CN1667119A - 一种成体干细胞及其培养方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新的成体干细胞及其培养方法和用途。该细胞具有高度自我复制能力和多系分化能力，其细胞培养特性、生长特性、形态学特性和生物学特性均不同于现有成体干细胞，现已被定向诱导分化为T淋巴细胞、巨噬细胞、表皮细胞和神经样细胞。采用先养后贴法进行培养，能够得到大量扩增的、高纯度的该细胞。该细胞临床应用前景广泛，能够用于人体的修复重建、构建人工组织、抗衰、抗癌、治疗造血功能低下和免疫功能低下，并能够作为基因载体用于治疗骨损伤或造血障碍等疾病，是解决当前干细胞来源困难问题的首选方案之一。

Description

一种成体干细胞及其培养方法和用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体地说涉及一种新的细胞及其培养方法和用途，更具体地说涉及一种成体干细胞及其培养方法和用途。

背景技术

干细胞是一种未分化细胞，有两个基本特性，一是具有自我复制能力，二是能分化成一种以上的功能细胞。根据分化潜能的大小，干细胞一般分成三类。第一类是全能干细胞(totipotent stem cell)，即受精卵在受精后的第1小时内，能分裂为功能一致的全能细胞，将其中的任一细胞置于女性子宫内均可发育为胎儿；第二类是胚胎干细胞(Embryonic stemcell)，它具有广泛的分化潜能，能生成除胎盘外的机体所有的组织细胞；第三类是成体干细胞(adult stem cells)，是一种具有终生自我复制(identical copies)或自我更新(self-renewal)能力的未分化细胞，它分布于不同的组织，并可演变成为各种类型的组织细胞。

成体干细胞是人体自身的多潜能干细胞(Pluripotent stem cells，简称PSC)，是具有相同或相似的细胞表型、多系分化能力的亚全能干细胞群体，存留在多种组织中并能够分离出来，而且在适合的微环境(nich)下能分化产生具有特定形态和功能的细胞(特化细胞)，实现跨系统分化，即能够分化成多种组织细胞，例如，骨髓间质干细胞(Mesenchymal stem cells，简称MSC)、外周血单核细胞(Monocytes)来源的PSC等。所谓微环境是指存在于干细胞所处的细胞基质中，对干细胞命运(是增殖还是分化)起调控作用的各种信号分子(生长因子及其受体、激素及介导分子)的总称(Watt FM，Hogana-Brigid LM.A bipotential precursorpopulation for pancreas and liver within the embryonic endoderm.Science，2000，128：871～811)。例如，MSC具有向成骨细胞、软骨细胞、神经胶质细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、血管内皮细胞和肺基质细胞等组织细胞转化的能力(Goodell MA，Jackson KA，Majika SM，et al.Stem cell plasticity in muscle and bone marrow.Ann NY Acad Sci，2001，938：208和Almeida-Porada G，Zanjani ED，Adult stem cell plasticity and methods of detection.RevClin Exp Hematol，2001，5：26)，肌组织卫星细胞能在特定的环境下造血，神经干细胞能分化为肝、血液和骨骼肌等多种组织。但是，成体干细胞在分化为特化细胞之前常产生一种或几种祖细胞，然后由祖细胞再分化产生特化细胞。

与胚胎干细胞相比较(表1)，成体干细胞具有三个明显特点。一是成体干细胞数量很少，其基本功能是参与组织更新、创伤修复及维持机体内环境稳定。研究表明，每10,000～15,000个骨髓细胞中只有一个造血干细胞(Weissman IL Stem cells：units of development，Units ofregeneration and units in evolution.Cell，2000，1000：157～168)，例如人和动物皮肤中的干细胞含量仅为7％～8％(Tani H，Morris RJ，Kaur P.Enrichment for murine keratinoytestem cells on cell surface phenotype，Proc Natl Acad Sci USA.2000，97(20)：10960)，Reynolds等的实验(Reynolds BA，Weiss RS.Generation of neurons and astrocytes form isolated cells ofthe adult mammalian central nervous system.Science，1992255：1707～1710)证明成体哺乳动物脑内的干细胞数量极少，仅占室下带区中相对静止数的0.1％～1％。二是成体干细胞常以特定的微环境为居住环境，其生物学特性受微环境的影响与制约，成体干细胞是自我复制还是分化为功能细胞，取决于所在的微环境和自身的功能状态。三是成体干细胞不像胚胎干细胞那样有确定的来源，胚胎干细胞来源于胚泡内层细胞团；而人们仍不能明确了解不同组织干细胞的发源地，有学者推测，成体干细胞是胚胎发育过程中保存下来的未分化的细胞(Weissman IL Stem cells：units of development，Units of regeneration and units inevolution.Cell，2000，1000：157～168)，这提示成体干细胞与胚胎干细胞可能会有更多的相似性和同源性。

                          表1、成体干细胞与胚胎干细胞的对比

	成体干细胞	胚胎干细胞
			共同点	①能自我复制；②能分化成特化细胞；③移植时有免疫排斥反应；
不同点	来源于骨髓、外周血、角膜、视网膜、脑、骨骼肌、齿髓、肝、皮肤、胃肠道黏膜层和胰腺	来源于胚泡内层细胞团
			有一定的可塑性，但分化类型少	可分化成各种类型的细胞
	培养易受多种生长因子影响，不能保持长时间不分化，且增殖慢、数量少	培养不易受多种生长因子影响，许多代可保持不分化状态，且增殖快、数量大
			分离、纯化、鉴定较困难，其增殖能力随年龄增大而减退，DNA变异多，应用因此受限	分离、纯化、鉴定较容易

成体干细胞与胚胎干细胞相比较，具有其优点：胚胎干细胞虽具有全能性和可以建系传代等优点，从理论上看，胚胎干细胞移植是治疗血液系统疾病、先天性遗传疾病以及多发性和转移性恶性肿瘤疾病的有效方法之一，其应用前景广阔，但实际应用是受限的。一方面是因为每个个体的主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex，简称MHC)不同，同种异体胚胎干细胞及其分化组织细胞用于临床会引起免疫排斥，因此，基于胚胎干细胞的治疗方案，要求对患者长期使用免疫抑制剂治疗或将患者的造血系统和外来细胞形成嵌合体。此外，在应用胚胎干细胞时，还必须确认胚胎干细胞供者没有诸如(肌)营养失调症之类的遗传性疾病。另一方面是因为胚胎干细胞虽然具有高度分化能力，并能分化成各种细胞类型，但这种分化是“非定位性”的，而目前尚不能控制胚胎干细胞在特定的部位分化成相应的细胞，临床直接使用时易导致畸胎瘤，因此，在应用胚胎干细胞治疗前，必须先进行初步的细胞诱导分化，以防止畸胎瘤的发生。

而成体干细胞具有类似胚胎干细胞的高度分化能力，在国内已建立了干细胞技术平台，有学者已从肌肉、肝脏、骨髓中成功地发现和分离了成体干细胞群，定向诱导分化成多种细胞，如成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、脂肪细胞、神经样细胞和血管内皮细胞等，并用于临床某些基本的治疗，如骨缺损、帕杰森氏综合征等。最近又研究发现，从胰腺等组织可分离出间充质表型的成体干细胞群，具有多系分化潜能。因此，相对而言，成体干细胞不存在胚胎干细胞的上述问题，例如骨髓移植实验并不引发畸胎瘤。

虽然成体干细胞如骨髓MSC和外周血单核细胞来源的PSC在自身的移植过程中不存在排斥反应的问题，但是骨髓的抽取势必造成组织损伤和病人的痛苦，而且其含量非常低，10⁵～10⁶个细胞中含有1个骨髓MSC；提取外周血单个核细胞(主要包括单核细胞、淋巴细胞和少量的其它细胞等)来源的PSC时，用血量较大，一般在500ml左右，对于多数患者显然是不可行的；更重要的是，不管是骨髓MSC，还是外周血单核细胞来源的PSC，分离纯化时间均较长(21～24天)，对于急需PSC治疗的患者，如果使用自身的骨髓或外周血，更是无法实现。所以，尽管成体干细胞移植也是目前治疗血液系统疾病、先天性遗传疾病以及多发性和转移性恶性肿瘤疾病的有效方法之一，但其在研究与临床治疗方面的应用还是无法满足要求。因此，培养、分离和体外大量扩增高纯度的目前已有的成体干细胞或者发现能够满足上述要求的新的成体干细胞，对于其应用就显得非常重要。

一般而言，干细胞的鉴定主要是依赖其形态和定位加以准确辨认。例如，在果蝇的性腺和外周神经系统中，干细胞有明确的定位，哺乳类的肌肉干细胞即附着于肌纤维边缘的肌卫星细胞。但在大多数情况下，干细胞的位置并不明确，因此，还需要利用细胞的培养特性(如是否贴壁生长)、生长特性(如旋涡生长或融合生长等)、形态学特性(如圆状、条梭状等)和生物学特性(如特殊化学染色、表面标志物以及该细胞某些酶的表达等)等方法来进行进一步鉴别该细胞是否是干细胞，而分子标记法(即采用流式细胞仪测定干细胞上的表面标志物)是国际上公认的方法和手段；同时，通过定向诱导分化方法，验证该细胞是否具有多系分化能力等，来进一步证实该细胞是否是成体干细胞。

有关干细胞培养所用的培养试剂(也称培养基或培养液)，目前主要有来自于美国Stemcell公司的Mesencult^TM培养试剂(是间质干细胞培养的专用试剂，间质干细胞即Mesenchymal stem cells，简称MSC)、美国GIBICO公司的高糖DMEM(即H-DMEM)培养试剂、低糖DMEM(即L-DMEM)培养试剂、α-MEM培养试剂、F12培养试剂和RPMI 1640培养试剂等。文献报道，骨髓MSC多用L-DMEM培养试剂培养，脐血MSC使用Mesencult^TM培养试剂或α-MEM培养试剂培养，成人外周血单核细胞来源的PSC使用的培养试剂是RPMI 1640培养试剂。

