性（好ましくは同一性）を有すること、及び／又は、通常４アミノ酸残基以下、中でも３アミノ酸残基以下、更には２アミノ酸残基以下の違いを除いて相同（好ましくは同一）であることを意味する（非特許文献１８）。但し、本態様の抗体は、その少なくとも１つのＣＤＲが、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６の対応するＣＤＲに対して、少なくとも１箇所のアミノ酸残基の置換を含むことを要件とする。また、重鎖ＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｈ２）のアミノ酸配列については、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６のＣＤＲ－Ｈ２のアミノ酸配列、或いは、後述するマウス親抗体ＩＧＦ１１－１６から誘導されたヒト化抗体ｈＩＧＦ１３＿ＰＳのＣＤＲ－Ｈ２の何れかと、通常７５％以上、中でも８０％以上、又は８５％以上、更には９０％以上の相同性（好ましくは同一性）を有すること、及び／又は、通常４アミノ酸残基以下、中でも３アミノ酸残基以下、更には２アミノ酸残基以下の違いを除いて相同（好ましくは同一）であればよいものとする。
　また、重鎖及び軽鎖の各フレームワーク領域（ＦＲ）は、それぞれヒトの各クラスの免疫グロブリンの対応するＦＲに由来する。本開示において、ヒトの免疫グロブリンのＦＲに「由来する」とは、本態様の抗体の各ＦＲのアミノ酸配列が、ヒトの免疫グロブリンの対応するＦＲのアミノ酸配列と、通常８０％以上、中でも８５％以上、更には９０％以上の相同性（好ましくは同一性）を有すること、及び／又は、通常４アミノ酸残基以下、中でも３アミノ酸残基以下、更には２アミノ酸残基以下の違いを除いて相同（好ましくは同一）であることを意味する。ヒト免疫グロブリンのフレームワークは、公共のデータベースから入手可能であり、マウス免疫グロブリンのフレームワークと相同性の高いフレームワークを選び出すことができる。なお、相同性を有するアミノ酸配列の同定には、例えばＩｇＢＬＡＳＴを使用することができる（非特許文献１６）。
　ここで、重鎖ＦＲ１の２５位のアミノ酸残基は、プロリンであることが好ましい。マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６の重鎖ＦＲ１とヒト化抗体の重鎖ＦＲ１との間には幾つか異なるアミノ酸残基が存在するが、実施例３に後述するように、本発明者等の検討によれば、ヒト化抗体ではセリンである重鎖ＦＲ１の２５位のアミノ酸残基を、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と同様にプロリンに置換することで、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と同等以上の活性（同等の程度として活性比が±２０％以内）を発揮できるので好ましい。
　上記の相同性を有する重鎖及び軽鎖の取得方法としては、例えば、本発明のヒト化抗体に由来する重鎖及び軽鎖の配列を鋳型として、抗体の進化工学的な手法を用いることが出来る。具体的にはＣＤＲへの部位特異的変異導入法やランダム変異導入法、ｃｈａｉｎシャフリング、ＣＤＲ ｗａｌｋｉｎｇなどの手法が用いられる。
　「ランダム変異導入法（random mutagenesis）」は、特定の遺伝子ＤＮＡに対してランダムな変異を導入し、変異体を作製する方法である。ＰＣＲ法による変異導入法では、ＤＮＡ増幅時に、複製の厳密度の低い条件を選択して、塩基の変異を導入する（error-prone PCR）。ＰＣＲ法で増幅されるＤＮＡの全域に対して任意の部位に変異が導入される。また、ＤＮＡシャッフリング法では、対象遺伝子をまずばらばらに切断後、ＰＣＲ法で同様に変異を導入することができる。さらにＤＮＡ合成の際に特定の合成ステップにおいていくつかの塩基を混合することで意図した領域や部位特異的にランダム変異導入することも可能である。
　「Ｃｈａｉｎ シャフリング（chain shuffling）」は、抗体可変領域のＶＨあるいはＶＬ遺伝子の一方を固定化し、他方をＶ遺伝子ライブラリーと結合させたライブラリーを構築、ファージ上に発現させ、もとの抗原に対する特異性が高い抗体可変領域の組み合わせをスクリーニングする方法である。ナイーブ／非免疫ライブラリーなどから得られた抗体のin vitro 親和性成熟では第一に選択される方法である。
　「ＣＤＲ ｗａｌｋｉｎｇ」は、ＶＨ及びＶＬ遺伝子の各ＣＤＲに対してランダム変異を導入し、その変異体の集団から選択条件を調節することにより結合の強い抗体を選択し、その選択されたＣＤＲを組み合わせて非常に高い結合力をもつクローンを得る方法である。一般的には、ＣＤＲ３のみにランダム変異を導入して検討することが多い。
　このように、一旦活性を有するヒト化親抗体を取得すれば、それを鋳型として活性を保持した新たなヒト化抗体への改変の方法論はほぼ確立されており、ＣＲＯなどで委託可能である。
　一態様によれば、本発明の抗体は、各ＣＤＲ配列として、特定のアミノ酸配列を有することが好ましい。具体的には以下のとおりである。なお、本発明においてアミノ酸配列の「同一性」（identity）とは、一致するアミノ酸残基の割合を意味し、「相同性」（similarity）とは、一致又は類似するアミノ酸残基の割合を意味する。相同性及び同一性は、例えばＢＬＡＳＴ法（ＮＣＢＩのＰＢＬＡＳＴのデフォルト条件）により決定することができる。また、ここで「類似するアミノ酸残基」とは、同様の化学的特質（例えば、電荷又は疎水性）を持つ側鎖を有するアミノ酸残基を意味する。類似するアミノ酸残基としては、例えば以下のグループが挙げられる。例えば、以下のグループに従えば、アラニンを類似のアミノ酸残基に置換する場合は、バリン、ロイシン、イソロイシン又はメチオニン残基に置換することを意味する。
（１）脂肪族側鎖を有するアミノ酸残基：アラニン（Ａｌａ又はＡ）、バリン（Ｖａｌ又はＶ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）及びメチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）残基。
（２）脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸残基：セリン（Ｓｅｒ又はＳ）及びトレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）残基。
（３）アミド含有側鎖を有するアミノ酸残基：アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）及びグルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）残基。
（４）芳香族側鎖を有するアミノ酸残基：フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）残基。
（５）塩基性側鎖を有するアミノ酸残基：リシン（ＬｙｓまたＫ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）残基。
（６）酸性側鎖を有するアミノ酸残基：アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）及びグルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）残基。
（７）硫黄含有側鎖を有するアミノ酸基：システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、及びメチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）残基。
　重鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｈ１）配列としては、配列番号１のアミノ酸配列、又は、配列番号１の何れか１箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列が好ましい。或いは、ＣＤＲ－Ｈ１配列は、配列番号１と８０％以上の相同性（好ましくは同一性）を有することが好ましい。中でも、ＣＤＲ－Ｈ１配列としては、配列番号１の３位のＴｒｐが維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列であって、当該３位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号１と８０％以上の相同性（好ましくは同一性）を有するアミノ酸配列を有することが好ましい。配列番号１のアミノ酸配列に対応する核酸塩基配列の一例を配列番号２に示す。
　重鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｈ２）配列としては、配列番号３若しくは配列番号５のアミノ酸配列、又は、配列番号３若しくは配列番号５の何れか１箇所、２箇所、若しくは３箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列が好ましい。或いは、ＣＤＲ－Ｈ２配列は、配列番号３又は配列番号５と８２％以上の相同性（好ましくは同一性）を有することが好ましい。中でも、ＣＤＲ－Ｈ２配列としては、配列番号３の１位のＧｌｕ及び３位のＡｓｎが各々維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されると共に、６位のＡｓｎが維持され、又は、Ｓｅｒ若しくはＧｌｎに置換されたアミノ酸配列であって、当該１位、３位、及び６位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所、２箇所、若しくは３箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号３と８２％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有することが好ましい。或いは、ＣＤＲ－Ｈ２配列としては、配列番号５の１位のＧｌｕ及び３位のＡｓｎが各々維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されると共に、６位のＳｅｒが維持され、又は、Ａｓｎ若しくはＧｌｎに置換されたアミノ酸配列であって、当該1位、３位、及び６位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所、２箇所、若しくは３箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号５と８２％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有することが好ましい。配列番号３と５のアミノ酸配列に対応する核酸塩基配列の一例を、それぞれ配列番号４と６に示す。
　重鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｈ３）配列としては、配列番号７のアミノ酸配列、又は、配列番号７の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列が好ましい。或いは、ＣＤＲ－Ｈ３配列は、配列番号７と７５％以上の相同性（好ましくは同一性）を有することが好ましい。中でも、ＣＤＲ－Ｈ３配列としては、配列番号７の４位のＡｒｇが維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列であって、当該４位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号７と７５％以上の相同性（好ましくは同一性）を有するアミノ酸配列を有することが好ましい。配列番号７のアミノ酸配列に対応する核酸塩基配列の一例を、配列番号８に示す。
　軽鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｌ１）配列としては、配列番号９のアミノ酸配列、又は、配列番号９の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列が好ましい。或いは、ＣＤＲ－Ｌ１配列は、配列番号９と８１％以上の相同性（好ましくは同一性）を有することが好ましい。中でも、ＣＤＲ－Ｌ１配列としては、配列番号９の９位のＴｒｐが維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列であって、当該９位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号９と８１％以上の相同性（好ましくは同一性）を有するアミノ酸配列を有することが好ましい。配列番号９のアミノ酸配列に対応する核酸塩基配列の一例を、配列番号１０に示す。
　軽鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｌ２）配列としては、配列番号１１のアミノ酸配列、又は、配列番号１１の何れか１箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列が好ましい。或いは、ＣＤＲ－Ｌ２配列は、配列番号１１と８５％以上の相同性（好ましくは同一性）を有することが好ましい。配列番号１１のアミノ酸配列に対応する核酸塩基配列の一例を、配列番号１２に示す。
　軽鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｌ３）配列としては、配列番号１３のアミノ酸配列、又は、配列番号１３の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列が好ましい。或いは、ＣＤＲ－Ｌ３配列は、配列番号１３と７７％以上の相同性（好ましくは同一性）を有することが好ましい。配列番号１３のアミノ酸配列に対応する核酸塩基配列の一例を、配列番号１４に示す。
　特に、本発明の抗体は、以下のＣＤＲ配列の組み合わせを有することが好ましい。即ち、ＣＤＲ－Ｈ１配列として、配列番号１のアミノ酸配列、ＣＤＲ－Ｈ２配列として、配列番号３又は配列番号５のアミノ酸配列、ＣＤＲ－Ｈ３配列として、配列番号７のアミノ酸配列、ＣＤＲ－Ｌ１配列として、配列番号９のアミノ酸配列、ＣＤＲ－Ｌ２配列として、配列番号１１のアミノ酸配列、及びＣＤＲ－Ｌ３配列として、配列番号１３のアミノ酸配列の組み合わせを有することが好ましい。
　なお、抗体におけるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、又はＣＤＲ－Ｌ３の各配列を同定する方法としては、例えばＫａｂａｔ法（非特許文献１３）やＣｈｏｔｈｉａ法（非特許文献１４）、或いはこれらの方法を更に改良した方法（非特許文献１５）などが挙げられる。これらの方法は、この領域の当業者にとっては技術常識であるが、たとえばDr. Andrew C.R. Martin‘s Groupのインターネットホームページ（http://www.bioinf.org.uk/abs/）から概要を知ることも可能である。
　さらに、実施例４で示すように、アラニンスキャンを行うことにより、ＣＤＲのアミノ酸配列の中で結合活性に重要な部位を同定することが出来る。その結果から、後述の表７及び表８に示すアミノ酸残基が極めて重要であることが明らかとなっている。少なくともこの部位のアミノ酸残基は、類似の性質を有するアミノ酸以外のアミノ酸に置換すると、結合性低下につながると考えられる。逆に、同様の性質を有するアミノ酸への置換により、親和性の向上を達成しうる可能性もある。一方で、アラニン置換したＣＤＲ領域５４部位のうち、４４部位はアラニン置換後も８０％以上の結合活性を示した。このことから、これらの部位におけるアミノ酸置換は、結合活性に大きな影響を与えないことが示唆される。このように、ＣＤＲ領域のアミノ酸配列を検索して結合に関与する部位を同定することにより、結合性を保持したまま免疫原性を低下させたり、物性を改善したり、結合性を向上させたりすることが可能である。
　本発明の抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域として、特定のアミノ酸配列を有することが好ましい。具体的には以下のとおりである。なお、本開示において「１箇所若しくは数箇所」とは、特に断り書き無い限り、１箇所、２箇所、３箇所、４箇所、５箇所、６箇所、７箇所、８箇所、９箇所、又は１０箇所の何れかを指すものとする。
　本発明の抗体は、重鎖可変領域として、配列番号４７のアミノ酸配列、又は、配列番号４７のアミノ酸配列において１若しくは数箇所のアミノ酸残基が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列を有することが好ましい。或いは、重鎖可変領域として、配列番号４７と９０％以上の相同性（好ましくは同一性）を有するアミノ酸配列を有することが好ましい。中でも、重鎖可変領域として、ＶＨ１３＿ＰＮ（配列番号４３）、ＶＨ１３＿ＰＳ（配列番号４７）、ＶＨ２３＿ＰＮ（配列番号４９）、ＶＨ２３＿ＰＳ（配列番号５３）、ＶＨ２５＿ＰＮ（配列番号５５）、又はＶＨ２５＿ＰＳ（配列番号５９）のアミノ酸配列を有することが好ましい。配列番号４３、４７，４９，５３，５５，及び５９のアミノ酸配列に対応する核酸塩基配列の一例を、それぞれ配列番号４４、４８，５０，５４，５６，及び６０に示す。
