TW202210513A - 抗ｉｇｆ－１受體人源化抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明課題為提供一種抗IGF-1受體人源化抗體，其不會透過人類IGF-1受體誘導低血糖症狀，並且可增加肌肉量。 解決手段為一種抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其係包含：來自小鼠母體抗體IGF11-16的重鏈及輕鏈的CDR、與來自人類抗體的重鏈及輕鏈的各FR，而且至少一個CDR包含對於小鼠母體抗體之對應的CDR至少1處胺基酸殘基的替換。

Description

抗ＩＧＦ－１受體人源化抗體
本發明關於一種抗IGF-1受體人源化抗體。具體而言，關於一種抗IGF-1受體人源化抗體，其係與IGF-1受體特異性地結合。
1.IGF-1 IGF-1是似胰島素成長因子，會透過由腦下垂體分泌的生長荷爾蒙(GH)造成的GH受體的活化主要由肝臟被分泌出來，藉由和IGF-1受體發生作用，會在各種臟器表現出各種生理機能。由此看來，可期待以IGF-1來治療各種疾病。IGF-1與前胰島素的胺基酸序列作比較，具有約40%的高相同性，因此也會有與胰島素受體結合，而表現出如胰島素般的作用的情形。另外，IGF-1受體與胰島素受體的胺基酸序列作比較，具有約60%的高相同性，因此兩種受體也會藉由形成異源二聚體而發揮出生理作用。此外，胰島素會藉由和胰島素受體發生作用而表現出強烈的血糖降低作用，因此可作為降血糖藥使用於治療。
2.IGF-1受體 IGF-1受體是由α鏈及β鏈所構成，是包含L1、CR、L2、Fn1、Fn2及Fn3這6個細胞外結構域、跨膜結構域及細胞內結構域的跨膜蛋白質。IGF-1受體的細胞內結構域具有酪胺酸激酶。細胞外結構域，隨著IGF-1結合於IGF-1受體時該受體的立體構造的變化，關係到細胞內酪胺酸激酶的活化。IGF-1受體會形成同源二聚複合體(同源型)，在與IGF-1結合時，藉由使受體激酶活化來傳遞訊號。另外，形成胰島素受體的異源二聚體複合體(異源型)，與胰島素或IGF-1結合時，藉由活化受體激酶來傳遞訊號。
3.IGF-1的生理作用 已知IGF-1有身長或體重增加等的生長促進作用及糖代謝促進或血糖降低作用等的似胰島素代謝作用。人類重組IGF-1美卡舍明(mecasermin)，被認為會改善胰島素受體異常症的高血糖、高胰島素血症、黑色表皮腫及多毛這些症狀。另外還被認為會改善生長荷爾蒙抵抗性侏儒症的成長障礙(非專利文獻1)。
4.IGF-1的生長促進作用 IGF-1是生長促進的主要因子(非專利文獻2、非專利文獻3)。實際上，人類重組IGF-1美卡舍明(mecasermin)，在臨床上被使用作為侏儒症的治療藥。另外還已知IGF-1會亢進人類軟骨細胞的DNA合成能力。另外，IGF-1的投予會讓腦下垂體摘出大鼠的體重增加，並使大腿骨骨長伸長。
5.IGF-1的肌肉量增加作用 對於透過IGF-1的細胞增殖活性的亢進而言，IGF-1受體的持續活化是必要的。在過度表現IGF-1受體的動物身上，肌肉量會增加。另外，IGF-1/IGFBP3的持續投予，會增進近端股骨骨折患者的握力，可改善不靠人幫助由座位站起的能力。已知高齡人及小鼠的肌肉中的IGF-1濃度與幼齡相比為較低，然而讓肌肉組織特異性地強制表現出IGF-1的高齡小鼠，與野生型小鼠相比，肌肉量較為改善(非專利文獻4)。
6.讓肌肉量增加的新藥 飢餓素受體的促效劑阿那莫林(Anamorelin)，在廢用性肌肉萎縮症、惡病質的臨床測試之中，會讓除脂體重增加。另一方面，觀察到副作用是想吐及血糖值上昇。肌肉生長抑制素會與激活素受體II(ActRII)發生作用，而阻礙Akt/mTOR，骨骼肌形成的負型控制因子。抗肌肉生長抑制素抗體LY2495655，會增加實施了全人工髖關節更換手術的患者及高齡者的肌肉量。另外，抗ActRII抗體 bimagrumab會增加神經肌肉疾病患者的肌肉量。但是，促進骨骼肌形成且可用來治療的藥，目前並不存在。
7.IGF-1的血糖降低作用 IGF-1的似胰島素作用，已知有血糖降低作用。IGF-1在來自大鼠肌肉的細胞，會亢進葡萄糖吸收作用。另外，IGF-1的投予會降低大鼠的血糖值。有文獻報告由IGF-1所產生的血糖降低作用，在臨床上有引發低血糖症狀的副作用。此外，IGF-1會因為對人體投予而引發低血糖症狀，因此在治療開始時，必須從低用量開始逐漸投予適當量，並觀察各種臨床發現，包括投予後的血糖值等。
IGF-1會透過Akt的磷酸化的亢進等表現出血糖降低作用。Akt的活性型變異體會亢進3T3-L1細胞的葡萄糖吸收。另一方面，Akt2缺損的小鼠，血糖值會上昇。另外，來自大鼠肌肉的細胞之中，Akt阻礙劑會阻礙由胰島素刺激所造成的葡萄糖吸收。此外，已知IGF-1會使與血糖降低作用有關的胰島素受體活化。由此看來，由IGF-1所產生的血糖降低作用，認為會和Akt的過度活化及胰島素受體的活化有關。
8.IGF-1的短血中半衰期 IGF-1的血中半衰期短，因此在治療過程中必須頻繁投予。實際上，人類重組IGF-1美卡舍明(mecasermin)的血中半衰期為約11小時至16小時，在治療侏儒症時，1天必須投予1次至2次。血中的IGF-1之約70至80%會與IGFBP3結合。IGF-1的游離體會表現出生理活性。IGFBP3的結合會將IGF-1的血中半衰期維持在約10小時到16小時。IGF-1與IGFBP3混合劑IPLEX，血中半衰期為約21小時到26小時，與IGF-1相比為較長，是可1天投予1次的藥劑。但是IPLEX已由市場退出。曾經有人嘗試開發出改善IGF-1的動態的PEG化IGF-1，然而可使用於治療的藥劑並不存在。
9.藉由IGF-1的作用所能夠期待的治療效果 已知IGF-1會和多種臟器發生作用，其生理機能有各式各樣。例如有文獻報告IGF-1在中樞神經系統中，透過IGF-1受體的活化，利用線粒體保護及抗氧化作用而會有神經保護作用。IGF-1會促進傷害後神經突的形成。另外，IGF-1被認為對肝硬化的治療是有用的。肝硬化是由肝功能障礙或慢性肝病病情發展到後來的疾病，並且會伴隨發生肝臟纖維化。在肝硬化模型動物身上，IGF-1的投予抑制了肝臟的纖維化。此外還已知IGF-1也與腎臟的發達、功能有關。在腎臟的繫膜細胞之中，IGF-1對於糖毒性造成的氧化應激及細胞凋亡會有保護作用。IGF-1可期待作為腎臟病的治療藥。
可期待藉由投予IGF-1來改善的病態，有肌少症、廢用性肌肉萎縮症、惡病質、侏儒症、Laron氏症、肝硬化、肝纖維化、老化、子宮內胎兒發育遲緩(IUGR)、神經病變、腦中風、脊髓損傷、心血管保護、糖尿病、胰島素抵抗性、代謝症候群、腎臟病、骨質疏鬆症、囊胞性纖維症、創傷治癒、肌強直性營養不良、愛滋肌肉減少症、伴隨HIV發生的脂肪移位症候群、燒傷、克隆氏症、Verner症候群、X性聯複合型免疫缺乏症、重聽、神經性厭食症及早產兒視網膜病變。像這樣，IGF-1具有多樣的生理作用，因此可期待作為各種疾病的治療藥。但是，副作用的血糖降低作用及因為短半衰期而多次投予，會是臨床使用時的課題。
10.抗IGF-1受體促效劑抗體 抗體製劑一般而言半衰期長，每月1次到2次的投予會表現出有效性。有幾個文獻報告抗IGF-1受體促效劑抗體在試管內(in vitro)短時間處理的受體活化作用。例如抗體3B7及抗體2D1在試管內促進了培養5小時的重組IGF-1受體表現細胞的DNA合成(非專利文獻5)。另外，具有癌細胞株增殖抑制活性的抗IGF-1受體拮抗劑抗體11A1、11A4、11A11及24-57會亢進IGF-1受體的酪胺酸的磷酸化，雖然在試管內極微弱(非專利文獻6)。另外有文獻揭示抗體16-13、17-69、24-57、24-60及24-31具有在試管內短時間內亢進細胞的DNA合成及葡萄糖吸收的作用，這些抗體可能會具有血糖降低作用(非專利文獻7)。
然而，IGF-1受體酪胺酸磷酸化，也會在具有癌細胞增殖抑制作用的αIR-3等的抗IGF-1受體拮抗劑抗體被觀察到，無法成為促效劑作用的指標(非專利文獻5、6、8)。另外，在胸苷或BrdU的吸收等DNA合成作為指標的細胞增殖測定之中，具有癌細胞增殖抑制作用的抗IGF-1受體拮抗劑抗體也會觀察到胸苷吸收(非專利文獻5～8)，而不能成為具有細胞增殖活性的促效劑抗體的指標。此外，這些都是24小時以內的短時間的評估，並沒有關於在數天的培養中促進細胞增殖的IGF-1受體促效劑抗體的報告(非專利文獻5～8)。更何况，並沒有在活體內(in vivo)表現出對IGF-1受體的促效劑活性的抗體的報告。另外，IGF-1會發揮降血糖作用與細胞增殖作用兩者，因此為了將抗IGF-1受體促效劑抗體作為治療藥投予至人體，必須避免血糖降低作用，然而目前為止並沒有這種抗IGF-1受體促效劑抗體的報告。另外還已知抗體分子量大、組織轉移性低，腦內轉移性為0.1%左右，肌肉組織轉移性為2%左右。因此，為了在抗體的轉移性低的組織發揮作用，必須是在極低濃度區域(pM級)表現出足夠藥理活性的抗體。然而目前為止並沒有在這種極低濃度可發生作用的抗IGF-1受體促效劑抗體的報告。
在這背景之下，本發明人等成功製作出一種抗IGF-1受體單株小鼠抗體IGF11-16，在試管內以極低濃度發揮出肌肉母細胞增殖作用，且以這樣的濃度不會誘導分化骨骼肌細胞的糖吸收。此外確認了所得到的該單株小鼠抗體在活體內不會引發低血糖症狀，會誘導肌肉量增加作用及生長板伸長作用(專利文獻1)。
11.抗IGF-1受體拮抗劑抗體 結合於IGF-1受體的抗體，利用阻礙IGF-1與IGF-1受體的結合的拮抗劑作用，曾經被嘗試應用於治療惡性腫瘤等。然而，現今的抗IGF-1受體拮抗劑抗體，在單獨治療過程中，不僅會有高血糖等的副作用多(非專利文獻9)，還會因為與其他抗癌劑的併用讓高血糖的發生率上昇(非專利文獻10)，因此被認為在治療方面的使用會受到限制。近年來，替妥木單抗(Teprotumumab)被承認適用於甲狀腺機能亢進的眼症(非專利文獻11)。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2018/221521號 [非專利文獻]
[非專利文獻1]人類介素C「製劑Somazon( 註冊商標 ) 注射用10mg」醫藥品訪談表(Interview form)、2015年5月改訂、第5版 [非專利文獻2]Abuzzahab, M.J., et al., IGF-I receptor mutations resulting in intrauterine and postnatal growth retardation. N Engl J Med, 2003. 349(23): p.2211-22. [非專利文獻3]Woods, K.A., et al., Intrauterine growth retardation and postnatal growth failure associated with deletion of the insulin-like growth factor I gene. N Engl J Med, 1996. 335(18): p.1363-7. [非專利文獻4]Musaro, A., et al., Localized Igf-1 transgene expression sustains hypertrophy and regeneration in senescent skeletal muscle, Nature Genetics, 2001, Vol.27, No.2, pp.195-200 [非專利文獻5]Xiong, L., et al., Growth-stimulatory monoclonal antibodies against human insulin-like growth factor I receptor. Proc Natl Acad Sci USA, 1992. 89(12): p.5356-60. [非專利文獻6]Runnels, H.A., et. al., Human monoclonal antibodies to the insulin-like growth factor 1 receptor inhibit receptor activation and tumor growth in preclinical studies. Adv Ther, 2010. 27(7): p.458-75. [非專利文獻7]Soos, M.A., et. al., A panel of monoclonal antibodies for the type I insulin-like growth factor receptor. Epitope mapping, effects on ligand binding, and biological activity. J Biol Chem, 1992. 267(18): p.12955-63. [非專利文獻8]Kato, H., et al., Role of tyrosine kinase activity in signal transduction by the insulin-like growth factor-I(IGF-I) receptor. Characterization of kinase-deficient IGF-I receptors and the action of an IGF-I-mimetic antibody(alpha IR-3). J Biol Chem, 1993. 268(4): p. 2655-61. [非專利文獻9]Atzori, F., et al., A Phase I Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Study of Dalotuzumab (MK-0646), an Anti-Insulin-like Growth Factor-1 Receptor Monoclonal Antibody, in Patients with Advanced Solid Tumors. Clin Cancer Res., 2011. 17(19): p.6304-12. [非專利文獻10]de Bono J.S., et al., Phase II randomized study of figitumumab plus docetaxel and docetaxel alone with crossover for metastaticcastration-resistant prostate cancer. Clin Cancer Res., 2014. 20(7): p.1925-34. [非專利文獻11]Markham. A, Teprotumumab: First Approval. Drugs, 2020. 80(5): p.509-512. [非專利文獻12]Riechman, L., Clark, M., Waldmann, H., Winter, G.: Reshaping human antibodies for therapy. Nature, 1988. 332: p.323-327. [非專利文獻13]Kabat et al., The Journal of Immunology, 1991, Vol. 147, No.5, pp.1709-1719 [非專利文獻14]Al-Lazikani et al., Journal of Molecular Biology, 1997, Vol.273, No.4, pp.927-948 [非專利文獻15]Abhinandan, K.R. et al., Molecular Immunology, 2008, Vol.45, pp.3832-3839 [非專利文獻16]Jian, Y. et al., Nucleic Acids Research, 2013, Vol.41, W34-W40 [非專利文獻17]Yamada, T. et al., Therapeutic monoclonal antibodies. Keio Journal of Medicine, 2011, Vol.60, No.2, pp37-46 [非專利文獻18]Burks, E.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, Vol.94, No.2, pp.412-417 [非專利文獻19]Dumet, C., et al., MAbs, 2019, Vol.11, No.8, pp1341-1350 [非專利文獻20]Saunders, K. O., Frontiers in Immunology, 2019, Vol.10, Article 1296 [非專利文獻21]Walle et al., Expert Opin. Biol. Ther., 2007, Vol.7, No.3, pp.405-418 [非專利文獻22]Silva, J-P., et al., The Journal of Biological Chemistry, 2015, Vol.290, No.9, pp.5462-5469
[發明所欲解決的課題]
本發明其中一個目的為提供一種抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物、或其製作方法，具有與既報之抗IGF-1受體小鼠抗體IGF11-16(專利文獻1)同等以上的特異性及結合親和性或活性。
本發明之具體目的，可列舉例如為了取得具有與曾經被報告的抗IGF-1受體小鼠抗體IGF11-16(專利文獻1)同等以上的特異性及結合親和性或活性的人源化抗體，(1)提供設計人類框架所必須的胺基酸；(2)提供抗原結合部位的CDR序列(在本發明中是藉由Kabat法來鑑定)之中維持活性所必須的胺基酸部位；(3)提供用來降低免疫原性的胺基酸替換；及(4)提供用來避免去醯胺化風險的胺基酸替換等，但是並不受這些例子限定。
藉由利用以及應用本發明，可得到例如不會透過人類IGF-1受體誘導低血糖症狀，可增加肌肉量之抗IGF-1受體人源化抗體。藉此可得到例如能夠以改善或治療肌少症、廢用性肌肉萎縮、或惡病質等的與IGF-1受體訊號相關聯的病態或疾病為目的來投予至人體的抗IGF-1受體人源化抗體。另外還可提供可投予至人體、確保低免疫原性或物性安定性之人源化抗體。 [用於解決課題的手段]