干细胞的分离、培养方法可分为三种：①有明确定位的干细胞，往往具有独特的生长方式，可以直接取其用于研究，或取其聚集区在培养试剂中进行体外培养后再进行分离、纯化和扩增培养。例如，骨髓中存在造血干细胞和骨髓MSC两种干细胞，在骨髓的体外培养中，造血干细胞和骨髓呈悬浮集落生长，而骨髓MSC则贴壁生长，这两种干细胞就很容易进行区分，而且也很容易通过更换培养试剂把两者分开，去掉悬浮生长的造血干细胞和骨髓；贴壁的骨髓MSC则留下，加入培养试剂进行扩增培养。②有分子标记的干细胞，如外周血干细胞具有表面特异抗原，一般利用带有标记的抗体与之结合，然后用流式细胞仪(FACS)、磁珠分选仪(MACS)等分选设备进行分选，然后在培养试剂中进行体外培养，再用于治疗血液病或作进一步研究。③未发现有特异分子标记的干细胞，可利用条件培养试剂筛选。例如，神经干细胞需要在低血清、成纤维生长因子(FGF)及转换生长因子β(TGFβ)等多种因子存在的培养试剂中进行培养时才能生长，而大部分细胞对血清是依赖的，长期的培养结果使大部分的其他细胞死亡，而神经干细胞则得到了纯化和扩增。

目前已报道的用于血液或骨髓来源成体干细胞的基本分离方法包括如下四个步骤：

①使用常规方法，分离出单个核细胞；

②将单个核细胞进行稀释，得细胞溶液；

③将该细胞溶液接种到含有培养试剂的器皿中，进行培养；

④弃去未贴壁的细胞，更换新的培养试剂继续培养贴壁的细胞，待细胞达到一定程度的融合时，消化传代。

下面是有关血液或骨髓来源的成体干细胞的分离方法的具体操作：

骨髓或外周血MSC的分离与纯化：骨髓或外周血用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释后，用淋巴细胞分离液如Ficoll分离液或Percoll分离液分离出单个核细胞；先用含有10～20％小牛血清的RPMI 1640培养试剂将单个核细胞进行稀释，得到细胞溶液，然后将该溶液接种到塑料培养器皿中，接种浓度为1×10⁶个/cm²；继续培养5～7天后，弃去未贴壁的细胞，更换新的完全培养试剂，继续培养贴壁的细胞，待细胞达到80％融合时，消化传代。

脐血MSC的分离与纯化：脐血用PBS稀释后，用淋巴细胞分离液如Ficoll分离液或Percoll分离液分离出单个核细胞；先用含有10～20％小牛血清的α-MEM培养试剂或Mesencult^TM培养试剂进行稀释，得到细胞溶液，然后将该溶液接种到塑料培养器皿中，接种浓度为1×10⁶个/cm²；继续培养5～7天后，弃去未贴壁的细胞，更换新的培养试剂，继续培养贴壁的细胞；待细胞达到80％融合时，消化传代。

外周血单核细胞来源的PSC的分离与纯化：取500ml外周血，利用选择粘附程序分离得到单个核细胞；用含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养试剂将单个核细胞进行稀释，得到细胞溶液，将该细胞溶液接种到15cm培养瓶中，每个培养瓶接种2×10⁷～3×10⁷个细胞；将培养瓶在37℃、8％CO₂条件下培养8～12h，先弃去未贴壁的细胞，然后将贴壁细胞重悬，接种到8孔培养板中，5～7天换半液继续培养。

由于脐血中的细胞成分一部分来源于新生儿机体，一部分来源于胎盘组织，其早期细胞含量远远高于成人外周血，因此理论上除已报道的CD34⁺造血干细胞和MSC外，应该还存在其它的成体干细胞，只是用目前所报道的方法不易培养。如果通过改变目前所使用的试剂及方法，在脐血中发现、分离出新的成体干细胞将变得更为可能。

迄今为止，尚未见新的有关来源于血液的新的成体干细胞及其培养方法和用途等方面的报道。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种新的成体干细胞，目的之二是提供该成体干细胞的培养方法，目的之三是提供该成体干细胞的用途。

本发明的技术构思如下：

1.细胞作为有机体的最小组成单位，在其生长和增殖过程中需要必须的营养成分如氨基酸、维生素、无机盐以及某些细胞因子等，不同的细胞对某些营养成分的需求也不尽相同。目前常用的细胞培养试剂(如L-DMEM培养试剂、α-MEM培养试剂或RPMI 1640培养试剂等)的营养成分能够满足绝大多数细胞生长的需要，但对于某些细胞来讲，其中某些营养成分有可能不足甚至缺乏。如果调整(增加或补加)细胞培养试剂的某些基础营养成分，就有可能发现和培养出新的细胞。

2.常规的细胞培养是采用等渗的培养试剂，在原代细胞培养过程中往往几种细胞同时增长，不易获得较纯的目的细胞。研究表明，渗透压的改变可导致细胞容积的改变，激活细胞膜上的离子通道(Robert W，Wei G，Scott H.Blocking swelling-activated chloride currentinhibits mouse liver cell proliferation.J Physio 2001，532：661和Shen MR，Droogmans G，Eggmont J，et al.Differential expression of volume-regulated anion channel during cell cycleprogression of human cervical cancer cells.J Physio.2000，529：385)，这些改变与细胞增殖的调控密切相关。对造血干细胞的研究发现，渗透压对集落形成细胞有影响，当渗透压低于正常的17％或高于正常的23％时对集落的形成明显的影响，并提示低渗透压对造血细胞体外培养更有害(张孝兵等，影响脐血造血细胞体外培养与检测的因素，华东理工大学学报1999，25：32)。因此，如果改变培养试剂的渗透压，就有可能实现对一些细胞增殖，而抑制另外一些细胞的生长或促进其凋亡，从而达到筛选细胞的目的。

3.血液或骨髓贴壁细胞的常规培养多选用一次贴壁的方法，即单个核细胞培养4～7天后，弃去悬浮的细胞，继续培养贴壁的细胞。这对于培养贴壁干细胞是不利的，因为干细胞的早期阶段(前体干细胞)可能还不具备某些生物学特性，如贴壁特性、形态学特性等，只有随着细胞的逐渐成熟，这些特性才能逐步表现出来。单个核细胞培养4～7天时，贴壁的细胞少部分为较早期的细胞如干细胞或未成熟的细胞，而绝大多数为成熟的单核细胞，如果此时将未贴壁的细胞弃去，势必将大量的干细胞丢失，造成的结果是干细胞的获得率低或培养不出干细胞。如果此时将未贴壁的细胞移种到新的培养器皿中继续培养，就有可能利于表现出贴壁特性的干细胞的贴壁，并筛掉贴壁的成熟的单核细胞，最终获得大量高纯度的干细胞。

4.由于蛋白质分子量巨大难以进入细胞，只能作用于细胞表面分子而发生作用；而且基因治疗有依赖病毒序列作为基因载体的弊病，因此限制了“分子治疗”的应用。如何克服这些弊病，改进技术，是分子治疗领域的主要课题之一。干细胞生物工程是指在体外对干细胞进行操作，包括体外增殖、定向诱导、横向分化、基因修饰和组织成形等。而干细胞生物工程是改造“分子治疗”的最佳选择：一是成体干细胞具有自我扩增和分化功能，因此导入的“外源基因”可以有效地得以扩散；二是成体干细胞可以在体外进行操作，对基因的改造和修饰可以在体外完成并经筛选后再导入体内，避免由于基因插入而导致的细胞失常；三是成体干细胞是人体细胞，作为载体其毒性最小，而且作为生命的最小单元，是导入组织的最佳形式。干细胞生物工程能为多种“不治之症”带来福音，具有极大的应用前景和产业化潜能。所以，如果我们能够找到一种合适的成体干细胞，能够体外定向诱导分化、体外高度纯化和体外大量、高速扩增，那么该成体干细胞将为临床应用提供了新的重要的药物来源。

为便于叙述，将新配制的培养试剂暂定名Potentculture培养试剂，将改进的培养方法简称为先养后贴法，将新发现的成体干细胞即来源于血液(如脐血或成人外周血等)的新的成体干细胞CD34^-CD45⁺多潜能干细胞(Umbilical cord blood or peripheral blood CD34^-CD45⁺Pluripotent stem cells)，简称为PSC3445。

本发明对前三项构思进行了逐一研究和实验验证，改进的主要内容是：

(1)调整现有培养试剂的组分和含量，配制新的培养试剂。一是添加某些缺少的营养成分，如某些氨基酸、维生素或核苷酸等；二是在培养细胞必需的营养成分基础上，再适当增加其含量；三是通过提高某些成分的含量，来提高培养试剂的渗透压，例如增加无机盐等的含量，可高出正常值的60％。

(2)改进细胞培养方法，采用先养后贴法。主要包括两个步骤：

①将单个核细胞在Potentculture培养试剂中培养数天，弃去贴壁的细胞，将未贴壁的细胞(即悬浮细胞)移种到另一培养器皿中再培养数天；

②弃去未贴壁的悬浮细胞，更换Potentculture培养试剂，继续培养留下的贴壁细胞数天，即得被筛选的目的细胞。

但是，为了筛选出大量扩增的、高纯度的目的细胞，则需改进该培养方法，即步骤①与上述内容相同，改进步骤②，增加步骤③，具体操作是：

②保留未贴壁的悬浮细胞，将其移种到另一培养器皿中，使用Potentculture培养试剂再继续培养数天；同时，更换Potentculture培养试剂，继续培养贴壁细胞数天，且每培养数天更换一次Potentculture培养试剂，或者在更换培养试剂进行培养数天后换半液继续培养，使其继续增殖；

③对未贴壁的悬浮细胞培养所得到的细胞溶液再进行分开培养，如此重复多次，即获得大量扩增的、高纯度的被筛选的目的细胞。

本发明的实验数据和结果均证实了本发明的技术构思是正确的，并得到了一种新的成体干细胞。下面，首先介绍研究和发现该新的成体干细胞PSC3445所使用的Potentculture培养试剂。

(一)Potentculture培养试剂

我们这里所述的Potentculture培养试剂是指Potentculture完全培养试剂，即其包括Potentculture基础培养试剂、血浆或血清类组分等，其中的Potentculture基础培养试剂包括氨基酸类、无机盐类、核酸类、葡萄糖和其它成分等。

1000ml的Potentculture基础培养试剂主要包括1400～1800mg氨基酸类、10000～15000mg无机盐、30～60mg维生素及脂类、40～70mg核酸类、800～1500mg葡萄糖和120～170mg其它成分，各组分分别优选1682.9mg、12479.9mg、54.7mg、48mg、3350mg和147.1mg。与1000ml的Potentculture基础培养试剂配套使用的血浆或血清类组分是指200～600ml的血浆或血浆和血清的混合物，优选使用400ml的血浆，或300ml血浆和100ml血清的混合物。

(二)PSC3445是一种新的成体干细胞

PSC3445的鉴定和鉴别是依据多层次和多角度的具体数据，从以下几个方面逐步深入的，例如从细胞培养特性、生长特性、形态学特性和生物学特性来证实该细胞是一种新的干细胞；并通过定向诱导分化方法，验证该细胞具有多系分化能力等，来进一步证实该细胞不但是一种新的干细胞，而且是一种新的多潜能干细胞即成体干细胞。