　本発明の抗体は、軽鎖可変領域として、配列番号６７のアミノ酸配列、又は、配列番号６７のアミノ酸配列において１若しくは数箇所のアミノ酸残基が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を有することが好ましい。或いは、軽鎖可変領域として、配列番号６７と９０％以上の相同性（好ましくは同一性）を有するアミノ酸配列を有することが好ましい。中でも、軽鎖可変領域として、ＶＬ１３（配列番号６１）、ＶＬ１４（配列番号６３）、ＶＬ２２（配列番号６５）、ＶＬ２３（配列番号６７）、又はＶＬ２４（配列番号６９）のアミノ酸配列を有することが好ましい。より好ましくはＶＬ２２（配列番号６５）、ＶＬ２３（配列番号６７）、又はＶＬ２４（配列番号６９）のアミノ酸配列である。配列番号６１、６３、６５、６７，及び６９のアミノ酸配列に対応する核酸塩基配列の一例を、それぞれ配列番号６２、６４、６６、６８、及び７０に示す。
　中でも、本発明の抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域として、それぞれ上述した何れかのアミノ酸配列を有することが好ましい。特に好ましい本発明の抗体としては、重鎖可変領域としてＶＨ１３＿ＰＳ（配列番号４７）のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域としてＶＬ２３（配列番号６７）のアミノ酸配列を有する抗体（以下「ｈＩＧＦ１３＿ＰＳ」という場合がある。）、又は、重鎖可変領域としてＶＨ２５＿ＰＳ（配列番号５９）のアミノ酸配列を有し、軽鎖可変領域としてＶＬ２３（配列番号６７）のアミノ酸配列を有する抗体（以下「ｈＩＧＦ２５＿ＰＳ」という場合がある。）である。
　本発明の抗体の重鎖及び軽鎖の各各定常領域のアミノ酸配列は、例えばヒトのＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、及びＩｇＤの各クラスのアミノ酸配列、並びにそれらの変異体のアミノ酸配列から選択することが可能である。一態様によれば、本発明の抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列は、ヒトＩｇＧ４クラスの重鎖定常領域のアミノ酸配列、又はその１～１０か所のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列であることが好ましい（非特許文献１９、２０）。一態様によれば、本発明の抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列は、ヒトＩｇＧ１クラスの重鎖定常領域のアミノ酸配列、又はその１～１０か所のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列であることが好ましい（非特許文献１９、２０）。
　本発明の抗体は、ヒトＩＧＦ－１受容体と抗原抗体反応を生じる抗体である。本開示において「抗原抗体反応」とは、ＩＧＦ－１受容体に対して、抗体が平衡解離定数（ＫＤ）１×１０-7Ｍ以下の親和性で結合することをいう。本発明の抗体は、ＩＧＦ－１受容体に対して、通常１×１０-7Ｍ以下、中でも１×１０-8Ｍ以下、更には１×１０-9Ｍ以下のＫＤで結合することが好ましい。最も好ましくは１×１０-10Ｍ以下である。
　本発明の抗体は、配列番号７１のアミノ酸配列を有するヒトＩＧＦ－１受容体の細胞外ドメインに特異的に結合することが好ましい。本開示において、抗体が抗原に対して「特異性」を有するとは、抗体とその抗原との間に高い抗原抗体反応が起こることをいう。特に、本開示において「ＩＧＦ－１受容体特異的抗体」とは、ＩＧＦ－１受容体を発現させた細胞と有意に抗原抗体反応を示す濃度において、ＩＧＦ－１受容体の高次構造と高い類似性を有するＩＮＳＲに対する抗原抗体反応性が１００分の１以下である抗体をいう。
　抗原抗体反応の測定は、当業者であれば固相又は液相の系での結合測定を適宜選択して行うことが可能である。そのような方法としては、酵素結合免疫吸着法（enzyme-linked immunosorbent assay：ＥＬＩＳＡ）、酵素免疫測定法（enzyme immunoassay：ＥＩＡ）、表面プラズモン共鳴法（surface plasmon resonance：ＳＰＲ）、蛍光共鳴エネルギー移動法（fluorescence resonance energy transfer：ＦＲＥＴ）、発光共鳴エネルギー移動法（luminescence resonance energy transfer：ＬＲＥＴ）等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。また、そのような抗原抗体結合を測定する際に、抗体及び／又は抗原を酵素、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素等で標識を行い、その標識した物質の物理的及び／又は化学的特性に適した測定方法を用いて抗原抗体反応を検出することも可能である。
　一態様によれば、本発明の抗体は、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と同等以上のＩＧＦ－１受容体シグナル活性化能を有することが好ましい。本開示において、ＩＧＦ－１受容体シグナル活性化能が「同等」とは、ＥＣ50値が２倍以内、及び／又は、Ｅmax値が±２０％以内であることを意味する。
　一態様によれば、本発明の抗体は、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と同等以上の増殖活性を有することが好ましい。本開示において、増殖活性が「同等」とは、筋芽細胞増殖試験において、ＥＣ50値が１０倍以内、Ｅmax値が９０％以上であることを意味する。
　一態様によれば、本発明の抗体は、組換え可溶性ＩＧＦ－１受容体への結合親和性が、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と同等以上であることが好ましい。本開示において、組換え可溶性ＩＧＦ－１受容体への結合親和性が「同等」とは、BIACOREによる組換え可溶性ＩＧＦ－１受容体への結合親和性解析において、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と比較した場合に、ＫＤ値が３分の１以上から３倍以内の範囲であることを意味する。
　一態様によれば、本発明の抗体は、血中半減期が長く、動物への単回投与により筋肉量増加作用を示すことが好ましい。実際に、本発明者等の検討によれば、本発明の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体は、後述の実施例に示すように、モルモット又はカニクイザルへ単回投与したところ、ＩＧＦ－１を持続投与したときと同程度の筋肉量増加作用を示した。
　一態様によれば、本発明の抗体は、正常哺乳動物において、低血糖症状を誘導せず、筋量増加作用を誘導しうることが好ましい。一態様によれば、本発明の抗体は、下垂体摘出モデル動物において、低血糖症状を誘導せず、成長板軟骨伸長作用を誘導しうることが好ましい。本開示において「血糖症状」とは、ヒトの場合、低血糖に伴って生じる冷や汗、動悸、意識障害、痙攣、手足の震えなどの症状を意味する。サルなどの脊椎動物においては自発運動の減少が初期症状として現れ、症状が強いと動きがほとんど無くなり、さらに血糖値が低下すると意識障害が起こり、死に至る。
　ＩＧＦ－１を脊椎動物に対して、筋肉量増加作用を示すような用量で投与すると、著しい血糖低下作用を奏し、通常は低血糖症状を誘導してしまう。しかし、一態様によれば、本発明の抗体は、脊椎動物の筋肉量及び／又は体長の増加を誘導する用量、より好ましくはその用量より１０倍以上高い用量で、脊椎動物に投与した場合でさえも、当該脊椎動物の血糖値を低下させる作用を有さない。また、一態様によれば、本発明の抗体は、脊椎動物の筋肉量及び／又は体長の増加を誘導する有効用量に対して１０倍以上の血中曝露量となるように脊椎動物に投与した場合でさえも、当該脊椎動物の血糖値を低下させる作用を有さない。実際に、本発明者等の検討によれば、本発明の抗体は、後述の実施例に示すように、モルモット及びカニクイザルにおいて１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与しても、低血糖症状を誘導しなかった。
　以上のことから、本発明の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体は、ＩＧＦ－１で期待される、廃用性筋萎縮及び低身長症等のＩＧＦ－１受容体が関連する種々の疾患の治療薬又は予防薬となる可能性を有し、ＩＧＦ－１の問題点である、血糖低下作用を克服し、血中半減期を長期化することが可能である。
　本発明の抗体は、ＩＧＦ－１受容体の細胞外ドメインに結合することにより、ＩＧＦ－１受容体が二量体を形成したホモ型の受容体、或いはＩＧＦ－１受容体とＩＮＳＲが二量体を形成したヘテロ型の受容体を活性化させると考えられる。
［免疫原性評価］
　抗医薬品抗体（Anti-Drug Antibody：ＡＤＡ）は、治療用抗体の効果及び薬物動態に影響を及ぼし、時に重篤な副作用をもたらすことがあるため、臨床における治療用抗体の有用性及び薬効はＡＤＡの産生によって制限され得る。多くの要因が治療用抗体の免疫原性に影響を及ぼすが、治療用タンパク質中に存在するエフェクターＴ細胞エピトープの重要性が多数報告されている。Ｔ細胞エピトープを予測するためのin silicoツールとしては、Epibase（Lonza）、iTope/TCED（Antitope）、及びEpiMatrix（EpiVax）等が開発されている。これらのin silicoツールを用いることで、各アミノ酸配列中のＴ細胞エピトープの存在を予測することができ（非特許文献２１）、潜在的免疫原性の評価が可能になる。本発明の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体に関しては、Epibase（Lonza）を用いて、潜在的免疫原性を評価した。 
［脱アミド化リスク］
　タンパク質を構成するアミノ酸配列のうち、脱アミド化が起こりやすいアミノ酸配列として、ＮＧ、ＮＴ、ＮＳ、及びＮＮが挙げられる。これらの配列を有するとアスパラギンの脱アミド化が起こり、アスパラギン酸へと変化する。このことにより、抗体の活性が低下してしまう恐れがあると共に、品質が均一でなくなる。このことから製造工程や保管において品質を保つために、脱アミド化リスクのあるアミノ酸を別のアミノ酸へ置換することによって活性低下を防ぎ均一性を保持することが可能である。本発明の抗体においては、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６の重鎖ＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｈ２）領域にＮＳ配列（重鎖５５位及び５６位）が存在したため、重鎖５５位のアスパラギン（Ｎ）が脱アミド化してアスパラギン酸（Ｄ）へ変換されるリスクを考慮して、当該アスパラギン（Ｎ）をセリン（Ｓ）に置換した。
［物性安定性評価］
　抗体の活性が長期に安定に保持されることを保証するために、温度を上昇させたり、ｐＨを変化させたりすることで物性安定性の解析を行う。本発明の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体においては、本抗体のＰＢＳ溶液を使用して、温度を３７℃に設定し１ヶ月間インキュベーションした試料を使用して、純度が９５％以上であること及び凝集物が生じないことを確認することで、物性安定性を確認した。
［抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体のエピトープ］
　一態様によれば、本発明の抗体は、ＩＧＦ－１受容体のＣＲドメインをエピトープとする。好ましくは、本発明の抗体は、ヒトＩＧＦ－１受容体のアミノ酸配列（配列番号７１）のうち、アミノ酸番号３０８から３１９に相当するアミノ酸配列（ＰｒｏＳｅｒＧｌｙＰｈｅＩｌｅＡｒｇＡｓｎＧｌｙＳｅｒＧｌｎＳｅｒＭｅｔ）を有するペプチドを含むエピトープ又はその近傍に結合する。本発明の抗体は、ＩＧＦ－１受容体のＣＲドメインに結合することにより、ＩＧＦ－１受容体が二量体を形成したホモ型の受容体、或いはＩＧＦ－１受容体とＩＮＳＲが二量体を形成したヘテロ型の受容体を活性化させると考えられる。
［抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化アゴニスト抗体］
　本発明のアゴニスト抗体は、ヒトＩｇＧクラス又はその変異体であることが好ましく、ヒトＩｇＧ４サブクラス若しくはその変異体、又は、ヒトＩｇＧ１サブクラス若しくはその変異体であることが好ましい。１つの例では、安定化ＩｇＧ４定常領域は、Ｋａｂａｔの系により、ヒンジ領域の位置２４１においてプロリンを含む（非特許文献２２）。この位置は、ＥＵ付番方式（非特許文献１３）により、ヒンジ領域の位置２２８に対応する。ヒトＩｇＧ４では、この残基は一般的にセリンであり、セリンのプロリンへの置換で安定化を誘導することができる。１つの例では、ＩｇＧ１の定常領域にＮ２９７Ａ変異を組み入れてＦｃ受容体への結合及び／又は補体を固定する能力をできるだけ抑えることができる。また、別の態様では、定常領域にアミノ酸置換を導入することでＦｃＲｎへの結合を調節し、血中半減期を長くすることも出来る。しかし、定常領域のアミノ酸置換はこれらの例示に限定されるものではない。
　本発明のアゴニスト抗体は、ＩＧＦ－１受容体に特異的に強力に結合し、インビトロで極めて低濃度から筋芽細胞増殖の亢進作用を有する。
　本発明のアゴニスト抗体は、動物へ単回投与した場合に、ＩＧＦ－１を持続投与したときの筋肉量増加作用と、同程度の筋量増加作用を示す。また、本発明のアゴニスト抗体は、血中半減期が長く、動物への単回投与で筋肉量増加作用を示し得る。本発明では、実際に、モルモット又はカニクイザルへ単回投与した場合に、ＩＧＦ－１を持続投与したときの筋肉量増加作用と、同程度の筋量増加作用を示した。
　更に、本発明のアゴニスト抗体は、筋肉量増加作用を示す用量において、血糖低下作用を有さないという特徴を有する。ＩＧＦ－１は、筋肉量増加作用を示す用量で投与した場合、著しい血糖低下作用を有する。しかし、本発明のアゴニスト抗体は、脊椎動物の筋肉量及び／又は体長の増加を誘導する用量において、当該脊椎動物の血糖値を低下させる作用を有さない。好ましくは、本発明のアゴニスト抗体は、脊椎動物の筋肉量及び／又は体長の増加を誘導する有効用量の１０倍以上の血中曝露量となるように投与した場合でさえも、脊椎動物の血糖値を低下させる作用を有さない。本発明では、実際に、モルモット又はカニクイザルにおいて、本発明のアゴニスト抗体を筋肉量の増加を誘導する有効用量の１０倍以上の血中曝露量となるように投与した場合でさえも、血糖低下及び低血糖症状は観察されなかった。
　以上のことから、本発明のアゴニスト抗体は、サルコペニア、廃用性筋萎縮、カケキシア及び低身長症等のＩＧＦ－１受容体が関連する種々の疾患の治療薬又は予防薬となる可能性を有し、ＩＧＦ－１の問題点である、血糖低下作用を克服し、血中半減期を長期化することが可能である。
［抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化アンタゴニスト抗体］
　本発明の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体は、その極めて高い結合性及び特異性を有する可変領域の性質を利用して、優れた活性と特異性を有する抗ＩＧＦ－１受容体アンタゴニスト抗体とすることができる。その際の態様としては、ＩｇＧの他にＦａｂやＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨＨのような形で使用することが考えられるが、これに限定されるものでは無い。
　このようにして作製された抗ＩＧＦ－１受容体アンタゴニスト抗体は、例えばがん細胞株におけるＩＧＦ－１依存性の細胞増殖活性を抑制することを指標に評価することができる。このようにして選択された抗ＩＧＦ－１受容体アンタゴニスト抗体は、抗ガン剤や異状な細胞増殖を伴う疾患や病態の改善及び治療薬として期待される。
　さらに他の抗原又はエピトープを認識する様々な抗体と直接又はリンカーなどを介して融合させることによって二重特異性抗体や多重特異性抗体を構築することもできる。その際の態様としては、ＩｇＧの他にＦａｂやＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨＨのような形で使用することが考えられるが、これに限定されるものでは無い。
　このようにして作製された抗ＩＧＦ－１受容体アンタゴニスト抗体を含有した二重特異性抗体や多重特異性抗体は、例えばがん細胞株におけるＩＧＦ－１依存性の細胞増殖活性を抑制することを指標に評価することができる。このようにして選択された抗ＩＧＦ－１受容体アンタゴニスト抗体を含有した二重特異性抗体や多重特異性抗体は、抗ガン剤や異状な細胞増殖を伴う疾患や病態の改善及び治療薬として期待される。
　本発明の抗ＩＧＦ－１受容体アンタゴニスト抗体は、ＩＧＦ－Ｉ受容体シグナルが活性化されることで病態が誘導される疾患の治療薬として期待される。ＩＧＦ－Ｉ受容体を活性化し得るリガンドとしては、ＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、Ｉｎｓｕｌｉｎなどが主に挙げられるが、ＩＧＦ－１受容体とヘテロ２量体形成したＲＴＫ（受容体型チロシンキナーゼ）のリガンド（ＥＧＦなどが挙げられる）やクロストークする他の受容体のリガンド（ＴＳＨなどが挙げられる）なども含まれる。本発明の抗体は、これらのリガンドによって活性化されたＩＧＦ－１受容体シグナルを抑制する作用（アロステリックアンタゴニスト作用を有する。つまり、本発明の抗体は、ＩＧＦ－１受容体に結合することで、過剰に誘導されるＩＧＦ－１受容体シグナル活性を抑制し、ＩＧＦ－１受容体が異常に活性化されることで誘導される疾患の治療又は予防に使用しうる。シグナル活性化抑制能はマウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と同等以上有することが好ましい。シグナル活性化抑制能が「マウス抗体ＩＧＦ１１－１６と同等」とは、筋芽細胞増殖においてＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、又はＩｎｓｕｌｉｎ等のＩＧＦ－Ｉ受容体を活性化し得るリガンドが誘導し得る最大細胞増殖活性を通常１０％以上、好ましくは２５％以上、特に好ましくは３５％以上抑制する活性を意味する。