亦即本發明關於以下項目。 [1]　一種抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其係包含：來自小鼠母體抗體IGF11-16的重鏈及輕鏈的各互補決定區(CDR)、與來自人類抗體的重鏈及輕鏈的各框架區(FR)，而且至少一個CDR包含對於小鼠母體抗體IGF11-16之對應的CDR至少1處胺基酸殘基的替換。 [2]　如[1]項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其中重鏈可變區之框架區1(FR-H1)之25位的胺基酸殘基為脯胺酸。 [3]　如[1]或[2]項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其中包含： SEQ ID NO:1之胺基酸序列；或SEQ ID NO:1之任一處胺基酸殘基被替換之胺基酸序列，以作為重鏈可變區之CDR-1(CDR-H1)序列， SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5之胺基酸序列；或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5之任一處、兩處或三處胺基酸殘基被替換之胺基酸序列，以作為重鏈可變區之CDR-2(CDR-H2)序列， SEQ ID NO:7之胺基酸序列；或SEQ ID NO:7之任一處或兩處胺基酸殘基被替換之胺基酸序列，以作為重鏈可變區之CDR-3(CDR-H3)序列， SEQ ID NO:9之胺基酸序列；或SEQ ID NO:9之任一處或兩處胺基酸殘基被替換之胺基酸序列，以作為輕鏈可變區之CDR-1(CDR-L1)序列， SEQ ID NO:11之胺基酸序列；或SEQ ID NO:11之任一處胺基酸殘基被替換之胺基酸序列，以作為輕鏈可變區之CDR-2(CDR-L2)序列， SEQ ID NO:13之胺基酸序列；或SEQ ID NO:13之任一處或兩處胺基酸殘基被替換之胺基酸序列，以作為輕鏈可變區之CDR-3(CDR-L3)序列。 [4]　如[1]或[2]項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其中包含： 與SEQ ID NO:1具有80%以上的相同性之胺基酸序列，以作為重鏈可變區之CDR-1(CDR-H1)序列， SEQ ID NO:3或與SEQ ID NO:5具有82%以上的相同性之胺基酸序列，以作為重鏈可變區之CDR-2(CDR-H2)序列， 與SEQ ID NO:7具有75%以上的相同性之胺基酸序列，以作為重鏈可變區之CDR-3(CDR-H3)序列， 與SEQ ID NO:9具有81%以上的相同性之胺基酸序列，以作為輕鏈可變區之CDR-1(CDR-L1)序列， 與SEQ ID NO:11具有85%以上的相同性之胺基酸序列，以作為輕鏈可變區之CDR-2(CDR-L2)序列， 與SEQ ID NO:13具有77%以上的相同性之胺基酸序列，以作為輕鏈可變區之CDR-3(CDR-L3)序列。 [5]　如[1]或[2]項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其中包含： SEQ ID NO:1之3位的Trp維持不變或被替換成類似的胺基酸殘基之胺基酸序列，並且該3位的胺基酸殘基以外的任一處胺基酸殘基被替換；或與SEQ ID NO:1具有80%以上的相同性之胺基酸序列，以作為重鏈可變區之CDR-1(CDR-H1)序列， SEQ ID NO:3之1位的Glu及3位的Asn分別維持不變或被替換成類似的胺基酸殘基，而且6位的Asn維持不變或被替換成Ser或Gln之胺基酸序列，並且該1位、3位及6位的胺基酸殘基以外的任一處、兩處或三處胺基酸殘基被替換；或與SEQ ID NO:3具有82%以上的相同性之胺基酸序列，或 SEQ ID NO:5之1位的Glu及3位的Asn分別維持不變或被替換成類似的胺基酸殘基，而且6位的Ser維持不變或被替換成Asn或Gln之胺基酸序列，並且該1位、3位及6位的胺基酸殘基以外的任一處、兩處或三處胺基酸殘基被替換；或與SEQ ID NO:5具有82%以上的相同性之胺基酸序列，以作為重鏈可變區之CDR-2(CDR-H2)序列， SEQ ID NO:7之4位的Arg維持不變或被替換成類似的胺基酸殘基之胺基酸序列，並且該4位的胺基酸殘基以外的任一處或兩處胺基酸殘基被替換；或與SEQ ID NO:7具有75%以上的相同性之胺基酸序列，以作為重鏈可變區之CDR-3(CDR-H3)序列， SEQ ID NO:9之9位的Trp維持不變或被替換成類似的胺基酸殘基之胺基酸序列，並且該9位的胺基酸殘基以外的任一處或兩處胺基酸殘基被替換；或與SEQ ID NO:9具有81%以上的相同性之胺基酸序列，以作為輕鏈可變區之CDR-1(CDR-L1)序列， SEQ ID NO:11之任一處胺基酸殘基被替換；或與SEQ ID NO:11具有85%以上的相同性之胺基酸序列，以作為輕鏈可變區之CDR-2(CDR-L2)序列， SEQ ID NO:13之任一處或兩處胺基酸殘基被替換；或與SEQ ID NO:13具有77%以上的相同性之胺基酸序列，以作為輕鏈可變區之CDR-3(CDR-L3)序列。 [6]　如請求項1～5項中任一項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其係特異性地結合於具有SEQ ID NO:71之胺基酸序列的人類IGF-1受體的細胞外結構域。 [7]　如[1]～[6]項中任一項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其中包含： SEQ ID NO:43、47、49、53、55、或59之胺基酸序列；在SEQ ID NO:43、47、49、53、55、或59之胺基酸序列之中一或多處胺基酸殘基被替換、缺失或附加之胺基酸序列；或與SEQ ID NO:43、47、49、53、55、或59具有90%以上的相同性之胺基酸序列，以作為重鏈可變區，及 SEQ ID NO:65、67、或69之胺基酸序列；在SEQ ID NO:65、67、或69之胺基酸序列之中一或多處胺基酸殘基被替換、缺失或附加之胺基酸序列；或與SEQ ID NO:65、67、或69具有90%以上的相同性之胺基酸序列，以作為輕鏈可變區。 [8]　如[1]～[7]項中任一項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其中包含： 人類免疫球蛋白的任一型的重鏈及/或輕鏈的恆定區，以作為重鏈及/或輕鏈的恆定區。 [9]　如[1]～[8]項中任一項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其中重鏈恆定區為人類IgG4型的重鏈恆定區或其1～10處胺基酸被替換之恆定區。 [10]　如[1]～[8]項中任一項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其中重鏈恆定區為人類IgG1型的重鏈恆定區或其1～10處胺基酸被替換之恆定區。 [11]　如[1]～[10]項中任一項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其係以平衡解離常數(KD)1×10-7 M以下的親和性與IGF-1受體結合。 [12]　如[1]～[11]項中任一項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其係具有IGF-1受體訊號活化能力。 [13]　如[1]～[12]項中任一項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其在肌肉母細胞增殖測試之中，具有增殖活性。 [14]　如[1]～[13]項中任一項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其在利用BIACORE進行的與重組可溶性IGF-1受體的結合性測試之中，具有與小鼠母體抗體IGF11-16同等以上的結合親和性。 [15]　如[1]～[14]項中任一項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其在正常哺乳動物身上，不會誘導低血糖症狀，可誘導肌肉量增加作用。 [16]　如[1]～[15]項中任一項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其在腦下垂體摘出模型動物身上，不會誘導低血糖症狀，可誘導生長板軟骨伸長作用。 [17]　如[1]～[16]項中任一項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其在以誘導脊椎動物的肌肉量及/或體長增加的用量被投予至該脊椎動物的情況，不會降低該脊椎動物的血糖值。 [18]　如[1]～[16]項中任一項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其係即使在相對於誘導脊椎動物的肌肉量及/或體長增加的有效用量10倍以上的血中曝露量，也不會降低該脊椎動物的血糖值。 [19]　如[1]～[18]項中任一項之人源化抗體、其片段或其衍生物，其係具有IGF-1受體訊號活化抑制能力。 [20]　如[1]～[18]項中任一項之人源化抗體、其片段或其衍生物，其在肌肉母細胞增殖測試之中，抑制可活化IGF-1受體的配體之IGF-1、IGF-2及胰島素的至少一者的增殖活性。 [21]　如[1]～[20]項中任一項之人源化抗體、其片段或其衍生物，其係在癌細胞增殖測試之中，具有抑制細胞增殖的活性。 [22]　如[1]～[21]項中任一項之抗IGF-I受體抗體、其片段或其衍生物，其中抗IGF-I受體抗體、其片段或其衍生物具有1)～4)之至少一個特徵： 1)阻礙由IGF-I受體活化配體所造成的脊椎動物細胞增殖， 2)在脊椎動物身上起因於IGF-I受體活化配體的細胞增殖性疾病當中，抑制細胞增殖， 3)在阻礙由IGF-I受體活化配體所造成的脊椎動物細胞增殖的用量下，不影響分化肌肉細胞的葡萄糖吸收， 4)在脊椎動物身上起因於IGF-I受體活化配體的細胞增殖性疾病當中，在抑制細胞增殖的用量下，不使該脊椎動物的血糖值變動。 [23]　如[1]～[22]項中任一項之人源化抗體、其片段或其衍生物，其在荷瘤模型動物身上，不會對血糖值造成影響，可誘導癌細胞增殖抑制作用。 [24]　如[23]項中任一項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其在荷瘤模型動物身上，即使在相對於可誘導癌細胞增殖抑制作用的有效用量10倍以上的血中曝露量，也不會對該模型動物的血糖值造成影響。 [25]　一種核酸分子，其係包含編碼如[1]～[24]項中任一項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物之聚核苷酸序列。 [26]　一種選殖載體或表現載體，其係包含至少一個如[25]項之核酸分子。 [27]　一種重組體細胞，其係如[26]項之載體被導入宿主細胞。 [28]　一種製造如[1]～[24]項中任一項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物之方法，並且包含培養如[27]項之重組體細胞，並將由前述重組體細胞所產生的該抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物純化之步驟。 [29]　一種醫藥組成物，其係包含如[1]～[24]項中任一項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物、如[25]項之核酸分子、如[26]項之載體、或如[27]項之重組體細胞以作為有效成分。 [30]　如[29]項之醫藥組成物，其係使用於治療肌肉萎縮性疾病或侏儒症。 [31]　如[30]項之醫藥組成物，其中肌肉萎縮性疾病為廢用性肌肉萎縮、肌少症、或惡病質。 [32]　如[28]項之醫藥組成物，其中侏儒症為Laron型侏儒症或生長荷爾蒙抵抗性侏儒症。 [33]　如[29]項之醫藥組成物，其係使用於治療與IGF-1受體相關聯的疾病。 [34]　如[33]項之醫藥組成物，其中與IGF-I受體相關聯的疾病，係選自由肝癌、神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、小兒癌、肢端肥大症、卵巢癌、胰臟癌、良性前列腺肥大症、乳癌、前列腺癌、骨癌、肺癌、結腸直腸癌、頸部癌、滑膜肉瘤、膀胱癌、胃癌、威爾姆氏腫瘤、轉移性類癌及血管活性腸肽分泌腫瘤相關聯的下痢、VIP瘤、Verner-Morrison症候群、Beckwith-Wiedemann症候群、腎臟癌、腎細胞癌、轉移性上皮癌、Ewing氏肉瘤、白血病、急性淋巴芽球性白血病、腦腫瘤、膠質母細胞瘤、非膠質母細胞瘤性腦腫瘤、髓膜瘤、腦下垂體腺瘤、前庭神經鞘瘤、原始性神經外胚層腫瘤、髓母細胞瘤、星狀細胞瘤、寡樹突膠質細胞瘤、室管膜瘤、脈絡叢乳頭狀瘤、巨人症、乾癬、動脈粥狀硬化症、平滑肌增生造成血管再狹窄、不適當的微血管增生、糖尿病視網膜病變、葛瑞夫茲氏病、多發性硬化症、全身性紅斑狼瘡、重症肌無力症、自體免疫甲狀腺疾病、橋本氏甲狀腺炎、甲狀腺眼病變、甲狀腺機能亢進、以及貝賽特氏症所構成的群組之疾病。 [發明之效果]
本發明之抗體、其片段或其衍生物，可得到一種抗IGF-1受體人源化抗體，藉由結合於人類IGF-1受體，可使用於治療或預防透過人類IGF-1受體作用的疾病。另外還可提供一種人源化抗體，可投予至人體，確保低免疫原性或物性安定性。
以下藉由具體的實施形態來說明本發明，然而本發明完全不受這些實施形態限定。此外，在本說明書之中，所引用的包含專利公報、專利申請公開公報及非專利公報的所有文獻，在各種目的方面，其全體因為援用而被編入本說明書中。
此外，在本說明書之中，表示濃度的「M」代表與莫耳濃度的「mol/L」同義的單位。
本發明是一種抗IGF-1受體人源化抗體，會特異性地結合於IGF-1受體。本發明之抗體，不會透過人類IGF-1受體誘導低血糖症狀，具有增加肌肉量的作用。藉此，可改善或治療肌少症、廢用性肌肉萎縮、惡病質等的IGF-1受體訊號關予的病態或疾病。另外，本發明之抗體是確保低免疫原性及物性安定性的人源化抗體。
[IGF] 在本揭示之中，「IGF」是指似胰島素成長因子(Insulin-like Growth Factor)，存在IGF-1與IGF-2。IGF-1及IGF-2是生物體內的配體，會結合於後述IGF-1受體(似胰島素成長因子-1受體：Insulin-like Growth Factor-I Receptor)，將細胞分裂或代謝的訊號送入細胞內，而具有促效劑活性。已知IGF-1及IGF-2也會和與IGF-1受體構造上有類似性的胰島素受體(INSR)微弱地交叉結合。在本說明書中，主要使用生理機能等已廣為人知的IGF-1，然而在檢討透過IGF-1受體與配體的結合的作用或疾病等的情況，也會有包括IGF-1與IGF-2兩者的作用來記載的情形。
IGF-1也被稱為體介素C，是由70個胺基酸所形成的單一多肽的荷爾蒙。人的IGF-1序列，可參照NCBI Reference Sequence 編號：NP_000609，或EMBL-EBI的UniProtKB登錄號P05019等來取得。分別將成熟型人IGF-1的胺基酸序列表示於SEQ ID NO:83，對應的核酸鹼基序列的一例表示於SEQ ID NO:84。該由70個胺基酸所形成的序列有許多種被保存著。在本發明中，僅記載為「IGF-1」的情況，只要沒有特別註明，意指具有荷爾蒙活性的IGF-1蛋白質。
IGF-1會在以肝臟細胞為首的生物體內的各種細胞產生，也會在血液或其他體液中存在。所以，天然型IGF-1可由動物的體液、或從動物分離的初代培養細胞或株化細胞等培養出來的培養物純化而得到。另外，IGF-1可藉由生長荷爾蒙來誘導細胞產生，因此亦可從被投予生長荷爾蒙的動物的體液、或從動物分離出來的初代培養細胞或株化細胞等在生長荷爾蒙存在下培養出來的培養物純化而得到IGF-1。另外，關於其他方法，還可使用編碼了IGF-1的胺基酸序列的核酸分子插入表現載體導入來自大腸菌等的原核生物或酵母、昆蟲細胞或哺乳類的培養細胞等的真核細胞宿主而成的重組體細胞，或使用導入了IGF-1基因的基因轉殖動物或基因轉殖植物等來製造出IGF-1。此外，人類IGF-1，也能夠以研究用試藥(Enzo Life Sciences, catalog:ADI-908-059-0100；Abnova, catalog: P3452等)、醫藥品(Somazon( 註冊商標 ) ，美卡舍明(mecasermin)，INCRELEX( 註冊商標 ) 等)的形式獲得。關於所使用的IGF-1在活體內及在試管內的活性，將World Health Organization的National Institute for Biological Standards and Control(NIBSC)的NIBSC code：91/554的IGF-1標準物質的活性定為1國際單位/微克並作比較，可評估其比活性。本發明中的IGF-1，是使用具有與該NIBSC code:91/ 554的IGF-1同等的比活性的IGF-1。
[IGF-1受體] 在本揭示之中，「IGF-1受體」或「IGF-1R」，是指似胰島素成長因子-I受體(Insulin-like Growth Factor-I Receptor)。在本說明書之中，「IGF-1受體」只要沒有特別註明，意指IGF-1受體蛋白質。IGF-1受體，是兩個由α鏈與β鏈所形成的次單元結合成的構造的蛋白質。在SEQ ID NO:71所示的人類IGF-1受體的胺基酸序列之中，由該胺基酸序列之中31位至735位的胺基酸序列所形成的部分相當於α鏈，β鏈相當於740位以後的序列。IGF-1受體的α鏈具有IGF-1的結合部分，β鏈為跨膜型的構造，會有往細胞內傳送訊號的功用。IGF-1受體的α鏈可分成L1、CR、L2、FnIII-1及FnIII-2a/ID/FnIII-2b的結構域。在SEQ ID NO:71所示的人類IGF-1受體的胺基酸序列之中，31位至179位的部分為L1結構域，180位至328位的部分為CR結構域，329位至491位的部分為L2結構域，492位至607位的部分為FnIII-1結構域，及608位至735位相當於FnIII-2a/ID/FnIII-2b結構域。人類IGF-1受體的胺基酸序列可參考EMBL-EBI的UniProtKB登錄號P08069等，而在序列表的SEQ ID NO:71也有揭示。