1.PSC3445是一种尚未报道的新的干细胞

①PSC3445的培养特性及生长特性

将来源于血液(如脐血)的单个核细胞加入到含有Potentculture培养试剂的塑料培养瓶培养5～7d，首先贴壁的为成熟的单核细胞，其含量达96％左右(Yong Zhao.David Glesne.Eliezer Huberman.A human peripheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotent stemcells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2003；100(5)：2426-2431)，其形态主要为圆形或不规则形，弃去这类贴壁细胞；将未贴壁生长的悬浮细胞移种到另一培养器皿中如24孔塑料培养板中继续培养1～2d，弃去未贴壁的细胞，更换Potentculture培养试剂，继续培养留下的贴壁细胞数天，其中成纤维样细胞即是被筛选的目的细胞，也即PSC3445(图1)。

对该部分贴壁细胞继续进行培养，PSC3445大量扩增，而圆形细胞逐渐死亡；当PSC3445增殖到一定程度，呈漩涡状生长(图2)。但不管PSC3445的数量达到多少，并不出现融合现象(图3)，这一点不同于骨髓及脐血MSC的生长特性(图4)。因此，PSC3445不同于单核细胞的形态特征，也不同于MSC的生长特性，而可能是一种新的干细胞。

②投射电镜下PSC3445的形态学特征

PSC3445在投射电镜下的特征是细胞周边有许多纤毛(图5)，细胞核为圆形或卵圆形，部分细胞核仁明显(图6)；随着细胞的成熟，胞浆中的颗粒逐渐增大(图7)。而同样具有贴壁能力的血液中的单核细胞，在电镜下其形态特征是细胞周边无纤毛，细胞核为马蹄形(图8)。因此，PSC3445的形态提示，其不同于单核细胞，而可能是一种新的干细胞。

③PSC3445的表面标志物

从表2可以看出，PSC3445的表面标志物与骨髓及血液来源的MSC或PSC的表面标志物不完全相同，如表面标志物HLA-DR、CD34、CD14、CD90、CD11b和CD105等均有不同，因此，PSC3445不同于目前所报道的MSC或PSC，而可能是一种新的干细胞。

表2、PSC3445与骨髓、外周血单个核细胞来源的PSC及MSC部分表面标志比较

组别	HLA-DR	CD3	CD14	CD11b	CD29	CD34	CD105	CD45	CD90
										PSC3445外周血PSC骨髓MSC脐血MSC	+--	---	++--	+--	+++	-+--	-++	++--	-++

表2中的HLA-DR、CD3、CD14、CD11b、CD29、CD34、CD45、CD90、CD105均为细胞的表面标志物，其中对应的“+”和“-”分别表示相应的细胞在此表面标志物测定上的“阳性”和“阴性”，即“有”和“无”；对应的空白处则表示到目前为止，还没有对该细胞相应的表面标志物进行测定，也未见到相应测定数据和结果的文献报道。

表2中外周血PSC的结果来自Yong Zhao.David Glesne.Eliezer Huberman.A humanperipheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotent stem cells Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2003，100(5)：2426-2431。

表2中骨髓MSC的统计结果来自Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al.Multilineagepotential ofadult human mesenchymal stem cells[J].Science，1999；284(2)：143-147，和CongetPA，Minguell JJ.Phenotypical and functional properties of human bone marrow mesenchymalprogenitor cell[J].J Cell Physiol，1999；181(1)，67-73，以及Deans RJ，Oseley AB.Mesenchymalstem cells：biology and potential clinical uses[J].Exp Hematol.2000；28(8)：875-84。

表2中脐血MSC的统计结果来自Erices A，Conget P，Minguell JJ.Mesenchymalprogenitor cells in human umbilical cord blood.Br J Haematol.2000；109(1)：235-42。

表面标志物检测的具体方法：将消化的原代、扩增一代脐血PSC、骨髓MSC，用PBS洗涤后配成1×10⁶个细胞/ml的细胞悬液，每个Epp.管中加0.5ml，其中两管为阴性对照管，分别加入鼠IgG1-FITC和IgG1-PE，其余管分别加入抗人CD34-PE、CD29-PE、CD14-PE、CD11b-PE、CD45-FITC、CD34-PE、CD3-FTIC、CD105-PE、CD166-PE、CD90-FTIC、CD33-PE、CD41-PE、CD-44FTIC、CD7-FTIC、CD61-FTIC和HLA-DR-PE。室温孵育20min，美国BD公司Calibure流式细胞仪获得5000～10000个细胞，cell-quest软件分析。

细胞表面标志测定所需要的单抗：荧光标记小鼠抗人抗体包括CD14-PE、CD11b-PE、CD45-FITC、CD34-PE、CD3-FTIC、CD105-PE、CD166-PE、CD29-PE、CD90-FTIC和HLA-DR-PE，购自美国的BD公司和Pharmagein公司。

④PSC3445的特殊化学染色特征

为进一步验证与核实，本发明对PSC3445进行特殊化学染色(表3)，并与有关可能类似的细胞进行对比分析，排除相同的可能性。从表3可以看出，PSC3445特殊化学染色也不同于脐血MSC，例如酸性磷酸酶(AP)染色的结果不同，即PSC3445不同于脐血来源的MSC，可能是一种新的干细胞。

表3、脐血PSC与MSC特殊化学染色结果对照

组别	ORO	POX	PAS	Alk.P	AP	NSE	SBB
								脐血MSCPSC3445	-	-	++	--	-+	++	-

表3中的“+”和“-”分别表示相应的细胞在此表面标志物测定上的“阳性”和“阴性”；对应的空白处则表示到目前为止，还没有对该相应细胞暂的此表面标志物进行测定，也未见到相应测定数据和结果的文献报道。其中，油红O(ORO)染色的结果如图9，红色表示阳性结果；过氧化酶(POX)染色，如采用四甲基联苯胺法，其结果如图10，棕色或黑色表示阳性结果；糖元(PAS)染色，如采用高碘酸-雪夫反应法，其结果如图11，红色表示阳性结果；碱性磷酸酶(Alk.P)染色，如采用钙-钴法，其结果如图12，黑色表示阳性结果；酸性磷酸酶(AP)染色，如采用硫化铅法，其结果如图13，棕黄色表示阳性结果；瑞氏染色(Wright)的结果显示，胞浆着深蓝色，核染色质较细致，则提示该细胞是幼稚细胞(如图14)；神经特异性烯醇化酶(NSE)染色，棕黄色表示阳性结果；苏丹黑B(SBB)染色，黑色表示阳性结果。

表3中脐血MSC的统计结果来自Erices A，Conget P，Minguell JJ.Mesenchymalprogenitor cells in human umbilical cord blood.Br J Haematol.2000；109(1)：235-42。

从以上的细胞培养特性、生长特性、电镜特性、表面标志物以及细胞的特殊化学染色结果综合分析，PSC3445是尚未见报道的一种新的干细胞。

2.PSC3445是一种新的成体干细胞

干细胞是一种未分化细胞，其基本特性为：一是具有自我复制能力，二是能分化为一种以上的功能细胞。成体干细胞是具有多系分化能力的亚全能干细胞群体，具有相同或相似的细胞表型；存留在多种组织中并能够分离出来，在适合的微环境下能分化产生具有特定形态和功能的细胞(特化细胞)。本发明PSC3445为多潜能成体干细胞即成体干细胞，进一步的实验依据如下：

①该细胞在脐血中的含量大约为10,000～100,000个有核细胞含1～5个左右，但其具有高度自我复制能力，在新型培养试剂中大量增殖，75ml脐血至少可获得5×10⁷个细胞，传10代以上的细胞的形态及表面标志物不发生变化。

②该细胞至少可诱导分化为3种以上的不同胚层来源的细胞，该细胞经T淋巴细胞诱导剂如白细胞介素2(IL-2)诱导后，细胞经流式细胞仪检测显示为CD3⁺CD4⁺或CD3⁺CD8⁺，提示该细胞为T淋巴细胞的两个亚群(图15、图16)，经瑞氏染色后细胞形态与外周血淋巴细胞形态相同(图17)。

      表4、LPS诱导后部分细胞因子的变化情况(单位：ng/L)

组别	IL-6	IL-8	IL-10	TNF
					实验组对照组	5729104.8	104000475.3	96.3530.60	87.57＜0.5

     表5、LPS诱导前后部分细胞标志物的变化情况(平均荧光强度)

组别	CD11b	CD14	CD45	CD80	HLA-DR
						实验组对照组	308.00259.87	613.15272.39	62.8138.30	29.6617.61	334.83247.52

经巨噬细胞诱导剂如脂多糖(LPS)诱导后，该细胞的白细胞介素10(IL-10)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)的分泌量明显增高(见表4)，且该细胞的部分细胞标志物表达增高(见表5)，提示该细胞为巨噬细胞。

经表皮细胞诱导剂如表皮细胞生长因子(EGF)诱导后，免疫组化染色显示CAM5.2、EMA、P63表达阳性，呈棕黄色(图18、图19、图20)，说明PSC3445已分化为表皮细胞。

经神经细胞诱导剂如神经细胞生长因子(NGF)诱导后，PSC3445的细胞形态变为神经样细胞(图21)，神经烯醇化酶(NSE)染色为阳性，即棕黄色(图22)，说明PSC3445无论从形态还是酶的表达方面已具备了神经细胞的特征。

③细胞周期检测结果分析显示，96％的细胞处在G0～G1期，0.2％细胞处在G2期，3.3％细胞处在S期，G2/G1为1.84(图23)，说明PSC3445符合成体干细胞的特征。

细胞周期检测的具体方法：取培养10d左右、1×10⁶个的PSC3445，1000转/分钟离心5分钟，去上清夜，加-20度预冷的75％的乙醇，固定过夜；1000转/分钟离心5分钟，去乙醇；PBS洗涤，再加入500微升的染液(含50微克/ml的溴化丙锭、100微克/ml的RNA酶)，染30分钟，用流式细胞仪(美国BD公司)检测，得结果。

综上所述，PSC3445符合成体干细胞的特征，具备多潜能性，因此，PSC3445是一种新的成体干细胞。

(三)PSC3445的培养方法

本发明所采用的细胞培养方法与目前已报道的用于血液或骨髓来源成体干细胞的基本分离方法的步骤①、②、③基本相同，主要是在步骤④上进行了多种改进。但是，在整个培养过程中，所使用的细胞培养试剂均为Potentculture培养试剂，与目前已报道的细胞培养试剂不同。下面主要就改进的方面重点进行阐述。