　ＩＧＦ－１受容体が異常に活性化されることで誘導される疾患の具体例としては、肝臓がん、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、小児がん、先端巨大症、卵巣がん、膵臓がん、良性前立腺肥大症、乳がん、前立腺がん、骨がん、肺がん、結腸直腸がん、頚部がん、滑膜肉腫、膀胱がん、胃がん、ウィルムス腫瘍、転移性カルチノイド及び血管作動性腸管ペプチド分泌腫瘍に関連する下痢、ビポーマ、ウェルナー－モリソン症候群、ベックウィズ－ヴィーデマン症候群、腎臓がん、腎細胞がん、移行上皮がん、ユーイング肉腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病、脳腫瘍、膠芽腫、非膠芽腫性脳腫瘍、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、未分化神経外胚葉性腫瘍、髄芽腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、脳室上衣腫、脈絡叢乳頭腫、巨人症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、血管の平滑筋再狭窄、不適切な微小血管増殖、糖尿病性網膜症、グレーヴズ病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、自己免疫性甲状腺疾患、橋本甲状腺炎、甲状腺眼症、甲状腺機能亢進症及びベーチェット病などが挙げられる。
　これらの作用は、担癌モデル動物等を用いて確認することができる。
［局所送達ツールとしての抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体］
　本発明の抗ＩＧＦ－１受容体抗体の極めて高い結合性と特異性を利用してＩＧＦ－１受容体発現細胞や発現組織などへ薬剤や抗体の局所デリバリーが可能である。その際の本発明の抗ＩＧＦ－１受容体抗体の態様としては、ＩｇＧの他にＦａｂやＦｖ、ｓｃＦｖ、ＶＨＨのような形で使用することが考えられるが、これに限定されるものでは無い。本発明の抗ＩＧＦ－１受容体抗体と薬剤が連結された抗体薬物複合体の利用によって、薬剤が局所へ送達されることで、より低用量で特異的に薬効を発揮させることが出来、副作用の低減にもつながる。
　このようにして作製された本発明の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体を送達ツールとして連結した薬剤又は抗体は、例えば、薬剤がアポトーシス誘導剤の場合は、ＩＧＦ－１受容体発現がん細胞株におけるアポトーシスを誘導することを指標に評価することができる。このようにして選択された抗ＩＧＦ－１受容体抗体を連結した薬剤又は抗体は、抗ガン剤や異状な細胞増殖を伴う疾患や病態の改善及び治療薬として期待される。
　さらに、放射能や蛍光化合物などでラベルした本発明の抗ＩＧＦ－１受容体抗体を使用して、ＩＧＦ－１受容体を発現するがん細胞を検出することも可能である。このような診断技術を使用することで抗ＩＧＦ－１受容体アンタゴニスト抗体による治療を効率的に行うことが出来る。
［競合結合］
　本発明の抗ＩＧＦ－１受容体抗体と、ＩＧＦ－１受容体に対して競合結合する抗体も、本発明の範囲に含まれる。本発明において「競合結合」とは、複数種のモノクローナル抗体が抗原と共存する際に、一方の抗体の抗原への結合が、他方の抗体の抗原への結合により阻害される現象を意味する。一般的には、一定量（濃度）のモノクローナル抗体に対して、別のモノクローナル抗体の量（濃度）を変えて加えていった場合に、前者の一定量のモノクローナル抗体の抗原への結合量が低下する添加量（濃度）を測定することによって測定可能である。その阻害の程度は、ＩＣ50又はＫｉという値で表すことができる。
　本発明の抗ＩＧＦ－１受容体抗体と競合結合するモノクローナル抗体とは、本発明の抗ＩＧＦ－１受容体抗体を１０ｎＭで用いて抗原抗体結合を検出した際に、ＩＣ50が通常１０００ｎＭ以下、中でも１００ｎＭ以下、更には１０ｎＭ以下の抗体をいう。競合結合の測定を行う場合、用いる抗体の一部又は全部を酵素、蛍光物質、発光物質、放射性同位元素等で標識を行い、その標識した物質の物理的及び／又は化学的特性に適した測定方法を用いて検出することでその測定を行うことも可能である。
［交差反応］
　本発明の抗体は、他の脊椎動物のＩＧＦ－１受容体に対して交差反応を有する。交差反応とは、その抗体が抗原抗体反応をするＩＧＦ－１受容体の動物種（例えばヒト）とは異なる他の動物種のＩＧＦ－１受容体にして抗体が結合性を示すことをいう。本発明の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体はヒト以外にモルモット、サル、ウサギなどのＩＧＦ－１受容体と交差反応性を示す。一方、マウス及びラットのＩＧＦ－１受容体には交差反応性を示さない。
　また、本発明の抗体と交差反応しない動物の種を用いて、その細胞や動物を遺伝子工学的に改変させることにより、本発明の抗体が交差反応するＩＧＦ－１受容体を発現する細胞や動物を作製することも可能である。
［結合親和性評価］
　本発明の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体は、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６（特許文献１）と同等以上のレベルの極めて強い結合親和性を有している。その結合親和性の評価は、たとえば、組換えＩＧＦ－１受容体の細胞外領域を抗原として使用し、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）解析によって行うことが出来る。実施例においては、BIACOREを使用して反応温度を４０℃に上げて、抗原固定量を低く抑えることで１価の結合親和性を解析しているが、この方法に限定されるものではなく、強い結合親和性を定量的に評価し得る解析方法であれば良い。
［ＩＧＦ－１受容体シグナル評価］
　本発明の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体は、ＩＧＦ－１受容体シグナル活性化を１次評価系として使用することで、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６（特許文献１）と同等以上のレベルのヒト化抗体を選択することにより得られたものである。
　ＩＧＦ－１受容体シグナル活性化の評価は、市販のPathHunter（登録商標）IGF1R Functional Assay（DiscoverX社製）を使用した。本システムでは、ＩＧＦ－１受容体シグナル直下のリン酸化を酵素活性として評価することができ、基質として化学発光物質を使用し、発光強度でシグナル強度を測定する。
　具体的には、ＩＧＦ－１受容体及びＩＧＦ－１受容体の細胞内のチロシンキナーゼと結合するＳＨ２ドメインを持つアダプタープロテインＳＨＣ１－Enzyme Acceptor（ＥＡ）融合タンパク質を、ＨＥＫ２９３細胞内に強制発現させた細胞株を用いた。この細胞株は、ＩＧＦ－１受容体へのリガンド結合によって受容体の二量体化が起こり、続いて受容体がリン酸化されることにより、ＳＨ２ドメインを持つアダプタープロテインがリクルートされ、受容体シグナル伝達複合体が形成され、空間的に隣接したチロシンキナーゼとＥＡの結合が促され、活性型β－ガラクトシダーゼが再構成される。このβ－ガラクトシダーゼ活性による加水分解された基質の化学発光シグナルのレベルを測定することにより、受容体型チロシンキナーゼに対する薬剤の作用を同定することが可能である。
　マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と同等以上のシグナル誘導活性を有するヒト化抗体バリアントを選択したのち、二次評価のヒト筋芽細胞増殖評価を行った。ＩＧＦ－１受容体シグナルを評価する方法は、この方法に限定されるものではなく、ＩＧＦ－１受容体チロシンリン酸化を直接又は間接的に且つ定量的に検出し得る系であれば良い。
［脊椎動物由来細胞の増殖誘導活性、筋肉量増加の誘導活性］
　本発明のヒト化抗体の２次評価系としてヒト筋芽細胞増殖評価を行い、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６（特許文献１）と同等の濃度域で同等以上のアゴニスト活性を有するヒト化抗体を絞り込んだ。そのようにして選択された本発明のヒト化抗体はインビボ（in vivo）において血糖低下作用を示さず、筋量増加作用を有することが確認された。すなわち、一態様における本発明の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体は、脊椎動物由来細胞の増殖誘導活性を有する。
　なお、本開示において「脊椎動物由来細胞」とは、好ましくは哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類又は魚類に由来する細胞であり、より好ましくは哺乳類又は鳥類に由来する細胞であり、更により好ましくは、ヒト、サル、ウサギ、モルモット、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ラット、又はマウスに由来する細胞である。これらの種に由来する細胞で、ＩＧＦ－１受容体を発現し、当該ＩＧＦ－１受容体に本発明の抗体が交差反応する細胞であれば、本発明の抗体によって細胞増殖が誘導されうる。また、本発明の抗体と交差反応性がある種のＩＧＦ－１受容体を発現されるように改変された細胞や動物、又は当該改変動物に由来する細胞も、本開示における「脊椎動物由来細胞」に含まれる。
　脊椎動物由来細胞のインビトロにおける増殖誘導活性を調べるための細胞としては、初代培養細胞、株化細胞、又はそれらの細胞の形質転換体細胞等を用いることが可能である。
　本開示において「初代培養細胞」とは、生物の臓器や組織から分離された細胞で、通常はある程度の継代数での継代培養が可能であるものをいう。脊椎動物由来の初代培養細胞は、脊椎動物の臓器や組織から酵素処理、物理的方法による分散又はｅｘｐｌａｎｔ法等の手法で得ることができる。また、脊椎動物から得られた臓器や組織、又はそれらの断片を用いることも可能である。それらの当該初代細胞を調製する臓器や組織としては、好ましくは甲状腺、副甲状腺や副腎等の内分泌組織、虫垂、扁桃腺、リンパ節や脾臓等の免疫組織、気管や肺等の呼吸器、胃、十二指腸、小腸や大腸等の消化器、腎臓や膀胱等の泌尿器、輸精管、睾丸や前立腺等の雄性生殖器、乳房や卵管等の雌性生殖器、心筋や骨格筋等の筋組織等が挙げられ、より好ましくは肝臓、腎臓若しくは消化器又は筋組織等であり、更により好ましくは筋組織である。本発明の抗体の増殖誘導活性を調べるために用いられる当該初代培養細胞としては、ＩＧＦ－１受容体を発現し、そのＩＧＦ－１受容体と結合するＩＧＦ－１によって増殖が誘導される細胞が用いられる。その代表としては、筋組織から分離された初代培養細胞である骨格筋筋芽細胞等が使われる。ヒトや動物由来の初代培養細胞としては、分譲や市販されているものを入手して使用することも可能である。ヒト初代培養細胞は、例えばＡＴＣＣ（登録商標）、ＥＣＡＣＣ、Ｌｏｎｚａ、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ等の機関や会社から入手できる。
　脊椎動物由来の細胞における本発明の抗体による細胞の増殖誘導活性を調べる方法としては、細胞数計測、ＤＮＡ合成量の測定、代謝酵素活性の変化量の測定等が挙げられる。細胞数計測の方法は、血球算定盤を用いた方法やコールターカウンター等の細胞数計測装置を用いた方法があり、ＤＮＡ合成量を測定する方法としては、［３Ｈ］－チミジンや５－ブロモ－２’－デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取込みによる測定方法、代謝酵素活性の変化量をみる方法としては、ＭＴＴ法、ＸＴＴ法やＷＳＴ法等の比色定量法があるが、当業者であれば適宜その他の方法等でも実施することができる。
　細胞の増殖誘導活性は、試験に用いる培養細胞に対して、本発明の抗体を反応させた場合の方が、当該抗体を反応させていない場合よりも細胞の増殖が上昇していることで判定できる。この場合、当該誘導活性の対照として、同条件で本来のＩＧＦ－１受容体のリガンドであるＩＧＦ－１を反応させた測定を行うと、その活性の評価に便利である。試験を行う培養細胞に対して、本発明の抗体及びＩＧＦ－１をそれぞれの濃度を変化させて反応させたときに、最大の増殖誘導活性の５０％を示すときの濃度をＥＣ50値として示す。ヒト骨格筋筋芽細胞を用いて増殖誘導活性を評価した場合、好ましくは本発明の抗体の細胞増殖誘導活性はＩＧＦ－１と同等以上のＥＣ50値であり、より好ましくは本発明の抗体のＥＣ50値はＩＧＦ－１の１／１０以下であり、更に好ましくは１／２０以下であり、更により好ましくは本発明の抗体のＥＣ50値はＩＧＦ－１の１／５０以下である。また、ヒト骨格筋筋芽細胞を用いて増殖誘導活性を評価した場合、本発明の抗体のＥＣ50値は、好ましくは０．５ｎＭ以下であり、より好ましくは０．３ｎＭ以下であり、更に好ましくは０．１ｎＭ以下である。
　インビボにおける増殖誘導活性を調べる方法としては、脊椎動物に本発明の抗体を投与して、投与された個体全体、又は投与された個体における臓器又は組織の質量、大きさ、細胞数等の変化を計測するか、当該脊椎動物細胞を移植された動物を用いて、当該移植を受けた個体において当該移植された脊椎動物細胞を含む移植片の質量、大きさ、細胞数等の変化を計測することで調べることができる。個体全体での計測では、体重、体長、四肢周囲長等の測定や、インピーダンス法による体組成測定、クレアチニン、身長係数等が用いられる。個体での臓器や組織、又は移植片の計測については、ヒト以外の動物では直接目的の臓器、組織又は移植片を回収し、質量、大きさや含まれる細胞数の算定等が行われる。また、非侵襲的に個体の臓器、組織又は移植片を計測する方法としては、ＤＸＡ（Dual-energy X-ray absorptiometry）法に代表されるＸ線撮影像やＣＴ、ＭＲＩによる画像解析、同位元素や蛍光物質によるトレーサーを用いた造影法等が用いられる。対象となる組織が骨格筋である場合には、筋力の変化等が指標となる。その他、当業者であれば適宜その他の方法を用いることで、本発明の抗体の脊椎動物由来細胞のインビボにおける増殖誘導活性に対する作用を調べることができる。本発明の抗体のインビボにおける脊椎動物由来細胞の増殖誘導活性を調べるためには、本発明の抗体を投与した個体と、本発明の抗体以外の抗体又は別の対照物質を投与された個体との間で、上に示した方法等での計測等を行った結果を比較することで評価することができる。
　抗体の血中動態に関して、後述の実施例１４において、本発明の抗体の設計の基となったマウス抗体ＩＧＦ１１－１６抗体（特許文献１）と本発明の抗体であるｈＩＧＦ１３＿ＰＳ及びｈＩＧＦ２５＿ＰＳ抗体のモルモット血中動態を比較しているが、ＩＧＦ１１－１６と比較して血中動態が改善していることが示された。
　本発明の抗体のインビボでの効果の１つとして、筋肉量及び／又は体長の増大効果が挙げられる。ＩＧＦ－１は骨格筋において上述の筋芽細胞の増殖や分化に作用するほか、筋線維を太くする作用もあり、そのような総合的な作用として筋肉量を増大させる効果があると考えられている。本発明の抗体もＩＧＦ－１と同様に動物に投与することによって、当該動物の筋肉量を増大させる効果を有する。
　本発明の抗体による筋肉量の増大効果を計測する方法としては、個体全体での計測では、体重、体長、四肢周囲長等の測定や、インピーダンス法による体組成測定、クレアチニン、身長係数等が用いられ、また、ＤＸＡ（Dual-energy X-ray absorptiometry）法に代表されるＸ線撮影像やＣＴ、ＭＲＩによる画像解析、同位元素や蛍光物質によるトレーサーを用いた造影法等の方法が用いられるほか、筋力の変化等も指標になる。また、ヒト以外の動物では直接筋肉を採取してその質量や大きさを計測する方法等も可能である。
　筋肉量の増加の効果は、本発明の抗体を投与された個体と当該抗体を投与されなかった個体での筋肉量の増加を比較すること、又は、一つの個体で本発明の抗体を投与する前と投与した後での筋肉量の比較を行うことで評価することができる。筋肉量の増加の効果は、本発明の抗体が投与により筋肉量の増加の差が見られれば、その効果を知ることができる。ＩＧＦ－１は骨の成長にも関与し、体長（ヒトの場合は身長）を増大させる働きもある。したがって、本発明の抗体も、動物に投与することによって体長を増大させる効果を有する。本発明の抗体による体長増大の効果は、個体の体重、体長、四肢周囲長等の測定によって計測することが可能である。
［動物での血糖値に対する作用］
　一態様によれば、本発明の抗体は、脊椎動物での血糖値に影響を及ぼさないという特徴を有する。ＩＧＦ－１は、ＩＧＦ－１受容体へのアゴニスト作用の一部として、血糖値の低下作用を起こすことが知られている。しかし、抗ＩＧＦ－１受容体アゴニスト抗体として機能する本発明のアゴニスト抗体は、動物に非経口的に投与した場合に筋肉量の増加を誘導する有効用量の更に１０倍以上の血中曝露量でも、血糖値を変動させないという特徴を示す。
　本発明の抗体が有する、脊椎動物における血糖低下を誘導しない作用に関して、例えばインビトロで評価することもできる。脊椎動物由来細胞のインビトロにおける細胞内へのグルコース取込みに影響を及ぼさないという特徴を調べるための細胞としては、初代培養細胞、株化細胞、又はそれらの細胞の形質転換体細胞等を用いることが可能である。