已知IGF-1受體會在生物體內的組織或細胞廣範圍地表現出來，會受到由IGF-1造成的細胞增殖誘導或細胞內訊號活化等的刺激。尤其肌肉母細胞，可使用於以細胞增殖活性作為指標來評估透過IGF-1的IGF-1受體的作用。由此看來，肌肉母細胞在解析結合於IGF-1受體的抗體的作用方面是有用的。另外，在將編碼人或其他脊椎動物的IGF-1受體的胺基酸序列的核酸分子插入表現載體，並導入來自昆蟲細胞或哺乳類的培養細胞等的真核細胞的宿主而成的重組體細胞之中，藉由在其細胞膜上讓被導入的核酸所編碼的IGF-1受體表現出來，可人工製造出表現出人或其他脊椎動物的IGF-1受體的細胞。該IGF-1受體表現細胞可使用於解析抗體的結合性或探討訊號在細胞內的傳遞等。
[小鼠母體抗體IGF11-16] 小鼠母體抗體IGF11-16被揭示於專利文獻1。IGF11-16的CDR-H1的胺基酸序列表示於SEQ ID NO:85，CDR-H2的胺基酸序列表示於SEQ ID NO:86，CDR-H3的胺基酸序列表示於SEQ ID NO:87，CDR-L1之胺基酸序列表示於SEQ ID NO:88，CDR-L2的胺基酸序列表示於SEQ ID NO:89，CDR-L3的胺基酸序列表示於SEQ ID NO:90，重鏈可變區的胺基酸序列表示於SEQ ID NO:39(將對應的核酸鹼基序列的一例表示於SEQ ID NO:40)，輕鏈可變區之胺基酸序列表示於SEQ ID NO:41(將對應的核酸鹼基序列的一例表示於SEQ ID NO:42)。將IGF11-16的輕鏈全長的胺基酸序列表示於SEQ ID NO:91(將對應的核酸鹼基序列的一例表示於SEQ ID NO:92)，將重鏈全長的胺基酸序列表示於SEQ ID NO:93(將對應的核酸鹼基序列的一例表示於SEQ ID NO:94)。包含IGF11-16的表現的抗體，全部意指該小鼠母體抗體IGF11-16。
[抗IGF-1受體人源化抗體] 根據本發明之其中一個型態，可提供新的抗IGF-1受體人源化抗體(以下將其適當地稱為「本發明之抗體」)。 在本揭示之中，「抗體」是指包含藉由雙硫鍵互相結合的至少兩個重鏈(H)及兩個輕鏈(L)的糖蛋白質。各個重鏈包含重鏈可變區(簡稱為VH)及重鏈恆定區，重鏈恆定區包含三個結構域CH1、CH2及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區(簡稱為VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個結構域CL。在輕鏈的恆定區存在被稱為λ鏈及κ鏈這兩種鏈。在重鏈的恆定區存在γ鏈、μ鏈、α鏈、δ鏈及ε鏈，依照該重鏈的不同，分別有IgG、IgM、IgA、IgD及IgE這些抗體的同型存在。VH及VL進一步可細分成被稱為框架區(FR)且較保守的四個區域(FR-1(FR1)、FR-2(FR2)、FR-3(FR3)、FR-4(FR4))；及被稱為互補決定區(CDR)的三個超可變區域(CDR-1(CDR1)、CDR-2(CDR2)、CDR-3(CDR3))。VH包含由胺基末端至羧基末端依照FR-1(FR-H1)、CDR-1(CDR-H1)、FR-2(FR-H2)、CDR-2(CDR-H2)、FR-3(FR-H3)、CDR-3(CDR-H3)、FR-4(FR-H4)的順序排列的三個CDR及四個FR。VL包含由胺基末端至羧基末端依照FR-1(FR-L1)、CDR-1(CDR-L1)、FR-2(FR-L2)、CDR-2(CDR-L2)、FR-3(FR-L3)、CDR-3(CDR-L3)、FR-4(FR-L4)的順序排列的三個CDR及四個FR。重鏈及輕鏈的可變區包含與抗原發生交互作用的結合結構域。
本發明之抗體可為抗體的片段及/或衍生物。抗體的片段可列舉F(ab’)2 、Fab、Fv等。抗體的衍生物，可列舉在恆定區部分人工導入胺基酸變異的抗體、改變了恆定區的結構域的結構的抗體、一分子中具有兩個以上的Fc的抗體、僅由重鏈或僅由輕鏈構成的抗體、糖鏈改變抗體、雙重特異性抗體、與抗體或抗體的片段化合物或抗體以外的蛋白質結合成的抗體共軛物、抗體酵素、奈米抗體、串聯scFv、雙重特異性串聯scFv、雙體抗體(Diabody)、VHH等。此外，在本發明中，在簡稱為「抗體」的情況，只要沒有另外明記，也包括抗體的片段及/或衍生物。
另外，單株抗體是指包含由特定胺基酸序列所形成的VH與VL的組合的單一種類抗體分子，但是古典的定義是指由來自單一抗體生產細胞的殖株所得到的抗體分子。單株抗體，也能夠得到具有編碼該抗體的蛋白質的胺基酸的基因序列的核酸分子，也能使用這種核酸分子以基因工程的方式製作出抗體。另外，使用重鏈、輕鏈，其可變區或CDR序列等的基因資訊進行用來提升抗體的結合性或特異性的改造等、或藉由由小鼠等動物的抗體改造成人型抗體，製作出適合於使用在治療劑的構造的抗體，是該領域的業界人士周知的技術。另外，藉由使用導入了人類抗體基因的非人類基因轉殖動物作為抗原致敏的動物，也可獲得人類單株抗體。除此之外，不用對動物致敏的方法，也有使用表現出人類抗體的抗原結合區域或其一部分的噬菌體庫(人類抗體噬菌體展示)，取得由與對應的抗原特異性地結合的抗體或特定胺基酸序列所形成的噬菌體殖株，由該資訊製作出人類抗體的技術，也是只要業界人士就能夠適當地進行(參考例如非專利文獻17等)。另外，在設計投予至人類以外的動物的抗體的情況，與人源化的技術同樣地，如果是業界人士就能夠適當地使用CDR或可變區的胺基酸序列資訊來設計。
根據其中一個態樣，本發明之抗體為一種抗IGF-1受體人源化抗體，其係包含：來自小鼠母體抗體IGF11-16的重鏈及輕鏈的各互補決定區(CDR)、與來自人類抗體的重鏈及輕鏈的各框架區(FR)，而且至少一個CDR包含對於小鼠母體抗體IGF11-16之對應的CDR至少1處胺基酸殘基的替換。
具體而言，本態樣之中，重鏈及輕鏈的各互補決定區(CDR)分別來自小鼠母體抗體IGF11-16之對應的CDR。此處，小鼠母體抗體「IGF11-16」，如前述般，是指本發明人等過去製作出的抗IGF-1受體單株小鼠抗體(專利文獻1)。另外，在本揭示之中，「來自」小鼠母體抗體的CDR，意指本態樣的抗體之各CDR的胺基酸序列，與小鼠母體抗體IGF11-16之對應的CDR的胺基酸序列通常具有75%以上，尤其80%以上，或者85%以上，甚至90%以上的相同性(宜為一致性)；及/或除了通常4個胺基酸殘基以下，尤其3個胺基酸殘基以下，甚至2個胺基酸殘基以下的不同以外為相同(宜為一致)(非專利文獻18)。但是，本態樣的抗體，是以其至少一個CDR包含對於小鼠母體抗體IGF11-16之對應的CDR至少1處胺基酸殘基的替換為要件。另外，重鏈CDR-2(CDR-H2)的胺基酸序列，只要是小鼠母體抗體IGF11-16的CDR-H2的胺基酸序列；或與由後述小鼠母體抗體IGF11-16誘導出的人源化抗體hIGF13_PS的CDR-H2之任一者具有通常75%以上，尤其80%以上，或85%以上，甚至90%以上的相同性(宜為一致性)；及/或除了通常4個胺基酸殘基以下，尤其3個胺基酸殘基以下，甚至2個胺基酸殘基以下的不同以外為相同(宜為一致)即可。
另外，重鏈及輕鏈的各框架區(FR)分別來自人類的各型免疫球蛋白之對應的FR。在本揭示之中，「來自」人類免疫球蛋白的FR，意指本態樣的抗體的各FR的胺基酸序列與人類免疫球蛋白之對應的FR之胺基酸序列通常具有80%以上，尤其85%以上，甚至90%以上的相同性(宜為一致性)；及/或除了通常4個胺基酸殘基以下，尤其3個胺基酸殘基以下，甚至2個胺基酸殘基以下的不同以外為相同(宜為一致)。人類免疫球蛋白的框架，可由公共的資料庫獲得，可選出與小鼠免疫球蛋白的框架相同性高的框架。此外，鑑定具有相同性的胺基酸序列時，可使用例如IgBLAST(非專利文獻16)。
此處，重鏈FR1之25位的胺基酸殘基，以脯胺酸為佳。小鼠母體抗體IGF11-16的重鏈FR1與人源化抗體的重鏈FR1之間存在幾處相異的胺基酸殘基，而如後面的實施例3所述般，根據本發明人等的檢討，人源化抗體是將重鏈FR1之25位的胺基酸殘基絲胺酸替換成脯胺酸以使其與小鼠母體抗體IGF11-16同樣，可發揮出與小鼠母體抗體IGF11-16同等以上的活性(同等的程度是活性比在±20%以內)，故為適合。
具有上述相同性的重鏈及輕鏈的獲得方法，例如，以來自本發明之人源化抗體的重鏈及輕鏈的序列作為模板，可使用抗體的進化工程的手段。具體而言，可使用在CDR上的部位特異的變異導入法或隨機變異導入法、鏈改組、CDR walking等的手段。
「隨機變異導入法(random mutagenesis)」，是對於特定基因DNA導入隨機的變異，製作出變異體的方法。在利用PCR法的變異導入法中，在DNA增幅時，選擇複製的嚴密度低的條件，導入鹼基的變異(error-prone PCR)。對於藉由PCR法增幅的DNA的全部區域可在任意部位導入變異。另外，在DNA改組法中，首先將對象基因切碎，然後藉由PCR法可同樣地導入變異。此外，DNA合成時，在特定合成步驟中混合幾種鹼基，可刻意在某區域或部位特異性地導入隨機變異。
「鏈改組(chain shuffling)」，是構築出將抗體可變區的VH或VL基因的其中一者固定化，使另一者與V基因庫結合成的文庫，使其在噬菌體上表現出來，並篩選出對原本的抗原特異性高的抗體可變區的組合的方法。由人類天然/非免疫抗體庫等所得到的抗體的體外親和力成熟是首先選擇的方法。
「CDR Walking」，是對於VH及VL基因的各CDR導入隨機變異，調整選擇條件而由該變異體的集團選出結合力強的抗體，將該所選出的CDR組合，而得到具有非常高結合力的殖株的方法。一般而言，僅在CDR3導入隨機變異來檢討的情形很多。
像這樣，只要取得暫且具有活性的人源化母體抗體，即可以其為模板改造成保持活性的新的人源化抗體，其方法論大致已經確立，可委託給受託研究機構(CRO)等來進行。
根據其中一個態樣，本發明之抗體以具有特定胺基酸序列作為各CDR序列為佳。具體而言如以下所述。此外，在本發明中胺基酸序列的「一致性」(identity)，意指一致的胺基酸殘基的比例，「相同性」(similarity)，意指一致或類似的胺基酸殘基的比例。相同性及一致性，可藉由例如BLAST法(NCBI的PBLAST的預設條件)來決定。另外，此處「類似的胺基酸殘基」，意指具有有同樣化學特質(例如電荷或疏水性)的側鏈的胺基酸殘基。類似的胺基酸殘基，可列舉例如以下的群組。例如，如果按照以下的群組將丙胺酸替換成類似的胺基酸殘基的情況，意指替換成纈胺酸、白胺酸、異白胺酸或甲硫胺酸殘基。
(1)具有脂肪族側鏈的胺基酸殘基：丙胺酸(Ala或A)、纈胺酸(Val或V)、白胺酸(Leu或L)、異白胺酸(I1e或I)及甲硫胺酸(Met或M)殘基。 (2)具有脂肪族羥基側鏈的胺基酸殘基：絲胺酸(Ser或S)及蘇胺酸(Thr或T)殘基。 (3)具有含醯胺的側鏈的胺基酸殘基：天門冬醯胺(Asn或N)及麩醯胺酸(Gln或Q)殘基。 (4)具有芳香族側鏈的胺基酸殘基：苯丙胺酸(Phe或F)、酪胺酸(Tyr或Y)、色胺酸(Trp或W)及組胺酸(His或H)殘基。 (5)具有鹼性側鏈的胺基酸殘基：離胺酸(Lys或K)、精胺酸(Arg或R)及組胺酸(His或H)殘基。 (6)具有酸性側鏈的胺基酸殘基：天門冬胺酸(Asp或D)及麩胺酸(Glu或E)殘基。 (7)具有含硫的側鏈的胺基酸基：半胱胺酸(Cys或C)及甲硫胺酸(Met或M)殘基。
重鏈可變區的CDR-1(CDR-H1)序列以SEQ ID NO:1之胺基酸序列；或SEQ ID NO:1之任一處胺基酸殘基被替換之胺基酸序列為佳。或者，CDR-H1序列以與SEQ ID NO:1具有80%以上的相同性(宜為一致性)為佳。尤其，CDR-H1序列以具有SEQ ID NO:1之3位的Trp維持不變或被替換成類似的胺基酸殘基之胺基酸序列，並且該3位的胺基酸殘基以外的任一處胺基酸殘基被替換；或與SEQ ID NO:1具有80%以上的相同性(宜為一致性)之胺基酸序列為佳。將SEQ ID NO:1之胺基酸序列所對應的核酸鹼基序列的一例揭示於SEQ ID NO:2。
重鏈可變區之CDR-2(CDR-H2)序列以SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5之胺基酸序列；或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5之任一處、兩處或三處胺基酸殘基被替換之胺基酸序列為佳。或者，CDR-H2序列以與SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5具有82%以上的相同性(宜為一致性)為佳。尤其，CDR-H2序列以具有SEQ ID NO:3之1位的Glu及3位的Asn分別維持不變或被替換成類似的胺基酸殘基，而且6位的Asn維持不變或被替換成Ser或Gln之胺基酸序列，並且該1位、3位及6位的胺基酸殘基以外的任一處、兩處或三處胺基酸殘基被替換；或與SEQ ID NO:3具有82%以上的相同性之胺基酸序列為佳。或者，CDR-H2序列以具有SEQ ID NO:5之1位的Glu及3位的Asn分別維持不變或被替換成類似的胺基酸殘基，而且6位的Ser維持不變或被替換成Asn或Gln之胺基酸序列，並且該1位、3位及6位的胺基酸殘基以外的任一處、兩處或三處胺基酸殘基被替換；或與SEQ ID NO:5具有82%以上的相同性之胺基酸序列為佳。將SEQ ID NO:3與5的胺基酸序列所對應的核酸鹼基序列的例子分別表示於SEQ ID NO:4與6。
重鏈可變區之CDR-3(CDR-H3)序列以SEQ ID NO:7的胺基酸序列；或SEQ ID NO:7的任一處或兩處胺基酸殘基被替換之胺基酸序列為佳。或者，CDR-H3序列以與SEQ ID NO:7具有75%以上的相同性(宜為一致性)為佳。尤其，CDR-H3序列以具有SEQ ID NO:7之4位的Arg維持不變或被替換成類似的胺基酸殘基之胺基酸序列，並且該4位的胺基酸殘基以外的任一處或兩處胺基酸殘基被替換；或與SEQ ID NO:7具有75%以上的相同性(宜為一致性)之胺基酸序列為佳，將SEQ ID NO:7之胺基酸序列所對應的核酸鹼基序列的一例揭示於SEQ ID NO:8。
輕鏈可變區之CDR-1(CDR-L1)序列，以SEQ ID NO:9之胺基酸序列；或SEQ ID NO:9之任一處或兩處胺基酸殘基被替換之胺基酸序列為佳。或者，CDR-L1序列以與SEQ ID NO:9具有81%以上的相同性(宜為一致性)為佳。尤其，CDR-L1序列，以具有SEQ ID NO:9之9位的Trp維持不變或被替換成類似的胺基酸殘基之胺基酸序列，並且該9位的胺基酸殘基以外的任一處或兩處胺基酸殘基被替換；或與SEQ ID NO:9具有81%以上的相同性(宜為一致性)之胺基酸序列為佳。將SEQ ID NO:9之胺基酸序列所對應的核酸鹼基序列的一例揭示於SEQ ID NO:10。
輕鏈可變區的CDR-2(CDR-L2)序列，以SEQ ID NO:11之胺基酸序列；或SEQ ID NO:11之任一處胺基酸殘基被替換之胺基酸序列為佳。或者，CDR-L2序列，以與SEQ ID NO:11具有85%以上的相同性(宜為一致性)為佳。將SEQ ID NO:11之胺基酸序列所對應的核酸鹼基序列的一例揭示於SEQ ID NO:12。
輕鏈可變區之CDR-3(CDR-L3)序列，以SEQ ID NO:13之胺基酸序列；或SEQ ID NO:13之任一處或兩處胺基酸殘基被替換之胺基酸序列為佳。或者，CDR-L3序列以與SEQ ID NO:13具有77%以上的相同性(宜為一致性)為佳。將SEQ ID NO:13之胺基酸序列所對應的核酸鹼基序列的一例表示於SEQ ID NO:14。
尤其本發明之抗體，以具有以下的CDR序列的組合為佳。亦即，以具有SEQ ID NO:1之胺基酸序列作為CDR-H1序列、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5之胺基酸序列作為CDR-H2序列、SEQ ID NO:7之胺基酸序列作為CDR-H3序列、SEQ ID NO:9之胺基酸序列作為CDR-L1序列、SEQ ID NO:11之胺基酸序列作為CDR-L2序列，及SEQ ID NO:13之胺基酸序列作為CDR-L3序列的組合為佳。
此外，鑑定抗體中的CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2、或CDR-L3各序列的方法，可列舉例如Kabat法(非專利文獻13)或Chothia法(非專利文獻14)、或將這些方法進一步改良後的方法(非專利文獻15)等。這些方法對該領域的業界人士來說是技術常識，例如從Dr. Andrew C.R. Martin's Group的網站首頁(http://www. bioinf.org.uk/abs/)就能夠知道概要。
此外，如實施例4所示般，藉由進行丙胺酸掃描，可鑑定CDR的胺基酸序列中對於結合活性而言重要的部位。由結果可知，後述表7及表8所示的胺基酸殘基極為重要。認為若至少該部位的胺基酸殘基替換成具有類似性質的胺基酸以外的胺基酸，則會導致結合性降低。相反地，藉由替換成具有同樣性質的胺基酸，也會有可達成提升親和性的可能性。另一方面，丙胺酸替換後的CDR區域的54個部位當中，44個部位在丙胺酸替換後仍表現出80%以上的結合活性。此結果提示了在這些部位的胺基酸替換，對於結合活性沒有造成大的影響。像這樣，藉由搜尋CDR區域的胺基酸序列，鑑定出與結合相關的部位，可保持住結合性並且降低免疫原性、改善物性，或提升結合性。
本發明之抗體，以具有特定胺基酸序列作為重鏈可變區及輕鏈可變區為佳。具體而言，如以下所述。此外，在本揭示之中，「一處或數處」，只要沒有特別註明，是指一處、兩處、三處、四處、五處、六處、七處、八處、九處或十處任一者。
本發明之抗體，以具有SEQ ID NO:47之胺基酸序列；或SEQ ID NO:47之胺基酸序列之中一或多處胺基酸殘基被替換、缺失或附加之胺基酸序列作為重鏈可變區為佳。或者，以具有與SEQ ID NO:47具有90%以上的相同性(宜為一致性)之胺基酸序列作為重鏈可變區為佳。尤其，以具有VH13_PN(SEQ ID NO:43)、VH13_PS(SEQ ID NO:47)、VH23_PN(SEQ ID NO:49)、VH23_PS(SEQ ID NO:53)、VH25_PN(SEQ ID NO:55)、或VH25_PS(SEQ ID NO:59)之胺基酸序列作為重鏈可變區域為佳。將SEQ ID NO:43、47、49、53、55及59之胺基酸序列所對應的核酸鹼基序列的例子分別表示於SEQ ID NO:44、48、50、54、56及60。