1、方法一，PSC3445的培养方法主要包括如下两个步骤：

①单个核细胞的分离：采用常规的细胞分离方法，但是其中使用的培养试剂是Potentculture培养试剂。即：在无菌条件下采集正常新鲜血或低温冻存血如外周血或脐血，优选新鲜血，加抗凝试剂如肝素等进行抗凝，离心，取白膜层；再用含血清如胎牛血清的Potentculture培养试剂或缓冲液如Hank’s液等叠加在单个核细胞的分离液上层进行稀释，再离心，取单个核细胞层洗涤备用。

②PSC3445的培养：包括纯化和扩增培养两个方面。即：将单个核细胞配成一定浓度的细胞溶液，并接种到Potentculture培养试剂中，置于37C、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养5～7天，弃去贴壁的细胞；将未贴壁的悬浮细胞移种到另一培养器皿如24孔板中，更换Potentculture培养试剂继续培养2～3天，所得的贴壁细胞中的成纤维样细胞即是所要筛选的PSC3445。

为了提高PSC3445的纯度或产量，还需进一步改进该培养方法：

一是采用反复贴壁法培养上述培养过程所得的未贴壁细胞，即将未贴壁的细胞移种到新的培养器皿如24孔板中，培养2～3天后，再将该培养过程中的未贴壁细胞移种到另一培养器皿，留下的PSC3445继续培养。如此反复4～7次，可获得更大量的、高纯度的PSC3445。

二是在使用Potentculture培养试剂时，所用的血浆优选使用成人外周血血浆，这样能够快速得到PSC3445。

三是在PSC3445的培养数量占培养面积的70～80％时，使用胰蛋白酶如含有0.1g％EDTA的0.125％胰蛋白酶消化，按1：2进行传代培养，这样能够得到更高纯度的PSC3445。

该方法的优点是：

①细胞的得率高：利用该试剂及方法得到的PSC为常规分离方法(如直接或一次贴壁法)的8～12倍以上。

②得到高纯度PSC的时间短：该方法为15天左右，报道的时间为21～24天，比目前报道的时间缩短了4～8天，这对于治疗急性病更有利。

2、方法二，PSC3445还能够采取目前的常规方法进行制备，具体包括如下步骤：

分离单个核细胞的同时，将单个核细胞配成一定浓度的细胞溶液接种到含有Potentculture培养试剂中，置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养5～7天，弃去未贴壁细胞，更换新的Potentculture培养试剂继续培养贴壁细胞，也能够得到PSC3445。

(四)PSC3445的用途

成体干细胞存在于多种组织，现已能够从成体的不同组织中获得成体干细胞，并且在特定的组织微环境或合适的体外培养条件下，成体干细胞可按预定的目标定向分化为某种组织特异的功能细胞，如不同组织来源的成体干细胞被诱导成为同一功能细胞，或者是同一种成体干细胞被诱导成为不同培层来源的功能细胞；而且研究已证实成体干细胞在适当的条件下可以诱导为肝细胞、成骨细胞、胰岛细胞、神经样细胞、心肌细胞等各种细胞。因此，不论何种组织器官受损都能够使用体内原位或异位获得的成体干细胞进行治疗。

本发明发现的PSC3445是使用新的细胞培养试剂Potentculture培养试剂和新的细胞培养方法先养后贴法得到的，研究和实验数据已证实，PSC3445是一种新的存在于血液中的成体干细胞，性质稳定，成活度高，实现了体外高度纯化和体外大量、高速扩增，还实现了体外定向诱导分化，解决了成体干细胞实际应用时的技术瓶颈，使PSC3445的全面推广应用即将成为现实。

目前，PSC3445主要包括四个方面的重要应用：

一是用于制备修复重建时移植所用的药物。组织器官缺损需要移植修补，终末器官衰竭需要移植替代，各种退行性疾病需要功能重建和细胞再生，成体干细胞及以它为基础的人工细胞、组织和器官移植是解决上述问题的最理想策略之一(Kondo T，Raff M.Oligodendrocyte precursor cells reprogrammed to become multipotential CNS stem cells.Science，2000；289(5 485)：1 754)。因此，PSC3445作为成体干细胞同样能够用于制备治疗这类疾病的药物，其移植是目前成体干细胞实际应用的优选方案。

二是用于制备构建人工组织的药物。真正意义上的人工组织是有正常结构及功能，活性细胞是实现生物学功能的关键因素，成体干细胞则是构建人体生物组织的种子细胞。以干细胞为种子细胞的人皮肤、骨、肌腱、血管、角膜、肌肉和神经等正在实验室形成(Zuk PA，Zhu M，Mizuno H，et al.Multiline age cells from human adipose tissue：Implications forcell-based therapies.Tissue Engi-neering，2001；7(2)：211和Clarke DL，Johansson CB，WilbertzJ，et al.Generalized potential ofadult stem cells.Science，2000；288(5547)：1660)。不久的将来，自体成体干细胞来源的人工组织将进入临床。因此，PSC3445作为成体干细胞同样能够作为组织构建的种子细胞，用于制备构建人工组织的药物。

三是用于制备抗衰老的药物。随着年龄的增长，成体干细胞的数量减少，自我更新和分化能力下降。成体干细胞活性下降，组织细胞更新缓慢是衰老的重要原因，成体干细胞是组织细胞更新的关键因素，设法恢复或增强老年人成体干细胞功能将是抗衰老的有效措施。因此，作为成体干细胞，PSC3445移植也是彻底治愈这类疾病的首选方案。

四是用于制备提高造血功能的药物。本发明的研究和实验数据还显示，PSC3445能分泌大量的IL-6。由于IL-6具有强化益血功能，能够促进肌体应急性反应，提高人体免疫功能，现已用于造血障碍或化疗后引起的造血功能低下的治疗以及提高免疫力。因此，PSC3445还能用于制备治疗造血障碍或化疗后引起的造血功能低下及提高免疫力等方面的药物。

此外，现有的研究还表明，成体干细胞如骨髓MSC可作为某些基因的载体如骨形成蛋白(BMP)、LacZ以及IL-3等基因的载体，在基因治疗某些疾病如骨损伤以及造血障碍等方面具有良好的效果(K.DANIEL RIEW，MD，JUEREN LOU，MD，NEILL M.ThoracoscopicIntradiscal Spine Fusion Using a Minimally Invasive Gene-Therapy Technique.THE JOURNALOF BONE AND JOINT SURGERY 2003，85(5)：866 Mosca JD，Hendricks JK，Buyaner D etal.Mesenchymal stem cells as vehicles for gene delivery.Clin Orthop 2000，379 Suppl：S71～90)。因此，PSC3445作为成体干细胞同样能够作为基因载体用于制备治疗某些疾病的药物。

附图说明

图1为倒置显微镜下PSC3445的细胞形态(放大100倍)；

图2为旋涡生长的PSC3445(放大40倍)；

图3为散在生长的PSC3445(放大200倍)；

图4为融合的骨髓MSC(放大200倍)；

图5为PSC3445电镜下形态(周边有纤毛)；

图6为PSC3445电镜下细胞核及核仁；

图7为PSC3445生长不同时期胞浆中的颗粒；

图8为外周血单核细胞电镜下的形态；

图9为PSC3445 ORO染色结果(放大1000倍，箭头所指处为阳性结果处)；

图10为PSC3445 POX染色结果(放大1000倍)；

图11为PSC3445 PAS染色结果(放大400倍)；

图12为PSC3445 Alk.P染色结果(放大400倍，箭头所指为处阳性结果处)；

图13为PSC3445AP染色结果；

图14为PSC3445瑞氏染色结果)；

图15为PSC3445经IL-2诱导后细胞的流式细胞图；

图16为PSC3445经IL-2诱导后细胞的流式细胞图；

图17为PSC3445经IL-2诱导后瑞氏染色结果(放大1000倍；

图18为PSC3445经EGF诱导后CAM5.2组化染色结果(放大1000倍)；

图19为PSC3445经EGF诱导后EMA组化染色结果(放大1000倍)；

图20为PSC3445经EGF诱导后P63组化染色结果(放大1000倍)；

图21为PSC3445经NGF诱导后的细胞形态(放大200倍)；

图22为PSC3445经NGF诱导后细胞NSE染色结果(放大400倍)；

图23为细胞周期分析流式细胞图。

具体实施方式

本发明公开新的成体干细胞及其培养方法和该细胞在制备有关药物中的应用，以满足人们的需要。

(一)Potentculture培养试剂

1000ml的Potentculture培养试剂的具体含量如下：

1、氨基酸类：                      1400～1800mg

(1)8种必需氨基酸                   450～650mg

包括异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、苏氨酸和缬氨酸等。

(2)非必需氨基酸                    950～1150mg

包括丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸等。

2、无机盐类：                   10000～15000mg

包括CaCl₂、Fe(NO₃)₃·9H₂O、KCl、MgSO₄·7H₂O、NaCl、NaHCO₃和NaH₂PO₄·2H₂O等。

3、维生素及脂类                 30～60mg

包括抗坏血酸、生物素、氧化胆盐、叶酸、肌醇、菸酰胺、吡哆醛、核黄素、硫氨酸、维生素B12、偏多酸钙等。

3、核酸类：                     40～70mg

包括腺苷、胞嘧啶核苷、脱氧腺苷、脱氧胞嘧啶核苷、脱氧鸟嘌呤核苷、鸟苷、胸腺嘧啶和尿嘧啶等。

4、葡萄糖：                     800～1500mg

5、其它成分：                   120～170mg

包括葡萄糖硫辛酸、酚红和丙酮酸盐。

6、血浆或血清类：               200～600ml

包括人血浆、马血清和牛血清等。

使用Potentculture培养试剂培养细胞的优点是：

①本培养试剂具有筛选作用：所得细胞纯度高，能够得到非常均一的条梭状细胞，而我们对报道方法重复实验结果看，所得到的细胞至少在两种以上；

②分离成功率高：每份脐血均可分离出PSC。而国外报道，大约只有25％的脐血中能够分离出MSC。

(二)PSC3445的培养方法

下面，进一步细化和阐述方法一的具体操作：

主要试剂的来源：新生马血清、无钙镁Hank’s液均购自美国GIBCO公司，胎牛血清来源于杭州四季青公司，淋巴细胞分离液购自上海试剂二厂。

①脐血单个核细胞的分离：无菌条件下采集正常人新鲜脐带血(脐血)50～100ml(妇产科健康产妇)，肝素(50U/ml)抗凝；脐血收集后＜2h进行处理：新鲜脐血2500r·min^-1离心15min，取白膜层；再用含有2％胎牛血清的无钙镁Hank’s液按1∶3进行稀释，叠加在Ficoll-paque上层，3000r·min^-1离心15min，取单个核细胞层洗涤备用。