　脊椎動物由来の細胞における本発明の抗体によるグルコース取込みに及ぼす影響を調べる方法としては、細胞内グルコース濃度の測定、グルコース類縁トレーサー物質の細胞内取込み量の測定、グルコーストランスポーターの変化の測定等が挙げられる。グルコース濃度の測定方法は、酵素法等の吸光度測定法があり、グルコース類縁トレーサー物質の細胞内取込み量を測定する方法としては、例えば［３Ｈ］－２’－デオキシグルコースの取込み量の測定、グルコーストランスポーターの変化をみる方法としては、細胞免疫染色法、ウエスタンブロット等があるが、当業者であれば適宜その他の方法等でも実施することができる。細胞内へのグルコース取込みに及ぼす影響は、試験に用いる培養細胞に対して、本発明の抗体を反応させた場合の細胞内へのグルコース取込みが、当該抗体を反応させていない場合と同程度であることで判定できる。この場合、当該誘導活性の対照として、同条件で本来のＩＧＦ－１受容体のリガンドであるＩＧＦ－１を反応させた測定を行うと、その活性の評価に便利である。
　脊椎動物由来細胞のインビボにおけるグルコース取込みを調べる方法としては、当該脊椎動物に本発明の抗体を投与して、投与された個体における臓器又は組織中のグルコース含量等の変化を計測することで調べることができる。個体全体での計測では、血糖値等の測定や、糖化蛋白質を指標としたヘモグロビンＡ１Ｃ等が用いられる。個体での臓器や組織中のグルコース取込み量等の測定においては、ヒト以外の動物においては直接目的の臓器又は組織を回収し、グルコース含量又はトレーサーの算定等が行われる。また、非侵襲的に個体の臓器又は組織中のグルコース取込みを測定する方法としては、Ｘ線撮影像やＣＴ、ＭＲＩによる画像解析、同位元素や蛍光物質によるトレーサーを用いた造影法等が用いられる。対象となる組織が骨格筋である場合には、グルコースクランプ等も指標となる。その他、当業者であれば適宜その他の方法を用いることで、本発明の抗体の脊椎動物由来細胞のインビボにおけるグルコース取込みに及ぼす影響を調べることができる。
　また、本発明の抗体は、脊椎動物に投与された場合、当該脊椎動物の筋肉量の増加を誘導する有効用量に対して、同一用量、好ましくは１０倍以上の用量においても、当該脊椎動物の血糖値を変動させないことを特徴とする。本発明の抗体の脊椎動物での血糖値の変化を調べるための動物としては、好ましくは哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類又は魚類に属する動物であり、より好ましくは哺乳類又は鳥類に属する動物であり、更により好ましくは、ヒト、サル、ウサギ、モルモット、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ラット、又はマウスである。また、本発明の抗体と交差反応性がある種のＩＧＦ－１受容体を発現されるように改変された動物も、本発明の抗体の脊椎動物での血糖値の変化を調べるための動物に含まれる。血糖値の測定は、観血的方法としては比色法や電極法等が用いられ、検出のための酵素にはグルコースオキシダーゼ法（ＧＯＤ法）、グルコースデヒドロゲナーゼ法（ＧＤＨ法）等があり、非観血的方法としては光学的測定法等があるが、当業者であれば適宜その他の方法も選択することができる。血糖値はヒトの場合、空腹時血糖値の正常域は、１００ｍｇ／ｄＬ～１０９ｍｇ／ｄＬである。血糖値に対する薬剤投与による有害事象は（有害事象共通用語規準ｖ４．０）、血糖値が７７ｍｇ／ｄＬ～５５ｍｇ／ｄＬの範囲より低値となる場合は低血糖、１０９ｍｇ／ｄＬ～１６０ｍｇ／ｄＬの範囲より高値となる場合は高血糖と定義されている。薬剤投与による血糖値に及ぼす影響がないとは、薬剤投与後の血糖値が５５ｍｇ／ｄＬより上で１６０ｍｇ／ｄＬ未満の範囲内となること、より好ましくは７７ｍｇ／ｄＬより上で１０９ｍｇ／ｄＬ未満の範囲内となることである。但し、血糖値は投与する動物によって正常値やその変動の幅が異なり、またヒトであっても投与時の血糖値が必ずしも正常値の範囲であるとは限らないことから、本開示において脊椎動物の血糖値を変動させないとは、本発明の抗体を投与された脊椎動物の血糖値が溶媒投与コントロール群と比較して、好ましくは３０％以内、より好ましくは２０％以内、更により好ましくは１０％以内の変化であることをいう。
［抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体の製法］
　本発明の抗体は、ＩＧＦ－１受容体に対するマウスモノクローナル抗体ＩＧＦ１１－１６（特許文献１）をヒト化することにより取得できる。ヒト以外の動物種から得られたモノクローナル抗体を使用してそのＣＤＲ領域をＣＤＲグラフティングによってヒトフレームワークに置き換えることをヒト化という（非特許文献１２）。さらに３次元構造解析により、立体構造を維持しながら、ヒトへの免疫原性（Ｔ細胞抗原性）を低下させるためのアミノ酸置換や、脱アミド化や酸化などの翻訳後修飾リスクを回避するためのアミノ酸置換を導入することで、活性を維持しつつ製造性や臨床での安全性を確保したヒト化抗体を作製する。
　活性を維持するために、（１）どんなヒトフレームワークのデザインが必要なのか、及び、（２）ＣＤＲ配列中のどのアミノ酸が重要なのか、に関する情報を得ることはヒト化において非常に重要である。そのようなヒト化抗体の取得方法の例は、後述の実施例１から９に記載されており、それによって得られたヒト化抗体としては、重鎖可変領域としてＶＨ１３＿ＰＮ（配列番号４３）、ＶＨ１３＿ＰＳ（配列番号４７）、ＶＨ２３＿ＰＮ（配列番号４９）、ＶＨ２３＿ＰＳ（配列番号５３）、ＶＨ２５＿ＰＮ（配列番号５５）、又はＶＨ２５＿ＰＳ（配列番号５９）を有すると共に、軽鎖可変領域としてＶＬ１３（配列番号６１）、ＶＬ１４（配列番号６３）、ＶＬ２２（配列番号６５）、ＶＬ２３（配列番号６７）、又はＶＬ２４（配列番号６９）を有するヒト化抗体が挙げられる。軽鎖可変領域として、より好ましくは、ＶＬ２２（配列番号６５）、ＶＬ２３（配列番号６７）、又はＶＬ２４（配列番号６９）を有する。しかし、本発明の抗体は、それらに限定されるものではない。
　得られた抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体について、その抗体のタンパク質のアミノ酸をコードする塩基配列を有する核酸分子を得ることも可能であり、そのような核酸分子を用いて遺伝子工学的に抗体を作製することも可能である。当該抗体の遺伝子情報におけるＨ鎖、Ｌ鎖、若しくはそれらの可変領域について、ＣＤＲ配列等の情報を参考にして、抗体の結合性や特異性の向上のための改変等を行うことができる。
　本発明の抗体を製造する方法としては、それぞれ取得したい抗体のタンパク質のアミノ酸をコードする遺伝子を導入された哺乳細胞、昆虫細胞、及び大腸菌などを培養し、得られた培養上清から常法によって抗体を精製して取得することができる。その具体的な方法としては、これに限定されるものではないが、以下のような方法が例示される。
　まず、Ｈ鎖可変領域をコードする核酸分子に、Ｈ鎖シグナルペプチドをコードする核酸分子と、Ｈ鎖定常領域をコードする核酸分子とを結合させて作製する。Ｌ鎖可変領域をコードする核酸分子に、Ｌ鎖シグナルペプチドをコードする核酸分子と、Ｌ鎖定常領域をコードする核酸分とを結合させて作製する。
　これらのＨ鎖遺伝子とＬ鎖遺伝子を、選択した宿主細胞で発現するのに適したベクター、例えばクローニングベクター又は発現用ベクターに組込む。ここで、Ｈ鎖遺伝子及びＬ鎖遺伝子は、両方の遺伝子が発現する形であれば、一つのベクターに組み込まれてもよく、また、それぞれ別のベクターに組み込まれてもよい。
　次に、Ｈ鎖遺伝子とＬ鎖遺伝子が組み込まれたベクターは、宿主細胞に導入される。宿主細胞としては、例えば哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞、若しくは植物細胞等の真核細胞、又は細菌細胞が挙げられる。宿主細胞に遺伝子を導入する方法としては、リン酸カルシウムやリポフェクション法などの化学的方法、エレクトロポレーション法やパーティクルガン法などの物理的方法又はウイルスやファージなどでの感染による方法などから適宜選択することができる。Ｈ鎖遺伝子及びＬ鎖遺伝子が導入された宿主細胞は、選択をかけることなく培養に用いることもできるし、薬剤耐性や栄養要求性などの性質を用いて遺伝子が導入された組換え体細胞を選択的に濃縮することや、更に遺伝子が導入された単一の宿主細胞から樹立されたクローンの組換え体細胞を培養に用いることも可能である。
　Ｈ鎖遺伝子及びＬ鎖遺伝子が導入された宿主細胞は、適切な培地と培養条件で培養される。ここで、宿主細胞内で発現したＨ鎖遺伝子及びＬ鎖遺伝子の産物は、通常は抗体タンパク質として培地中に分泌され、当該培地を回収することで産生された抗体タンパク質を得ることができる。但し、遺伝子と宿主との組み合わせにより、必要がある場合には宿主細胞を破壊して細胞内に蓄積した抗体タンパク質を回収すること、原核細胞の場合にはペリプラズム画分から抗体タンパク質を回収することも選択できる。回収された抗体タンパク質を含む培地等の試料から抗体を精製する方法としては、塩沈法、透析や限外濾過法等による濃縮や溶媒の交換、プロテインＡ、プロテインＧ又は抗原等が固定化された担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーなどが一般に用いられるが、その他、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィーやサイズ排除クロマトグラフィー等の方法も適宜用いて精製することが可能である。これらの手順に用いられる各種の手法は、何れも当業者には周知である。
　ここで、免疫グロブリンの重鎖及び／又は軽鎖をコードする遺伝子について、望む形質を導入するための遺伝子改変を行ったり、免疫グロブリンの重鎖及び／又は軽鎖の可変領域又はＣＤＲ領域の構造情報を用いたりすることにより、抗体キメラタンパク質、低分子抗体、スキャフォールド抗体等を作製することは、当業者であれば公知の技術を用いて実施可能である。また、抗体の性能の向上や副作用の回避を目的に、抗体の定常領域の構造に改変を入れることや、糖鎖の部分での改変を行うことも、当業者によく知られた技術によって適宜行うことができる。
［抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体を含有する薬］
　本発明の抗体は、ＩＧＦ－１に関連した状態又はＩＧＦ－１受容体への作用に起因する疾患の治療薬又は予防薬又は診断薬として利用可能である。以降、治療薬・予防薬又は診断薬を総称して「薬」又は「薬剤」と記載する。
　具体的には、ＩＧＦ－１に関連した状態又は抗ＩＧＦ－１受容体アゴニスト抗体での治療又は予防の対象となる疾患としては、筋萎縮性疾患（例えば廃用性筋萎縮、サルコペニア、カケキシア等）、低身長症（例えばラロン型低身長症、成長ホルモン抵抗性低身長症等）、肝硬変、肝線維化、糖尿病性腎症、慢性腎不全、老化、子宮内胎児発育遅延（ＩＵＧＲ）、神経疾患、脳卒中、脊髄損傷、心血管保護、糖尿病、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、腎症、骨粗しょう症、嚢胞性線維症、創傷治癒、筋強直性ジストロフィー、エイズ筋減弱症、ＨＩＶに伴う脂肪再分布症候群、火傷、クローン病、ウェルナー症候群、Ｘ連鎖性複合免疫不全症、難聴、神経性無食欲症及び未熟児網膜症、ターナー症候群、プラダー・ウィリー症候群、シルバー・ラッセル症候群、特発性低身長、肥満、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、低筋肉量、心筋虚血、低骨密度などがあげられるがこれらに限定されるものではない。
　特に、本発明の抗体は、筋萎縮性疾患（例えば廃用性筋萎縮、サルコペニア、カヘキシア等）及び／又は低身長症（例えばラロン型低身長症、成長ホルモン抵抗性低身長症等）の治療薬又は予防薬としての使用が好ましい。また、本発明の抗体は投与によって血糖値の変動を生じさせない点において優れている。本抗ＩＧＦ－１受容体抗体の一部又は全てを構成成分として融合又は連結した抗体薬や抗体薬物複合体又は診断薬での治療又は予防又は診断の対象となる疾患としては、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、小児がん、先端巨大症、卵巣がん、膵臓がん、良性前立腺肥大症、乳がん、前立腺がん、骨がん、肺がん、結腸直腸がん、頚部がん、滑膜肉腫、膀胱がん、胃がん、ウィルムス腫瘍、転移性カルチノイド及び血管作動性腸管ペプチド分泌腫瘍に関連する下痢、ビポーマ、ウェルナー－モリソン症候群、ベックウィズ－ヴィーデマン症候群、腎臓がん、腎細胞がん、移行上皮がん、ユーイング肉腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病、脳腫瘍、膠芽腫、非膠芽腫性脳腫瘍、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、未分化神経外胚葉性腫瘍、髄芽腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、脳室上衣腫、脈絡叢乳頭腫、巨人症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、血管の平滑筋再狭窄、不適切な微小血管増殖、糖尿病性網膜症、グレーヴズ病、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、自己免疫性甲状腺疾患、橋本甲状腺炎、甲状腺眼症、甲状腺機能亢進症、及びベーチェット病が挙げられる。
　本発明の抗体を含有する薬は、本発明の抗体の他に、医薬的に許容される担体及び／又はその他の添加剤を含有する、医薬組成物の形態として製剤化してもよい。医薬的に許容される担体及び／又はその他の添加剤を用いての製剤は、例えばUniversity of the Sciences in Philadelphia, “Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th EDITION”, Lippincott Williams & Wilkins, 2000に記載の方法で実施することが可能である。
　このような薬剤の一つの形態としては、無菌の水性液又は油性液に溶解、懸濁、又は乳化することによって調製された液剤或いは凍結乾燥剤として供される。このような溶剤又は溶解液として、水性液としては注射用蒸留水、生理食塩水等が挙げられ、それに加えて浸透圧調節剤（例えば、Ｄ－グルコース、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム等）が添加される場合、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（例えばエタノール）、ポリアルコール（例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例えばポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０）等が併用される場合もある。また、溶剤又は溶解液としては油性液が用いられる場合もあり、当該油性液の例としてはゴマ油、大豆油等があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等が併用される場合もある。このような製剤においては、適宜、緩衝剤（例えば、リン酸塩類緩衝剤、酢酸塩類緩衝剤）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカイン等）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコール等）、保存剤（例えば、アスコルビン酸、エリソルビン酸及びそれらの塩等）、着色剤（例えば、銅クロロフィル、β－カロチン、赤色２号、青色１号等）、防腐剤（例えばパラオキシ安息香酸エステル、フェノール、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウム等）、増粘剤（例えばヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース及びそれらの塩等）、安定化剤（例えばヒト血清アルブミン、マンニトール、ソルビトール等）、矯臭剤（例えばメントール、柑橘香料等）の添加剤が用いられる場合がある。
　別の形態として、粘膜適応用薬剤もあげられる。この製剤においては、粘膜への吸着性、滞留性等を付与することを主な目的として、添加剤として粘着剤、粘着増強剤、粘稠剤、粘稠化剤等（例えば、ムチン、カンテン、ゼラチン、ペクチン、カラギーナン、アルギン酸ナトリウム、ローカストビンガム、キサンタンガム、トラガントガム、アラビアゴム、キトサン、プルラン、ワキシースターチ、スクラルフェート、セルロース、及びその誘導体（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリグリセリン脂肪酸エステル、アクリル酸（メタ）アクリル酸アルキル共重合体、又はその塩、ポリグリセリン脂肪酸エステル等）が含有される場合もある。しかしながら、生体に供与される治療剤又は予防剤の形態及び溶剤や添加剤はこれらに限定されるものではなく、当業者であれば適宜選択できる。
　本発明の抗体を含有する薬は、本発明の抗体の他に、既存の他の薬物（活性成分）を含んでいてもよい。また、抗体薬物複合体や二重特異性抗体・多重特異性抗体のように他の薬剤などと融合又は連結されていても良い。また、本発明の抗体を含む薬を、既存の他の薬物と組み合わせ、キットの形態としてもよい。抗ＩＧＦ－１受容体アゴニスト抗体と組み合わせる活性成分として、成長ホルモン又はそのアナログ、インスリン又はそのアナログ、ＩＧＦ－２又はそのアナログ、抗ミオスタチン抗体、ミオスタチンアンタゴニスト、抗アクチビンIIＢ型受容体抗体、アクチビンIIＢ受容体アンタゴニスト、可溶性アクチビンIIＢ型受容体又はそのアナログ、グレリン又はそのアナログ、フォリスタチン又はそのアナログ、ベータ２アゴニスト、及び選択的アンドロゲン受容体モジュレーターが挙げられる。
