CN112708591A - 一种用于肌肉干细胞体外分化的化学成分明确的培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于肌肉干细胞体外分化的化学成分明确的培养基，即肌肉干细胞体外诱导分化的无血清的更高效、廉价的化学成分明确的培养基。该化学成分明确的培养基相较于现有的一般肌肉干细胞分化培养基，在分化第2天能够提高MYOG基因的相对表达量4.48倍，在分化第6天提高MYHC基因的相对表达量55.28倍，在终末分化阶段的细胞分化百分比从34.94％提高到57.93％，存在极显著差异，并且诱导分化形成的肌纤维更多、更粗、更长。该化学成分明确分化培养基的发明，进一步提高了肌肉干细胞的分化效率，为肌肉干细胞更高效地分化成肌管，为3D培养肌肉干细胞生产细胞培养肉提供了更高效、廉价的方法。

Description

一种用于肌肉干细胞体外分化的化学成分明确的培养基
技术领域
本发明属于干细胞和动物细胞培养肉技术领域，具体地，涉及一种用于肌肉干细胞体外分化的化学成分明确的培养基。
背景技术
细胞培养肉是依据动物肌肉生长修复机理，利用其干细胞进行体外培养而获得的肉类，它不需要经过动物养殖，直接用细胞工厂化生产肉类。细胞培养肉作为一种颠覆性肉类生产方式为补充未来肉类蛋白供应、实现肉类绿色生产提供了新的途径。根据测算，相较于传统的畜牧业，细胞培养肉产业能减少35％到60％的能耗、少占用98％的土地和少产生80％以上的温室气体。
肌肉干细胞又称卫星细胞，位于基底膜的下方，源自脊椎动物胚胎形成早期的中胚层，是骨骼肌再生的必要条件。肌肉损伤后，肌肉干细胞被激活进入细胞周期，并迅速增殖，大多数细胞进行分化融合形成肌纤维，少数细胞自我更新后恢复静息状态，以补充卫星细胞池。相似地，培养肉在体外生产过程需要种子细胞富集后进行诱导分化，促使大部分肌肉干细胞融合形成肌纤维，因此选择一种优良的细胞分化培养基是培养肉生产过程中的关键一环，直接影响肌管融合与蛋白产生。
目前普遍使用的体外肌肉干细胞诱导分化的培养基配方是DMEM基础培养基加入2％马血清和1％双抗。该培养基能够支持基本的细胞分化过程，在分化第5天左右达到最高肌管融合率。但是该培养基由于马血清的添加，导致化学成分不明确，存在不同批次培养基成分不稳定、易存在病毒等病原体污染、成本昂贵等问题。此外，该培养基条件下的肌肉干细胞分化百分比仅为35％左右，分化效率低。这意味运用该含血清培养基无法大规模高效、稳定、廉价地生产细胞培养肉，严重阻碍了细胞培养肉产业化的进程。因此，开发一种化学成分明确的、能够促进肌肉干细胞高效分化的无血清分化培养基变得尤为重要。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是替代传统分化培养基中的血清成分，提供一套化学成分明确的肌肉干细胞分化培养基及其应用方法。
本发明的第一个目的是提供一种用于肌肉干细胞体外分化的化学成分明确的改良细胞分化培养基，所述改良细胞分化培养基为不含血清成分。所述无血清成分是指不添加有包括马血清、胎牛血清、牛血清、人血清等任何动物血清成分，所述改良细胞分化培养基为添加有细胞培养辅助因子的肌肉干细胞分化培养基，通过添加辅助因子，替代传统肌肉干细胞分化培养基中的血清成分。
进一步的，所述肌肉干细胞分化培养基包括肌肉干细胞基础培养基和青霉素链霉素双抗溶液，所述肌肉干细胞基础培养基和青霉素链霉素双抗溶液的体积比为99:1(v/v)；
优选的，所述肌肉干细胞基础培养基选自DMEM培养基、MEM培养基、DMEM/F12培养基、F10培养基中的一种；