本發明之抗體，以包含下述的胺基酸序列作為輕鏈可變區為佳，具有SEQ ID NO:67之胺基酸序列；或SEQ ID NO:67之胺基酸序列之中一或多處胺基酸殘基被替換、缺失或附加的胺基酸序列。或者，以具有與SEQ ID NO:67具有90%以上的相同性(宜為一致性)之胺基酸序列作為輕鏈可變區為佳。尤其，以具有VL13(SEQ ID NO:61)、VL14(SEQ ID NO:63)、VL22(SEQ ID NO:65)、VL23(SEQ ID NO:67)、或VL24(SEQ ID NO:69)之胺基酸序列作為輕鏈可變區為佳。較佳為VL22(SEQ ID NO:65)、VL23(SEQ ID NO:67)、或VL24(SEQ ID NO:69)之胺基酸序列。將SEQ ID NO:61、63、65、67及69之胺基酸序列所對應的核酸鹼基序列的例子分別表示於SEQ ID NO:62、64、66、68及70。
其中，本發明之抗體，以分別具有上述任一者之胺基酸序列作為重鏈可變區及輕鏈可變區為佳。特別合適的本發明之抗體，如具有VH13_PS(SEQ ID NO:47)之胺基酸序列作為重鏈可變區，具有VL23(SEQ ID NO:67)之胺基酸序列作為輕鏈可變區之抗體(以下會有稱為「hIGF13_PS」的情形)；或具有VH25_PS(SEQ ID NO:59)之胺基酸序列作為重鏈可變區，具有VL23(SEQ ID NO:67)之胺基酸序列作為輕鏈可變區之抗體(以下會有稱為「hIGF25_PS」的情形)。
本發明之抗體的重鏈及輕鏈的各個恆定區之胺基酸序列，例如可由人類的IgG、IgA、IgM、IgE及IgD各型的胺基酸序列，及其變異體之胺基酸序列選擇。根據其中一個態樣，本發明之抗體的重鏈恆定區之胺基酸序列，以人類IgG4型的重鏈恆定區之胺基酸序列；或其1～10處胺基酸被替換之胺基酸序列為佳(非專利文獻19、20)。根據其中一個態樣，本發明之抗體的重鏈恆定區之胺基酸序列，以人類IgG1型的重鏈恆定區之胺基酸序列；或其1～10處胺基酸被替換之胺基酸序列為佳(非專利文獻19、20)。
本發明之抗體是與人類IGF-1受體發生抗原抗體反應的抗體。在本揭示之中，「抗原抗體反應」，是指抗體以平衡解離常數(KD)1×10-7 M以下的親和性結合於IGF-1受體。本發明之抗體，以通常1×10-7 M以下，尤其1×10-8 M以下，甚至1×10-9 M以下的KD和IGF-1受體結合為佳。最佳為1×10-10 M以下。
本發明之抗體，以特異性地結合於具有SEQ ID NO:71之胺基酸序列的人類IGF-1受體之細胞外結構域為佳。在本揭示之中，抗體對於抗原具有「特異性」，是指抗體與其抗原之間發生顯著的抗原抗體反應。尤其在本揭示之中，「IGF-1受體特異的抗體」，是指在與表現出IGF-1受體的細胞顯著地呈現抗原抗體反應的濃度下，對於與IGF-1受體的高次構造具有高類似性的INSR的抗原抗體反應性為百分之一以下的抗體。
抗原抗體反應的測定，如果是業界人士，就能夠適當地選擇固相或液相的系統來進行結合測定。這種方法，可列舉酵素結合免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay：ELISA)、酵素免疫測定法(enzyme immunoassay：EIA)、表面電漿子共振法(surface plasmon resonance：SPR)、螢光共振能量移動法(fluorescence resonance energy transfer：FRET)、發光共振能量移動法(luminescence resonance energy transfer：LRET)等，然而並不受這些方法限定。另外，在測定這樣的抗原抗體結合時，亦可將抗體及/或抗原以酵素、螢光物質、發光物質、放射性同位元素等加以標識，並使用適合於該標識後的物質的物理及/或化學特性的測定方法來偵測抗原抗體反應。
根據其中一個態樣，本發明之抗體，以具有與小鼠母體抗體IGF11-16同等以上的IGF-1受體訊號活化能力為佳。本揭示之中，IGF-1受體訊號活化能力為「同等」，意指EC50 值在兩倍以內及/或Emax 值在±20%以內。
根據其中一個態樣，本發明之抗體，以具有與小鼠母體抗體IGF11-16同等以上的增殖活性為佳，在本揭示之中，增殖活性為「同等」，意指在肌肉母細胞增殖測試時，EC50 值在10倍以內，Emax 值在90%以上。
根據其中一個態樣，本發明之抗體，與重組可溶性IGF-1受體的結合親和性，以與小鼠母體抗體IGF11-16同等以上為佳。在本揭示之中，與重組可溶性IGF-1受體的結合親和性為「同等」，意指在利用BIACORE來解析重組可溶性IGF-1受體的結合親和性當中，與小鼠母體抗體IGF11-16相比，KD值在3分之1以上至3倍以內的範圍。
根據其中一個態樣，本發明之抗體，以血中半衰期長，對動物單次投予即表現出肌肉量增加作用為佳。實際上，根據本發明人等的檢討，本發明之抗IGF-1受體人源化抗體，如後述實施例所示般，對天竺鼠或食蟹猴單次投予的結果，會表現出與持續投予IGF-1時同程度的肌肉量增加作用。
根據其中一個態樣，本發明之抗體，以在正常哺乳動物身上不會誘導低血糖症狀，並且可誘導肌肉量增加作用為佳。根據其中一個態樣，本發明之抗體，在腦下垂體摘出模型動物之中，不會誘導低血糖症狀，以可誘導生長板軟骨伸長作用為佳。在本揭示之中，「血糖症狀」，在人的情況，意指伴隨低血糖發生的發冷或冒汗、心悸、意識障礙、痙攣、手腳抖動等的症狀。在猴子等的脊椎動物的情況，初期症狀是出現自發運動的減少，若症狀強，則幾乎沒有活動，若血糖值進一步降低，則會發生意識障礙，導致死亡。
若以表現出肌肉量增加作用的用量對脊椎動物投予IGF-1，則會發揮出顯著的血糖降低作用，通常會誘導低血糖症狀。但是，根據其中一個態樣，本發明之抗體，即使在以誘導脊椎動物的肌肉量及/或體長的增加的用量，較佳為該用量10倍以上的高用量投予至脊椎動物的情況，也不會有降低該脊椎動物的血糖值的作用。另外，根據其中一個態樣，本發明之抗體，即使在以相對於誘導脊椎動物的肌肉量及/或體長增加的有效用量10倍以上的血中曝露量的方式投予至脊椎動物的情況，也不會有降低該脊椎動物的血糖值的作用。實際上，根據本發明人等的檢討，本發明之抗體，如後述實施例所示般，即使以10mg/kg的用量投予在天竺鼠及食蟹猴身上，也不會誘導低血糖症狀。
由以上看來，本發明之抗IGF-1受體人源化抗體，會有成為被期待以IGF-1來達成的廢用性肌肉萎縮及侏儒症等的IGF-1受體相關的各種疾病的治療藥或預防藥的可能性，克服了IGF-1問題點的血糖降低作用，並可延長血中半衰期。
本發明之抗體，被認為藉由結合於IGF-1受體的細胞外結構域，會使IGF-1受體形成二聚體的同源型受體或IGF-1受體與INSR形成二聚體的異源型受體活化。
[免疫原性評估] 抗醫藥品抗體(Anti-Drug Antibody：ADA)會對治療用抗體的效果及藥物動態造成影響，有時會有帶來嚴重副作用的情形，因此臨床上的治療用抗體的有用性及藥效會因為ADA的產生而受到限制。許多因素會對治療用抗體的免疫原性造成影響，而許多文獻報告出存在於治療用蛋白質中的效應T細胞表位的重要性。用來預測T細胞表位的電腦模擬工具，已有Epibase(Lonza)、iTope/TCED(Antitope)及EpiMatrix(EpiVax)等被開發出來。藉由使用這些電腦模擬工具，可預測出各胺基酸序列中的T細胞表位的存在(非專利文獻21)，能夠評估潛在的免疫原性。關於本發明之抗IGF-1受體人源化抗體，是使用Epibase(Lonza)來評估潛在的免疫原性。
[去醯胺化風險] 構成蛋白質的胺基酸序列之中，容易發生去醯胺化的胺基酸序列，可列舉NG、NT、NS及NN。若具有這些序列，則天門冬醯胺會發生去醯胺化而變成天門冬胺酸。因此會有抗體的活性降低的顧慮，而且品質變得不均。由此看來，在製造步驟中或在保管時，為了保障品質，藉由將有去醯胺化風險的胺基酸替換成其他胺基酸，可防止活性降低，保持均一性。在本發明的抗體之中，在小鼠母體抗體IGF11-16的重鏈CDR-2(CDR-H2)區域存在NS序列(重鏈55位及56位)，因此考慮到重鏈55位的天門冬醯胺(N)去醯胺化而轉換成天門冬胺酸(D)的風險，將該天門冬醯胺(N)替換成絲胺酸(S)。
[物性安定性評估] 為了保證長期安定地保持抗體的活性，使溫度上昇或改變pH來進行物性安定性的解析。在本發明的抗IGF-1受體人源化抗體的情況，使用了本抗體的PBS溶液，將溫度設定在37℃保溫1個月後，使用此試樣來確認純度為95%以上以及不會產生凝集物，而確認了物性安定性。
[抗IGF-1受體人源化抗體的表位] 根據其中一個態樣，本發明之抗體是以IGF-1受體的CR結構域為表位。理想的情況，本發明之抗體會結合於包含具有相當於人類IGF-1受體的胺基酸序列(SEQ ID NO:71)之中，胺基酸編號308至319的胺基酸序列(ProSerGlyPheIleArgAsnGlySerGlnSerMet)的胜肽的表位或其附近。認為本發明之抗體，會藉由結合於IGF-1受體的CR結構域，而使IGF-1受體形成二聚體的同源型受體或IGF-1受體與INSR形成二聚體的異源型受體活化。
[抗IGF-1受體人源化促效劑抗體] 本發明之促效劑抗體，宜為人類IgG型或其變異體，以人類IgG4亞型或其變異體，或人類IgG1亞型或其變異體為佳。其中一個例子當中，安定化IgG4恆定區，依照Kabat的系統，在鉸鏈區的241位包含了脯胺酸(非專利文獻22)。該位置依照EU編號方法(非專利文獻13)是對應於鉸鏈區的228位。在人類IgG4中，該殘基一般而言為絲胺酸，藉由將絲胺酸替換成脯胺酸，可使其安定化。在其中一個例子當中，在IgG1的恆定區加入N297A變異，儘可能抑制與Fc受體的結合及/或固定補體的能力。另外，在其他態樣中，藉由在恆定區導入胺基酸替換，可調節與FcRn的結合，延長血中半衰期。但是，恆定區的胺基酸替換並不受這些例示限定。
本發明之促效劑抗體會與IGF-1受體特異性地強力結合，在試管內從極低濃度就開始具有肌肉母細胞增殖的亢進作用。
本發明之促效劑抗體，在對動物單次投予的情況，會表現出與持續投予IGF-1時的肌肉量增加作用同程度的肌肉量增加作用。另外，本發明之促效劑抗體的血中半衰期長，對動物單次投予即可表現出肌肉量增加作用。在本發明中，實際對天竺鼠或食蟹猴單次投予的情況，會表現出與持續投予IGF-1時的肌肉量增加作用同程度的肌肉量增加作用。
此外，本發明之促效劑抗體，具有在表現肌肉量增加作用的用量下沒有血糖降低作用的特徵。IGF-1在以表現出肌肉量增加作用的用量投予的情況，有顯著的血糖降低作用。但是，本發明之促效劑抗體，在誘導脊椎動物的肌肉量及/或體長的增加的用量下，沒有降低該脊椎動物的血糖值的作用。理想的情況，本發明之促效劑抗體，即使在以誘導脊椎動物的肌肉量及/或體長的增加的有效用量的10倍以上的血中曝露量來投予的情況，也不會有降低脊椎動物的血糖值的作用。在本發明中，就算是實際在天竺鼠或食蟹猴身上，以誘導肌肉量增加的有效用量的10倍以上的血中曝露量來投予本發明之促效劑抗體的情況，也沒有觀察到血糖降低及低血糖症狀。
由以上看來，本發明之促效劑抗體，會有成為肌肉減少症、廢用性肌肉萎縮、惡病質及侏儒症等的IGF-1受體相關聯的各種疾病的治療藥或預防藥的可能性，能夠克服IGF-1問題點的血糖降低作用，讓血中半衰期延長。
[抗IGF-1受體人源化拮抗劑抗體] 本發明之抗IGF-1受體人源化抗體，利用了其具有極高的結合性及特異性的可變區的性質，可製成具有優異活性與特異性的抗IGF-1受體拮抗劑抗體。此時的態樣，除了IgG之外，還可考慮以如Fab或Fv、scFv、VHH般的形式來使用，然而並不受其限定。
以這樣的方式製作出的抗IGF-1受體拮抗劑抗體，例如能夠以抑制癌細胞株的IGF-1依存性細胞增殖活性為指標來評估。以這樣的方式選出的抗IGF-1受體拮抗劑抗體，可期待作為抗癌劑或伴隨異常細胞增殖而發生的疾病或病態的改善及治療藥。
此外，藉由與辨識其他抗原或表位的各種抗體直接融合或透過連接子等融合，亦可構築出雙重特異性抗體或多重特異性抗體。此時的態樣，除了IgG之外，還可考慮以如Fab或Fv、scFv、VHH般的形式來使用，然而並不受其限定。
以這樣的方式所製作出的含有抗IGF-1受體拮抗劑抗體的雙重特異性抗體或多重特異性抗體，例如能夠以抑制癌細胞株的IGF-1依存性細胞增殖活性為指標來評估。以這樣的方式選出的含有抗IGF-1受體拮抗劑抗體的雙重特異性抗體或多重特異性抗體，可期待作為抗癌劑或伴隨異常細胞增殖而發生的疾病或病態的改善及治療藥。
本發明之抗IGF-1受體拮抗劑抗體，藉由活化IGF-I受體訊號，可期待作為誘導出病態的疾病的治療藥。可活化IGF-I受體之配體，主要可列舉IGF-1、IGF-2、胰島素等，也包括與IGF-1受體形成異源二聚體的RTK(受體型酪胺酸激酶)的配體(可列舉EGF等)或串擾的其他受體的配體(可列舉TSH等)等。本發明之抗體具有抑制被這些配體活化的IGF-1受體訊號的作用(別構拮抗劑作用)。亦即，本發明之抗體，藉由結合於IGF-1受體，可抑制過度誘導的IGF-1受體訊號活性，可使用於治療或預防IGF-1受體被異常活化所引發的疾病。訊號活化抑制能力，以與小鼠母體抗體IGF11-16同等以上為佳。訊號活化抑制能力與「小鼠抗體IGF11-16同等，意指在肌肉母細胞增殖過程中，將IGF-1、IGF-2、或胰島素等可活化IGF-I受體之配體所可誘導的最大細胞增殖活性抑制在通常10%以上的活性，宜為25%以上，特佳為35%以上。
IGF-1受體被異常活化所引發的疾病的具體例子，可列舉肝癌、神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、小兒癌、肢端肥大症、卵巢癌、胰臟癌、良性前列腺肥大症、乳癌、前列腺癌、骨癌、肺癌、結腸直腸癌、頸部癌、滑膜肉瘤、膀胱癌、胃癌、威爾姆氏腫瘤、轉移性類癌及血管活性腸肽分泌腫瘤相關聯的下痢、VIP瘤、Verner-Morrison症候群、Beckwith-Wiedemann症候群、腎臟癌、腎細胞癌、轉移性上皮癌、Ewing氏肉瘤、白血病、急性淋巴芽球性白血病、腦腫瘤、膠質母細胞瘤、非膠質母細胞瘤性腦腫瘤、髓膜瘤、腦下垂體腺瘤、前庭神經鞘瘤、原始性神經外胚層腫瘤、髓母細胞瘤、星狀細胞瘤、寡樹突膠質細胞瘤、室管膜瘤、脈絡叢乳頭狀瘤、巨人症、乾癬、動脈粥狀硬化症、平滑肌增生造成血管再狹窄、不適當的微血管增生、糖尿病視網膜病變、葛瑞夫茲氏病、多發性硬化症、全身性紅斑狼瘡、重症肌無力症、自體免疫甲狀腺疾病、橋本氏甲狀腺炎、甲狀腺眼病變、甲狀腺機能亢進，以及貝賽特氏症等。 這些作用可使用荷瘤模型動物等來確認。
[作為局部遞送工具的抗IGF-1受體人源化抗體] 利用本發明之抗IGF-1受體抗體極高的結合性與特異性，可對IGF-1受體表現細胞或表現組織等局部輸送藥劑或抗體。此時本發明之抗IGF-1受體抗體的態樣，除了IgG之外，還可考慮以如Fab或Fv、scFv、VHH般的形式來使用，然而並不受其限定。藉由利用本發明之抗IGF-1受體抗體與藥劑連結成的抗體藥物複合體，將藥劑遞送至局部，能夠以較低用量特異性地發揮藥效，也會減少副作用。
連結了以這樣的方式製作出的本發明之抗IGF-1受體人源化抗體作為遞送工具的藥劑或抗體，例如在藥劑為細胞凋亡誘導劑的情況，能夠以誘導IGF-1受體表現癌細胞株的細胞凋亡為指標來評估。連結了以這樣的方式選出的抗IGF-1受體抗體的藥劑或抗體，可期待作為抗癌劑或伴隨異常細胞增殖發生的疾病或病態的改善及治療藥。
此外，還可使用以放射能或螢光化合物等標記的本發明之抗IGF-1受體抗體來偵測表現出IGF-1受體的癌細胞。藉由使用這種診斷技術，可有效率地進行利用抗IGF-1受體拮抗劑抗體的治療。
[競爭結合] 和本發明之抗IGF-1受體抗體競爭結合於IGF-1受體的抗體，也被包含在本發明之範圍。在本發明中「競爭結合」，意指多種單株抗體與抗原共存時，一種抗體與抗原的結合會因為另一種抗體與抗原的結合而被阻礙的現象。一般而言，可藉由相對於一定量(濃度)的單株抗體，改變添加量(濃度)來添加其他單株抗體，測定前者一定量的單株抗體在抗原上的結合量降低時的添加量(濃度)來作測定。其阻礙的程度能夠以IC50 或Ki值來表示。
和本發明之抗IGF-1受體抗體競爭結合的單株抗體，是指以10nM使用本發明之抗IGF-1受體抗體偵測抗原抗體結合時，IC50 通常為1000nM以下，尤其100nM以下，甚至10nM以下的抗體。在進行競爭結合的測定的情況，亦可將所使用的抗體的一部分或全部以酵素，螢光物質、發光物質、放射性同位元素等來予以標識，並使用適合於該標識物質的物理及/或化學特性的測定方法作偵測，以進行該競爭結合測定。
[交叉反應] 本發明之抗體，具有對於其他脊椎動物的IGF-1受體的交叉反應性。交叉反應，是指對於不同於與該抗體發生抗原抗體反應的IGF-1受體的動物(例如人類)的其他動物的IGF-1受體，抗體表現出結合性。本發明之抗IGF-1受體人源化抗體，除了人以外，還會與天竺鼠、猴子、兔子等的IGF-1受體表現出交叉反應性。另一方面，對小鼠及大鼠的IGF-1受體不會表現出交叉反應性。
另外，還可使用不會與本發明之抗體交叉反應的動物，以基因工程的方式改造其細胞或該動物，製作出表現出與本發明之抗體交叉反應的IGF-1受體的細胞或動物。
[結合親和性評估] 本發明之抗IGF-1受體人源化抗體，具有與小鼠母體抗體IGF11-16(專利文獻1)同等以上的水準極強的結合親和性。其結合親和性的評估，例如可使用重組IGF-1受體的細胞外區域作為抗原，藉由SPR(表面電漿子共振)解析來進行。在實施例之中，使用BIACORE，將反應溫度提高至40℃，並將抗原固定量壓低，以解析一價的結合親和性，然而並不受此方法限定，只要是能定量評估強的結合親和性的解析方法即可。
[IGF-1受體訊號評估] 本發明之抗IGF-1受體人源化抗體，是使用IGF-1受體訊號活化作為一級評估系統，藉由選出與小鼠母體抗體IGF11-16(專利文獻1)同等以上水準的人源化抗體來獲得。
IGF-1受體訊號活化的評估，是使用市售的PathHunter( 註冊商標 ) IGF1R Functional Assay(DiscoverX公司製)。在本系統中，能夠以IGF-1受體訊號下游的磷酸化作為酵素活性來評估，使用化學發光物質作為基質，藉由發光強度來測定訊號強度。
具體而言，使用了在HEK293細胞內強制表現出IGF-1受體及具有與IGF-1受體之細胞內的酪胺酸激酶結合的SH2結構域的轉接子蛋白質SHC1-Enzyme Acceptor(EA)融合蛋白質的細胞株。該細胞株會因為IGF-1受體上的配體結合，而發生受體的二聚體化，接下來，藉由受體被磷酸化，具有SH2結構域的轉接子蛋白質會被召集，形成受體訊號傳遞複合體，空間中鄰接的酪胺酸激酶與EA的結合會被促進，而再構成活性型β-半乳糖苷酶。可藉由測定因為該β-半乳糖苷酶活性而被水解的基質的化學發光訊號強度來鑑定藥劑對受體型酪胺酸激酶的作用。
選擇具有與小鼠母體抗體IGF11-16同等以上的訊號誘導活性的人源化抗體變種，然後進行二次評估之人類肌肉母細胞增殖評估。評估IGF-1受體訊號的方法並不受限於此方法，只要是可直接或間接且定量地偵測IGF-1受體酪胺酸磷酸化的系統即可。