　また、本抗ＩＧＦ－１受容体抗体を構成成分として含む抗体薬や抗体薬物複合体の調製において、本抗ＩＧＦ－１受容体抗体と組み合わされる活性成分、或いは本抗ＩＧＦ－１受容体抗体と共に含有される活性成分としては、コルチコステロイド、制吐薬、オンダンセトロン塩酸、グラニセトロン塩酸、メトクロプラミド（metoclopramide）、ドンペリドン、ハロペリドール、シクリジン、ロラゼパム、プロクロルペラジン、デキサメタゾン、レボメプロマジン、トロピセトロン、癌ワクチン、ＧＭ－ＣＳＦ阻害薬、ＧＭ－ＣＳＦ ＤＮＡワクチン、細胞に基づくワクチン、樹状細胞ワクチン、組換えウイルスワクチン、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）ワクチン、同種腫瘍ワクチン、自己腫瘍ワクチン、鎮痛薬、イブプロフェン、ナプロキセン、トリサリチル酸コリンマグネシウム、オキシコドン塩酸、抗血管形成薬、抗血栓薬、抗ＰＤ－１抗体、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、アテゾリズマブ、抗ＣＴＬＡ４抗体、イピリムマブ、抗ＣＤ２０抗体、リツキシマブ、抗ＨＥＲ２抗体、トラスツズマブ、抗ＣＣＲ４抗体、モガムリズマブ、抗ＶＥＧＦ抗体、ベバシズマブ、抗ＶＥＧＦ受容体抗体、可溶性ＶＥＧＦ受容体断片、抗ＴＷＥＡＫ抗体、抗ＴＷＥＡＫ受容体抗体、可溶性ＴＷＥＡＫ受容体断片、ＡＭＧ ７０６、ＡＭＧ ３８６、抗増殖薬、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害薬、αｖβ３阻害薬、αｖβ５阻害薬、ｐ５３阻害薬、Ｋｉｔ受容体阻害薬、ｒｅｔ受容体阻害薬、ＰＤＧＦＲ阻害薬、成長ホルモン分泌阻害薬、アンジオポエチン阻害薬、腫瘍浸潤マクロファージ阻害薬、ｃ－ｆｍｓ阻害薬、抗ｃ－ｆｍｓ抗体、ＣＳＦ－１阻害薬、抗ＣＳＦ－１抗体、可溶性ｃ－ｆｍｓ断片、ペグビソマント、ゲムシタビン、パニツムマブ、イリノテカン、及びＳＮ－３８が挙げられる。配合される本発明の抗体以外の薬物の用量としては、通常の治療に用いられる用量で行うことができるが、状況に応じて増減することも可能である。
　本発明における薬剤は、症状の改善を目的として、非経口的に投与することができる。非経口投与の場合には、例えば経鼻剤とすることができ、液剤、縣濁剤、固形製剤等を選択できる。また別の非経口投与の形態としては、注射剤とすることができ、注射剤としては、皮下注射剤、静脈注射剤、点滴注射剤、筋肉注射剤、脳室内注射剤又は腹腔内注射剤等を選択することができる。またその他の非経口投与に用いる製剤としては、坐剤、舌下剤、経皮剤、経鼻剤以外の経粘膜投与剤等も挙げられる。更に、ステントや血管内栓塞剤に含有若しくは塗布する態様で、血管内局所投与することもできる。
　本発明における治療剤又は予防剤の投与量は、患者の年齢、性別、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間、又は当該医薬組成物に含有される活性成分の種類等により異なるが、通常成人１人あたり、１回につき主剤を０．１ｍｇから１ｇの範囲で、好ましくは０．５ｍｇから１００ｍｇの範囲で、１週から４週間に１回、若しくは１か月から２か月に１回投与することができる。しかし、投与量及び投与回数は種々の条件により変動するため、前記投与量及び回数よりも少ない量及び回数で充分な場合もあり、また前記の範囲を超える投与量及び投与回数が必要な場合もある。
　以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施例にも束縛されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において、任意の形態で実施することが可能である。
［実施例１］マウス抗体ＩＧＦ１１－１６のヒト化抗体のデザイン：
・ヒトフレームワークの選定
　Kohlerら（Nature, (1975), Vol.256, pp.495-497）のハイブリドーマ法により作製し得られたＩＧＦ－１受容体に対するマウスモノクローナル抗体ＩＧＦ１１－１６（特許文献１）の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）中の相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸を、鋳型ヒト抗体に移植した。移植先となる鋳型ヒト抗体としては、マウス抗体ＩＧＦ１１－１６（マウス親抗体）のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列（それぞれ配列番号３９及び配列番号４１）に対して、それらと相同性の高いアミノ酸配列を持つヒト抗体の生殖細胞系列（germline）の中から、重鎖配列としてＶＨ－１－４６（配列番号９５）及びＶＨ－１－ｅ（配列番号９６）、重鎖Ｊ－セグメントとしてＪＨ４（配列番号９７）、軽鎖配列としてＶＫ１－Ｌ５（配列番号９８）及びＶＫ１－Ａ２０（配列番号９９）、軽鎖Ｊ－セグメントとしてＪＫ２（配列番号１００）を選択し、これらを以下の表１に示すように組み合わせた２通りのヒト化抗体フレームワークを用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
・ＣＤＲ領域のグラフティング及びＦＲアミノ酸置換
　上記の鋳型ヒト抗体ＶＨ及びＶＬのＦＲに、マウス抗体ＩＧＦ１１－１６のＶＨ及びＶＬから必要なアミノ酸配列を移植してヒト化抗体を作製した。
　具体的には、ＶＨについては、前述の鋳型ヒト抗体ＶＨのＣＤＲアミノ酸配列及びＦＲアミノ酸の数カ所をマウス抗体ＩＧＦ１１－１６のＶＨ中の対応するアミノ酸配列で置換し、マウス抗体ＩＧＦ１１－１６をヒト化したＶＨのアミノ酸配列をデザインし、更にそれらのアミノ酸をコードするＤＮＡの塩基配列をデザインした。
　ＶＬについては、前述の鋳型ヒト抗体ＶＬのＣＤＲアミノ酸配列及びＦＲアミノ酸の数カ所をマウス抗体ＩＧＦ１１－１６のＶＬ中のアミノ酸配列に置換し、マウス抗体ＩＧＦ１１－１６をヒト化したＶＬのアミノ酸配列をデザインし、更にそれらのアミノ酸をコードするＤＮＡの塩基配列をデザインした。
　デザインしたヒト化抗体の重鎖及び軽鎖の構成を下記表２に示す。
　なお、本実施例の記載及び図面中において、デザインされたヒト化抗体重鎖可変領域と重鎖定常領域とを連結して構成されるヒト化重鎖、デザインされたヒト化抗体軽鎖可変領域と軽鎖定常領域とを連結して構成されるヒト化軽鎖、更にはそれらのヒト化重鎖とヒト化軽鎖とを組み合わせて構成される完全ヒト化抗体を、使用した重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域の名称により略称する場合がある。例えば、図１Ａ中の“ＶＬ２２／ＶＨ１３＿ＰＳ”とは、ＶＬ２２を軽鎖可変領域とし、これにヒトκ鎖定常領域を連結した軽鎖と、ＶＨ１３＿ＰＳを重鎖可変領域とし、これにＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐ重鎖定常領域を連結した重鎖とを組み合わせて構成されるヒト化抗体を指す。 また、配列番号１５、１７、１９、２１、２３、２５及び２７のアミノ酸配列に対応する核酸塩基配列の一例を、それぞれ配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６及び２８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
［実施例２］ヒト化抗体の調製：
　デザインしたヒト化抗体の重鎖可変領域と、ヒトＩｇＧ４サブクラスを安定化した変異体であるヒトＩｇＧ４Ｓ２２８Ｐ変異体の重鎖定常領域をコードするＤＮＡをそれぞれ合成し、ｐｃＤＮＡ３．４系発現ベクターに組み込み連結し、ヒト化抗体重鎖を発現するプラスミドとした。
　デザインしたヒト化抗体の軽鎖可変領域については、κ鎖定常領域を連結したヒト化抗体軽鎖領域をコードするＤＮＡを合成し、ｐｃＤＮＡ３．４系発現ベクターに組み込み、ヒト化抗体軽鎖を発現するプラスミドとした。
　これらのヒト化抗体重鎖発現プラスミドとヒト化抗体軽鎖発現プラスミドを混合して、ＥｘｐｉＣＨＯ（登録商標） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Thermo Fisher Scientific）を用いて細胞に導入することにより、各種抗体を発現させた。この際、ＦＷ１＿ＶＨ１を組込んだ重鎖発現プラスミドとＦＷ１＿ＶＬ１を組込んだ軽鎖発現プラスミドとを組み合わせて発現させたヒト化抗体をＦＷ１＿ｖａｒ１抗体、ＦＷ２＿ＶＨ１を組込んだ重鎖発現プラスミドとＦＷ２＿ＶＬ２を組込んだ軽鎖発現プラスミドとを組み合わせて発現させたヒト化抗体をＦＷ２＿ｖａｒ２抗体と、それぞれ命名した。ＦＷ１＿ｖａｒ９、ＦＷ１＿ｖａｒ１０、及びＦＷ１＿ｖａｒ１４に関しても、同様に実施及び命名した。ヒト化抗体は、ヒト化抗体重鎖及びヒト化抗体軽鎖発現プラスミドを導入した細胞の培養上清を、プロテインＡカラムを用いてアフィニティー精製することにより取得した。
　以降のヒト化抗体の調製に関しては、上述の方法に準じて行った。
［実施例３］ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ （登録商標） によるＩＧＦ－１受容体活性化作用：
　デザインされたヒト化抗体のＩＧＦ－１受容体に対する活性化作用を検出するために、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）ＩＧＦ１Ｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｓｓａｙ（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）を用いて、以下の手順によりＩＧＦ－１受容体シグナルの活性化を測定した。
　ＩＧＦ－１受容体を発現させた細胞を、ポリ－Ｄ－リジンコート又はコラーゲン－Ｉコートされた９６ウェルプレート（Ｂｌａｃｋ／ｃｌｅａｒ又はＷｈｉｔｅ／ｃｌｅａｒ）に、９０μＬ／ウェル（２×１０4ｃｅｌｌｓ／ウェル又は５×１０3ｃｅｌｌｓ／ウェル）で播種し、３７℃、５％ＣＯ2の条件でインキュベートした。翌日、各濃度の薬剤を１０μＬ／ウェルで添加し、３７℃、５％ＣＯ2の条件でインキュベートした。その翌日、培養上清を３０μＬで取り、１５μＬの基質溶液を添加して、６０分間反応させ、ルミノメーター（Ｔｒｉｓｔａｒ、ベルトールド）にて発光シグナル（ＲＬＵ）を測定した。１２．５ｎＭ抗体添加による蛍光強度から抗体０．１ｎＭ添加時の値をバックグラウンドとして差し引いた値を活性化強度とし、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６の値を１としてヒト化抗体の相対値を算出した。
　結果を表３に示す。この結果からヒト化抗体（ＦＷ１＿ｖａｒ１、ｖａｒ９、ｖａｒ１０、ｖａｒ１４、及びＦＷ２＿ｖａｒ２）のＩＧＦ－１受容体活性化能が、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と比較して２０％を超えて減弱していることがわかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　そこで、ヒト化抗体の抗原結合領域であるＣＤＲ領域に関して、マウスと異なる配列部分である重鎖ＣＤＲ２領域のＡ６１、Ｑ６２、Ｑ６５、及びＧ６６をそれぞれＮ６１、Ｅ６２、Ｋ６５、及びＳ６６にアミノ酸置換しマウス親抗体と同一にしたアミノ酸置換ヒト化抗体（ＦＷ１＿ｖａｒ１０＿ＮＥＫＳ、ＦＷ１＿ｖａｒ１４＿ＮＥＫＳ）を作製し、比較対象としてマウス親抗体ＩＧＦ１１－１６、ＦＷ１＿ｖａｒ１を使用して、前述と同様にＩＧＦ－１受容体活性化能を比較した。
　結果を表４に示す。その結果、活性強度の回復は観察されなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　以上の結果から、ＣＤＲ領域のアミノ酸配列をマウス親抗体ＩＧＦ１１－１６のＣＤＲと同一のアミノ酸配列に戻しても、その活性強度はマウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と同等のレベル（活性強度比が±２０％以内）に回復しなかった。よって、ＣＤＲではなく、ＦＲ（フレーム領域）が活性低下に影響していることが推察された。
　そこで、ＦＲ１、ＦＲ２、及びＦＲ３をそれぞれマウスのＦＲに置換したヒト化抗体を作製した。作製したヒト化抗体のマウスＦＲ置換体を表５に示す。これらの置換体のＩＧＦ－１受容体シグナル活性化を前述の通りＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）の系によって評価した。マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６の可変領域とヒトＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）の定常領域を融合させたヒトキメラＩＧＦ１１－１６抗体（Ｃｈｉｍｅｒａ）を陽性対照として、抗体濃度１６．７ｎＭにおけるシグナル強度を前述同様に比較した。結果を表５に示す。また、配列番号２９、３１、３３、３５、及び３７のアミノ酸配列に対応する核酸塩基配列の一例を、それぞれ配列番号３０、３２、３４、３６、及び３８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　以上の結果から、シグナル強度がヒトキメラＩＧＦ１１－１６と同等（値が±２０％以内）である置換体は、ＦＷ１＿ｖａｒ９＿ｍＦＲ－Ｈ１であり、マウス重鎖ＦＲ１がヒト化抗体の活性保持に重要であることが判った。
　そこで、次にマウス重鎖ＦＲ１の中で活性を保持するために必要なアミノ酸を同定した。マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６とヒト化抗体の重鎖ＦＲ１のアミノ酸の違いは７か所存在したため、１か所ずつマウス親抗体のアミノ酸へ置換した。作製したマウスＦＲ１アミノ酸置換ヒト化抗体を表６に示す。これらのヒト化抗体マウスＦＲ１アミノ酸置換体についてＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）の系でＩＧＦ－１受容体活性化シグナル強度を測定し、抗体濃度１６．７ｎＭにおけるシグナル強度をマウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と比較した。その結果、２５位のセリンをプロリンに置換したヒト化抗体のみがマウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と同等（活性比が±２０％以内）であった。結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　以上の結果から、重鎖ＦＲ１領域の２５位のプロリンが活性保持に重要であることが判った。以降のヒト化抗体の重鎖は全て２５位のＰ（プロリン、Ｐｒｏ）置換体を使用した。
［実施例４］アラニン置換による活性維持に重要なＣＤＲ領域アミノ酸同定：
　ＣＤＲ領域において、活性を保持するために必要なアミノ酸を同定する目的で、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６においてそれぞれのアミノ酸をアラニン置換し、その置換体のシグナル活性化能をＥＣ50値とＥmax値で比較し、結合活性を抗原ＥＬＩＳＡで評価した。マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と比較してＥＣ50値：２倍以内、Ｅmax値：±２０％以内を同等の活性と定義した。
　ＩＧＦ－１受容体シグナル活性化能は、実施例３で記載したＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）の系で評価した。ＥＣ50値及びＥmaxは、解析ソフトＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して算出した。結合活性に関しては、組換えＩＧＦ－１受容体細胞外領域を抗原として固定した抗原ＥＬＩＳＡで測定した。具体的には、ヒトリコンビナントＩＧＦ－１Ｒ（Ｒ＆Ｄ社製）をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で０．５μｇ／ｍＬに調製した。固層化プレートに調製したヒトリコンビナントＩＧＦ－１Ｒ溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。４℃で一晩反応させ、３％ＢＳＡ／ＰＢＳ（０．０２％アジ化ナトリウム含有）に置換した。ＥＬＩＳＡに使用するまで４℃で保存した。固層化プレートに被験物質溶液（５ｎＭ濃度の抗体溶液）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。室温で1時間反応させたのち、洗浄液（ＰＢＳＴ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水））にて２回洗浄した。アルカリフォスファターゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（３％ＢＳＡ／ＰＢＳにて２０００倍希釈した）を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加した。室温で４５分間反応させ、洗浄液にて３回洗浄したのち、基質（ｐＮＰＰ（パラニトロフェニルリン酸））を添加して反応を開始させた。室温で１時間反応させたのちに、４０５及び５５０ｎｍの吸光度を測定し、吸光度４０５ｎｍ－吸光度５５０ｎｍの差の値を算出した。この値を結合活性として解析を行った。