优选的，所述的青霉素-链霉素双抗溶液，青霉素的含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/ml。
进一步的，所述细胞培养辅助因子自以下细胞培养补充因子中的多种：N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、PEG-PPG-PEG、血清白蛋白、吐温、转铁蛋白、乙醇胺、胆固醇、维生素E、棕榈酸、硬脂酸、胰岛素、棕榈油酸、亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、油酸、亚硒酸钠、亚油酸、IGF(胰岛素样生长因子)。
进一步的，所述改良细胞分化培养基中，细胞培养辅助因子添加总浓度的范围为：0.05-50mg/mL。
优选的，所述改良细胞分化培养基中，细胞培养辅助因子添加总浓度的范围为：0.5-30mg/mL。
进一步优选的，所述改良细胞分化培养基中，细胞培养辅助因子添加总浓度为3mg/mL。
进一步的，所述改良细胞分化培养基中，任一添加的细胞培养辅助因子的浓度为0.5ng/mL100mg/ml。
优选的，所述改良细胞分化培养基中，任一添加的细胞培养辅助因子的浓度为50ng/mL-50mg/ml；
进一步优选的，所述改良细胞分化培养基中，任一添加的细胞培养辅助因子的浓度为50ng/mL-1.2mg/ml。
本发明的第二个目的是提供前述的用于肌肉干细胞体外分化的化学成分明确的改良细胞分化培养基在体外诱导肌肉干细胞分化中的应用，具体的，为采用前述的改良细胞分化培养基对肌肉干细胞进行体外诱导分化。
进一步的，所述的改良细胞分化培养基能够在体外诱导分化过程中促进肌肉干细胞分化。具体的，能够提高肌肉干细胞在体外诱导分化过程中的分化效率、分化能力、分化水平。
进一步的，所述的改良细胞分化培养基能够提高肌肉干细胞在体外诱导分化过程中MYOG、MYHC、CAV-3基因表达量。
进一步的，所述的改良细胞分化培养基能够提高肌肉干细胞在体外诱导分化过程中肌球蛋白重链蛋白(MYHC)的合成
作为该应用的一种特殊的实施方式，采用前述用于肌肉干细胞体外分化的化学成分明确的改良细胞分化培养基，体外诱导肌肉干细胞分化方法，包括下列步骤：
1)取经过纯化后的原代肌肉干细胞；
2)采用肌肉干细胞增殖培养基在经过基质胶铺板的培养皿中扩增肌肉干细胞至90％以上的密度；
3)吸去肌肉干细胞增殖培养基后，加入前述改良细胞分化培养基润洗细胞，再次吸去培养基，重新补充新的改良细胞分化培养基，继续培养，诱导分化；
4)每隔2天采用前述改良细胞分化培养基进行半换液，继续培养，直至细胞融合形成肌纤维。
采用本发明所述的改良细胞分化培养基对肌肉干细胞进行体外诱导分化5天后，有57.93％的细胞融合形成肌纤维。
其中，步骤1)中纯化后的细胞指从幼猪身上分离得到的，经过细胞流式分选仪分选后，Pax7表面抗体阳性率在90％以上的肌肉干细胞。
进一步的，前述细胞培养的环境条件为在CO2培养箱中37℃培养，CO2培养箱中CO2浓度为5％(v/v)。
进一步的，步骤2)中采用的基质胶铺板浓度为基质胶：PBS＝1：50(Val)。所采用的肌肉干细胞增殖培养基为20vol％胎牛血清、79vol％F10培养基、1vol％的青霉素链霉素双抗以及1-10ng/ml成纤维细胞生长因子。
本发明的第三个目的是提供前述的改良细胞分化培养基在制备培养肉中的应用，所述应用包括以下步骤：
1)将I型胶原、含酚红的DMEM培养基、氢氧化钠溶液混合，得到混合溶液。
2)将肌源性细胞与步骤1)获得的混合溶液混合后，得到含细胞的混合溶液。