②PSC3445的纯化及扩增培养：将单个核细胞配成适当浓度的细胞溶液，并接种到Potentculture培养试剂中，接种浓度1×10⁶～1×10⁸个细胞/cm²置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养5～7天，弃去贴壁的细胞；将未贴壁的悬浮细胞移种到另一培养器皿如24孔板中，更换Potentculture培养试剂继续培养2～3天，所得的贴壁细胞中的成纤维样细胞即是所要筛选的PSC3445。

待PSC占培养面积的70～80％左右时，用含有0.1g％EDTA的0.125％胰蛋白酶消化，按1∶2传代，可得到大量扩增的高纯度的PSC3445。

(三)PSC3445的用途

表6、1999年以来发现的成体干细胞多能性实例

发表时间	作者	内容
			1999.011999.122000.012000.072000.10.2000.112000.112000.122001.042001.042001.052001.082001.082002.082003.03	Bjornson CRJackson KAEricesClarke RGalli RLagasse ELiechty KWShen CkZuk PALumelsky NKrause DSOrlic DToma JGHou LLZhao Y	神经干细胞→血细胞肌肉干细胞→血细胞脐血间质干细胞→脂肪细胞、成骨细胞神经干细胞→肝细胞神经干细胞→肌肉细胞造血干细胞→肝细胞骨髓间质干细胞→软骨、脂肪、肌肉、肺等组织胰腺来源的干细胞→肝细胞脂肪来源的干细胞→软骨细胞，肌肉细胞神经干细胞→胰岛细胞骨髓间质干细胞→多种器官的上皮细胞造血干细胞→肌肉细胞皮肤来源的干细胞→神经、肌肉、脂肪细胞脐血间质干细胞→神经样细胞外周血单个核细胞来源的PSC→神经样细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞、表皮细胞、肝细胞等

表6中所涉及的参考文献如下：

①Bjornson CR，Rietze RL，Reynolds BA，et al.Turning brain into blood：a hematopoieticfate adopted by adult neural stem cells in vivo.Science.1999 Jan 22；283(5401)：534-7.

②Jackson KA，Mi T，Goodell MA.Hematopoietic potential of stem cells isolated frommurine skeletal muscle.Proc Natl Acad Sci USA.1999 Dec 7；96(25)：14482-6.

③Clarke DL，Johansson CB，Wilbertz J，et al.Generalized potential of adult neural stemcells.Science.2000 Jun 2；288(5471)：1660-3.

④Galli R，Borello U，Gritti A，et al.Skeletal myogenic potential of human and mouseneural stem cells.Nat Neurosci.2000 Oct；3(10)：986-91.

⑤Lagasse E，Connors H，Al-Dhalimy M，et al.Purified hematopoietic stem cells candifferentiate into hepatocytes in vivo.Nat Med.2000 Nov；6(11)：1229-34.

⑥Liechty KW，MacKenzie TC，Shaaban AF，et al.Human mesenchymal stem cells engraftand demonstrate site-specific differentiation after in utero transplantation in sheep.Nat Med.2000 Nov；6(11)：1282-6.

⑦Zuk PA，Zhu M，Mizuno H，et al.Multilineage cells from human adipose tissue：implications for cell-based therapies.Tissue Eng.2001 Apr；7(2)：211-28

⑧Lumelsky N，Blondel O，Laeng P，et al.Differentiation of embryonic stem cells toinsulin-secreting structures similar to pancreatic islets.Science.2001 May 18；292(5520)：1389-94.Epub 2001 Apr 26.

⑨Krause DS，Theise ND，Collector MI，et al.Multi-organ，multi-lineage engraftment by asingle bone marrow-derived stem cell.Cell.2001 May 4；105(3)：369-77.

⑩Orlic D，Kajstura J，Chimenti S，et al.Mobilized bone marrow cells repair the infarctedheart，improving function and survival.Proc Natl Acad Sci U S A.2001 Aug 28；98(18)：10344-9.Epub 2001 Aug 14.

(11)Toma JG，Akhavan M，Fernandes KJ，et al.Isolation of multipotent adult stem cells fromthe dermis of mammalian skin.Nat Cell Biol.2001 Sep；3(9)：778-84.

从表6可以得出，一是成体干细胞存在于多种组织；二是不同组织来源的成体干细胞能够诱导成同一功能细胞，如神经干细胞、造血干细胞、胰腺来源的干细胞等均能够诱导成肝细胞；三是同一种成体干细胞也能够诱导成为不同培层来源的功能细胞，如外周血单个核细胞来源的PSC能够被分别诱导成为神经样细胞、T淋巴细胞、巨噬细胞、表皮细胞、肝细胞等。

MSC是目前研究最多、最具有代表性和分化倾向最多的成体干细胞之一，PSC3445同样具有与MSC相似的多向分化潜能，而且实现了体外定向诱导分化、体外高度纯化和体外大量、高速扩增，解决了其临床使用上的技术瓶颈，使其实际推广应用即将成为现实。下面以MSC的临床应用为依据和引导，进一步阐述PSC3445作为一种新的成体干细胞在临床上的具体应用。

MSC是具有向多种中胚层和神经外胚层来源的组织细胞分化的能力，已证实至少可向9种以上的成熟细胞分化，这些细胞包括肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、脂肪细胞、上皮细胞、神经细胞、肌肉细胞、肝细胞和肌腱细胞等，也可以分化为造血干细胞和基质细胞(Lagasse E，Connors H，Al-Dhalimy M，et al.Purified hematopoietic stem cellscan differentiate into hepatocytes in vivo.Nat Med，2000；6(11)：1229)。将单个MSC移植到小鼠骨髓组织中，发现它可以不但形成骨髓及血液细胞，而且可以进入肝、肺、皮肤、胃及肠等组织中，并分化为相应组织类型的成熟细胞(Liechty KW，Mackenzie TC，Shaaban AF，etal.Human mesenchymal stem cells engraft and demonstrate site-specific differentiation after inutero transplantation in sheep.Nat Med，2000；6(11)：1 282)；将MSC注射到心肌损伤的大鼠心肌组织中，可分化为心肌细胞，修复心肌损伤(Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.Science，1999；284(5 411)：143和Krause DS，Theise ND，Collector MI，et al.Multi-organ，muliti-lineage engraftment by asingle bone marrow-derived stem cell.Cell，2001；105(3)：369)；将人MSC移植到羊胚胎中，MSC可随胚胎发育进入多种组织中，发育分化为肌肉、皮肤、胸腺和脂肪等成熟细胞，显示出相应的组织特异性(Lagasse E，Connors H，Al-Dhalimy M，et al.Purified hematopoieticstem cells can differentiate into hepatocytes in vivo.Nat Med，2000；6(11)：1 229)。MSC分化多向性提示，它可能成为细胞治疗和组织器官构建的理想种子细胞。MSC体外培养具有黏附于塑料培养皿壁的能力，且易于分离，体外经过长期的连续培养和冷冻保存后，不会改变其分化潜能，因而可能成为一种组织替代治疗的细胞新来源。过去认为神经、肌肉等组织难以再生，现已从中分离获得成体干细胞，证实这些干细胞可以在其特定组织中更新受损的组织细胞。如果将神经干细胞和肌肉干细胞移植到丧失造血功能的小鼠体内，可以产生造血细胞，重建造血功能，提示这些细胞可以作为血液细胞的新来源(Jackson KA，Majka Sm，Wong H，et al.Regeneration of ischemic cardiac muscle and vascular endothelium by adult stemcells.J Clin Inverst，2001；107(11)：1 395)；造血干细胞是各种血液细胞的种子细胞，但移植到脑内可转变为神经细胞(Orlic D，Kajstuya J，Chimenti S，et al.Bone marrow cells regenerateinfarcted myocardium.Nature，2001；410(6 829)：701)，进入肝脏可分化为肝细胞，使肝脏恢复正常功能(Bjornson CR，Rietze RL，Reynolds BA，et al.Turning brain into blood：Ahematopoietic fate adopted by adult stem cells in vivo.Science，1999；283(5 401)：534)；因此，成体干细胞有可能成为退行性脑病变和肝损伤功能重建的新型起源细胞。皮肤干细胞除再生皮肤细胞外，也可以转变为神经元、平滑肌、脂肪和胶质细胞等，神经干细胞移植到肌肉组织也同样可以分化为肌肉细胞。此外，在体外培养条件下，少突胶质细胞的前体在特定情况时可发生重新规化(reprogramm)而形成多能神经干细胞，后者则可分化成为神经原细胞，这一发现不仅为获得神经干细胞提供了又一新途径，而且提示细胞分化的机制十分复杂，干细胞可能具有惊人的分化潜能(Mezey E，Chandross KJ.Bone marrow；A possiblealternative source of cells in the adult nervous system.Eur J Pharmacol，2000；405(1-3)：297)，其中角膜干细胞已在移植治疗中获得成功。

最近，在肥胖患者的脂肪组织中分离获得大量成体于细胞，证实这种成体干细胞具有与MSC相似的多向分化潜能，因此脂肪组织有可能成为体内最大的成体干细胞库，彻底解决干细胞来源困难的问题(Theise ND，Nimmakayalu M，Gardner R，et al.Liver from bonemarrow in humans.Hepatology，2000；32(1)：11)。类似地，PSC3445实现了体外高度纯化和体外大量、高速扩增，因此，PSC3445也是解决当前干细胞来源困难问题的方案之一。