　作製したＩＧＦ１１－１６抗体ＣＤＲ置換体とシグナル活性化及び結合活性の測定結果を表７及び表８に示す。得られた結果から、ＣＤＲ領域において、アラニン置換することで結合活性が約１～２割に低下したアミノ酸部分、すなわちＣＤＲ－Ｌ１の位置３２のトリプトファン、ＣＤＲ－Ｈ１の位置３３のトリプトファン、ＣＤＲ－Ｈ２の位置５０のグルタミン酸、ＣＤＲ－Ｈ２の位置５２のアスパラギン及びＣＤＲ－Ｈ３の位置１０２のアルギニンの５つのアミノ酸が活性保持に極めて重要であることが同定された。また、ＣＤＲ－Ｈ１の位置３５のヒスチジン、ＣＤＲ－Ｈ２の位置５４のセリン、ＣＤＲ－Ｈ２の位置５５のアスパラギン、ＣＤＲ－Ｈ２の位置５６のセリン、ＣＤＲ－Ｈ２の位置５９のアスパラギン、及び、ＣＤＲ－Ｈ２の位置６４のフェニルアラニンはＡｌａ置換により活性が低下したことから活性保持に寄与していると考えられる。
　一方、アラニン置換したＣＤＲ領域におけるアミノ酸残基５４部位のうち、４４部位はアラニン置換後も８０％以上の結合活性を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
［実施例５］ヒト化重鎖可変領域のデザイン：
　実施例３の結果から重鎖の２５位のプロリンが活性維持に重要なことが判明したため、重鎖の２５位をＰとして、ヒト化重鎖可変領域ＦＷ１＿ＶＨ１及びＦＷ２＿ＶＨ１を基本骨格としてデザインを行った。ＦＷ１＿ＶＨ１のＦＲ１を基本としてアミノ酸置換体を検討したため、ＦＷ２－ＶＨ１のＦＲ１部分はＦＷ１＿ＦＲ１と同一にするため、Ｓ１６Ａのアミノ酸置換を行った。また、免疫原性低減のためのアミノ酸置換導入は、Ｅｐｉｂａｓｅ（登録商標）（Ｌｏｎｚａ社）の免疫原性スコア解析結果に基づいて実施した。デザインされた重鎖可変領域リストを以下の表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
［実施例６］ヒト化軽鎖可変領域のデザイン：
　ヒト化軽鎖可変領域に関しては、ＦＷ１＿ＶＬ１及びＦＷ２＿ＶＬ２を基本骨格としてデザインを行った。免疫原性スコア低下のためのアミノ酸置換導入は、Ｅｐｉｂａｓｅ（登録商標）（Ｌｏｎｚａ社）の解析結果に基づいて実施した。デザインされた軽鎖可変領域リストを表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
［実施例７］脱アミド化リスクアミノ酸置換体によるヒト化抗体デザイン：
　ヒト化抗体を製造する際に脱アミド化が起こると品質管理が困難となる。そのため、事前に脱アミド化リスクのあるアミノ酸は、活性に影響のない別のアミノ酸へ置換することが必要である。一般的に脱アミド化リスクのある配列としてＮＧ、ＮＴ、ＮＳ、及びＮＮが挙げられる。本ヒト化抗体の重鎖のＣＤＲ－Ｈ２領域においてＮＳ配列が存在する。故に、５５位のアスパラギン（Ｎ）が脱アミド化してアスパラギン酸（Ｄ）へ変換されるリスクを考慮してアミノ酸置換を行った。置換した重鎖のリストを表１１に示す。また、配列番号４５、５１、及び５７のアミノ酸配列に対応する核酸塩基配列の一例を、それぞれ配列番号４６、５２、及び５８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
［実施例８］ヒト化抗体のＩＧＦ－１受容体シグナル活性化作用による選択：
　ヒト化抗体をＩＧＦ－１受容体の活性化作用に基づいて評価し、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と同等の活性を有するヒト化抗体を選択した。
　抗ＩＧＦ－１受容体アゴニスト抗体のＩＧＦ－１受容体に対する活性化作用を検出するために、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）ＩＧＦ１Ｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｓｓａｙ（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）を用いてＩＧＦ－１受容体シグナルの活性化を測定した。
　ＩＧＦ－１受容体を発現させた細胞を、ポリ－Ｄ－リジンコート又はコラーゲン－Ｉコートされた９６ウェルプレート（Ｂｌａｃｋ／ｃｌｅａｒ又はＷｈｉｔｅ／ｃｌｅａｒ）に、９０μＬ／ウェル（２×１０4ｃｅｌｌｓ／ウェル又は５×１０3ｃｅｌｌｓ／ウェル）で播種し、３７℃、５％ＣＯ2の条件でインキュベートした。翌日、各濃度の薬剤を１０μＬ／ウェルで添加し、３７℃、５％ＣＯ2の条件でインキュベートした。その翌日、培養上清を３０μＬで取り、１５μＬの基質溶液を添加して、６０分間反応させ、ルミノメーター（Ｔｒｉｓｔａｒ、ベルトールド）にて発光シグナル（ＲＬＵ）を測定した。
　測定の結果、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と同等（マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と比較してＥＣ50値：２倍以内、Ｅmax値：±２０％以内）の活性を確認したヒト化抗体を表１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
［実施例９］ヒト化抗体のヒト筋芽細胞増殖活性による選択：
　ヒト化抗体をヒト筋芽細胞増殖活性に基づいて評価し、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と同等の活性を有するヒト化抗体を選択した。
　抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体のヒト筋芽細胞に対する増殖活性を検討するため、ヒト筋芽細胞に薬剤を添加して、４日後の細胞内のＡＴＰ量を測定した。
　正常ヒト骨格筋筋芽細胞（Ｈｕｍａｎ Ｓｋｅｌｅｔａｌ Ｍｕｓｃｌｅ Ｍｙｏｂｌａｓｔ Ｃｅｌｌｓ、ＨＳＭＭ、Ｌｏｎｚａ）を、ＳｋＢＭ－２（Ｌｏｎｚａ、ＣＣ－３２４６）に１％ＢＳＡを含む培地を使用して、９６ウェルプレート（Ｃｏｌｌａｇｅｎ ｔｙｐｅ Ｉ ｃｏａｔｅｄ）に、０．１ｍＬ／ウェル（２×１０3ｃｅｌｌｓ／ウェル）で播種し、３７℃、５％ＣＯ2の条件でインキュベートした。細胞播種の翌日に各種薬剤を２５μＬ／ウェルで添加し、３７℃、５％ＣＯ2の条件で４日間インキュベートした。細胞増殖の指標として細胞内のＡＴＰ量を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定した。４日間インキュベートした９６ウェルプレートを、培養液が５０μＬ／ウェルとなるように上清を除き、３０分以上室温にて静置した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）試薬を５０μＬ／ウェルで添加して１０分以上反応させた後に、ルミノメーター（Ｔｒｉｓｔａｒ、ベルトールド）にて発光シグナルを測定した。
　その結果、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と同等（マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と比較して、ＥＣ50値：１０倍以内、Ｅmax：９０％以上）の活性を確認したヒト化抗体を表１３に示す。また、測定結果のグラフを図１Ａ～Ｆに示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
［実施例１０］免疫原性評価：
　ヒト化抗体の免疫原性を解析するために、ＬｏｎｚａのＥｐｉｂａｓｅ（登録商標）ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏを使用し、免疫原性スコアを算出した。ＬｏｎｚａのＥｐｉｂａｓｅ（登録商標）ｉｎ Ｓｉｌｉｃｏプラットフォームは、既に実験的に決定された１０－ｍｅｒのペプチドとＨＬＡ ｃｌａｓｓ II受容体の結合親和性とともにＨＬＡ ｃｌａｓｓ II受容体の構造特性を使用して、抗体に含まれるアミノ酸配列中に存在するＴ細胞の活性化に必要な条件である潜在的なペプチド／ＨＬＡ結合を予測し、免疫原性スコアとして算出する免疫原性予測方法である。８５種類のＨＬＡクラスIIアロタイプ（４３種のＤＲＢ１、８種のＤＲＢ３／４／５、２２種のＤＱ、１２種のＤＰ）における評価をすることで、全人口の９９％以上をカバーすることができる。免疫原性スコアは、アロタイプの結合親和性に加えて出現頻度などを加味してスコア化された。
　結果を表１４及び表１５に示す。同様に評価したマウス親抗体ＩＧＦ１１－１６及びマウス・ヒトキメラ抗体（マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６の可変領域とヒトＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）の定常領域を有する抗体）の免疫原性スコアと比較して、ヒト化抗体の免疫原性が低いことが判った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
［実施例１１］哺乳動物ＩＧＦ－１受容体に対する結合活性評価：
　ヒト（配列番号７１）、カニクイザル（配列番号７３）、ウサギ（配列番号７５）、モルモット（配列番号７７）、ラット（配列番号７９）及びマウス（配列番号８１）のＩＧＦ－１受容体に対する抗ＩＧＦ－１受容体アゴニスト抗体の結合活性を検討するために、各種ＩＧＦ－１受容体を発現させた細胞を用いてＣｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ＥＬＩＳＡを実施した。
　ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にリポフェクション法によりヒト（配列番号７２）、カニクイザル（配列番号７４）、ウサギ（配列番号７６）、モルモット（配列番号７８）、ラット（配列番号８０）及びマウス（配列番号８２）のＩＧＦ－１受容体遺伝子を組込んだｐＥＦ１発現ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ）を導入した。リポフェクション後に一晩以上培養させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を４×１０4ｃｅｌｌｓ／ウェルで９６ウェルプレート（ポリ－Ｄ－リジンコート）に添加して、１０％緩衝ホルマリン（Ｍｉｌｄｆｏｒｍ（登録商標）１０ＮＭ、Ｗａｋｏ）を用いて固定し、３％ＢＳＡを含有したリン酸緩衝液にてブロッキングしたものをＥＬＩＳＡに使用した。
　ＥＬＩＳＡは、１％ＢＳＡ／１％ＦＢＳ／ＰＢＳにて５ｎＭに調製された各ヒト化抗体溶液を各ウェルに１００μＬ添加して３７℃にて約１時間反応させた。洗浄液にて３回洗浄した。１％ＢＳＡ／１％ＦＢＳ／ＰＢＳにて各濃度に調製された抗ヒトＩｇＧ抗体ＨＲＰコンジュゲート溶液を各ウェルに１００μＬ添加して３７℃にて約１時間反応させ、洗浄液にて３回洗浄した。各ウェルに基質（ＴＭＢ）を１００μＬ添加して反応を開始させた。約３０分後に各ウェルに１００μＬの１Ｍ硫酸を添加して４５０及び６５０ｎｍの吸光度を測定し、吸光度４５０ｎｍ－吸光度６５０ｎｍの差の値を算出した。ＩＧＦ－１受容体遺伝子を導入していないＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｍｏｃｋ）に対する吸光度４５０－６５０ｎｍの差の値の値と比較することで、結合活性を解析した。
　図２にヒト、モルモット、カニクイザル、及びウサギの各ＩＧＦ－Ｒに対する反応性の結果を示す。その結果、ヒト化抗体ｈＩＧＦ１３＿ＰＳ及びｈＩＧＦ２５＿ＰＳは、ヒト、モルモット、カニクイザル及びウサギのＩＧＦ－１受容体を発現させた細胞では、Ｍｏｃｋ細胞と比較して、結合活性を２倍程度上昇させ、ヒトマウスキメラ抗体ＩＧＦ１１－１６と同等の反応性であった。一方、ラット及びマウスのＩＧＦ－１受容体を発現させた細胞に対する結合活性は、Ｍｏｃｋ細胞と同程度であった。これらのことから、ヒト化抗体ｈＩＧＦ１３＿ＰＳ及びｈＩＧＦ２５＿ＰＳは、ヒト、モルモット、カニクイザル及びウサギのＩＧＦ－１受容体には結合するが、ラット及びマウスのＩＧＦ－１受容体には結合しないことが判った。
［実施例１２］表面プラズモン共鳴法によるＩＧＦ－１受容体に対する結合親和性：
　薬剤のＩＧＦ－１受容体に対する結合特性（結合速度及び解離速度）を検討するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法により測定した。
　測定システムはＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ２００システムを使用した。センサーチップＣＭ３（ＢＲ-１００５－３６、ＧＥ）の全フローセルに、抗ヒスチジンタグモノクローナル抗体を、Ａｍｉｎｅ Ｃｏｕｐｌｉｎｇ Ｋｉｔ（ＢＲ－１０００－５０、ＧＥ）及びＨｉｓ Ｃａｐｔｕｒｅ Ｋｉｔ（２８－９９５０－５６、ＧＥ）で、約３０００ＲＵ固定し、使用した。ランニングバッファーはＨＢＳ－ＥＰ＋（ＢＲ－１００６－６９、ＧＥ）を使用した。リガンドは、リコンビナントヒトＩＧＦ－１受容体ヒスチジンタグ（３０５－ＧＲ－０５０、Ｒ＆Ｄ ＳＹＳＴＥＭＳ、以下ＩＧＦ－１Ｒ－Ｈｉｓ）を測定システムに捕捉し使用した。アナライトは、各濃度の薬剤を使用した。リガンド陰性対照にＩＧＦ－１Ｒ－Ｈｉｓを捕捉していないフローセルを使用した。薬剤陰性対照は、ＰＢＳ（ＰＢＳ ｐＨ７．４（１ｘ）、＃１００１００４９、Ｇｉｂｃｏ）を使用した。
　測定システムの測定温度を４０℃に設定とした。フローセル（２及び４）の抗ヒスチジンタグモノクローナル抗体にＩＧＦ－１Ｒ－Ｈｉｓ（＜２×１０-8Ｍ）を１００ＲＵ以下となるように反応させた。流速３０μＬ／分とし、１０ｎＭの精製マウスＩｇＧ２ａ、κ、アイソタイプＣｔｒｌ、Ｃｌｏｎｅ：ＭＧ２ａ－５３（４０１５０２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、以下ｃｔｒｌ ＩｇＧ２ａ）を１分間反応させ、ＨＢＳ－ＥＰ＋を１０分以上流した。アナライトをＨＢＳ－ＥＰ＋で段階希釈し（０．５～８×１０-10Ｍ）、全フローセルに反応させた。
　測定条件シングルサイクルカイネティクス法を使用した。各濃度のアナライトを６００秒ずつ反応させ結合曲線を得た後、ＨＢＳ－ＥＰ＋を１２００秒反応させ解離曲線を得た。反応終了後、再生用バッファー１（０．２％ＳＤＳ）、再生用バッファー２（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１Ｍ ＮａＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2）及び再生用バッファー３（１０ｍＭ グリシン－ＨＣｌ（ｐＨ１．５））を各１分間反応させ、測定システムのＩＧＦ－１Ｒ－Ｈｉｓを除去し洗浄した。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖｅｒ２．０）を使用して、１：１ ＢｉｎｄｉｎｇのＭｏｄｅｌで解析し、解離速度定数（ｋａ、１／Ｍｓ）、結合速度定数（ｋｄ、１／ｓ）及び解離定数（ＫＤ、Ｍ）を算出した。結果を表１６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　ｈＩＧＦ１３＿ＰＳ及びｈＩＧＦ２５＿ＰＳのヒトＩＧＦ－１受容体に対するＫＤ値は、Ｅ－１０以下であり、抗ＩＧＦ－１受容体アゴニストヒト化抗体の最も好ましいクライテリアを満たしていることがわかった。
［実施例１３］インビボ血糖低下作用（モルモットにおける血糖低下作用）：
　抗ＩＧＦ－１受容体アゴニスト抗体のインビボでの血糖低下作用の有無を確認するために、モルモットにｈＩＧＦ１３＿ＰＳ及びｈＩＧＦ２５＿ＰＳを単回投与して、継時的に血糖値を測定して、血糖低下作用の有無を検討した。血糖低下作用とは、血糖値を５０ｍｇ／ｄＬ以下に低下させる、又は低血糖症状を起こす作用とする。
　モルモットを１２時間絶食させ、各ヒト化抗体：ｈＩＧＦ１３＿ＰＳ及びｈＩＧＦ２５＿ＰＳを、１０ｍｇ／ｋｇで単回静脈内投与した。モルモットは、投与２４時間後まで絶食させた。覚醒状態のモルモットを、投与前（０時間）、投与１、２、４、８、２４、４８、７２、及び１４４時間後に採血して、グルテストセンサー（三和化学研究所）を使用して血糖値を測定した。結果を図３Ａ、Ｂに示す。
　各ヒト化抗体は、溶媒のみを投与した溶媒対照群と比較して、血糖値に有意な差を認めず、投与後の血糖値は何れも５０ｍｇ／ｄＬ以上であった。このことから、各ヒト化抗体は、ＩＧＦ－１のような顕著な血糖低下作用を有さず、血糖値に影響を及ぼさないことから、ＩＧＦ－１の副作用である低血糖を克服する薬剤としての可能性が示された。
［実施例１４］ヒト化抗体のモルモットにおける血中動態：
　モルモットを１２時間絶食させ、ヒト化抗体ｈＩＧＦ１３＿ＰＳ及びｈＩＧＦ２５＿ＰＳ又はＩＧＦ１１－１６（マウス親抗体）を、１及び１０ｍｇ／ｋｇで単回静脈内投与した。モルモットは、投与２４時間後まで絶食させ、２４時間後に再給餌した。覚醒状態のモルモットを、投与前（０時間）、投与２、４、８、２４、４８、７２、９６、１２０、及び１４４時間後に採血して、血漿中のヒト化抗体濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。
　具体的には、リコンビナントＩＧＦ－１Ｒ（Ｒ＆Ｄ社製）を使用して、抗原ＥＬＩＳＡにて測定を行った。定量化する際の検量線は、モルモットに投与した濃度既知の抗体を、モルモット血漿で段階希釈して標準物質とした。標準物質と血漿は１０倍から１０００倍希釈して測定を実施した。