3)将步骤2)获得的含细胞的混合溶液加入到多孔网状培养肉生产模具中进行培养，在37℃，5％二氧化碳的培养箱中培养2h以形成水凝胶肌肉组织，之后在水凝胶肌肉组织中加入增殖培养基培养1天之后，将增殖培养基换为前述化学成分明确的改良细胞分化培养基，凝胶肌肉组织在该培养基中培养，在多孔网状培养肉生产模具中进行培养5天后，即得多孔网状肌肉组织。
进一步的，所述I型胶原、含酚红的DMEM培养基的体积比为50:40，添加氢氧化钠溶液将pH值调节至7.3-7.5。
进一步的，所述步骤1)中，还包括向混合溶液中添加基质胶，所述基质胶与混合溶液的体积比为8:91.5，将基质胶与混合溶液混匀后，加入模具进行培养，所述基质胶可帮助网状肌肉组织分化。
进一步的，所述步骤2)肌源性细胞为肌肉干细胞、肌肉祖细胞、肌肉前体细胞中的一种，所述含细胞的混合溶液中，肌源性细胞的密度为1x105个/ml-1x107个/ml。
进一步的，所述多孔网状培养肉生产模具为专利号ZL201921875316.X专利记载的多孔的网状培养肉生产模具。
本发明的第四个目的是提供采用前述的改良细胞分化培养基培养得到的培养肉。
采用所述的改良细胞分化培养基对接种在孔网状培养肉生产模具中的肌肉干细胞进行诱导分化，相比采用常规分化培养基诱导分化，可提高肌肉干细胞的分化标志肌球蛋白重链的表达。
本发明技术方案所实现的有益效果为：
细胞培养肉生产的关键一环是肌肉干细胞进入分化进程，细胞相互融合形成肌纤维，但是目前现有的肌肉干细胞分化培养基具有化学成分不明确、成本昂贵等缺点，在生物化学、医学、食品科学等方面的应用都有所局限，且诱导肌肉干细胞分化效率较低，经过该分化培养基诱导分化5天后的细胞分化效率仅为35.94％，无法充分利用肌肉干细胞的分化潜能。这意味运用该含血清培养基无法大规模高效、稳定、廉价地生产细胞培养肉，严重阻碍了细胞培养肉产业化的进程。
本发明用于肌肉干细胞体外分化的化学成分明确的改良细胞分化培养基，通过细胞培养辅助因子的添加，代替血清在分化培养基中的使用，避免了血清化学成分不明确，存在不同批次培养基成分不稳定、易存在病毒等病原体污染、成本昂贵等问题。同时，采用本发明提供的改良细胞分化培养基，在体外诱导肌肉干细胞分化中，极显著地提高肌肉干细胞的分化效率，激发其分化潜能，同时产生更多的肌源性蛋白质，能够在更短的时间内形成更多的多核肌管，形成更粗更长的肌纤维。该化学成分明确的肌肉干细胞分化培养基在3D生产细胞培养肉时，也能提供更高的分化效率，表达更多的肌球蛋白重链，生产出品质更高的细胞培养肉。
与现有的细胞分化培养基相比，采用本发明化学成分明确的改良细胞分化培养基，在分化第2天能够提高MYOG基因的相对表达量4.48倍，在分化第6天提高MYHC基因的相对表达量55.28倍，在分化第5天表达更多的肌球蛋白重链(多5％)，在终末分化阶段的细胞分化百分比从34.94％提高到57.93％，存在极显著差异，并且诱导分化形成的肌纤维更多、更粗、更长。以上分化性能的提高，为肌肉干细胞更高效地分化成肌管，为3D培养肌肉干细胞生产细胞培养肉提供了更高效、廉价的方法。
附图说明
图1添加有细胞培养辅助因子的化学成分明确的改良细胞分化培养基诱导分化肌肉干细胞第5天分化情况。
图2现有的含2％马血清的细胞分化培养基诱导分化肌肉干细胞第5天分化情况(阳性对照)。
图3添加有细胞培养辅助因子的化学成分明确的改良细胞分化培养基和现有的含2％马血清的细胞分化培养基(阳性对照)分别诱导分化肌肉干细胞第5天分化情况对比(MYHC/DAPI染色)。