[來自脊椎動物細胞的增殖誘導活性、肌肉量增加的誘導活性] 本發明之人源化抗體的二級評估系統，是進行人類肌肉母細胞增殖評估，篩選出與小鼠母體抗體IGF11-16(專利文獻1)在同等的濃度區域具有同等以上的促效劑活性的人源化抗體。確認了以這樣的方式選出的本發明之人源化抗體，在活體內(in vivo)不會表現血糖降低作用，且具有肌肉量增加作用。亦即，其中一個態樣中的本發明之抗IGF-1受體人源化抗體，具有來自脊椎動物細胞的增殖誘導活性。
此外，在本揭示之中，「來自脊椎動物的細胞」，宜為來自哺乳類、鳥類、爬蟲類、兩生類或魚類的細胞，較佳為來自哺乳類或鳥類的細胞，更佳為來自人類、猴子、兔子、天竺鼠、牛、豬、綿羊、馬、犬、大鼠或小鼠的細胞。只要是在來自這些動物的細胞中表現出IGF-1受體，且本發明之抗體與該IGF-1受體發生交叉反應之細胞，即可藉由本發明之抗體來誘導細胞增殖。另外，被改造成表現出與本發明之抗體有交叉反應性的物種的IGF-1受體的細胞或動物、或來自該經改造的動物的細胞，也被包括在本揭示中的「來自脊椎動物的細胞」。
用來調查來自脊椎動物細胞在試管內的增殖誘導活性之細胞，可使用初代培養細胞、株化細胞、或這些細胞的轉形體細胞等。
在本揭示之中，「初代培養細胞」是指由生物的臟器或組織分離出來的細胞，且通常能夠以某程度的繼代數來繼代培養。來自脊椎動物的初代培養細胞，可藉由從脊椎動物的臟器或組織開始進行酵素處理、利用物理方法的分散，或藉由explant法等的手段來獲得。另外，還可使用由脊椎動物得到的臟器、組織、或其片段。調製這些初代細胞的臟器或組織，合適的例子，可列舉甲狀腺、副甲狀腺或副腎等的內分泌組織、闌尾、扁桃腺、淋巴節或脾臟等的免疫組織、氣管或肺等的呼吸器官、胃、十二指腸、小腸或大腸等的消化器官、腎臟或膀胱等的泌尿器官、輸精管、睪丸或前列腺等的雄性生殖器、乳房或輸卵管等的雌性生殖器、心肌或骨骼肌等的肌肉組織等，較佳為肝臟、腎臟或消化器官或肌肉組織等，更佳為肌肉組織。為了調查本發明之抗體的增殖誘導活性所使用的該初代培養細胞，可使用表現出IGF-1受體，並藉由與該IGF-1受體結合的IGF-1誘導增殖的細胞。作為其代表，可使用從肌肉組織分離出來的初代培養細胞之骨骼肌肌肉母細胞等。來自人或動物的初代培養細胞，可取得分讓或市售的細胞來使用。人類初代培養細胞，可由例如ATCC( 註冊商標 ) 、ECACC、Lonza、Gibco( 註冊商標 ) 、Cell Applications、ScienCell research laboratories、PromoCell等的機關或公司獲得。
調查來自脊椎動物的細胞中由本發明之抗體所產生的細胞增殖誘導活性的方法，可列舉測量細胞數、測定DNA合成量、測定代謝酵素活性的變化量等。作為測量細胞數的方法，已有使用血球計數板的方法或使用庫爾特計數器等的細胞數測量裝置的方法，作為測定DNA合成量的方法，已有利用[3H]-胸苷或5-溴-2’-去氧尿苷(BrdU)的吸收的測定方法，作為觀測代謝酵素活性的變化量的方法，已有MTT法、XTT法或WST法等的比色定量法，然而如果是業界人士，也會適當地以其他方法等來實施。
細胞的增殖誘導活性，在使測試用的培養細胞與本發明之抗體發生反應的情況，可藉由細胞的增殖比沒有與該抗體發生反應的情況還上昇來判定。此情況下，若以相同條件與原本IGF-1受體的配體IGF-1發生反應來進行測定以作為該誘導活性的對照組，則利於該活性的評估。對於進行測試的培養細胞，將本發明之抗體及IGF-1改變成各種濃度來反應時，將呈現最大增殖誘導活性的50%時的濃度以EC50 值表示。在使用人骨骼肌肌肉母細胞評估增殖誘導活性時，理想的情況，本發明之抗體的細胞增殖誘導活性為與IGF-1同等以上的EC50 值，較理想的情況，本發明之抗體的EC50 值為IGF-1的1/10以下，更理想為1/20以下，再更理想的情況，本發明之抗體的EC50 值為IGF-1的1/50以下。另外，在使用人骨骼肌肌肉母細胞評估增殖誘導活性時，本發明之抗體的EC50 值，宜為0.5nM以下，較佳為0.3nM以下，更佳為0.1nM以下。
調查活體內的增殖誘導活性的方法，可藉由對脊椎動物投予本發明之抗體，並測量被投予的個體整體或被投予的個體的臟器或組織的質量、大小、細胞數等的變化，或使用移植了該脊椎動物細胞的動物，測量在該接受移植的個體身上，含該移植的脊椎動物細胞的移植片的質量、大小、細胞數等的變化來調查。在測量個體整體時，可使用體重、體長、四肢周圍長等的測定、或利用阻抗法進行的體組成測定、肌酸酐、身長係數等。關於個體的臟器、組織或移植片的測量，在人類以外的動物的情況，可直接回收目標臟器、組織或移植片，計算質量、大小或所含的細胞數等來進行。另外，非侵襲地測量個體的臟器、組織或移植片的方法，可使用以DXA(Dual-energy X-ray absorptiometry)法為代表的X光攝影或利用CT、MRI的影像解析、使用利用同位元素或螢光物質的追蹤劑的造影法等。在對象組織為骨骼肌的情況，肌力的變化等可當作指標。其他，如果是業界人士，會適當地使用其他方法來調查本發明之抗體在來自脊椎動物細胞活體內對增殖誘導活性的作用。為了調查本發明之抗體在活體內的來自脊椎動物細胞增殖誘導活性，可藉由以上揭示的方法等進行計測等，比較投予本發明之抗體的個體與投予本發明之抗體以外的抗體或其他對照物質的個體之間結果的差異來評估。
關於抗體的血中動態，在後述實施例14之中比較了本發明之抗體的設計基礎的小鼠抗體IGF11-16抗體(專利文獻1)與本發明之抗體hIGF13_PS及hIGF25_PS抗體的天竺鼠血中動態，結果顯示與IGF11-16相比，血中動態較為改善。
本發明之抗體在活體內的其中一個效果，可列舉肌肉量及/或體長的增加效果。IGF-1在骨骼肌之中，除了影響上述肌肉母細胞增殖或分化之外，還會有使肌肉纖維變粗的作用，其總合的作用，被認為會有增加肌肉量的效果。本發明之抗體也與IGF-1同樣地，藉由投予至動物，會有增加該動物的肌肉量的效果。
關於測量本發明之抗體所產生的肌肉量增加效果的方法，在測量個體整體時，可使用體重、體長、四肢周圍長等的測定、或利用阻抗法的體組成測定、肌酸酐、身長係數等，另外還可使用DXA(Dual-energy X-ray absorptiometry)法為代表的X光攝影或利用CT、MRI的影像解析、使用利用同位素或螢光物質的追蹤劑的造影法等的方法，除此之外，肌力的變化等也能當作指標。另外，對於人類以外的動物，還可直接採取肌肉，測量其質量或大小的方法等。
肌肉量增加的效果，可藉由比較投予本發明之抗體的個體與並未投予該抗體的個體的肌肉量增加，或比較對單一個體投予本發明之抗體前與投予後的肌肉量來評估。肌肉量的增加效果，只要是藉由投予本發明之抗體，可觀察到肌肉量的增加的差異，即可得知其效果。IGF-1也和骨骼的成長有關，也會有增加體長(人類的情況為身長)的作用。所以，本發明之抗體，對動物投予時也具有讓體長增加的效果。本發明之抗體所產生的體長增加效果，可藉由個體的體重、體長、四肢周圍長等的測定來測量。
[對動物的血糖值的作用] 根據其中一個態樣，本發明之抗體，其特徵為不對脊椎動物的血糖值造成影響。IGF-1對IGF-1受體的促效劑作用的一部分，已知有引發血糖值的降低作用。但是，作為抗IGF-1受體促效劑抗體發揮功能的本發明之促效劑抗體，在對動物非口服投予的情況，即使在誘導肌肉量增加的有效用量甚至10倍以上的血中曝露量，也會表現出不使血糖值變動的特徵。
關於本發明之抗體所具有的不會誘導脊椎動物血糖降低的作用，例如可在試管內作評估。用來調查不會對來自脊椎動物細胞在試管內的細胞內葡萄糖吸收造成影響的特徵的細胞，可使用初代培養細胞、株化細胞、或這些細胞的轉形體細胞等。
調查在來自脊椎動物的細胞中本發明之抗體對葡萄糖吸收造成的影響的方法，可列舉測定細胞內葡萄糖濃度、測定葡萄糖類緣追蹤劑物質在細胞內的吸收量、測定葡萄糖轉運子的變化等。葡萄糖濃度的測定方法，已知有酵素法等的吸光度測定法；測定葡萄糖類緣追蹤劑物質在細胞內的吸收量的方法，例如有測定[3H]-2’-去氧葡萄糖的吸收量；觀察葡萄糖轉運子的變化的方法，已知有細胞免疫染色法、西方墨點法等，如果是業界人士也會適當地以其他方法等來實施。對細胞內葡萄糖吸收造成的影響，在使測試用的培養細胞與本發明之抗體發生反應的情況，可藉由細胞內的葡萄糖吸收與沒有與該抗體反應的情況為同程度來判定。此情況下，若以相同條件與原本IGF-1受體的配體IGF-1發生反應來進行測定以作為該誘導活性的對照組，則利於該活性的評估。
調查來自脊椎動物細胞活體內的葡萄糖吸收的方法，可藉由對該脊椎動物投予本發明之抗體，測量被投予的個體的臟器或組織中的葡萄糖含量等的變化來調查。在測量個體整體時，可使用血糖值等的測定、或以糖化蛋白質為指標的血紅素A1C等。在測定個體的臟器或組織中的葡萄糖吸收量等時，在人類以外的動物的情況，可直接回收目標臟器或組織，並且進行葡萄糖含量或追蹤劑的計算等。另外，非侵襲地測定個體的臟器或組織中的葡萄糖吸收的方法，可使用X光攝影或利用CT、MRI的影像解析、使用利用同位素或螢光物質的追蹤劑的造影法等。在對象組織為骨骼肌的情況，葡萄糖鉗夾等也可當作指標。其他方面，如果是業界人士，也會適當地使用其他方法來調查本發明之抗體在來自脊椎動物細胞中對活體內的葡萄糖吸收造成的影響。
另外，本發明之抗體，其特徵為：在投予至脊椎動物的情況，即使是在與相對於誘導該脊椎動物的肌肉量增加的有效用量相同的用量，宜為10倍以上的用量，也不會使該脊椎動物的血糖值變動。用來調查本發明之抗體對脊椎動物血糖值的影響的動物，宜為屬於哺乳類、鳥類、爬蟲類、兩生類或魚類的動物，較佳為屬於哺乳類或鳥類的動物，更佳為人類、猴子、兔子、天竺鼠、牛、豬、綿羊、馬、犬、大鼠、或小鼠。另外，被改造成表現出與本發明之抗體有交叉反應性的物種的IGF-1受體的動物，也包括了用來調查本發明之抗體對脊椎動物血糖值的影響的動物。關於血糖值的測定，侵入性的方法可使用比色法或電極法等，偵測所使用的酵素有葡萄糖氧化酶(GOD法)、葡萄糖去氫酶(GDH法)等，非侵入性的方法有光學測定法等，如果是業界人士也會適當地選擇其他方法。關於血糖值，在人類的情況，空腹時血糖值的正常區域為100mg/dL～109mg/dL。關於藥劑投予對血糖值造成的不良反應(不良反應通用術語標準v4.0)，血糖值低於77mg/dL～55mg/dL的範圍的情況定義為低血糖，高於109mg/dL～160mg/dL的範圍的情況定義為高血糖。藥劑投予對血糖值沒有影響，是指藥劑投予後血糖值在高於55mg/dL且未達160mg/dL的範圍內，較佳為高於77mg/dL且未達109mg/dL的範圍內。但是，血糖值的正常值或其變動幅度會依照投予的動物而有所不同，而且即使是人類，投予時的血糖值也不一定在正常值的範圍，因此在本揭示之中，不使脊椎動物的血糖值變動，是指投予本發明之抗體的脊椎動物的血糖值與投予溶劑的控制組相比，宜為30%以內，較佳為20%以內，更佳為10%以內的變化。
[抗IGF-1受體人源化抗體的製法] 本發明之抗體，可藉由使對IGF-1受體的小鼠單株抗體IGF11-16(專利文獻1)人源化來取得。將使用由人以外的動物得到的單株抗體，將其CDR區域藉由CDR嫁接替換成人類框架稱為人源化(非專利文獻12)。此外，藉由三維構造解析，導入用來維持立體構造同時降低對人的免疫原性(T細胞抗原性)的胺基酸替換或用來避免去醯胺化或氧化等的轉譯後修飾風險的胺基酸替換，製作出維持活性同時確保製造性或臨床安全性的人源化抗體。
獲得關於為了維持活性(1)哪種人類框架的設計是必須及(2)CDR序列中的哪個胺基酸重要的資訊，在人源化時是非常重要的。這種人源化抗體的取得方法的例子記載於後述實施例1至9，藉此得到的人源化抗體，可列舉具有VH13_PN(SEQ ID NO:43)、VH13_PS(SEQ ID NO:47)、VH23_PN(SEQ ID NO:49)、VH23_PS(SEQ ID NO:53)、VH25_PN(SEQ ID NO:55)、或VH25_PS(SEQ ID NO:59)作為重鏈可變區，而且具有VL13(SEQ ID NO:61)、VL14(SEQ ID NO:63)、VL22(SEQ ID NO:65)、VL23(SEQ ID NO:67)、或VL24(SEQ ID NO:69)作為輕鏈可變區的人源化抗體。較佳為具有VL22(SEQ ID NO:65)、VL23(SEQ ID NO:67)、或VL24(SEQ ID NO:69)作為輕鏈可變區。但是，本發明之抗體並不受其限定。
關於所得到的抗IGF-1受體人源化抗體，亦可取得具有編碼該抗體的蛋白質的胺基酸的鹼基序列的核酸分子，並使用這種核酸分子以基因工程的方式製作出抗體。對於該抗體的基因資訊中的重鏈、輕鏈、或其可變區，可參考CDR序列等的資訊，進行用來提升抗體的結合性或特異性的改變等。
製造本發明之抗體的方法，是將導入了編碼各所欲取得的抗體的蛋白質的胺基酸的基因的哺乳動物細胞、昆蟲細胞及大腸菌等加以培養，並由所得到的培養上清液藉由常法純化出抗體而取得。其具體的方法可例示如以下般的方法，但並不受其限定。
首先，使編碼重鏈可變區的核酸分子與編碼重鏈訊號胜肽的核酸分子及編碼重鏈恆定區的核酸分子結合來進行製作。然後，使編碼輕鏈可變區的核酸分子與編碼輕鏈訊號胜肽的核酸分子及編碼輕鏈恆定區的核酸分子結合來進行製作。
將這些重鏈基因與輕鏈基因插入適合於在所選擇的宿主細胞中表現出來的載體，例如選殖載體或表現用載體。此處，重鏈基因及輕鏈基因，只要是表現出兩種基因的形式，可插入同一個載體，或者還可分別插入不同的載體。
接下來，插入重鏈基因與輕鏈基因的載體會被導入宿主細胞。宿主細胞，可列舉例如哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞、或植物細胞等的真核細胞、或細菌細胞。在宿主細胞中導入基因的方法，可由磷酸鈣或脂質體轉染法等的化學方法、電穿孔法或粒子槍法等的物理方法、或利用病毒或噬菌體等的感染的方法等適當地選擇。導入重鏈基因及輕鏈基因的宿主細胞，不需選擇而能夠使用於培養，使用藥劑耐性或營養要求性等的性質將導入了基因的重組體細胞選擇性地濃縮，或可進一步將由導入了基因的單一宿主細胞建立出的殖株的重組體細胞使用於培養。
導入重鏈基因及輕鏈基因的宿主細胞需以適當的培養基與培養條件來培養。此處，在宿主細胞內表現的重鏈基因及輕鏈基因的產物，通常會以抗體蛋白質的形式被分泌至培養基中，藉由回收該培養基，可得到所產生的抗體蛋白質。但是，依照基因與宿主的組合的不同，還可選擇在有必要的情況將宿主細胞破壞，並回收累積在細胞內的抗體蛋白質，在原核細胞的情況由周質部分來回收抗體蛋白質。由含有所回收的抗體蛋白質的培養基等的試樣純化出抗體的方法，一般可使用鹽析法、利用透析或超過濾法等的濃縮或溶劑的交換、使用固定了蛋白質A、蛋白質G或抗原等的擔體的親和層析等，其他還可適當地使用離子交換層析、疏水層析、混合模式層析或粒徑篩析層析等的方法來純化。這些程序所使用的各種手段，任一者對業界人士皆為周知。
此處，對於編碼免疫球蛋白的重鏈及/或輕鏈的基因，藉由進行用來導入所希望的性狀的基因改造，或使用免疫球蛋白的重鏈及/或輕鏈的可變區域或CDR區域的構造資訊，製作出嵌合抗體蛋白質、低分子抗體、支架抗體等，如果是業界人士就會使用周知的技術來實施。另外，為了提升抗體性能或避免副作用，可藉由業界人士周知的技術適當地改變抗體的恆定區構造或改變糖鏈的部分。
[含有抗IGF-1受體人源化抗體的藥] 本發明之抗體，可作為起因於IGF-1相關聯的狀態或對IGF-1受體的作用的疾病的治療藥、預防藥或診斷藥來利用。之後會將治療藥、預防藥或診斷藥總稱而記載為「藥」或「藥劑」。
具體而言，IGF-1相關聯的狀態或抗IGF-1受體促效劑抗體的治療或預防對象的疾病，可列舉肌肉萎縮性疾病(例如廢用性肌肉萎縮、肌肉減少症、惡病質等)、侏儒症(例如Laron型侏儒症、生長荷爾蒙抵抗性侏儒症等)、肝硬化、肝纖維化、糖尿病性腎臟病、慢性腎不全、老化、子宮內胎兒發育遲緩(IUGR)、神經病變、腦中風、脊髓損傷、心血管保護、糖尿病、胰島素抵抗性、代謝症候群、腎臟病、骨質疏鬆症症、囊胞性纖維症、創傷治癒、肌強直性營養不良、愛滋病肌少症、伴隨HIV發生的脂肪移位症候群、燒傷、克隆氏症、Verner症候群、X性聯複合型免疫缺乏症、重聽、神經性厭食症及早產兒視網膜病變、特納氏症候群、普瑞德威利症候群、Silver-Russell症候群，特發性侏儒、肥胖、多發性硬化症、潰瘍性大腸炎、低肌肉量、心肌缺血、低骨密度等，然而並不受其限定。
尤其，本發明之抗體以作為肌肉萎縮性疾病(例如廢用性肌肉萎縮、肌肉減少症、惡病質等)及/或侏儒症(例如Laron型侏儒症、生長荷爾蒙抵抗性侏儒症等)的治療藥或預防藥來使用為佳，另外，本發明之抗體，在不會因為投予而發生血糖值的變動這點是優異的。融合或連結本抗IGF-1受體抗體的一部分或全部作為構成成分的抗體藥、抗體藥物複合體或診斷藥的治療、預防或診斷的對象疾病，可列舉神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、小兒癌、肢端肥大症、卵巢癌、胰臟癌、良性前列腺肥大症、乳癌、前列腺癌、骨癌、肺癌、結腸直腸癌、頸部癌、滑膜肉瘤、膀胱癌、胃癌、威爾姆氏腫瘤、轉移性類癌及血管活性腸肽分泌腫瘤相關聯的下痢、VIP瘤、Verner-Morrison症候群、Beckwith-Wiedemann症候群、腎臟癌、腎細胞癌、轉移性上皮癌、Ewing氏肉瘤、白血病、急性淋巴芽球性白血病、腦腫瘤、膠質母細胞瘤、非膠質母細胞瘤性腦腫瘤、髓膜瘤、腦下垂體腺瘤、前庭神經鞘瘤、原始性神經外胚層腫瘤、髓母細胞瘤、星狀細胞瘤、寡樹突膠質細胞瘤、室管膜瘤、脈絡叢乳頭狀瘤、巨人症、乾癬、動脈粥狀硬化症、平滑肌增生造成血管再狹窄、不適當的微血管增生、糖尿病視網膜病變、葛瑞夫茲氏病、全身性紅斑狼瘡、重症肌無力症、自體免疫甲狀腺疾病、橋本氏甲狀腺炎、甲狀腺眼病變、甲狀腺機能亢進，以及貝賽特氏症。
含有本發明之抗體的藥，除了本發明之抗體之外，還可製劑化成為含有醫藥所容許的擔體及/或其他添加劑的醫藥組成物的形態。使用醫藥所容許的擔體及/或其他添加劑的製劑，可依照例如University of the Sciences in Philadelphia, "Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th EDITION", Lippincott Williams&Wilkins, 2000所記載的方法來實施。