成体干细胞在修复重建中的应用。临床严重创伤等引起的组织缺损，依靠自体自然修复能力难以恢复正常的组织结构与功能，需要进行移植治疗。现代外科技术已经有了较大的发展，移植技术本身并不存在大的困难，关键是获得理想的移植材料。成体干细胞、胚胎干细胞、治疗性克隆以及以干细胞为种子细胞的生物组织工程技术的发展，已为临床修复重建治疗开辟了全新的领域。从分化潜能看，胚胎干细胞是最具有临床应用前景的种子细胞，但目前存在的问题是材料来源困难，体外培养的胚胎干细胞生长缓慢，分化机制不清，定向诱导远还存在许多技术问题。胚胎干细胞来源的移植材料用于临床还存在免疫排斥问题，甚至可能有发生肿瘤的隐患。与胚胎干细胞相比，成体干细胞具有离成熟细胞距离较近、来源丰富、可塑性强及具有多向分化潜能等特点，最大特色是可实现个体化治疗，无免疫排斥问题，在临床应用方面显示出真正的希望。成体干细胞的临床应用几乎涉及目前临床医学面临的所有医学难题。组织器官缺损需要移植修补，终末器官衰竭需要移植替代，各种退行性疾病如肝硬化和糖尿病等需要功能重建和细胞再生，成体干细胞及以它为基础的人工细胞、组织和器官移植是解决上述问题的最理想策略之一。成体干细胞工程技术可用于所有组织器官的修复重建，如皮肤创面植皮、组织缺损修补、关节置换、血管替代、心脏瓣膜置换、组织或器官的替代、糖尿病患者的胰岛植入、终末脏器损伤或功能衰竭的置换等。成体干细胞及其衍生组织器官将产生一种全新的治疗技术，给现代医学带来革命性的变化，临床常见的许多“不治之症”将有可能通过成体干细胞及其衍生物移植而得到有效治疗。由于成体干细胞具有多向分化潜能，并存在于多种组织中，因此便于从患者自体获得成体干细胞，经体外扩增和诱导处理移植到靶组织中发挥作用。

目前，成体干细胞研究成果已经提示其在临床治疗方面有广阔的应用前景：如脑组织、嗅球神经的成体干细胞直接移植到骨髓、皮肤、脂肪等组织；成体干细胞体外诱导为神经或神经前体细胞移植治疗帕金森氏病、老年性痴呆和脑损伤等神经系统疾病；骨髓、肝组织成体干细胞治疗骨胳肌、心肌损伤；骨髓来源成体干细胞重建肝功能；皮肤、骨髓组织成体干细胞治疗皮肤损伤；角膜缘成体干细胞移植治疗角膜病；骨髓、肌组织成体干细胞移植治疗心肌损伤；胰岛成体干细胞移植治疗糖尿病。

成体干细胞的另一重要用途是用于人工组织构建。真正意义上的人工组织是有正常结构及功能，活性细胞是实现生物学功能的关键因素，成体干细胞则是构建人体生物组织的种子细胞。以干细胞为种子细胞的人皮肤、骨、肌腱、血管、角膜、肌肉和神经等正在实验室形成。其中，组织工程人工皮研究已取得突破性进展，并已应用于临床。目前，利用组织工程技术再造组织和器官，总的来讲还是结构比较单一的器官或器官的一部分，对于结构十分复杂的组织，如肝、肢体等尚有一定距离，但现代生物技术的发展相当迅速，不久的将来，自体成体干细胞来源的人工组织将进入临床。

基于成体干细胞的功能重建技术还可用于抗衰老治疗。随着年龄的增长，成体干细胞的数量减少，自我更新和分化能力下降。成体干细胞活性下降，组织细胞更新缓慢是衰老的重要原因，设法恢复或增强老年人成体干细胞功能将是抗衰老的有效措施。

另外，新近研究发现，肿瘤的发生与成体干细胞密切相关，证据是肿瘤细胞中存在肿瘤干细胞，某些肿瘤起源于肿瘤干细胞(Bicmco P，Robey PG.Stem cells tissue engineering.Nature，2001；414(6859)：118)。这类细胞具有长期生存和克隆扩增的能力，这两种细胞的自我更新调节机制具有一致性。在临床肿瘤治疗中，肿瘤性成体干细胞对抗肿瘤药物不敏感可能是治疗失败和复发的重要原因，在干细胞水平消除肿瘤性细胞才能彻底根治肿瘤(RaoMS，Mttson MP.Stem cells and aging：Expanding the possibilities.Mech Ageing Dev，2001；122(1)：713和Reya T，Morrison SJ，Clarke MF，et al.Stem cells，cancer，and cancer stem cells.Nature，2001；414(6859)：105)。

能够用于制备提高造血功能的药物。本发明的研究和实验数据还显示，PSC3445能分泌大量的IL-6。由于IL-6具有强化益血功能和抗癌作用，能够促进肌体应急性反应，提高人体免疫功能，现已用于造血障碍或化疗后引起的造血功能低下、提高免疫力以及广泛的抗癌治疗。骨髓、外周血、脐血、肌肉和神经等组织的成体干细胞移植重建造血免疫功能。因此，PSC3445还能用于制备治疗造血障碍或化疗后引起的造血功能低下、提高免疫力及抗癌等方面的药物。

本发明培养的新细胞PSC3445是成体干细胞，在IL-2、NGF、LPS、EGF等诱导剂的诱导下能够定向分化为T淋巴细胞、神经样细胞、巨噬细胞、表皮细胞等功能细胞，实现了细胞培养的四种定向诱导，具体诱导过程如下：

①淋巴细胞的定向诱导

将培养数天的脐血来源的PCS3445，更换用含胎牛血清、IL-2的α-MEM进行诱导，同时设对照组(不加IL-2和不更换培养试剂两个对照组)。定期补液一次，补液时保持IL-2的浓度不变。诱导数天后，PSC3445变为悬浮生长的细胞，采用流式细胞仪检测与形态学观察，悬浮的细胞即为CD3⁺CD4⁺或CD3⁺CD8⁺的T淋巴细胞。

②巨噬细胞的定向诱导

将培养数天的生长旺盛的脐血来源的PCS3445，用含胎牛血清、LPS的MEM进行诱导。定期补液一次，补液时保持LPS的浓度不变。采用流式细胞仪检测与诱导后细胞因子如IL-6、IL-8、IL-10、TNF等的检测，发现PSC3445已被诱导成为巨噬细胞。

③神经样细胞的定向诱导

将培养数天的脐血来源的PCS3445，更换用含胎牛血清、NGF的α-MEM进行诱导，同时设对照组(不加NGF的对照组，不更换培养试剂的两个对照组)。数天后，PSC3445在形态上变为神经样细胞，NSE染色呈阳性反应，说明PSC3445已在NGF的作用下被诱导成神经样细胞。

④表皮细胞的定向诱导

将培养数天的脐血来源的PCS，用含胎牛血清、EGF的MEM进行诱导，定期补液一次，补液时保持EGF的浓度不变。数天后，组织化学染色显示CAM5.2、EMA、P63均为阳性，说明PSC3445已被诱导成为表皮细胞。

根据目前的研究和临床实践证实，T淋巴细胞为免疫细胞，成体肝细胞诱导的CD8⁺阳性的T淋巴细胞对肿瘤细胞、体内衰老的细胞具有杀伤作用，成体肝细胞诱导的CD4⁺阳性的T淋巴细胞具有辅助免疫辅助功能，因此，T淋巴细胞对于治疗免疫功能低下的患者具有良好的效果。成体肝细胞诱导的神经样细胞目前主要用于帕杰森综合征等神经性损伤疾病的治疗。巨噬细胞为抗原提呈细胞，对于启动免疫应答具有重要的作用，因此，成体肝细胞诱导的巨噬细胞能够用于某些癌症病人的治疗，如结肠癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌等。

该成体干细胞能够在适当的条件下与许多生物化学物质作用生成组合物，无论这些生物化学物质是否具有生物活性或具有治疗疾病的功能，这些生物化学物质是包括医药学上可接受的载体、天然产物、化学合成药物或人类用药等中的一种；优选包括医药学上可接受的载体。

所说的载体包括赋形剂，如淀粉、水等；润滑剂，如硬脂酸镁等；崩解剂，如微晶纤维素等；填充剂，如乳糖等；粘接剂，如预胶化淀粉、糊精等。

该成体干细胞及其组合物均能用于制备治疗所述疾病的药物。所述及的该成体干细胞能够单独施用于需要治疗的患者，还能够以组合物的形式即将治疗有效量的该成体干细胞和以上所述的生物化学物质形成的组合物，施用于需要治疗的患者。所述的药物是指含有本发明方法所获得的成体干细胞PSC3445和常规载体及助剂组成的药物制剂，包含仅有用本发明方法所获得的PSC3445的药物制剂，或者是以本发明方法所获得的PSC3445作为活性成分与传统的辅剂和添加物一起组成的药物制剂，能够采用本领域公知的方法制成各种剂型，剂型包括含服制剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、注射剂及其他非肠道给药组合物，采取注射(包括静脉注射、静脉滴注、肌肉注射、皮下注射)等给药途径进行某疾病的治疗。以上所述剂型中优选溶液剂、注射剂，进一步优选注射剂。

对于液体制剂如混悬剂、乳剂、溶液剂、注射剂等的制备，所选用敷料包括任何常用的敷料如环糊精化合物、乙二醇、丙二醇、吐温、乙醇、油等均可在低于产生刺激剂量下选用，还可以加入适当的酸或碱以及缓冲溶液如柠檬酸及磷酸缓冲液以保证生物化学物质的稳定性；为保证液体制剂的等渗性质，还可以选用氯化钠、甘露醇、葡萄糖等加入，另外还可加入防腐剂。

注射针剂含有本发明PSC3445，优选以无菌冻干物储存。在给药前与合适的等渗溶液混合，等渗溶液包括传统的适于注射或注入的等渗水系统，其中含有用于注射液的普通添加物如稳定剂和促溶剂，优选生理盐水或通过缓冲液调成的等渗溶液。

含服制剂及其他非肠道给药组合物含有本发明PSC3445，包括本发明PSC3445与普通添加物如惰性稀释剂、稳定剂、乳化剂、润滑剂等混合，并用已知方法进行制备的剂型等。

用于患者时，该成体干细胞的使用有两种情况，一是全身使用，一般的要求量为10⁶个细胞/kg·d；二是局部使用，可根据收获的细胞数而定，量高效果相对要好，一般为10⁶～10⁷个细胞/kg·d均可。该剂量或用量，通常还要根据患者的年龄和体重以及症状的状况决定。

下面通过实施例具体说明本发明的内容，以下所述的实例是为了更好地阐述本发明，并不是用来限制本发明的范围。

实施例1、Potentculture培养试剂的配方

1000ml的Potentculture培养试剂的具体组成和含量如下：

①氨基酸类：                             1682.9mg

以下所述的氨基酸产品未标记来源的，均来自美国Gibico公司。

A.8种必需氨基酸                          592.4mg

包括94.4mg的L-异亮氨酸(货号22405013，纯度＞99％)、94.4mg的L-亮氨酸(货号12424016，纯度＞99％)、131.6mg的L-赖氨酸(货号12407011，纯度＞99％)、26.9mg的蛋氨酸(美国Sigma公司，货号9625，纯度98％)、59.4mg的L-苯丙氨酸(货号12409017，纯度＞99％)、15.7mg的L-色氨酸(货号12432019，纯度＞99％)、85.7mg的L-苏氨酸(货号12410015，纯度＞99％)和84.3mg的L-缬氨酸(货号12413019，纯度＞99％)。