图4添加有细胞培养辅助因子的化学成分明确的改良细胞分化培养基和现有的含2％马血清的细胞分化培养基分别诱导分化肌肉干细胞分别在预分化、分化第2、4、6天MYOG基因的表达情况。
图5添加有细胞培养辅助因子的化学成分明确的改良细胞分化培养基和现有的含2％马血清的细胞分化培养基分别诱导肌肉干细胞分化在预分化、分化第2、4、6天MYHC基因的表达情况。
图6添加有细胞培养辅助因子的化学成分明确的改良细胞分化培养基和现有的含2％马血清的细胞分化培养基分别诱导肌肉干细胞分化在预分化、分化第2、4、6天CAV-3基因的表达情况。
图7添加有细胞培养辅助因子的化学成分明确的改良细胞分化培养基和现有的含2％马血清的细胞分化培养基分别诱导肌肉干细胞分化在预分化、分化第1、5天的蛋白免疫印记的实验结果(MYHC蛋白)。
图8添加有细胞培养补充因子的化学成分明确的肌肉干细胞分化培养基和现有的含2％马血清的分化培养基分别诱导分化肌肉干细胞第5天细胞分化百分比对比。
具体实施方式
本发明提出的化学成分明确的细胞分化培养基，，为添加有细胞培养补充因子的细胞培养基，其他方面与正常肌肉干细胞体外培养方法一致。
下述实施例中增殖阶段使用的肌肉干细胞增殖培养基配方为79vol％F10基础培养基、20vol％胎牛血清、1vol％青霉素-链霉素双抗、并加入5ng/ml重组人成纤维细胞生长因子(Basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)。
下述实施例中采用的现有的肌肉干细胞细胞分化培养基(阳性对照)为97vol％DMEM/F12基础培养基加入2vol％马血清和1vol％青霉素-链霉素双抗的细胞培养基。
下述实施例中采用的用于肌肉干细胞体外分化的化学成分明确的改良细胞分化培养基为：99vol％DMEM/F12基础培养基加入1vol％青霉素-链霉素双抗再补充按表1所示的细胞培养辅助因子。表1
Figure BDA0002858863510000061
Figure BDA0002858863510000071
下述实施例中采用的细胞为幼猪肌肉干细胞，进一步的为贴壁细胞，更进一步的，是经过细胞流式分选仪分选后，Pax7表面抗体阳性率在90％以上的肌肉干细胞。
下述实施例中采用的培养条件皆为CO2培养箱中37℃培养，CO2的浓度皆为5％(v/v)。
下述实施例中采用的检测方法，除非另外说明，否则都是领域内公开的实验方法、检测方法和制备方法。具体参见Shijie Ding等人的文献“Maintaining bovine satellitecells stemness through p38 pathway”(DOI：10.1038/s41598-018-28746-7)
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1猪肌肉干细胞诱导分化：
本实验分为两组，分别为现有细胞分化培养基处理组(阳性对照)和本发明所述的化学成分明确的改良细胞分化培养基处理组，具体处理方法如下：
1)基质胶铺板：配制基质胶：PBS＝1：50(Val)的溶液，以1mL/板的量加入3.5cm培养皿中，置于CO2培养箱中1-6小时，取出后吸干液体，用PBS清洗2次后吸干。
2)细胞接种：高纯度的P6代之前的猪肌肉干细胞按60000-120000个/板的密度接种到用基质胶铺板后的3.5cm培养皿中，用添加了5ng/ml重组人成纤维细胞生长因子(Basic Fibroblast Growth Factor,bFGF)的增殖培养基培养并两天进行换液。