這種藥劑的其中一個形態，是以藉由在無菌的水性液體或油性液體中溶解、懸浮或乳化所調製出的液劑或冷凍乾燥劑的形式來提供。這樣的溶劑或溶解液，在水性液體方面，可列舉注射用蒸餾水、生理食鹽水等，此外在添加滲透壓調節劑(例如D-葡萄糖、D-山梨醇、D-甘露醇、氯化鈉等)的情況，也會有併用適當的溶解輔助劑，例如醇(例如乙醇)、聚醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子性界面活性劑(例如聚山梨醇酯80、聚氧伸乙基硬化蓖麻油50)等的情形。另外還會有溶劑或溶解液使用油性液體的情形，該油性液體的例子，可列舉芝麻油、大豆油等，也會有併用作為溶解輔助劑的苯甲酸苄酯、苯甲醇等的情形。在這種製劑之中，會有適當地使用緩衝劑(例如磷酸鹽類緩衝劑、醋酸鹽類緩衝劑)、舒緩劑(例如苯扎氯銨、鹽酸普魯卡因等)、安定劑(例如人類血清蛋白素、聚乙二醇等)、保存劑(例如抗壞血酸、異抗壞血酸及其鹽等)、著色劑(例如銅葉綠素、β-胡蘿蔔素、紅色2號、藍色1號等)、防腐劑(例如對羥基安息香酸酯、酚、氯化苯索寧、苯扎氯銨等)、增黏劑(例如羥丙基纖維素、羧甲基纖維素及這些鹽等)、安定化劑(例如人類血清蛋白素、甘露醇、山梨醇等)、矯臭劑(例如薄荷醇、柑橘香料等)的添加劑的情形。
其他形態還可列舉黏膜適應用藥劑。在此製劑之中，以賦予對黏膜的吸附性、滯留性等為主要目的，也會有含有黏著劑、黏著增強劑、黏稠劑、黏稠化劑等(例如黏蛋白、洋菜、明膠、果膠、鹿角菜膠、海藻酸鈉、刺槐豆膠、黃原膠、黃耆膠、阿拉伯膠、幾丁聚醣、普魯蘭多醣、糯性澱粉、斯克拉非(Sucralfate)、纖維素及其衍生物(例如羥丙基甲基纖維素、聚甘油脂肪酸酯、丙烯酸(甲基)丙烯酸烷酯共聚物、或其鹽、聚甘油脂肪酸酯等)作為添加劑的情形，然而，投予至生物體的治療劑或預防劑的形態及溶劑或添加劑並不受到其限定，如果是業界人士就能夠適當地選擇。
含有本發明之抗體的藥，除了本發明之抗體之外，還可含有現存的其他藥物(活性成分)。另外，可如抗體藥物複合體或雙重特異性抗體、多重特異性抗體般與其他藥劑等融合或連結，另外還可將包含本發明之抗體的藥與現存的其他藥物組合，製成套組的形態。與抗IGF-1受體促效劑抗體組合的活性成分，可列舉生長荷爾蒙或其類似物、胰島素或其類似物、IGF-2或其類似物、抗肌肉生長抑制素抗體、肌肉生長抑制素拮抗劑、抗激活素IIB型受體抗體、激活素IIB受體拮抗劑、可溶性激活素IIB型受體或其類似物、飢餓素或其類似物、卵泡抑素或其類似物、β2促效劑及選擇的雄激素受體調節劑。
另外，在調製包含本抗IGF-1受體抗體為構成成分的抗體藥或抗體藥物複合體時，可與本抗IGF-1受體抗體組合的活性成分，或者可與本抗IGF-1受體抗體合併含有的活性成分，可列舉皮質類固醇、制吐藥、鹽酸安坦息吐、鹽酸格拉息沖、甲氧氯普胺(metoclopramide)、多潘立酮、氟哌啶醇(Haloperidol)、賽克利嗪(Cyclizine)、蘿拉西泮(Lorazepam)、丙氯拉嗪(Prochlorperazine)、地塞米松(Dexamethasone)、左美丙嗪(Levomepromazine)、托烷司瓊(Tropisetron)、癌症疫苗、GM-CSF阻礙劑、GM-CSFDNA疫苗、以細胞製作出的疫苗、樹突狀細胞疫苗、重組病毒疫苗、熱休克蛋白質(HSP)疫苗、同種腫瘤疫苗、自體腫瘤疫苗、鎮痛藥、布洛芬(Ibuprofen)、萘普生(Naproxen)、三水楊酸膽鹼鎂、鹽酸羥考酮、抗血管形成藥、抗血栓藥、抗PD-1抗體、納武利尤單抗(Nivolumab)、帕博利珠單抗(Pembrolizumab)、抗PD-L1抗體、阿替利珠單抗(Atezolizumab)、抗CTLA4抗體、伊匹木單抗(Ipilimumab)、抗CD20抗體、利妥昔單抗(Rituximab)、抗HER2抗體、曲妥珠單抗(Trastuzumab)、抗CCR4抗體、莫格利珠單抗(Mogamulizumab)、抗VEGF抗體、貝伐單抗(Bevacizumab)、抗VEGF受體抗體、可溶性VEGF受體片段、抗TWEAK抗體、抗TWEAK受體抗體、可溶性TWEAK受體片段、AMG 706、AMG 386、抗增殖藥、法尼基蛋白質轉移酶阻礙劑、αvβ3阻礙劑、αvβ5阻礙劑、p53阻礙劑、Kit受體阻礙劑、ret受體阻礙劑、PDGFR阻礙劑、生長荷爾蒙分泌阻礙劑、血管生成素阻礙劑、腫瘤浸潤巨噬細胞阻礙劑、c-fms阻礙劑、抗c-fms抗體、CSF-1阻礙劑、抗CSF-1抗體、可溶性c-fms片段、培維索孟(Pegvisomant)、吉西他濱(Gemcitabine)、帕尼單抗(Panitumumab)、伊立替康(Irinotecan)及SN-38。所摻合的本發明之抗體以外的藥物的用量，可為通常的治療所使用的用量，亦可依照狀況增減。
本發明中的藥劑，以改善症狀為目的，亦可非口服投予。在非口服投予的情況，例如可採用經鼻劑，可選擇液劑、懸浮劑、固體製劑等。另外，其他非口服投予的形態，可採用注射劑，注射劑可選擇皮下注射劑、靜脈注射劑、點滴注射劑、肌肉注射劑、腦室內注射劑或腹腔內注射劑等。另外，其他非口服投予所使用的製劑，還可列舉栓劑、舌下劑、經皮劑、經鼻劑以外的經黏膜投予劑等。此外亦能夠以含於或塗佈於支架或血管內栓塞劑的態樣在血管內局部投予。
本發明中的治療劑或預防劑的投予量，會依照患者的年齡、性別、體重、症狀、治療效果、投予方法、處理時間或該醫藥組成物所含有的活性成分的種類等而有所不同，通常成人每人每次可在0.1mg至1g的範圍，宜為0.5mg至100mg的範圍投予主劑，1至4週投予1次、或1到2個月投予1次。但是，投予量及投予次數會依照各種條件而變動，因此也會有量及次數少於前述投予量及次數就足夠的情形，另外還會有必須超過前述範圍的投予量及投予次數的情形。 [實施例]
以下列舉實施例進一步詳細說明本發明。但是，本發明也並不受以下的實施例所束縛，在不脫離本發明旨趣的範圍，能夠以任意的形態來實施。
[實施例1]小鼠抗體IGF11-16的人源化抗體的設計： ･人類框架的選定 將藉由Kohler等(Nature, (1975), Vol.256, pp.495-497)的融合瘤法製得的對IGF-1受體的小鼠單株抗體IGF11-16(專利文獻1)的重鏈可變區(VH)及輕鏈可變區(VL)中的互補決定區(CDR)胺基酸移植至模板人類抗體。移植目標的模板人類抗體，是從具有與小鼠抗體IGF11-16(小鼠母體抗體)的VH及VL的胺基酸序列(分別為SEQ ID NO:39及SEQ ID NO:41)高相同性的胺基酸序列的人類抗體的生殖細胞系列(germline)之中，選擇VH-1-46(SEQ ID NO:95)及VH-1-e(SEQ ID NO:96)作為重鏈序列、JH4(SEQ ID NO:97)作為重鏈J-片段、VK1-L5(SEQ ID NO:98)及VK1-A20(SEQ ID NO:99)作為輕鏈序列、JK2(SEQ ID NO:100)作為輕鏈J-片段，使用了將這些如以下表1所示般組合成的兩種人源化抗體框架。
Figure 02_image001
･CDR區域的移植及FR胺基酸替換 由小鼠抗體IGF11-16的VH及VL將必要的胺基酸序列移植至上述模板人類抗體VH及VL的FR，製作出人源化抗體。
具體而言，關於VH，是將前述模板人類抗體VH的CDR胺基酸序列及FR胺基酸的數處以小鼠抗體IGF11-16的VH中對應的胺基酸序列來替換，設計出使小鼠抗體IGF11-16人源化的VH之胺基酸序列，進一步設計出編碼這些胺基酸的DNA的鹼基序列。
關於VL，是將前述模板人類抗體VL的CDR胺基酸序列及FR胺基酸的數處替換成小鼠抗體IGF11-16的VL中的胺基酸序列，設計出使小鼠抗體IGF11-16人源化的VL之胺基酸序列，進一步設計出編碼這些胺基酸的DNA的鹼基序列。
將所設計出的人源化抗體的重鏈及輕鏈的構成揭示於下述表2。 此外，在本實施例的記載及圖式中，會有將所設計出的人源化抗體重鏈可變區與重鏈恆定區連結所構成的人源化重鏈、所設計出的人源化抗體輕鏈可變區與輕鏈恆定區連結所構成的人源化輕鏈，甚至這些人源化重鏈與人源化輕鏈組合所構成的完全人源化抗體，以所使用的重鏈可變區及/或輕鏈可變區的名稱來簡稱的情形。例如圖1A中的"VL22/VH13_PS"，是指將以VL22作為輕鏈可變區並於其上連結人類κ鏈恆定區而成的輕鏈與以VH13_PS作為重鏈可變區並於其上連結IgG4S228P重鏈恆定區而成的重鏈組合所構成的人源化抗體。另外，將SEQ ID NO:15、17、19、21、23、25及27之胺基酸序列所對應的核酸鹼基序列的例子分別表示於SEQ ID NO:16、18、20、22、24、26及28。
Figure 02_image003
[實施例2]人源化抗體的調製： 分別合成出編碼了所設計出的人源化抗體的重鏈可變區與使人類IgG4亞型安定化的變異體的人類IgG4S228P變異體的重鏈恆定區的DNA，將其插入pcDNA3.4系表現載體並且連結，而製作出表現人源化抗體重鏈的質體。
關於所設計出的人源化抗體的輕鏈可變區，是合成出編碼了連結κ鏈恆定區的人源化抗體輕鏈區域的DNA，並將其插入pcDNA3.4系表現載體，而製作出表現人源化抗體輕鏈的質體。
藉由將這些人源化抗體重鏈表現質體與人源化抗體輕鏈表現質體混合，使用ExpiCHO( 註冊商標 ) Expression System(Thermo Fisher Scientific)導入細胞，以表現出各種抗體。此時，分別將插入FW1_VH1的重鏈表現質體與插入FW1_VL1的輕鏈表現質體組合所表現出的人源化抗體命名為FW1_var1抗體，將插入FW2_VH1的重鏈表現質體與插入FW2_VL2的輕鏈表現質體組合所表現出的人源化抗體命名為FW2_var2抗體。關於FW1_var9、FW1_var10及FW1_var14，也同樣地實施及命名。人源化抗體是藉由使用蛋白質A管柱將導入人源化抗體重鏈及人源化抗體輕鏈表現質體的細胞的培養上清液親和純化來取得。 關於之後的人源化抗體的調製，是依照上述方法來進行。
[實施例3]利用PathHunter( 註冊商標 ) 進行的IGF-1受體活化作用： 為了偵測所設計出的人源化抗體對IGF-1受體的活化作用，使用PathHunter( 註冊商標 ) IGF1R Functional Assay (DiscoverX)，依照以下的程序測定IGF-1受體訊號的活化。
將表現出IGF-1受體的細胞，以90μL/well (2×104 cells/well或5×103 cells/well)接種至塗佈了聚D-離胺酸或塗佈了膠原蛋白I型的96孔盤(Black/clear或White/clear)，並在37℃、5%CO2 的條件下保溫。翌日，以10μL/well添加各濃度的藥劑，並在37℃、5%CO2 的條件下保溫。翌日，量取培養上清液30μL，添加15μL的基質溶液，使其反應60分鐘，並藉由光度計(Tristar，berthold)測定發光訊號(RLU)。將添加12.5nM抗體時的螢光強度減去作為背景值的添加0.1nM抗體時之值，將此值定為活化強度，小鼠母體抗體IGF11-16之值定為1，計算出人源化抗體的相對值。
將結果揭示於表3。由此結果可知，人源化抗體(FW1_var1、var9、var10、var14及FW2_var2)的IGF-1受體活化能力，與小鼠母體抗體IGF11-16相比，減弱超過20%。
Figure 02_image005
於是，關於人源化抗體的抗原結合區域之CDR區域，分別將與小鼠不同的序列部分的重鏈CDR2區域的A61、Q62、Q65及G66胺基酸替換成N61、E62、K65及S66，製作出與小鼠母體抗體相同的胺基酸替換人源化抗體(FW1_var10_NEKS、FW1_var14_NEKS)，使用小鼠母體抗體IGF11-16、FW1_var1作為比較對象，與前述同樣地比較IGF-1受體活化能力。
將結果揭示於表4。結果並未觀察到活性強度的恢復。
Figure 02_image007
由以上結果看來，即使CDR區域的胺基酸序列變回與小鼠母體抗體IGF11-16的CDR相同的胺基酸序列，其活性強度也並未恢復至與小鼠母體抗體IGF11-16同等的水準(活性強度比在±20%以內)。所以推測，並非CDR而是FR(框架區域)，會對活性降低有影響。
於是，製作出將FR1、FR2及FR3分別替換成小鼠的FR的人源化抗體。將所製作出的人源化抗體的小鼠FR替換體揭示於表5。如前述般，藉由PathHunter( 註冊商標 ) 的系統來評估這些替換體的IGF-1受體訊號活化。以融合了小鼠母體抗體IGF11-16的可變區與人類IgG4(S228P)的恆定區的人嵌合IGF11-16抗體(Chimera)作為陽性對照組，與前述同樣地比較抗體濃度16.7nM時的訊號強度。將結果揭示於表5。另外，將SEQ ID NO:29、31、33、35及37之胺基酸序列所對應的核酸鹼基序列的例子分別表示於SEQ ID NO:30、32、34、36及38。
Figure 02_image009
由以上的結果，判明了訊號強度與人嵌合IGF11-16同等(值為±20%以內)的替換體為FW1_var9_mFR-H1，小鼠重鏈FR1對於人源化抗體的活性保持而言是重要的。
於是，接下來鑑定小鼠重鏈FR1之中為了保持活性所必要的胺基酸。小鼠母體抗體IGF11-16與人源化抗體的重鏈FR1存在七處胺基酸的不同，因此逐一替換成小鼠母體抗體的胺基酸。將所製作出的小鼠FR1胺基酸替換人源化抗體揭示於表6。對於這些人源化抗體小鼠FR1胺基酸替換體，藉由PathHunter( 註冊商標 ) 的系統來測定IGF-1受體活化訊號強度，並將抗體濃度16.7nM時的訊號強度與小鼠母體抗體IGF11-16作比較。結果，只有將25位的絲胺酸替換成脯胺酸的人源化抗體，與小鼠母體抗體IGF11-16為同等(活性比在±20%以內)。將結果揭示於表6。
Figure 02_image011
由以上的結果，判明了重鏈FR1區域之25位的脯胺酸對於活性保持是重要的。後續的人源化抗體的重鏈全部使用25位的P(脯胺酸，Pro)替換體。
[實施例4]利用丙胺酸替換來鑑定對於活性維持而言重要的CDR區域胺基酸： 為了鑑定CDR區域之中為了保持活性所必要的胺基酸，對小鼠母體抗體IGF11-16之中的各胺基酸實施丙胺酸替換，以EC50 值與Emax 值來比較該替換體的訊號活化能力，藉由抗原ELISA來評估結合活性。將與小鼠母體抗體IGF11-16相比EC50 值在2倍以內、Emax 值在±20%以內定義為同等的活性。
IGF-1受體訊號活化能力，是藉由實施例3所記載的PathHunter( 註冊商標 ) 的系統來評估。EC50 值及Emax 是使用解析軟體GraphPad Prism來計算。關於結合活性，是以重組IGF-1受體細胞外區域作為抗原，藉由固定的抗原ELISA作測定。具體而言，將人類重組IGF-1R(R&D公司製)以PBS(磷酸緩衝生理食鹽水)調製成0.5μg/mL。將所調製出的人類重組IGF-1R溶液以50μL/well添加至固相化盤。在4℃下反應一晩，更換成3%BSA/PBS(含有0.02%疊氮化鈉)。到使用於ELISA為止都保存在4℃。在固相化盤以50μL/well添加待測物質溶液(5nM濃度的抗體溶液)。在室溫下使其反應1小時，然後以洗淨液(PBST(含有0.05%Tween20的磷酸緩衝生理食鹽水))洗淨2次。以50μL/well添加鹼性磷酸酶標識抗小鼠IgG抗體(以3%BSA/PBS稀釋2000倍)。在室溫下使其反應45分鐘，以洗淨液洗淨三次之後，添加基質(pNPP(對硝基苯基磷酸酯))，讓反應開始。在室溫下反應1小時之後，測定405及550nm的吸光度，計算出吸光度405nm-吸光度550nm的差值。以此值作為結合活性來進行解析。
將所製作出的IGF11-16抗體CDR替換體與訊號活化及結合活性的測定結果揭示於表7及表8。由所得到的結果，鑑定出在CDR區域之中，因為丙胺酸替換，結合活性降低至約1～2成的胺基酸部分，亦即CDR-L1之32位的色胺酸、CDR-H1之33位的色胺酸、CDR-H2之50位的麩胺酸、CDR-H2之52位的天門冬醯胺及CDR-H3之102位的精胺酸之5個胺基酸，對於活性保持極為重要。另外，CDR-H1之35位的組胺酸、CDR-H2之54位的絲胺酸、CDR-H2之55位的天門冬醯胺、CDR-H2之56位的絲胺酸、CDR-H2之59位的天門冬醯胺及CDR-H2之64位的苯丙胺酸，會因為Ala替換而活性降低，因此認為有助於活性保持。 另一方面，丙胺酸替換後的CDR區域的胺基酸殘基54個部位當中，44個部位在丙胺酸替換後仍表現出80%以上的結合活性。
Figure 02_image013
Figure 02_image015
[實施例5]人源化重鏈可變區的設計： 由實施例3的結果，判明了重鏈之25位的脯胺酸對於活性維持而言是重要的，因此將重鏈的25位定為P，並以人源化重鏈可變區FW1_VH1及FW2_VH1作為基本骨架進行設計。以FW1_VH1的FR1為基本檢討胺基酸替換體，為了讓FW2-VH1的FR1部分與FW1_FR1相同而進行了S16A的胺基酸替換。另外，用來降低免疫原性的胺基酸替換導入，是根據Epibase( 註冊商標 ) (Lonza公司)的免疫原性分數解析結果來實施。將所設計出的重鏈可變區清單揭示於以下的表9。
Figure 02_image017
[實施例6]人源化輕鏈可變區的設計： 關於人源化輕鏈可變區，是以FW1_VL1及FW2_VL2作為基本骨架進行設計。用來降低免疫原性分數的胺基酸替換導入，是根據Epibase( 註冊商標 ) (Lonza公司)的解析結果來實施。將所設計出的輕鏈可變區清單揭示於表中。
Figure 02_image019
[實施例7]利用去醯胺化風險胺基酸替換體設計人源化抗體： 在製造人源化抗體時，若發生去醯胺化，則品質管理會變得困難。因此，有去醯胺化風險的胺基酸必須事先替換成對活性沒有影響的其他胺基酸。一般而言，有去醯胺化風險的序列，可列舉NG、NT、NS及NN。在本人源化抗體的重鏈的CDR-H2區域之中存在NS序列。所以，考慮到55位的天門冬醯胺(N)去醯胺化而轉換成天門冬胺酸(D)的風險，將進行胺基酸替換。所替換的重鏈的清單揭示於表11。另外，將SEQ ID NO:45、51及57之胺基酸序列所對應的核酸鹼基序列的例子分別表示於SEQ ID NO:46、52及58。
Figure 02_image021
[實施例8]利用IGF-1受體訊號活化作用選擇人源化抗體： 根據IGF-1受體的活化作用來評估人源化抗體，並選擇具有與小鼠母體抗體IGF11-16同等的活性的人源化抗體。
為了偵測抗IGF-1受體促效劑抗體對IGF-1受體的活化作用，使用PathHunter( 註冊商標 ) IGF1R Functional Assay(DiscoverX)，測定IGF-1受體訊號的活化。
將表現出IGF-1受體的細胞，以90μL/well (2×104 cells/well或5×103 cells/well)接種至塗佈了聚D-離胺酸或塗佈了膠原蛋白I型的96孔盤(Black/clear或White/clear )，並在37℃、5%CO2 的條件下保溫。翌日，以10μL/well添加各濃度的藥劑，在37℃、5%CO2 的條件下保溫。翌日，量取培養上清液30μL，添加15μL的基質溶液，使其反應60分鐘，並藉由光度計(Tristar，berthold)來測定發光訊號(RLU)。