B.非必需氨基酸                           1090.5mg

包括15mg的L-丙氨酸(货号21002019，纯度＞99％)、126.2mg的L-精氨酸(货号12401014，纯度＞99％)、30mg的L-天冬酰胺(货号12416012，纯度＞99％)、18mg的L-天冬氨酸(货号12417010，纯度＞99％)、60mg的L-半胱氨酸(货号11033016，纯度＞99％)、43.2mg的L-胱氨酸(货号12402012，纯度＞99％)、45mg的L-谷氨酸(货号11048014，纯度＞99％)、48mg的L-甘氨酸(货号12421012，纯度＞99％)、525.6mg的L-谷氨酰胺(货号21051024，纯度＞99％)、50.4mg的L-组氨酸(货号12422010，纯度＞99％)、24mg的L-脯氨酸(货号21096029，纯度＞99％)、40.2mg的L-丝氨酸(货号22430011，纯度＞99％)和64.9mg的L-酪氨酸(货号12412011，纯度＞99％)。

②无机盐类：                         12479.9mg

包括240mg的CaCl₂(中国天津登峰化学试剂厂，分析纯，纯度≥98％)、0.06mg的Fe(NO₃)₃·9H₂O(中国大港亿中化工厂，分析纯，纯度＞98％)、480mg的KC1(中国天津市四通化工厂，分析纯，纯度≥99.5％)、240mg的MgSO₄·7H₂O(中国天津登峰化学试剂厂，分析纯，纯度≥98％)、7920mg的NaCl(中国天津市四通化工厂，分析纯，纯度≥99.5％)、3420mg的NaHCO₃(中国河南焦作化工三厂，分析纯，纯度≥99％)和179.8mg的NaH₂PO₄·2H₂O(中国上海化学试剂总厂所属上海试剂二厂，优级纯，纯度≥99.9％)。

③维生素和脂类：                      54.7mg

以下所述的维生素和脂类产品未标记来源的，均来自美国Sigma公司。

30mg的抗坏血酸(货号7631，纯度＞99％)、0.06mg的D-生物素(货号4501，纯度＞99％)、0.8mg的维生素B₁₂(美国Gibico公司，货号13100011，纯度＞99％)、3mg的吡哆醛(货号9755，纯度＞99％)、0.3mg的核黄素(货号4500，纯度＞99％)、3mg偏多酸钙(货号2625)、3mg氧化胆碱(货号7527，纯度＞98％)、3mg叶酸(货号8758，纯度98％)、5.5mg肌醇(货号7508，纯度99％)、3mg菸酰胺(货号0636，纯度95％)、3mg硫氨酸(货号3902，纯度97％)。

④核酸类：                    48mg

以下所述的核酸类产品未标记来源的，均来自美国Sigma公司。

包括6mg的腺苷(货号9251，纯度＞99％)、6mg的胞嘧啶核苷(货号4654，纯度≥99％)、6mg的脱氧腺苷(货号8668，纯度99％～100％)、6mg的脱氧胞嘧啶核苷(货号0776，纯度95％～98％)、6mg的脱氧鸟嘌呤核苷(货号0991，纯度99％～100％)、6mg的鸟苷(货号6264，纯度98％)、6mg的胸腺嘧啶(美国Gibico公司，货号16495038，纯度＞99％)和6mg的尿嘧啶(货号3750，纯度＞99％)。

⑤葡萄糖：                    1200mg

来源：中国天津登峰化学试剂厂，分析纯，纯度≥98％。

⑥其它成分：                  147.1mg

包括0.12mg的葡萄糖硫辛酸(美国Sigma公司，货号1395，纯度99％)、15mg的酚红(美国Gibico公司，货号11160025，纯度＞99％)和132mg的丙酮酸盐(美国Sigma公司，货号5194)。

⑦血浆或血清类：              400ml

400ml血浆(三份脐血混合血浆)。

将本发明所配置的Potentculture基础培养试剂与其他的细胞培养试剂进行比较，能够发现在组分和含量方面均有明显差异(表8)，组分更加全面，并调整了组分的含量，使其渗透压明显高于其他的细胞培养试剂的渗透压(表7)，从而达到了所期望的筛选细胞的目的。

         表7、Potentculture培养试剂与其他部分细胞培养试剂在渗透压方面的比较

组  别	吸光度实际测定值(单位：A)				渗透势(单位：Pma)	毫渗压(单位：mosmol/L)
							第1次	第2次	第3次	均值
	Potentculture培养试剂L-DMEM培养试剂A-MEM培养试剂RPMI 1640培养试剂MesencultTM培养试剂	0.4890.3020.3030.3010.302	0.4830.3070.3080.3000.305	0.4820.3050.3020.3010.306							0.4840.3050.3040.3010.305	1.2050.7570.7500.7470.750	480300298296299

     表8、Potentculture基础培养试剂与其他部分细胞培养试剂在组分和含量方面的比较

成    分	L-DMEM	α-MEM	RPMI1640	Potentculture
					氨基酸类
丙氨酸(L-alanine)		25		15
					精氨酸(L-arginine)	84	126.4	200	126.2
天冬酰胺(L-asparagine)		50	50	30
					天冬氨酸(L-aspartic acid)		30	20	18
半胱氨酸(L-cysteine·HCL·H2O)		100	50	60
					胱氨酸(L-cysteine)	48	24		43.2
谷氨酸(L-glutamic acid)		75	20	45
					谷氨酰胺(L-glutamic)	584	292	300	525.6
甘氨酸(glycine)	30	50	10	48
					组氨酸(L-histidine·HCL·H2O)	42	42	15	50.4
异亮氨酸(L-isoleucine)	104.8	52.5	50	94.4
					亮氨酸(L-leucine)	104.8	52.5	50	94.4
赖氨酸(L-lysine·HCL)	146.2	73.1	40	131.6
					蛋氨酸(L-methionine)	30	14.9	15	26.9
苯丙氨酸(L-phenylalanine)	66	33.02	15	59.4
					脯氨酸(L-proline)		40	20	24
丝氨酸(L-serine)	42	25	30	40.2
					苏氨酸(L-threonine)	95.2	47.64	20	85.7
色氨酸(L-tryptophan)	16	10.2	5	15.7
					酪氨酸(L-tyrosine)	72	36.22	20	64.9
缬氨酸(L-valine)	93.6	46.9	20	84.3
					无机盐类
CaCl2	200	200	100	240
					Fe(NO3)3·9H2O	0.1			0.06
KCl	400	400	400	480
					MgSO4·7H2O	200	200	100	240
NaCl	6400	6800	6000	7920
					NaHCO3	3700	2000	2200	3420
NaH2PO4·2H2O	141.3	158.3		179.8
					核酸类
腺苷(Adenosine)		10		6
					胞嘧啶核苷(ctytidine)		10		6
脱氧腺苷(deoxyadenosine)		10		6
					脱氧胞嘧啶核苷(deoxycytidine)		10		6
脱氧鸟嘌呤核苷(dexyguanosine)		10		6
					还原型谷胱甘肽(glutathione reduced)			1
胸腺嘧啶(thymidine)		10		6
					尿嘧啶(uridine)		10		6

成    分	L-DMEM	α-MEM	RPMI1640	Potentculture
					鸟苷(guanosine)		10		6
维生素和脂类
					抗坏血酸(L-ascorbic acid)		50		30
生物素(biotin)
					偏多酸钙(D-Ca pantothenate)	4	1	0.25	3
氧化胆碱(choline chloride)	4	1	3	3
					叶酸(folic acid)	4	1	1	3
肌醇(I-inositol)	7.2	2	35	5.5
					菸酰胺(nicotinamide)	4	1	1	3
吡哆醛(pyridoxal-HCL)	4	1	1	3
					核黄素(riboflavin)	0.4	0.1	0.2	0.3
硫氨酸(thiamine HCL)	4	1	1	3
					维生素B12(vitamin B12)		1.36	0.005	0.8
葡萄糖(glucose)	1000	1000	2000	1200
					其它成分
硫辛酸(lipoic acid)		0.2		0.1
					酚红(sodium phenol red)	15	10	5	15
丙酮酸盐(pyruvate)	110	110		132

实施例2、PSC3445的培养方法

(1)主要试剂的来源：新生马血清、无钙镁Hank’s液均购自美国GIBCO公司，胎牛血清来源于杭州四季青公司，淋巴细胞分离液购自上海试剂二厂。

①脐血单个核细胞的分离：无菌条件下采集正常人新鲜脐血80ml(妇产科健康产妇)，肝素(50U/ml)抗凝；脐血收集后2h内进行处理：新鲜脐血2500r·min^-1离心15min，取白膜层(白细胞层)；再用含有2％胎牛血清的无钙镁Hank’s液按1∶3进行稀释，叠加在Ficoll-paque上层，3000r·min^-1离心15min，取单个核细胞层，用含有2％胎牛血清的无钙镁Hank’s液洗涤备用。

②PSC3445的纯化及扩增培养：将单个核细胞配成适当浓度的细胞溶液，并接种到Potentculture培养试剂(见实施例1)中，接种浓度1×10⁷个细胞/cm²；置于37℃、5％CO₂、80％相对湿度的培养箱中培养6天，首先贴壁的为成熟的单核细胞，其形态主要为圆形或不规则形，弃去该贴壁的细胞；将未贴壁的悬浮细胞移种到24孔塑料培养板中，更换Potentculture培养试剂继续培养2天，所得的贴壁细胞中的成纤维样细胞即是所要筛选的PSC3445。

③待PSC3445占培养面积的75％时，用含有0.1g％EDTA的0.125％胰酶消化，按1∶2传代，可得到大量扩增的高纯度的PSC3445。

(2)脐血PSC增殖与周期分析

将培养6～7d的未贴壁脐血单个核细胞转种至24孔培养板，继续培养1～2d，移去未贴壁细胞同时换新的培养试剂，计数10份脐血中的随机10个培养孔，每孔计数10个高倍视野的条梭状细胞。依次于换液后0d，第1d、第2d、……、第9d的成纤维状细胞数，取平均值，根据所得细胞数绘制细胞增殖曲线(方法参照司徒镇强主编的细胞培养)。在换液后第4～5d将细胞消化，经Hank’s洗涤后，经流式细胞仪(上海华舜)测定PSC细胞周期。