3)诱导分化：待细胞增殖分裂至铺满整个培养皿后(扩增肌肉干细胞至90％以上的密度)，吸去肌肉干细胞增殖培养基，分别用现有的肌肉干细胞细胞分化培养基(阳性对照)和本发明所述的化学成分明确的改良细胞分化培养基清洗一遍细胞，在以2mL/板的体积加入对应的分化培养基进行诱导分化，每2天进行一次半换液，第5天观察分化形成肌纤维后的分化效果。
4)结果显示：本发明提供的改良细胞分化培养基相对于常规肌肉干细胞细胞分化培养基，能够促进体外肌肉干细胞的分化能力，有更高的分化效率，形成的肌管更多、更长、更粗(图1、图2)。
实施例2猪肌肉干细胞诱导分化免疫荧光检测
1)收样：将通过实施例1采用现有肌肉干细胞分化培养基处理组(阳性对照)和本发明所述的化学成分明确的改良肌肉干细胞分化培养基处理组诱导分化5天后肌管成熟的细胞，分别吸去培养基，用PBS清洗1遍，加入质量体积百分比4％(m/V)多聚甲醛在4℃过夜固定。
2)MYHC蛋白与DAPI免疫荧光染色：吸掉4％多聚甲醛，用PBS清洗3次，每次用摇床摇5min，期间用免疫组化笔画圈，每个圈加50uL左右0.5％trizol，摇15min，再用PBS清洗3次，加入用1％BSA稀释的MYHC抗体(1：800)，4℃孵育16小时后，PBS洗3次洗掉抗体，加入用1％BSA稀释的二抗(1：500)，避光静置孵育1小时，用PBS清洗一次，加入DAPI封片剂，盖上盖玻片，上镜拍照(图3)。
3)细胞分化率统计：采用Image J软件进行细胞核数目计数，分别统计肌管内/外大小大于50平方英寸的，圆度介于0-1中间的细胞核，并进行计数与显著性分析(图8)。
3)结果显示：采用现有肌肉干细胞分化培养基处理组(阳性对照)的细胞分化百分比为34.94％±2.7％(n＝6)，采用本发明所述的化学成分明确的改良细胞分化培养基处理组的细胞分化百分比为57.93％±3.96％(n＝6)。可以看出，所述的化学成分明确的改良细胞分化培养基能够极显著(P<0.0001)地提高细胞分化百分比，使更多细胞参与融合形成肌纤维。
实施例3猪肌肉干细胞诱导分化基因、蛋白水平检测
1)基因水平检测：
按照实施例1的处理方法，在步骤3)诱导分化的第2、4、6天分别取样，用实时荧光定量PCR分别检测现有的肌肉干细胞分化培养基(阳性对照)和本发明所述的化学成分明确的改良细胞分化培养基培养第2、4、6天MYOG、MYHC、CAV-3的基因表达量(图4、图5、图6)。其中MYOG基因一般在分化前期高表达，表征肌肉干细胞分化能力，MYHC在分化进程中表达量不断上升，表征肌肉干细胞分化水平。
结果表明本发明所述的化学成分明确的改良细胞分化培养基处理组相对于现有肌肉干细胞分化培养基处理组(阳性对照)，在分化第2天能够提高MYOG基因的相对表达量4.48倍，在分化第6天提高MYHC基因的相对表达量55.28倍。因此，本发明所述的化学成分明确的改良细胞分化培养基提高了肌肉干细胞的分化能力和分化水平。
2)蛋白水平：
按照实施例1的处理方法，在步骤3)诱导分化的第1、5天分别取样，分别取现有的肌肉干细胞分化培养基(阳性对照)和本发明所述的化学成分明确的改良细胞分化培养基培养培养第1、5天的细胞各2盘，各加入100μL的RIPA(另加终浓度1mM PMSF)，在冰上裂解30min收集-20℃保存待用。之后12000g离心5分钟，收集上清,使用赛默飞的BCA试剂盒测定和蛋白浓度，按照4:1(V:V)加入5X的loading buffer，混匀后95℃加热5min变性蛋白,-80℃保存。