將測定結果，確認與小鼠母體抗體IGF11-16同等(與小鼠母體抗體IGF11-16比較，EC50 值在2倍以內、Emax 值在±20%以內)的活性的人源化抗體揭示於表12。
Figure 02_image023
[實施例9]利用人類肌肉母細胞增殖活性選擇人源化抗體： 根據人肌肉母細胞增殖活性來評估人源化抗體，並選擇具有與小鼠母體抗體IGF11-16同等的活性的人源化抗體。
為了檢討抗IGF-1受體人源化抗體對人肌肉母細胞的增殖活性，將藥劑添加至人肌肉母細胞，測定四天後細胞內的ATP量。
將正常人骨骼肌肌肉母細胞(Human Skeletal Muscle Myoblast Cells，HSMM，Lonza)，使用含1%BSA的SkBM-2(Lonza，CC-3246)培養基，以0.1mL/well(2×103 cells/well)接種至96孔盤(Collagen type I coated)，並在37℃、5%CO2 的條件下保溫。在細胞接種的翌日以25μL/well添加各種藥劑，並在37℃、5%CO2 的條件下保溫四天。使用CellTiter-Glo( 註冊商標 ) Luminescent Cell Viability Assay (Promega)測定細胞內的ATP量以作為細胞增殖的指標。將保溫四天的96孔盤中的上清液除去，使培養液成為50μL/well，並在室溫下靜置30分鐘以上。以50μL/well添加CellTiter-Glo( 註冊商標 ) 試劑，使其反應10分鐘以上，然後藉由光度計(Tristar，berthold)測定發光訊號。
結果，將確認與小鼠母體抗體IGF11-16同等(與小鼠母體抗體IGF11-16比較，EC50 值在10倍以內，Emax 在90%以上)的活性的人源化抗體揭示於表13。另外，將測定結果的圖形表示於圖1A～F。
Figure 02_image025
[實施例10]免疫原性評估： 為了解析人源化抗體的免疫原性，使用Lonza的Epibase( 註冊商標 ) in Silico，計算出免疫原性分數。Lonza的Epibase( 註冊商標 ) 電腦模擬平台是一種免疫原性預測方法，使用先由實驗決定好的10-mer的胜肽與HLA class II受體的結合親和性以及HLA class II受體的構造特性來預測存在於抗體中所含的胺基酸序列中的T細胞的活化必要條件的潛在胜肽/HLA結合，並以免疫原性分數來計算。藉由85種HLA Class II異型(43種DRB1、8種DRB3/4/5、22種DQ、12種DP)的評估，可涵蓋全人口的99%以上。免疫原性分數，除了異型的結合親和性之外，還將出現頻率等納入考量而分數化。
將結果揭示於表14及表15。同樣地，將所評估的小鼠母體抗體IGF11-16及小鼠人嵌合抗體(具有小鼠母體抗體IGF11-16的可變區與人類IgG4(S228P)的恆定區的抗體)的免疫原性分數加以比較，判明了人源化抗體的免疫原性低。
Figure 02_image027
Figure 02_image029
[實施例11]對哺乳動物IGF-1受體的結合活性評估： 為了檢討抗IGF-1受體促效劑抗體對人類(SEQ ID NO:71)、食蟹猴(SEQ ID NO:73)、兔子(SEQ ID NO:75)、天竺鼠(SEQ ID NO:77)、大鼠(SEQ ID NO:79)及小鼠(SEQ ID NO:81)的IGF-1受體的結合活性，使用表現出各種IGF-1受體的細胞來實施Cell-based ELISA。
藉由脂質體轉染法，將插入人類(SEQ ID NO:72)、食蟹猴(SEQ ID NO:74)、兔子(SEQ ID NO:76)、天竺鼠(SEQ ID NO:78)、大鼠(SEQ ID NO:80)及小鼠(SEQ ID NO:82)的IGF-1受體基因的pEF1表現載體(Thermo fisher)導入HEK293T細胞。將脂質體轉染後培養一晩以上的HEK293T細胞，以4×104 cells/well添加至96孔盤(塗佈了聚D-離胺酸)，使用10%緩衝福馬林(Mildform( 註冊商標 ) 10NM，Wako)固定，並以含有3%BSA的磷酸緩衝液來阻斷，將其使用於ELISA。
ELISA是將以1%BSA/1%FBS/PBS調製成5nM的各人源化抗體溶液100μL添加至各孔，使其在37℃下反應約1小時。以洗淨液洗淨三次。將藉由1%BSA/1%FBS/ PBS調製成各濃度的抗人類IgG抗體HRP共軛物溶液100μL添加至各孔，在37℃下使其反應約1小時，以洗淨液洗淨三次。在各孔中添加基質(TMB)100μL，讓反應開始。約30分鐘後在各孔中添加100μL的1M硫酸，測定450及650nm的吸光度，計算出吸光度450nm-吸光度650nm的差值。與並未導入IGF-1受體基因的HEK293T細胞(Mock)的吸光度450-650nm的差值作比較來解析結合活性。
圖2表示了對人類、天竺鼠、食蟹猴及兔子的各IGF-R的反應性的結果。結果，人源化抗體hIGF13_PS及hIGF25_PS在表現出人類、天竺鼠、食蟹猴及兔子的IGF-1受體的細胞中，與Mock細胞相比，使結合活性上昇2倍左右，反應性與人小鼠嵌合抗體IGF11-16同等。另一方面，對表現出大鼠及小鼠的IGF-1受體的細胞的結合活性，與Mock細胞為相同程度。由這些結果判明了人源化抗體hIGF13_PS及hIGF25_PS會結合於人類、天竺鼠、食蟹猴及兔子的IGF-1受體，然而不會結合於大鼠及小鼠的IGF-1受體。
[實施例12]利用表面電漿子共振法測定對IGF-1受體的結合親和性： 為了檢討藥劑對IGF-1受體的結合特性(結合速度及解離速度)，藉由表面電漿子共振(SPR)法來進行測定。
測定系統是使用BIACORE T200系統。在Sensor Chip CM3(BR-1005-36，GE)的所有樣品槽中，將抗組胺酸標記的單株抗體以Amine Coupling Kit(BR-1000-50，GE)及His Capture Kit(28-9950-56、GE)固定約3000RU來使用。運行緩衝液是使用HBS-EP+(BR-1006-69，GE)。配體是將重組人類IGF-1受體組胺酸標記(305-GR-050，R&D SYSTEMS，以下稱為IGF-1R-His)捕捉至測定系統來使用。分析物是使用各濃度的藥劑。配體陰性對照組是使用並未捕捉IGF-1R-His的樣品槽。藥劑陰性對照組是使用PBS(PBS pH7.4(1x)，#10010049，Gibco)。
將測定系統的測定溫度設定在40℃。使樣品槽(2及4)的抗組胺酸標記的單株抗體與IGF-1R-His(＜2×  10-8 M)反應至100RU以下。流速定為30μL/分鐘，與10nM的純化小鼠IgG2a、κ、同型Ctrl、Clone:MG2a-53 (401502，BioLegend，以下稱為ctrl IgG2a)反應1分鐘，以HBS-EP+沖10分鐘以上。將分析物以HBS-EP+階段稀釋(0.5～8×10-10 M)，並在所有的樣品槽中進行反應。
測定條件使用了單循環動力學法。與各濃度的分析物進行反應各600秒，得到結合曲線，然後與HBS-EP+進行反應1200秒，得到解離曲線。反應結束後，與再生用緩衝液1(0.2%SDS)、再生用緩衝液2(100mM Tris-HCl (pH8.5)、1M NaCl、15mM MgCl2 )及再生用緩衝液3(10mM甘胺酸-HCl(pH1.5))進行反應各1分鐘，將測定系統的IGF-1R-His除去，並且洗淨。使用Biacore T200 Evaluation software(ver2.0)，以1：1Binding的Model解析，計算出解離速度常數(ka，1/Ms)、結合速度常數(kd，1/s)及解離常數(KD，M)。將結果揭示於表16。
Figure 02_image031
可知hIGF13_PS及hIGF25_PS對人類IGF-1受體的KD值是在E-10以下，滿足了抗IGF-1受體促效劑人源化抗體的最理想標準。
[實施例13]在活體內的血糖降低作用(在天竺鼠身上的血糖降低作用)： 為了確認抗IGF-1受體促效劑抗體在活體內有無血糖降低作用，對天竺鼠單次投予hIGF13_PS及hIGF25_PS，逐時測定血糖值，並檢討有無血糖降低作用。血糖降低作用，是指使血糖值降低至50mg/dL以下或引發低血糖症狀的作用。
使天竺鼠絕食12小時，並以10mg/kg單次靜脈內投予各人源化抗體：hIGF13_PS及hIGF25_PS。天竺鼠絕食至投予24小時後。對清醒狀態的天竺鼠在投予前(0小時)、投予1、2、4、8、24、48、72及144小時後採血，使用Glutest Sensor(三和化學研究所)測定血糖值。將結果表示於圖3A、B。
各人源化抗體，與僅投予溶劑的溶劑對照組比較，血糖值沒有觀察到顯著差異，投予後的血糖值任一者皆在50mg/dL以上。由此結果看來，各人源化抗體不具有如IGF-1般顯著的血糖降低作用，不會對血糖值造成影響，顯示有作為克服IGF-1副作用之低血糖的藥劑的可能性。
[實施例14]人源化抗體在天竺鼠的血中動態： 使天竺鼠絕食12小時，以1及10mg/kg單次靜脈內投予人源化抗體hIGF13_PS及hIGF25_PS或IGF11-16(小鼠母體抗體)。使天竺鼠絕食至投予24小時後，24小時後再餵飼料。對清醒狀態的天竺鼠在投予前(0小時)、投予2、4、8、24、48、72、96、120及144小時後採血，藉由ELISA測定血漿中的人源化抗體濃度。
具體而言，使用重組IGF-1R(R&D公司製)，藉由抗原ELISA進行測定。定量化時的檢量線，是將投予至天竺鼠而且已知濃度的抗體以天竺鼠血漿階段稀釋，定為標準物質。標準物質與血漿稀釋10倍至1000倍來實施測定。
將重組IGF-1R的0.5μg/mL的PBS溶液添加至96孔盤(MaxiSorp(NUNC))，在4℃下固定一整晚。此外，以3%BSA/PBS進行阻斷，製作出重組IGF-1R固定孔盤。另一方面，使用未投予抗體的天竺鼠的血漿將所投予的抗體階段稀釋，定為標準物質。將血漿及標準物質稀釋10倍，並以50μL/well添加至重組IGF-1R固定孔盤。在室溫下進行反應1小時30分，然後以PBS-T(PBS、0.025% Tween20)進行洗淨操作。然後，以50μL/well添加將鹼性磷酸酶標識抗人類IgG(H+L)多株抗體(Southern Biotechnology Associates公司，Cat#2087-04)以3%BSA/ PBS稀釋2000倍而成的溶液，並在室溫下使其反應1小時。然後，以PBS-T進行洗淨操作，以100μL/well添加pNpp (WAKO公司，Cat#149-02342)作為發色基質，在室溫下保溫1小時。然後，以孔盤讀取儀測定405nm及550nm的吸光度，求得吸光度405nm-550nm的差值。以標準物質的抗體濃度描繪出檢量線，計算出血漿中的抗體濃度。
將結果表示於圖4。血漿中的人源化抗體濃度會依存於投予用量而上昇，即使是低用量組，到投予第144小時為止的血漿中人源化抗體濃度，與投予24小時後相比，也維持在約50%以上。顯示了人源化抗體的血中動態，與小鼠母體抗體IGF11-16相比，持續性較優異。
[實施例15]人源化抗體在正常天竺鼠身上的肌肉量增加作用： 對正常天竺鼠靜脈內單次投予hIGF13_PS，測定兩週後的肌肉質量，並與IGF-1的持續投予及小鼠母體抗體IGF11-16的靜脈內投予時的肌肉量增加作用作比較。
將hIGF13_PS及小鼠母體抗體IGF11-16以0.1mg/kg單次投予至正常天竺鼠的靜脈內。使用滲透壓幫浦(ALZET)，將其植入皮下，持續投予人類IGF-1(美卡舍明)至達到1mg/kg/day，以作為陽性對照組。僅將溶劑投予至靜脈內以作為控制組。藥劑投予兩週後，讓天竺鼠在麻醉下放血致死，將伸趾長肌摘出，測定肌肉質量。
將結果表示於圖5。以0.1mg/kg靜脈內投予hIGF13_PS的群組，與僅以溶劑處置的控制組相比，較顯著增加了肌肉量。另外，其藥效是在與以1mg/kg/day持續投予人類IGF-1的群組或靜脈內投予小鼠母體抗體IGF11-16的藥效強度相同的程度。
由以上的結果顯示，hIGF13_PS單次投予即可期待與持續投予人類IGF-1兩週有同等的藥效。
[實施例16]人源化抗體之腦下垂體摘出天竺鼠的生長板軟骨伸長作用： hIGF13_PS的生長板軟骨增殖作用評估，是使用天竺鼠腦下垂體摘出(HPX)模型，評估脛骨近端的骨端線厚度(Epiphyseal line thicknes)。天竺鼠腦下垂體摘出(HPX)模型，因為腦下垂體摘出，生長荷爾蒙的產生會受到抑制，因此會成為低IGF-1狀態。
對腦下垂體摘出的天竺鼠以0.3mg/kg及1.0mg/kg單次皮下投予hIGF13_PS，採收兩週後的右下肢。製作出脛骨近端的生長板軟骨的組織標本，藉由甲苯胺藍測定生長板軟骨的厚度(骨端線厚度)。藉由滲透壓幫浦以1mg/kg/day皮下持續投予IGF-1(美卡舍明)製劑作為陽性對照組，而且1天1次以1mg/kg/day進行皮下投予GH (Somatropin)製劑。
將結果表示於圖6。在IGF-1製劑投予組及GH製劑投予組觀察到骨端線厚度的增加，這被認為是補充因為HPX而降低的血中IGF-1、或補充因為HPX而失去的GH所造成的結果。在hIGF13_PS抗體組，顯示了不會使腦下垂體摘出(HPX)個體的血中IGF-1濃度上昇，會用量依存地使骨端線厚度變厚。
由以上的結果顯示，hIGF13_PS抗體會具有藉由透過IGF-1R的訊號活化讓腦下垂體摘出(HPX)處理造成的IGF-1濃度降低所伴隨發生的骨端線阻塞恢復的作用。
[實施例17]人源化抗體在食蟹猴身上的血糖降低作用： 為了確認抗IGF-1受體促效劑抗體在食蟹猴身上有無血糖降低作用，對食蟹猴單次投予hIGF13_PS，逐時測定血糖值，並與IGF-1(1mg/kg)單次投予時的血糖降低作用作比較。血糖降低作用，是指與溶劑投予組比較，降低至未達50%，或引發低血糖症狀的作用。
對食蟹猴以10mg/kg單次靜脈內或皮下投予人源化抗體。在投予前(0小時)、投予後5分鐘、30分鐘、1、2、4、8及24小時後採血，使用Medisafe Fit(Terumo股份有限公司)測定血糖值。
將結果表示於圖7。各人源化抗體，與僅投予溶劑的溶劑對照組比較，血糖值沒有觀察到差異，投予後的血糖值任一者皆與溶劑對照組為同等的水準。另一方面，IGF-1投予組在2小時後變成低血糖，呈現低血糖症狀，因此投予葡萄糖使其恢復。
[實施例18]人源化抗體在食蟹猴的血中動態： 將人源化抗體hIGF13_PS以1及10mg/kg單次靜脈內或皮下投予至食蟹猴。在投予前(0小時)、投予2、4、8、24、48、72及144小時後採血，並藉由ELISA測定血漿中的人源化抗體濃度。
具體而言，使用重組IGF-1R(R&D公司製，Cat#305-GR-050)，並藉由抗原ELISA進行測定。定量化時的檢量線，是將投予至猴子而且濃度已知的抗體以猴子血漿階段稀釋，製成標準物質。標準物質與血漿是稀釋10倍至1000倍來實施測定。
將0.5μg/mL重組IGF-1R的PBS溶液添加至96孔盤(MaxiSorp(NUNC))，在4℃下固定一整晚。此外，以3%BSA/PBS進行阻斷，製作出重組IGF-1R固定孔盤。另一方面，使用未投予抗體的猴子的血漿將所投予的抗體階段稀釋，定為標準物質。將血漿及標準物質稀釋10倍，以50μL/well添加至重組IGF-1R固定孔盤。在室溫下進行反應1小時30分，然後以PBS-T(PBS、0.025%Tween20)進行洗淨操作。然後，以50μL/well添加將鹼性磷酸酶標識抗人類IgG(H+L)多株抗體(Southern Biotechnology Associates公司，Cat#2087-04)以3%BSA/PBS稀釋2000倍而成的溶液，並使其在室溫下反應1小時。然後，以PBS-T進行洗淨操作，以100μL/well添加pNpp(WAKO公司，Cat#149-02342)作為發色基質，並在室溫下保溫1小時。然後，以孔盤讀取儀測定405nm及550nm的吸光度，並計算出吸光度405nm-550nm的差值。以標準物質的抗體濃度描繪出檢量線，計算出血漿中的抗體濃度。
將結果表示於圖8。由本結果確認了hIGF13_PS在食蟹猴的血中動態良好。
[實施例19]人源化抗體在食蟹猴身上的肌肉量增加作用： 對於兩隻食蟹猴個體以1mg/kg實施靜脈內hIGF13_PS投予。在投予前與投予後3～4週後，藉由DXA(Dual Energy X-ray Absorptiometry)法測定肌肉量。
具體而言，對於測定對象猴子，利用鹽酸氯胺酮(Arevipharma GmbH，50mg/mL，0.2mL/kg)及鹽酸美托咪啶水溶液(Domitor，Orion Corporation，1mg/mL，0.08mL/kg)的肌肉內投予(臀部)來進行全身麻醉，使用雙重能量X光吸收測定裝置(Discovery-A、HOLOGIC公司)，進行脂肪量(Fat Mass，g)、非脂肪量(Lean Body Mass，g)、骨量(Bone Mineral Content(BMC)，g)的測量，解析非脂肪量以作為肌肉量。測定左右腕部(上肢)的BMC(骨鹽量)及Lean+BMC(g)，計算出肌肉量(g)，並與投予前的肌肉量作比較。
結果，與投予前相比，兩隻皆呈現肌肉量較增加，上肢的肌肉增加率，相對於投予前分別為7.4%、10.9%。由此結果確認了hIGF13_PS的肌肉增加作用。
此外，對於兩隻食蟹猴個體，以10mg/kg實施hIGF13_PS皮下投予。在投予前與投予後3～4週後，藉由DXA(Dual Energy X-ray Absorptiometry)法測定肌肉量。
具體而言，對於測定對象猴子，利用鹽酸氯胺酮(Arevipharma GmbH，50mg/mL，0.2mL/kg)及鹽酸美托咪啶水溶液(Domitor，Orion Corporation，1mg/mL，0.08mL/kg)的肌肉內投予(臀部)進行全身麻醉，使用雙重能量X光吸收測定裝置(Discovery-A、HOLOGIC公司)，進行脂肪量(Fat Mass，g)、非脂肪量(Lean Body Mass，g)、骨量(Bone Mineral Content(BMC)，g)的測量，解析非脂肪量以作為肌肉量。測定左右下肢的BMC(骨鹽量)及Lean+ BMC(g)，計算出肌肉量(g)，並與投予前的肌肉量作比較。
結果，與投予前相比，兩隻皆呈現肌肉量增加，下肢的肌肉增加率與投予前相比分別為3.3%、12.7%。由此結果確認了hIGF13_PS的肌肉增加作用。