　リコンビナントＩＧＦ－１Ｒの０．５μｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液を９６ウェルプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ（ＮＵＮＣ））に添加して終夜、４℃で固定した。さらに３％ＢＳＡ／ＰＢＳにてブロッキングを行い、リコンビナントＩＧＦ－１Ｒ固定プレートを作製した。一方、抗体を投与しないモルモット血漿を使用して、投与した抗体を段階希釈して標準物質とした。血漿及び標準物質を１０倍希釈して５０μＬ／ウェルでリコンビナントＩＧＦ－１Ｒ固定プレートに添加した。室温で１時間３０分反応を行い、その後、ＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳ、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０）にて洗浄操作を行った。その後、アルカリフォスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体（Southern Biotechnology Associates社、Ｃａｔ＃２０８７－０４）を３％ＢＳＡ／ＰＢＳにて２０００倍希釈した溶液を５０μＬ／ウェルで添加し、室温で１時間反応させた。その後、PＢＳ－Ｔで洗浄操作を行い、発色基質としてｐＮｐｐ（ＷＡＫＯ社、Ｃａｔ＃１４９－０２３４２）を１００μＬ／ウェルで添加して室温で１時間インキュベーションした。その後、プレートリーダーにて４０５ｎｍ及び５５０ｎｍの吸光度を測定し、吸光度４０５ｎｍ－５５０ｎｍの差の値を求めた。標準物質とした抗体濃度で検量線を描き、血漿中の抗体濃度を算出した。
　結果を図４に示す。血漿中のヒト化抗体濃度は投与用量に依存して上昇し、低用量群でも投与１４４時間目迄の血漿中ヒト化抗体濃度は、投与２４時間後と比較して約５０％以上を維持していた。ヒト化抗体の血中動態はマウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と比較して持続性に優れていることが示された。
［実施例１５］正常モルモットにおけるヒト化抗体の筋肉量増加作用：
　正常モルモットにｈＩＧＦ１３＿ＰＳを静脈内へ単回投与して、２週間後の筋質量を測定し、ＩＧＦ－１の持続投与及びマウス親抗体ＩＧＦ１１－１６の静脈内投与した時の筋量増加作用と比較した。
　ｈＩＧＦ１３＿ＰＳ及びマウス親抗体ＩＧＦ１１－１６を、正常モルモットの静脈内に０．１ｍｇ／ｋｇで単回投与した。陽性対照としてヒトＩＧＦ－Ｉ（メカセルミン）を、浸透圧ポンプ（アルゼット）を使用して皮下に埋め込み、１ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙとなるように持続投与した。コントロールとしては、溶媒のみを静脈内投与した。薬剤投与の２週間後、モルモットを麻酔下で放血致死させ、長趾伸筋を摘出し筋質量を測定した。
　その結果を図５に示す。ｈＩＧＦ１３＿ＰＳを０．１ｍｇ／ｋｇ静脈内投与した群は、溶媒のみを処置したコントロール群と比較して有意に筋肉量を増加させた。また、その薬効は、ヒトＩＧＦ－Ｉを１ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで持続投与した群やマウス親抗体ＩＧＦ１１－１６を静脈内投与した薬効強度と同程度であった。
　以上の結果から、ｈＩＧＦ１３＿ＰＳは、単回投与によりヒトＩＧＦ－１の２週間持続投与と同等の薬効を期待し得ることが示された。
［実施例１６］ヒト化抗体の下垂体摘出モルモットにおける成長板軟骨伸長作用：
　ｈＩＧＦ１３＿ＰＳの成長板軟骨増殖作用評価としてモルモット下垂体摘出（ＨＰＸ）モデルを用いて脛骨近位部の骨端線厚（Ｅｐｉｐｈｙｓｅａｌ ｌｉｎｅ ｔｈｉｃｋｎｅｓ）を評価した。モルモット下垂体摘出（ＨＰＸ）モデルは、下垂体摘出によって成長ホルモンの産生が抑制されるため、低ＩＧＦ－１状態となる。
　ｈＩＧＦ１３＿ＰＳを０．３ｍｇ／ｋｇ及び１．０ｍｇ／ｋｇで下垂体摘出モルモットへ単回皮下投与し、２週間後の右下肢を採材した。脛骨近位部の成長板軟骨の組織標本を作製し、トルイジンブルーにより成長板軟骨の厚さ（骨端線厚）を測定した。陽性対照としてＩＧＦ－１（メカセルミン）製剤を１ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで浸透圧ポンプにより皮下持続投与すると共に、ＧＨ（ソマトロピン）製剤を１ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙで１日１回皮下投与を行った。
　その結果を図６に示す。ＩＧＦ－１製剤投与群及びＧＨ製剤投与群では骨端線厚の増加が認められ、これらはＨＰＸにより低下した血中ＩＧＦ－１の補充、又はＨＰＸにより失われたＧＨの補充によるものと考えられた。ｈＩＧＦ１３＿ＰＳ抗体群では、下垂体摘出（ＨＰＸ）個体の血中ＩＧＦ－１濃度を上昇させること無く、用量依存的に骨端線厚を厚くすることが示された。
　以上のことより、ｈＩＧＦ１３＿ＰＳ抗体は、下垂体摘出（ＨＰＸ）処理によるＩＧＦ－１濃度低下に伴う骨端線の閉塞を、ＩＧＦ－１Ｒを介したシグナルの活性化により回復させる作用があることが示された。
［実施例１７］ヒト化抗体のカニクイザルにおける血糖低下作用：
　抗ＩＧＦ－１受容体アゴニスト抗体のカニクイザルにおける血糖低下作用の有無を確認するために、カニクイザルにｈＩＧＦ１３＿ＰＳを単回投与して、継時的に血糖値を測定して、ＩＧＦ－１（１ｍｇ／ｋｇ）の単回投与時の血糖低下作用と比較した。血糖低下作用とは、溶媒投与群と比較して５０％未満に低下させる、又は低血糖症状を起こす作用とする。
　カニクイザルに、ヒト化抗体を、１０ｍｇ／ｋｇで単回静脈内又は皮下投与した。投与前（０時間）、投与後５分、３０分、１、２、４、８、及び２４時間後に採血して、メディセーフフィット（テルモ株式会社）を使用して血糖値を測定した。
　結果を図７に示す。各ヒト化抗体は、溶媒のみを投与した溶媒対照群と比較して、血糖値に差を認めず、投与後の血糖値は何れも溶媒対照群と同等レベルであった。一方、ＩＧＦ－１投与群は２時間後低血糖となり、低血糖症状を示したため、グルコースを投与して回復させた。
［実施例１８］ヒト化抗体のカニクイザルにおける血中動態：
　ヒト化抗体ｈＩＧＦ１３＿ＰＳを、１及び１０ｍｇ／ｋｇでカニクイザルへ単回静脈内又は皮下投与した。投与前（０時間）、投与２、４、８、２４、４８、７２、及び１４４時間後に採血して、血漿中のヒト化抗体濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。
　具体的には、リコンビナントＩＧＦ－１Ｒ（Ｒ＆Ｄ社製、Ｃａｔ＃３０５－ＧＲ－０５０）を使用して抗原ＥＬＩＳＡにて測定を行った。定量化する際の検量線は、サルに投与した濃度既知の抗体をサル血漿で段階希釈して標準物質とした。標準物質と血漿は１０倍から１０００倍希釈して測定を実施した。
　リコンビナントＩＧＦ－１Ｒの０．５μｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液を９６ウェルプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ（ＮＵＮＣ））に添加して終夜、４℃で固定した。さらに３％ＢＳＡ／ＰＢＳにてブロッキングを行い、リコンビナントＩＧＦ－１Ｒ固定プレートを作製した。一方、抗体を投与しないサル血漿を使用して、投与した抗体を段階希釈して標準物質とした。血漿及び標準物質を１０倍希釈して５０μＬ／ウェルでリコンビナントＩＧＦ－１Ｒ固定プレートに添加した。室温で１時間３０分反応を行い、その後、ＰＢＳ－Ｔ（ＰＢＳ、０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０）にて洗浄操作を行った。その後、アルカリフォスファターゼ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体（Southern Biotechnology Associates社、Ｃａｔ＃２０８７－０４）を３％ＢＳＡ／ＰＢＳにて２０００倍希釈した溶液を５０μＬ／ウェルで添加し、室温で１時間反応させた。その後、ＰＢＳ－Ｔで洗浄操作を行い、発色基質としてｐＮｐｐ（ＷＡＫＯ社、Ｃａｔ＃１４９－０２３４２）を１００μＬ／ウェルで添加して室温で１時間インキュベーションした。その後、プレートリーダーにて４０５ｎｍ及び５５０ｎｍの吸光度を測定し、吸光度４０５ｎｍ－５５０ｎｍの差の値を算出した。標準物質とした抗体濃度で検量線を描き、血漿中の抗体濃度を算出した。
　結果を図８に示す。本結果から、ｈＩＧＦ１３＿ＰＳのカニクイザルにおける血中動態が良好であることが確認された。
［実施例１９］ヒト化抗体のカニクイザルにおける筋肉量増加作用：
　カニクイザル２個体に対して、ｈＩＧＦ１３＿ＰＳを１ｍｇ／ｋｇで静脈内投与を実施した。投与前と投与後３～４週間後においてＤＸＡ（Ｄｕａｌ Ｅｎｅｒｇｙ Ｘ－ｒａｙ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ）法によって筋肉量を測定した。
　具体的には、測定対象のサルに対して、塩酸ケタミン（Ａｒｅｖｉｐｈａｒｍａ ＧｍｂＨ、５０ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍＬ／ｋｇ）及び塩酸メデトミジン水溶液（ドミトール、Ｏｒｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、１ｍｇ／ｍＬ、０．０８ｍＬ／ｋｇ）の筋肉内投与（臀部）による全身麻酔を行い、二重エネルギーＸ線吸収測定装置（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ－Ａ、ＨＯＬＯＧＩＣ社）を用いて、脂肪量（Ｆａｔ Ｍａｓｓ、ｇ）、非脂肪量（Ｌｅａｎ Ｂｏｄｙ Ｍａｓｓ、ｇ）、骨量（Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｃｏｎｔｅｎｔ（ＢＭＣ）、ｇ）の計測を行い、非脂肪量を筋肉量として解析した。左右腕部（上肢）のＢＭＣ（骨塩量）及びＬｅａｎ＋ＢＭＣ（ｇ）を測定し、筋肉量（ｇ）を算出し、投与前の筋肉量と比較した。
　その結果、２匹共に、投与前と比較して筋量増加を示し、上肢の筋肉増加率は、投与前と比較してそれぞれ７．４％、１０．９％であった。この結果からｈＩＧＦ１３＿ＰＳの筋肉増加作用が確認された。
　さらに、カニクイザル２個体に対して、ｈＩＧＦ１３＿ＰＳを１０ｍｇ／ｋｇで皮下投与を実施した。投与前と投与後３～４週間後においてＤＸＡ（Ｄｕａｌ Ｅｎｅｒｇｙ Ｘ－ｒａｙ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ）法によって筋肉量を測定した。
　具体的には、測定対象のサルに対して、塩酸ケタミン（Ａｒｅｖｉｐｈａｒｍａ ＧｍｂＨ、５０ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍＬ／ｋｇ）及び塩酸メデトミジン水溶液（ドミトール、Ｏｒｉｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、１ｍｇ／ｍＬ、０．０８ｍＬ／ｋｇ）の筋肉内投与（臀部）による全身麻酔を行い、二重エネルギーＸ線吸収測定装置（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ－Ａ、ＨＯＬＯＧＩＣ社）を用いて、脂肪量（Ｆａｔ Ｍａｓｓ、ｇ）、非脂肪量（Ｌｅａｎ Ｂｏｄｙ Ｍａｓｓ、ｇ）、骨量（Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｃｏｎｔｅｎｔ（ＢＭＣ）、ｇ）の計測を行い、非脂肪量を筋肉量として解析した。左右下肢のＢＭＣ（骨塩量）及びＬｅａｎ＋ＢＭＣ（ｇ）を測定し、筋肉量（ｇ）を算出し、投与前の筋肉量と比較した。
　その結果、２匹共に、投与前と比較して筋量増加を示し、下肢の筋肉増加率は、投与前と比較してそれぞれ３．３％、１２．７％であった。この結果からｈＩＧＦ１３＿ＰＳの筋肉増加作用が確認された
［実施例２０］ＨｅｐＧ２細胞増殖に対するＩＧＦ１１－１６の作用
　マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６がＨｅｐＧ２細胞増殖に対して及ぼす濃度依存的な作用を細胞生存アッセイにより評価した。
　ＨｅｐＧ２細胞株をＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，１１９９５）にＦＢＳを１％添加した培地で懸濁し、コラーゲン－Ｉコート９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３５６６５０）に０．２５×１０4ｃｅｌｌｓ／ウェルで播種した。翌日にＢＳＡ／ＰＢＳ，ＩＧＦ－１（メカセルミン）、コントロールマウスＩｇＧ１抗体（ｍＩｇＧ１）、ＩＧＦ１１－１６抗体、及びシクツムマブ（Ｃｉｘｕｔｕｍｕｍａｂ；ＩＧＦ－１受容体アンタゴニスト抗体）を、５０ｎＭから１／１０公比で希釈して添加した。２日後、細胞増殖の指標として細胞内のＡＴＰ量を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ７５７１）を使用して、マルチ検出モードマイクロプレートリーダー（ＳＰＡＲＫ、ＴＥＣＡＮ）にて発光シグナルを測定した。コントロールマウスＩｇＧ１抗体（ｍＩｇＧ１）の各濃度ポイントの値を１００％として、％ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌを算出し、グラフとして表示した（図９）。
　その結果、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６がＨｅｐＧ２細胞増殖に対して抑制作用を示すことが観察された。この結果から、ＩＧＦ１１－１６が少なくともある種のがん細胞に対してはアンタゴニストの作用を示しうると考えられた。
［実施例２１］ＩＧＦ－１によるヒト乳がん細胞株（ＭＣＦ７）の増殖活性に対するＩＧＦ１１－１６の作用
　 ＩＧＦ－１によるヒト乳がん細胞株（ＭＣＦ７）増殖活性に対するＩＧＦ１１－１６の作用を評価するため、５０ｎＭ ＩＧＦ１１－１６を共存させた条件下でｈＩＧＦ－１（メカセルミン）の濃度依存的な増殖活性を、添加２日後の細胞内のＡＴＰ量によって測定した。
　ヒト乳がん細胞株（ＭＣＦ７）を、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で培養した。翌日、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地を使用して、９６ウェルプレート（Ｃｏｌｌａｇｅｎ－ｔｙｐｅ Ｉ ｃｏａｔｅｄ）に、０．１ｍＬ／ウェル（２．５×１０3ｃｅｌｌｓ／ウェル）で播種し、３７℃、５％ＣＯ2の条件でインキュベートした。細胞播種の翌日に、１％ＢＳＡ含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に培地交換して、３７℃、５％ＣＯ2の条件で約８時間インキュベートした。その後、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳまたはＩＧＦ１１－１６抗体を５０ｎＭ添加後、５０ｎＭから１／１０公比で希釈したＩＧＦ－１を添加し、３７℃、５％ＣＯ2の条件で２日間インキュベートした。細胞増殖の指標として細胞内のＡＴＰ量を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｇ７５７１）を使用して、マルチ検出モードマイクロプレートリーダー（ＳＰＡＲＫ、ＴＥＣＡＮ）にて発光シグナルを測定した。 それぞれの濃度のＩＧＦ－１添加群の０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ添加群の平均値を１００％として、５０ｎＭ ＩＧＦ１１－１６添加における変化を％ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌを算出することで表した。結果を表１７に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　その結果、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６がＩＧＦ－１によるヒト乳がん細胞株（ＭＣＦ７）の最大活性を低減させる抑制作用を有することが示された。この結果からＩＧＦ１１－１６がアロステリックアンタゴニストの作用を有すると考えられた。
　本発明は、脊椎動物のＩＧＦ－１受容体に特異的に結合し、ＩＧＦ－１受容体を介して筋肉量を増加させつつ、血糖値を低下させない抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体を提供することができるため、ＩＧＦ－１受容体に関連する疾患の治療、予防、又は診断に利用可能である。また、本発明は、ＩＧＦ－１受容体の過剰なシグナルを抑制することにより、細胞の異常増殖あるいは活性化が関係する疾患の治療、予防、又は診断にも利用可能であり、その産業上の価値は極めて高い。

Claims (34)

  1. 　マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６に由来する重鎖及び軽鎖の各相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体に由来する重鎖及び軽鎖の各フレームワーク領域（ＦＲ）とを含むと共に、少なくとも１つのＣＤＲが、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６の対応するＣＤＲに対して、少なくとも１箇所のアミノ酸残基の置換を含む、抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