SDS-page凝胶电泳:提前配置好电泳缓冲液和转印液(转印液需要另加10％的甲醇)，电泳缓冲液没过12％的变性琼脂糖预制凝胶板情况下，取含20ug变性后的蛋白分别加至上样孔之中，设置电压80V电泳30min和120电泳90min及以上两个程序，观察蛋白上样液是否到达预制板的底部。
转膜：将PVDF膜放入甲醇之中活化10s左右，放入转印液里保存待用，按照海绵、2层滤纸、凝胶、活化的PVDF膜、2层滤纸、海绵放置，用转印夹夹紧，放入电泳槽后加入配置好的转印液90V运行90min。
封闭：将转印结束的PVDF膜放入封闭液(用TBST配置的5％脱脂奶粉)之中，室温摇床封闭2h后吸掉封闭液。
一抗和二抗孵育：按照抗体的具体情况稀释MyHC一抗，4℃孵育14-16h。一抗孵育结束后回收一抗，TBST清洗三遍，每遍5min。加入稀释后的二抗并孵育2h，结束后TBST清洗三遍，每遍5min。
显影：使用显影液暗处覆盖PVDF膜，孵育5min后吸去显影液，凝胶成像仪下拍照。并使用Quantity One分析软件进行灰度分析。本实验使用的内参蛋白为Gapdh(图7)。
结果显示：本发明所述的化学成分明确的改良细胞分化培养基处理组能够在5天内将细胞内肌球蛋白重链表达量提高28.5倍，同时，相比于现有的含2％马血清的细胞分化培养基处理组(阳性对照)，本发明所述改良细胞分化培养基在诱导分化第5天有更高的肌球蛋白重量含量(高出5％)。
实施例4培养肉制备
1)将I型胶原、含酚红的DMEM培养基、氢氧化钠溶液混合，得到混合溶液。所述I型胶原、含酚红的DMEM培养基的体积比为50:40，添加氢氧化钠溶液将pH值调节至7.3-7.5；混合溶液中添加基质胶，所述基质胶与混合溶液的体积比为8:91.5。
2)将肌肉干细胞与步骤1)获得的混合溶液混合后，得到密度为1x106个/ml的含细胞的混合溶液。
3)将步骤2)获得的含细胞的混合溶液分为两组，分别加入到专利号ZL201921875316.X专利记载的多孔网状培养肉生产模具中进行培养，在37℃，5％二氧化碳的培养箱中培养2h以形成水凝胶肌肉组织，之后在水凝胶肌肉组织中加入增殖培养基培养1天之后，其中一组将增殖培养基换为化学成分明确的改良细胞分化培养基，另一组将增殖培养基换为现有的细胞分化培养基，凝胶肌肉组织在两种培养基中分别培养，在多孔网状培养肉生产模具中进行培养5天后，得到多孔网状肌肉组织，即培养肉产品。
结果显示：与现有的含2％马血清的细胞分化培养基相比，本发明所述的化学成分明确的改良细胞分化培养基处理组在细胞培养肉制备过程中组织收缩提前，形成的培养肉具有肌纤维更多、更长、更粗，且规则地定向排列的优点，同时产生更多的肌球蛋白重链。
以上公开的实例是为了说明本发明公开的实施案例，但不能理解为本发明的局限，本文列出了许多不同的抗氧化剂和分化抑制剂，在不脱离本发明范围和精神的前提下，仍有许多不同可以进一步的组合，因此本发明不只局限于公开的实施案例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

Claims (10)

1.一种用于肌肉干细胞体外分化的化学成分明确的改良细胞分化培养基，其特征在于，所述改良细胞分化培养基为添加有细胞培养辅助因子的肌肉干细胞分化培养基，所述改良细胞分化培养基不含血清成分。
2.根据权利要求1所述的改良细胞分化培养基，其特征在于，所述肌肉干细胞分化培养基包括肌肉干细胞基础培养基和青霉素链霉素双抗溶液，所述肌肉干细胞基础培养基和青霉素链霉素双抗溶液的体积比为99:1；
优选的，所述肌肉干细胞基础培养基选自DMEM培养基、MEM培养基、DMEM/F12培养基、F10培养基中的一种；