实施例3、PSC3445的定向诱导

本发明PSC3445培养10～12天后，加适当的诱导剂进行诱导。PSC3445在四种诱导剂诱导下的具体诱导过程和结果如下：

①淋巴细胞的定向诱导

将培养10～12天的脐血来源的PSC3445，更换用含10％胎牛血清、300U/ml的IL-2的α-MEM进行诱导，同时设对照组(不加IL-2和不更换培养试剂两对照组)。每三天补液一次，补液时IL-2浓度仍为300U/ml。诱导7～10天后PSC3445变为悬浮生长的细胞，经流式细胞仪检测与形态学观察悬浮的细胞为CD3⁺CD4⁺或CD3⁺CD8⁺的T淋巴细胞。

②巨噬细胞的定向诱导

将培养10～12天的生长旺盛的脐血来源的PSC3445，用含10％胎牛血清的MEM加入500ng/ml的LPS进行诱导，每三天补液一次，补液时LPS浓度仍为500ng/ml。经流式细胞仪检测与诱导后细胞因子如IL-6、IL-8、IL-10、TNF等的检测，发现PSC3445已被诱导成为巨噬细胞。

③神经样细胞的定向诱导

将培养10～12天的脐血来源的PSC3445，更换用含10％胎牛血清，200ng/ml NGF的α-MEM进行诱导，同时设对照组。经7天左右的诱导后，PSC3445在形态上已变为神经样细胞，NSE染色呈阳性反应，说明PSC3445已在NGF的作用下诱导成神经样细胞。

④表皮细胞的定向诱导

将培养10～12天的脐血来源的PSC3445，用含10％胎牛血清的MEM加入200ng/mlEGF进行诱导，每三天补液一次，补液时EGF浓度仍为200ng/ml。组织化学染色显示CAM5.2、EMA、P63均为阳性，说明PSC3445已被诱导成为表皮细胞。

Claims (25)

1.一种成体干细胞，其特征在于，该细胞具有高度自我复制能力和多系分化能力，其细胞培养特性、生长特性、形态学特性和生物学特性均不同于现有成体干细胞，包括如下特征：

①该细胞传10代以上，其细胞形态及表面标志物不发生变化；

②该细胞经诱导剂诱导后，分化为多种不同胚层来源的细胞，包括T淋巴细胞、巨噬细胞、表皮细胞和神经样细胞；

③该细胞是成纤维样细胞，在培养后能大量扩增，呈漩涡状生长，且不出现融合现象；

④该细胞在投射电镜下的特征是细胞周边有许多纤毛，细胞核为圆形或卵圆形，部分细胞核仁明显，细胞成熟后，胞浆中的颗粒逐渐增大；

⑤该细胞的表面标志物包括HLA-DR、CD34、CD14、CD90、CD11b和CD105，与骨髓及血液来源的间质干细胞或多潜能干细胞的表面标志物不完全相同；

⑥该细胞的特殊化学染色与脐血间质干细胞不同。

2.根据权利要求1所述的成体干细胞的培养方法，包括如下步骤：

①常规方法分离出单个核细胞，其中使用的培养试剂是Potentculture培养试剂；

②将单个核细胞进行稀释，得细胞溶液；

③将该细胞溶液接种到含有Potentculture培养试剂的器皿中，进行培养；

④弃去未贴壁的细胞，更换新的Potentculture培养试剂继续培养贴壁的细胞，即得该细胞；

所述的Potentculture培养试剂各组分及配比是：1000ml的该细胞培养试剂主要包括1400～1800mg氨基酸类、10000～15000mg无机盐类、30～60mg维生素及脂类、40～70mg核酸类、1000～1400mg葡萄糖类、120～170mg其它成分以及200～600ml血浆或血清类组分。

3.根据权利要求1所述的成体干细胞的培养方法，包括如下步骤：

①常规方法分离出单个核细胞，其中使用的培养试剂是Potentculture培养试剂；

②将单个核细胞进行稀释，得细胞溶液；

③将该细胞溶液接种到含有Potentculture培养试剂的器皿中，进行培养；

④弃去贴壁的细胞，将未贴壁的细胞移种到另一培养器皿中再培养，更换新的Potentculture培养试剂继续培养贴壁的细胞，即得该细胞；

所述的Potentculture培养试剂各组分及配比是：1000ml的该细胞培养试剂主要包括1400～1800mg氨基酸类、10000～15000mg无机盐类、30～60mg维生素及脂类、40～70mg核酸类、1000～1400mg葡萄糖类、120～170mg其它成分以及200～600ml血浆或血清类组分。

4.根据权利要求1所述的成体干细胞的培养方法，包括如下步骤：

①常规方法分离出单个核细胞，其中使用的培养试剂是Potentculture培养试剂；

②将单个核细胞进行稀释，得细胞溶液；

③将该细胞溶液接种到含有Potentculture培养试剂的器皿中，进行培养；

④更换Potentculture培养试剂，继续培养贴壁细胞；同时，保留未贴壁的悬浮细胞，将其移种到另一培养器皿中，使用Potentculture培养试剂继续培养；对未贴壁细胞培养所得到的细胞溶液再进行分开培养，如此重复多次，即获得大量扩增的、高纯度的该细胞；

所述的Potentculture培养试剂各组分及配比是：1000ml的该细胞培养试剂主要包括1400～1800mg氨基酸类、10000～15000mg无机盐类、30～60mg维生素及脂类、40～70mg核酸类、1000～1400mg葡萄糖类、120～170mg其它成分以及200～600ml血浆或血清类组分。

5.根据权利要求2、3或4任一项所述的成体干细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤①的常规分离方法是：在无菌条件下采集正常新鲜皿或低温冻存血，加抗凝试剂抗凝，离心，取白膜层；再用含血清的Potentculture培养试剂或缓冲液叠加在单个核细胞的分离液上层进行稀释，再离心，取单个核细胞层洗涤备用。

6.根据权利要求2、3或4任一项所述的成体干细胞的培养方法，其特征在于，所述步骤③的培养条件是将培养器皿置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养5～7天。

7.根据权利要求2、3或4任一项所述的成体干细胞的培养方法，其特征在于，所述的Potentculture培养试剂各组分及配比是：1000ml的该细胞培养试剂包括1682.9mg氨基酸类、12479.9mg无机盐类、54.7mg维生素及脂类、48mg核酸类、1200mg葡萄糖、147.1mg其它成分以及300ml血浆和100ml血清的混合物或400ml血浆。

8.根据权利要求7所述的成体干细胞的培养方法，其特征在于，所述的Potentculture培养试剂各组分及配比是：1000ml的该细胞培养试剂包括94.4mg的L-异亮氨酸、94.4mg的L-亮氨酸、131.6mg的L-赖氨酸、26.9mg的蛋氨酸、59.4mg的L-苯丙氨酸、15.7mg的L-色氨酸、85.7mg的L-苏氨酸、84.3mg的L-缬氨酸、15mg的L-丙氨酸、126.2mg的L-精氨酸、30mg的L-天冬酰胺、18mg的L-天冬氨酸、60mg的L-半胱氨酸、43.2mg的L-胱氨酸、45mg的L-谷氨酸、48mg的L-甘氨酸、525.6mg的L-谷氨酰胺、50.4mg的L-组氨酸、24mg的L-脯氨酸、40.2mg的L-丝氨酸、64.9mg的L-酪氨酸、240mg的CaCl₂、0.06mg的Fe(NO₃)₃·9H₂O、480mg的KCl、240mg的MgSO₄·7H₂O、7920mg的NaCl、3420mg的NaHCO₃、179.8mg的NaH₂PO₄·2H₂O、30mg的抗坏血酸、0.06mg的D-生物素、0.8mg的维生素B₁₂、3mg的吡哆醛、0.3mg的核黄素、3mg偏多酸钙、3mg氧化胆碱、3mg叶酸、5.5mg肌醇、3mg菸酰胺、3mg硫氨酸、6mg的腺苷、6mg的胞嘧啶核苷、6mg的脱氧腺苷、6mg的脱氧胞嘧啶核苷、6mg的脱氧鸟嘌呤核苷、6mg的鸟苷、6mg的胸腺嘧啶、6mg的尿嘧啶、1200mg葡萄糖、0.12mg的葡萄糖硫辛酸、15mg的酚红、132mg的丙酮酸盐、三份脐血混合成的400ml血浆。

9.根据权利要求1所述的成体干细胞在制备修复重建药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的成体干细胞在制备修复重建药物中的应用，其特征在于，所述的修复重建是包括组织器官缺损的移植修补、终末器官衰竭的移植替代或退行性疾病的移植再生中的一种。

11.根据权利要求9或10所述的成体干细胞在制备修复重建药物中的应用，其特征在于，所述的组织器官缺损是包括皮肤创面植皮、组织缺损修补、关节置换、血管替代、心脏瓣膜置换、组织或器官的替代、糖尿病患者的胰岛植入或终末脏器损伤的置换中的一种。

12.根据权利要求9或10所述的成体干细胞在制备修复重建药物中的应用，其特征在于，所述的退行性疾病是包括肝硬化或糖尿病中的一种。

13.根据权利要求9或10所述的成体干细胞在制备修复重建药物中的应用，其特征在于，所述的修复重建药物还包括在治疗神经系统疾病中的应用。

14.根据权利要求13所述的成体干细胞在制备修复重建药物中的应用，其特征在于，所述的神经系统疾病是包括帕金森氏病、老年性痴呆或脑损伤中的一种。

15.根据权利要求1所述的成体干细胞在制备构建人工组织药物中的应用。

16.根据权利要求15所述的成体干细胞在制备构建人工组织药物中的应用，其特征在于，所述的人工组织是包括以该细胞为种子细胞的人皮肤、骨、肌腱、血管、角膜、肌肉或神经中的一种。

17.根据权利要求1所述的成体干细胞在制备抗衰老药物中的应用。

18.根据权利要求1所述的成体干细胞在制备治疗造血功能低下药物中的应用。

19.根据权利要求18所述的成体干细胞在制备治疗造血功能低下药物中的应用，其特征在于，所述的造血功能低下是包括造血障碍或化疗后引起的造血功能低下中的一种。

20.根据权利要求1所述的成体干细胞作为基因载体的应用。

21.根据权利要求20所述的成体干细胞作为基因载体的应用，其特征在于，所述的基因是包括骨形成蛋白、LacZ或IL-3中的一种。

22.根据权利要求20或21所述的成体干细胞作为基因载体的应用，其特征在于，所述的基因载体在治疗骨损伤或造血障碍中的应用。

23.根据权利要求1所述的成体干细胞在制备抗癌药物中的应用。

24.根据权利要求23所述的成体干细胞在制备抗癌药物中的应用，其特征在于，所述的癌症是包括结肠癌、肺癌、膀胱癌或卵巢癌中的一种。

25.根据权利要求1所述的成体干细胞在制备治疗免疫功能低下药物中的应用。

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