  2. 　重鎖可変領域のフレームワーク領域１（ＦＲ－Ｈ１）の２５位のアミノ酸残基がプロリンである、請求項１に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
  3. 　重鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｈ１）配列として、配列番号１のアミノ酸配列、又は、配列番号１の何れか１箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列、
    　重鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｈ２）配列として、配列番号３若しくは配列番号５のアミノ酸配列、又は、配列番号３若しくは配列番号５の何れか１箇所、２箇所、若しくは３箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列、
    　重鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｈ３）配列として、配列番号７のアミノ酸配列、又は、配列番号７の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列、
    　軽鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｌ１）配列として、配列番号９のアミノ酸配列、又は、配列番号９の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列、
    　軽鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｌ２）配列として、配列番号１１のアミノ酸配列、又は、配列番号１１の何れか１箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列、
    　軽鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｌ３）配列として、配列番号１３のアミノ酸配列、又は、配列番号１３の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換されたアミノ酸配列
    を含む、請求項１又は２に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
  4. 　重鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｈ１）配列として、配列番号１と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
    　重鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｈ２）配列として、配列番号３又は配列番号５と８２％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
    　重鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｈ３）配列として、配列番号７と７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
    　軽鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｌ１）配列として、配列番号９と８１％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
    　軽鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｌ２）配列として、配列番号１１と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
    　軽鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｌ３）配列として、配列番号１３と７７％以上の相同性を有するアミノ酸配列
    を含む、請求項１又は２に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
  5. 　重鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｈ１）配列として、配列番号１の３位のＴｒｐが維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列であって、当該３位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号１と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
    　重鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｈ２）配列として、
    　　配列番号３の１位のＧｌｕ及び３位のＡｓｎが各々維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されると共に、６位のＡｓｎが維持され、又は、Ｓｅｒ若しくはＧｌｎに置換されたアミノ酸配列であって、当該１位、３位、及び６位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所、２箇所、若しくは３箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号３と８２％以上の相同性を有するアミノ酸配列、或いは、
    　　配列番号５の１位のＧｌｕ及び３位のＡｓｎが各々維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されると共に、６位のＳｅｒが維持され、又は、Ａｓｎ若しくはＧｌｎに置換されたアミノ酸配列であって、当該１位、３位、及び６位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所、２箇所、若しくは３箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号５と８２％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
    　重鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｈ３）配列として、配列番号７の４位のＡｒｇが維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列であって、当該４位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号７と７５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
    　軽鎖可変領域のＣＤＲ－１（ＣＤＲ－Ｌ１）配列として、配列番号９の９位のＴｒｐが維持され、又は、類似のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列であって、当該９位のアミノ酸残基以外の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号９と８１％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
    　軽鎖可変領域のＣＤＲ－２（ＣＤＲ－Ｌ２）配列として、配列番号１１の何れか１箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号１１と８５％以上の相同性を有するアミノ酸配列、
    　軽鎖可変領域のＣＤＲ－３（ＣＤＲ－Ｌ３）配列として、配列番号１３の何れか１箇所若しくは２箇所のアミノ酸残基が置換され、又は、配列番号１３と７７％以上の相同性を有するアミノ酸配列
    を含む、請求項１又は２に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
  6. 　配列番号７１のアミノ酸配列を有するヒトＩＧＦ－１受容体の細胞外ドメインに特異的に結合する、請求項１～５の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
  7. 　重鎖可変領域として、配列番号４３、４７、４９、５３、５５、若しくは５９のアミノ酸配列、配列番号４３、４７、４９、５３、５５、若しくは５９のアミノ酸配列において１若しくは数箇所のアミノ酸残基が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列、又は、配列番号４３、４７、４９、５３、５５、若しくは５９と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び、
    　軽鎖可変領域として、配列番号６５、６７、若しくは６９のアミノ酸配列、配列番号６５、６７、若しくは６９のアミノ酸配列において１若しくは数箇所のアミノ酸残基が置換、欠失、若しくは付加されたアミノ酸配列、又は、配列番号６５、６７、若しくは６９と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列
    を含む、請求項１～６の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
  8. 　重鎖及び／又は軽鎖の定常領域として、ヒト免疫グロブリンの何れかのクラスの重鎖及び／又は軽鎖の定常領域を含む、請求項１～７の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
  9. 　重鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ４クラスの重鎖定常領域又はその１～１０箇所のアミノ酸が置換された定常領域である、請求項１～８の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
  10. 　重鎖定常領域が、ヒトＩｇＧ１クラスの重鎖定常領域又はその１～１０箇所のアミノ酸が置換された定常領域である、請求項１～８の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
  11. 　ＩＧＦ－１受容体に対して平衡解離定数（ＫＤ）１×１０-7Ｍ以下の親和性で結合する、請求項１～１０の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
  12. 　ＩＧＦ－１受容体シグナル活性化能を有する、請求項１～１１の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
  13. 　筋芽細胞増殖試験において、増殖活性を有する、請求項１～１２の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
  14. 　ＢＩＡＣＯＲＥによる組換え可溶性ＩＧＦ－１受容体への結合性試験において、マウス親抗体ＩＧＦ１１－１６と同等以上の結合親和性を有する、請求項１～１３の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
  15. 　正常哺乳動物において、低血糖症状を誘導せず、筋量増加作用を誘導しうる、請求項１～１４の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
  16. 　下垂体摘出モデル動物において、低血糖症状を誘導せず、成長板軟骨伸長作用を誘導しうる、請求項１～１５の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
  17. 　脊椎動物の筋肉量及び／又は体長の増加を誘導する用量において当該脊椎動物に投与された場合に、当該脊椎動物の血糖値を低下させない、請求項１～１６の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
  18. 　脊椎動物の筋肉量及び／又は体長の増加を誘導する有効用量に対して１０倍以上の血中曝露量においても、当該脊椎動物の血糖値を低下させない、請求項１～１６の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
  19. 　ＩＧＦ－１受容体シグナル活性化抑制能を有する、請求項１～１８の何れか一項に記載のヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
  20. 　筋芽細胞増殖試験において、ＩＧＦ－１受容体を活性化しうるリガンドであるＩＧＦ－１、ＩＧＦ－２、及びインスリンの少なくとも一つの増殖活性を抑制する、請求項１～１８の何れか一項に記載のヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
  21. 　がん細胞増殖試験において、細胞増殖を抑制する活性を有する、請求項１～２０の何れか一項に記載のヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
  22. 　抗ＩＧＦ－Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体が、１）～４）の少なくとも一つの特徴を有する、請求項１～２１のいずれか一項に記載の抗ＩＧＦ－Ｉ受容体抗体もしくはその断片、又はそれらの誘導体。
    １）ＩＧＦ－Ｉ受容体活性化リガンドによる脊椎動物由来細胞の増殖を阻害する。
    ２）脊椎動物におけるＩＧＦ－Ｉ受容体活性化リガンドに起因する細胞増殖性疾患における細胞増殖を抑制する。
    ３）ＩＧＦ－Ｉ受容体活性化リガンドによる脊椎動物由来細胞の増殖を阻害する用量において、分化筋細胞でのグルコース取込みに影響しない。
    ４）脊椎動物におけるＩＧＦ－Ｉ受容体活性化リガンドに起因する細胞増殖性疾患における細胞増殖を抑制する用量において、当該脊椎動物の血糖値を変動させない。
  23. 　担癌モデル動物において、血糖値に影響を与えることなく、がん細胞増殖抑制作用を誘導しうる、請求項１～２２の何れか一項に記載のヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
  24. 　担癌モデル動物において、がん細胞増殖抑制作用を誘導しうる有効用量に対して１０倍以上の血中曝露量においても、当該モデル動物の血糖値に影響を与えない、請求項２３に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体。
  25. 　請求項１～２４の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子。
  26. 　請求項２５に記載の核酸分子を少なくとも一つ含むクローニングベクター又は発現ベクター。
  27. 　請求項２６に記載のベクターが宿主細胞に導入された組換え体細胞。
  28. 　請求項１～２４の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体を製造する方法であって、請求項２７に記載の組換え体細胞を培養し、前記組換え体細胞から産生される当該抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体を精製する工程を含む方法。
  29. 　請求項１～２４の何れか一項に記載の抗ＩＧＦ－１受容体ヒト化抗体若しくはその断片、又はそれらの誘導体、請求項２５に記載の核酸分子、請求項２６に記載のベクター、或いは請求項２７に記載の組換え体細胞を有効成分として含む、医薬組成物。
  30. 　筋萎縮性疾患又は低身長症の治療に用いられる、請求項２９に記載の医薬組成物。
  31. 　筋萎縮性疾患が、廃用性筋萎縮、サルコペニア、又はカヘキシアである、請求項３０に記載の医薬組成物。
  32. 　低身長症が、ラロン型低身長症又は成長ホルモン抵抗性低身長症である、請求項３０に記載の医薬組成物。
  33. 　ＩＧＦ－１受容体に関連した疾患の治療に用いられる、請求項２９に記載の医薬組成物。
  34. 　ＩＧＦ－Ｉ受容体に関連した疾患が、肝臓がん、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、小児がん、先端巨大症、卵巣がん、膵臓がん、良性前立腺肥大症、乳がん、前立腺がん、骨がん、肺がん、結腸直腸がん、頚部がん、滑膜肉腫、膀胱がん、胃がん、ウィルムス腫瘍、転移性カルチノイド及び血管作動性腸管ペプチド分泌腫瘍に関連する下痢、ビポーマ、ウェルナー－モリソン症候群、ベックウィズ－ヴィーデマン症候群、腎臓がん、腎細胞がん、移行上皮がん、ユーイング肉腫、白血病、急性リンパ芽球性白血病、脳腫瘍、膠芽腫、非膠芽腫性脳腫瘍、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、未分化神経外胚葉性腫瘍、髄芽腫、星状細胞腫、乏突起膠腫、脳室上衣腫、脈絡叢乳頭腫、巨人症、乾癬、アテローム性動脈硬化症、血管の平滑筋再狭窄、不適切な微小血管増殖、糖尿病性網膜症、グレーヴズ病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、自己免疫性甲状腺疾患、橋本甲状腺炎、甲状腺眼症、甲状腺機能亢進症ならびにベーチェット病からなる群より選択される疾患である、請求項３３に記載の医薬組成物。
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