优选的，所述的青霉素-链霉素双抗溶液中，青霉素的含量为10000U/ml，链霉素的含量为10mg/ml。
3.根据权利要求1所述的改良细胞分化培养基，其特征在于，所述细胞培养辅助因子选自以下细胞培养补充因子中的多种：N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、PEG-PPG-PEG、血清白蛋白、吐温、转铁蛋白、乙醇胺、胆固醇、维生素E、棕榈酸、硬脂酸、胰岛素、棕榈油酸、亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、油酸、亚硒酸钠、亚油酸、IGF。
4.根据权利要求1所述的改良细胞分化培养基，其特征在于，所述改良细胞分化培养基中，细胞培养辅助因子添加总浓度的范围为：0.05-50mg/mL；
优选的，所述改良细胞分化培养基中，细胞培养辅助因子添加总浓度的范围为0.5-30mg/mL；
进一步优选的，所述改良细胞分化培养基中，细胞培养辅助因子添加总浓度为3mg/mL。
5.根据权利要求3所述的改良细胞分化培养基，其特征在于，所述改良细胞分化培养基中，任一添加的细胞培养辅助因子的浓度为0.5ng/mL-100mg/ml；
优选的，所述改良细胞分化培养基中，任一添加的细胞培养辅助因子的浓度为50ng/mL-50mg/ml；
进一步优选的，所述改良细胞分化培养基中，任一添加的细胞培养辅助因子的浓度为50ng/mL-1.2mg/ml。
6.权利要求1所述的改良细胞分化培养基在体外诱导肌肉干细胞分化中的应用，其特征在于，采用权利要求1所述的改良细胞分化培养基对肌肉干细胞进行体外诱导分化。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的改良细胞分化培养基能够在体外诱导分化过程中促进肌肉干细胞分化。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的改良细胞分化培养基能够提高肌肉干细胞在体外诱导分化过程中MYOG、MYHC、CAV-3基因表达量。
9.权利要求1所述的改良细胞分化培养基在制备培养肉中的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：
1)将I型胶原、含酚红的DMEM培养基、氢氧化钠溶液混合，得到混合溶液。
2)将肌源性细胞与步骤1)获得的混合溶液混合后，得到含细胞的混合溶液。
3)将步骤2)获得的含细胞的混合溶液加入到多孔网状培养肉生产模具中进行培养，在37℃，5％二氧化碳的培养箱中培养2h以形成水凝胶肌肉组织，之后在水凝胶肌肉组织中加入增殖培养基培养1天之后，将增殖培养基换为权利要求1所述的化学成分明确的改良细胞分化培养基，凝胶肌肉组织在该培养基中培养，在多孔网状培养肉生产模具中进行培养5天后，即得多孔网状肌肉组织；
优选的，步骤1)所述I型胶原、含酚红的DMEM培养基的体积比为50:40，添加氢氧化钠溶液将pH值调节至7.3-7.5；
优选的，所述步骤1)中，还包括向混合溶液中添加基质胶，所述基质胶与混合溶液的体积比为8:91.5，将基质胶与混合溶液混匀后，加入模具进行培养，所述基质胶可帮助网状肌肉组织分化；
优选的，所述步骤2)肌源性细胞为肌肉干细胞、肌肉祖细胞、肌肉前体细胞中的一种，所述含细胞的混合溶液中，肌源性细胞的密度为1x105个/ml-1x107个/ml。
10.采用权利要求1所述的改良细胞分化培养基培养得到的培养肉。
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