[實施例20]IGF11-16對HePG2細胞增殖的作用 藉由細胞生存測定，評估小鼠母體抗體IGF11-16對HepG2細胞增殖造成的濃度依存作用。
使HepG2細胞株在添加了1%FBS的DMEM (Gibco，11995)培養基中懸浮，並以0.25×104 cells/well接種至塗佈了膠原蛋白I型的96孔盤(Corning，356650)。翌日，將BSA/PBS,IGF-1(美卡舍明)、控制組小鼠IgG1抗體(mIgG1)、IGF11-16抗體及西妥木單抗(Cixutumumab；IGF-1受體拮抗劑抗體)由50nM以1/10公比稀釋，並且添加。兩天後，使用CellTiter-Glo( 註冊商標 ) Luminescent Cell Viability Assay(Promega，G7571)測定細胞內的ATP量作為細胞增殖指標，藉由多重偵測模式微孔盤讀取儀(SPARK，TECAN)測定發光訊號。將控制組小鼠IgG1抗體(mIgG1)的各濃度點的值定為100%，計算出% of Control，並以圖形來表示(圖9)。
結果觀察到小鼠母體抗體IGF11-16對於HepG2細胞增殖表現出抑制作用。由此結果認為，IGF11-16至少對於某種癌細胞可表現出拮抗劑的作用。
[實施例21]IGF11-16對於IGF-1所產生的人體乳癌細胞株(MCF7)增殖活性的作用 為了評估IGF11-16對於IGF-1所產生的人體乳癌細胞株(MCF7)增殖活性的作用，藉由添加兩天後細胞內的ATP量來測定在與50nM IGF11-16共存的條件下hIGF-1(美卡舍明)濃度依存的增殖活性。
以含有10%FBS的DMEM/F12培養基來培養人體乳癌細胞株(MCF7)。翌日，使用含有10%FBS的DMEM/F12培養基，以0.1mL/well(2.5×103 cells/well)接種至96孔盤(Collagen-type I coated)，並在37℃、5%CO2 的條件下保溫。細胞接種的翌日，將培養基更換成含有1%BSA的DMEM/F12培養基，並在37℃、5%CO2 的條件下保溫約8小時。然後，在添加0.1%BSA/PBS或IGF11-16抗體50nM之後，添加由50nM以1/10公比稀釋後的IGF-1，並在37℃、5%CO2 的條件下保溫兩天。使用CellTiter-Glo( 註冊商標 ) Luminescent Cell Viability Assay(Promega，G7571)測定細胞內的ATP量作為細胞增殖的指標，藉由多重偵測模式微孔盤讀取儀(SPARK、TECAN)測定發光訊號。將各濃度的IGF-1添加組的0.1%BSA/PBS添加組的平均值定為100%，計算出添加50nM IGF11-16時的變化，並以% of Control來表示。將結果揭示於表17。
Figure 02_image033
結果顯示，小鼠母體抗體IGF11-16具有抑制作用，會降低由IGF-1所產生的人體乳癌細胞株(MCF7)的最大活性。由此結果認為，IGF11-16具有別構拮抗劑的作用。 [產業上的可利用性]
本發明可提供一種抗IGF-1受體人源化抗體，會特異性地結合於脊椎動物的IGF-1受體，並透過IGF-1受體來增加肌肉量，同時不會降低血糖值，因此可利用於治療、預防或診斷IGF-1受體相關聯的疾病。另外，本發明藉由抑制IGF-1受體的過度的訊號，還可利用於治療、預防、或診斷細胞異常增殖或活化相關的疾病，其在產業上的價值極高。
[圖1A～F]是表示將本發明之各種人源化抗體所具有的人肌肉母細胞增殖活性與小鼠母體抗體IGF11-16作比較的圖形。 圖1B同上。 圖1C同上。 圖1D同上。 圖1E同上。 圖1F同上。
[圖2]是表示藉由使用表現出各動物種類的IGF-1R之HEK293T細胞的ELISA所測得的本發明之人源化抗體hIGF13_PS及hIGF25_PS對各動物種類的IGF-1R反應性，並與人小鼠嵌合抗體IGF11-16作比較的圖形。
[圖3A]是表示將本發明之人源化抗體hIGF13_PS投予至天竺鼠時血糖值變遷的圖形。 [圖3B]是表示將本發明之人源化抗體hIGF25_PS投予至天竺鼠時血糖值變遷的圖形。
[圖4]是表示將本發明之人源化抗體hIGF13_ PS及hIGF25_PS投予至天竺鼠時血中濃度的變遷，並與投予小鼠母體抗體IGF11-16時作比較的圖形。
[圖5]是表示對正常天竺鼠靜脈內單次投予本發明之人源化抗體hIGF13_PS兩週後的伸趾長肌質量的變化，並與皮下持續投予IGF-1及靜脈內單次投予小鼠母體抗體IGF11-16作比較的圖形。
[圖6]是表示對摘出腦下垂體的天竺鼠靜脈內單次投予本發明之人源化抗體hIGF13_PS兩週後脛骨近端的骨端線厚度的變化，並與皮下持續投予IGF-1及皮下持續投予GH製劑作比較的圖形。
[圖7]是表示將本發明之人源化抗體hIGF13_ PS投予至食蟹猴時血糖值變遷，與投予IGF-1時的作比較的圖形。
[圖8]是表示將本發明之人源化抗體hIGF13_ PS投予至食蟹猴時血中濃度變遷的圖形。
[圖9]是表示小鼠母體抗體IGF11-16對HepG2細胞增殖造成的濃度依存的作用的圖形。
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Claims (34)

  1. 一種抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其係包含：來自小鼠母體抗體IGF11-16的重鏈及輕鏈的各互補決定區(CDR)、與來自人類抗體的重鏈及輕鏈的各框架區(FR)，而且至少一個CDR包含對於小鼠母體抗體IGF11-16之對應的CDR至少1處胺基酸殘基的替換。
  2. 如請求項1之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其中重鏈可變區的框架區1(FR-H1)的25位胺基酸殘基為脯胺酸。
  3. 如請求項1或2之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其中包含： SEQ ID NO:1之胺基酸序列；或SEQ ID NO:1之任一處胺基酸殘基被替換之胺基酸序列，以作為重鏈可變區之CDR-1(CDR-H1)序列， SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5之胺基酸序列；或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5之任一處、兩處或三處胺基酸殘基被替換之胺基酸序列，以作為重鏈可變區之CDR-2(CDR-H2)序列， SEQ ID NO:7之胺基酸序列；或SEQ ID NO:7之任一處或兩處胺基酸殘基被替換之胺基酸序列，以作為重鏈可變區之CDR-3(CDR-H3)序列， SEQ ID NO:9之胺基酸序列；或SEQ ID NO:9之任一處或兩處胺基酸殘基被替換之胺基酸序列，以作為輕鏈可變區之CDR-1(CDR-L1)序列， SEQ ID NO:11之胺基酸序列；或SEQ ID NO:11之任一處胺基酸殘基被替換之胺基酸序列，以作為輕鏈可變區之CDR-2(CDR-L2)序列， SEQ ID NO:13之胺基酸序列；或SEQ ID NO:13之任一處或兩處胺基酸殘基被替換之胺基酸序列，以作為輕鏈可變區之CDR-3(CDR-L3)序列。
  4. 如請求項1或2之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其中包含： 與SEQ ID NO:1具有80%以上的相同性之胺基酸序列，以作為重鏈可變區之CDR-1(CDR-H1)序列， 與SEQ ID NO:3或與SEQ ID NO:5具有82%以上的相同性之胺基酸序列，以作為重鏈可變區之CDR-2(CDR-H2)序列， 與SEQ ID NO:7具有75%以上的相同性之胺基酸序列，以作為重鏈可變區之CDR-3(CDR-H3)序列， 與SEQ ID NO:9具有81%以上的相同性之胺基酸序列，以作為輕鏈可變區之CDR-1(CDR-L1)序列， 與SEQ ID NO:11具有85%以上的相同性之胺基酸序列，以作為輕鏈可變區之CDR-2(CDR-L2)序列， 與SEQ ID NO:13具有77%以上的相同性之胺基酸序列，以作為輕鏈可變區之CDR-3(CDR-L3)序列。
  5. 如請求項1或2之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其中包含： SEQ ID NO:1之3位的Trp維持不變或被替換成類似的胺基酸殘基之胺基酸序列，並且該3位的胺基酸殘基以外的任一處胺基酸殘基被替換；或與SEQ ID NO:1具有80%以上的相同性之胺基酸序列，以作為重鏈可變區之CDR-1(CDR-H1)序列， SEQ ID NO:3之1位的Glu及3位的Asn分別維持不變或被替換成類似的胺基酸殘基，而且6位的Asn維持不變或被替換成Ser或Gln之胺基酸序列，並且該1位、3位及6位的胺基酸殘基以外的任一處、兩處或三處胺基酸殘基被替換；或與SEQ ID NO:3具有82%以上的相同性之胺基酸序列，或 SEQ ID NO:5之1位的Glu及3位的Asn分別維持不變或被替換成類似的胺基酸殘基，而且6位的Ser維持不變或被替換成Asn或Gln之胺基酸序列，並且該1位、3位及6位的胺基酸殘基以外的任一處、兩處或三處胺基酸殘基被替換；或與SEQ ID NO:5具有82%以上的相同性之胺基酸序列，以作為重鏈可變區之CDR-2(CDR-H2)序列， SEQ ID NO:7之4位的Arg維持不變或被替換成類似的胺基酸殘基之胺基酸序列，並且該4位的胺基酸殘基以外的任一處或兩處胺基酸殘基被替換；或與SEQ ID NO:7具有75%以上的相同性之胺基酸序列，以作為重鏈可變區之CDR-3(CDR-H3)序列， SEQ ID NO:9之9位的Trp維持不變或被替換成類似的胺基酸殘基之胺基酸序列，並且該9位的胺基酸殘基以外的任一處或兩處胺基酸殘基被替換；或與SEQ ID NO:9具有81%以上的相同性之胺基酸序列，以作為輕鏈可變區之CDR-1(CDR-L1)序列， SEQ ID NO:11之任一處胺基酸殘基被替換；或與SEQ ID NO:11具有85%以上的相同性之胺基酸序列，以作為輕鏈可變區之CDR-2(CDR-L2)序列， SEQ ID NO:13之任一處或兩處胺基酸殘基被替換；或與SEQ ID NO:13具有77%以上的相同性之胺基酸序列，以作為輕鏈可變區之CDR-3(CDR-L3)序列。
  6. 如請求項1～5項中任一項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其係特異性地結合於具有SEQ ID NO:71之胺基酸序列的人類IGF-1受體的細胞外結構域。
  7. 如請求項1～6項中任一項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其中包含： SEQ ID NO:43、47、49、53、55、或59之胺基酸序列；在SEQ ID NO:43、47、49、53、55、或59之胺基酸序列之中一或多處胺基酸殘基被替換、缺失或附加之胺基酸序列；或與SEQ ID NO:43、47、49、53、55、或59具有90%以上的相同性之胺基酸序列，以作為重鏈可變區，及 SEQ ID NO:65、67、或69之胺基酸序列；在SEQ ID NO:65、67、或69之胺基酸序列之中一或多處胺基酸殘基被替換、缺失或附加之胺基酸序列；或與SEQ ID NO:65、67、或69具有90%以上的相同性之胺基酸序列，以作為輕鏈可變區。
  8. 如請求項1～7項中任一項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其中包含： 人類免疫球蛋白的任一型的重鏈及/或輕鏈的恆定區，以作為重鏈及/或輕鏈的恆定區。
  9. 如請求項1～8項中任一項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其中重鏈恆定區為人類IgG4型的重鏈恆定區或其1～10處胺基酸被替換之恆定區。
  10. 如請求項1～8項中任一項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其中重鏈恆定區為人類IgG1型的重鏈恆定區或其1～10處胺基酸被替換之恆定區。
  11. 如請求項1～10項中任一項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其係以平衡解離常數(KD)1×10-7 M以下的親和性與IGF-1受體結合。
  12. 如請求項1～11項中任一項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其係具有IGF-1受體訊號活化能力。
  13. 如請求項1～12項中任一項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其在肌肉母細胞增殖測試之中，具有增殖活性。
  14. 如請求項1～13項中任一項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其在利用BIACORE進行的與重組可溶性IGF-1受體的結合性測試之中，具有與小鼠母體抗體IGF11-16同等以上的結合親和性。
  15. 如請求項1～14項中任一項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其在正常哺乳動物身上，不會誘導低血糖症狀，可誘導肌肉量增加作用。
  16. 如請求項1～15項中任一項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其在腦下垂體摘出模型動物身上，不會誘導低血糖症狀，可誘導生長板軟骨伸長作用。
  17. 如請求項1～16項中任一項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其在以誘導脊椎動物的肌肉量及/或體長增加的用量被投予至該脊椎動物的情況，不會降低該脊椎動物的血糖值。
  18. 如請求項1～16項中任一項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其係即使在相對於誘導脊椎動物的肌肉量及/或體長增加的有效用量10倍以上的血中曝露量，也不會降低該脊椎動物的血糖值。
  19. 如請求項1～18項中任一項之人源化抗體、其片段或其衍生物，其係具有IGF-1受體訊號活化抑制能力。
  20. 如請求項1～18項中任一項之人源化抗體、其片段或其衍生物，其在肌肉母細胞增殖測試之中，抑制可活化IGF-1受體的配體之IGF-1、IGF-2及胰島素中的至少一者的增殖活性。
  21. 如請求項1～20項中任一項之人源化抗體、其片段或其衍生物，其係在癌細胞增殖測試之中，具有抑制細胞增殖的活性。
  22. 如請求項1～21項中任一項之抗IGF-I受體抗體、其片段或其衍生物，其中抗IGF-I受體抗體、其片段或其衍生物具有1)～4)之至少一個特徵： 1)阻礙由IGF-I受體活化配體所造成的脊椎動物細胞增殖， 2)在脊椎動物身上起因於IGF-I受體活化配體的細胞增殖性疾病當中，抑制細胞增殖， 3)在阻礙由IGF-I受體活化配體所造成的脊椎動物細胞增殖的用量下，不影響分化肌肉細胞的葡萄糖吸收， 4)在脊椎動物身上起因於IGF-I受體活化配體的細胞增殖性疾病當中，在抑制細胞增殖的用量下，不使該脊椎動物的血糖值變動。
  23. 如請求項1～22項中任一項之人源化抗體、其片段或其衍生物，其在荷瘤模型動物身上，不會對血糖值造成影響，可誘導癌細胞增殖抑制作用。
  24. 如請求項23之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物，其在荷瘤模型動物身上，即使在相對於可誘導癌細胞增殖抑制作用的有效用量10倍以上的血中曝露量，也不會對該模型動物的血糖值造成影響。
  25. 一種核酸分子，其係包含編碼如請求項1～24項中任一項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物之聚核苷酸序列。
  26. 一種選殖載體或表現載體，其係包含至少一個如請求項25之核酸分子。
  27. 一種重組體細胞，其係如請求項26之載體被導入宿主細胞。
  28. 一種製造如請求項1～24項中任一項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物之方法，並且包含：培養如請求項27之重組體細胞，並將由前述重組體細胞所產生的該抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物純化之步驟。
  29. 一種醫藥組成物，其係包含如請求項1～24項中任一項之抗IGF-1受體人源化抗體、其片段或其衍生物、如請求項25之核酸分子、如請求項26之載體、或如請求項27之重組體細胞以作為有效成分。
  30. 如請求項29之醫藥組成物，其係使用於治療肌肉萎縮性疾病或侏儒症。
  31. 如請求項30之醫藥組成物，其中肌肉萎縮性疾病為廢用性肌肉萎縮、肌少症、或惡病質。
  32. 如請求項30之醫藥組成物，其中侏儒症為Laron型侏儒症或生長荷爾蒙抵抗性侏儒症。
  33. 如請求項29之醫藥組成物，其係使用於治療與IGF-1受體相關聯的疾病。
  34. 如請求項33之醫藥組成物，其中與IGF-I受體相關聯的疾病，係選自由肝癌、神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、小兒癌、肢端肥大症、卵巢癌、胰臟癌、良性前列腺肥大症、乳癌、前列腺癌、骨癌、肺癌、結腸直腸癌、頸部癌、滑膜肉瘤、膀胱癌、胃癌、威爾姆氏腫瘤、轉移性類癌及血管活性腸肽分泌腫瘤相關聯的下痢、VIP瘤、Verner-Morrison症候群、Beckwith- Wiedemann症候群、腎臟癌、腎細胞癌、轉移性上皮癌、Ewing氏肉瘤、白血病、急性淋巴芽球性白血病、腦腫瘤、膠質母細胞瘤、非膠質母細胞瘤性腦腫瘤、髓膜瘤、腦下垂體腺瘤、前庭神經鞘瘤、原始性神經外胚層腫瘤、髓母細胞瘤、星狀細胞瘤、寡樹突膠質細胞瘤、室管膜瘤、脈絡叢乳頭狀瘤、巨人症、乾癬、動脈粥狀硬化症、平滑肌增生造成血管再狹窄、不適當的微血管增生、糖尿病視網膜病變、葛瑞夫茲氏病、多發性硬化症、全身性紅斑狼瘡、重症肌無力症、自體免疫甲狀腺疾病、橋本氏甲狀腺炎、甲狀腺眼病變、甲狀腺機能亢進、以及貝賽特氏症所構成的群組之疾病。
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