JP7064189B2 - 骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、または神経細胞に分化可能な前駆細胞、その作製方法、およびその使用方法 - Google Patents
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Description
[項1]CCN1およびCCN2のいずれか一方またはその両方を発現する幹細胞を調製する工程、および前記幹細胞に1つ又はそれ以上のリプログラミング因子を導入する工程を含む、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、または神経細胞に分化可能な前駆細胞の作製方法
[項2]CCN1およびCCN2のいずれか一方またはその両方を発現する幹細胞を調製する工程が、骨髄由来の幹細胞、歯髄由来の幹細胞、臍帯組織由来の幹細胞、脂肪組織由来の幹細胞、または胎盤組織由来の幹細胞を不死化する工程を含む、項1に記載の方法
[項3]骨髄由来の幹細胞、歯髄由来の幹細胞、臍帯組織由来の幹細胞、脂肪組織由来の幹細胞、または胎盤組織由来の幹細胞が、間葉系幹細胞である、項2に記載の方法
[項4]幹細胞を不死化する工程が、該幹細胞に、テロメラーゼ(TERT)を導入することを含む、項2または項3に記載の方法
[項5]1つ又はそれ以上のリプログラミング因子が、OCT3/4、SOX2、KLF4およびL-Myc;OCT3/4、SOX2およびKLF4;OCT3/4、KLF4およびC-MYC;OCT3/4、SOX2、KLF4およびC-MYC;OCT3/4およびSOX2;OCT3/4、SOX2およびNANOG;OCT3/4、SOX2およびLIN28;OCT3/4およびKLF4の組合せのいずれかの組合せを含む、項1~項4のいずれかに記載の方法
[項6]1つ又はそれ以上のリプログラミング因子が、OCT3/4、SOX2、KLF4およびL-Mycの組合せである、項5に記載の方法
[項7]CCN1およびCCN2のいずれか一方またはその両方を発現する幹細胞に1つ又はそれ以上のリプログラミング因子を導入することによって作製された、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、または神経細胞に分化可能な前駆細胞
[項8]CCN1およびCCN2のいずれか一方またはその両方を発現する幹細胞が、骨髄由来の幹細胞、歯髄由来の幹細胞、臍帯組織由来の幹細胞、脂肪組織由来の幹細胞、または胎盤組織由来の幹細胞を不死化する工程を含む方法により調製された、項7に記載の細胞
[項9]項3~項6のいずれかに記載の方法に従って作製された、項8に記載の細胞
[項10]受託番号P-02505で寄託された細胞
[項11]項7~項10のいずれかに記載の細胞を、神経細胞培養培地もしくは神経分化培地、または神経細胞誘導因子を含む神経細胞培養培地もしくは神経分化培地中で培養する工程を含む、神経細胞を製造する方法
[項12]項7~項10のいずれかに記載の細胞、および項11に記載の方法で製造された神経細胞のいずれか一方またはその両方を含む、脊髄損傷、重症筋無力症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、または統合失調症を処置するための組成物。
<ヒト間葉系幹細胞の不死化>
市販の骨髄由来のヒト間葉系幹細胞(hMSC)(タカラバイオC-12974)を組織培養用シャーレで培養し、付着細胞を回収した。回収した細胞を、ヒト・テロメラーゼ遺伝子(Retro-E1/hTERT virus G207 コスモバイオ)、および緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子を組み込んだレトロウイルスベクターにてトランスフェクトした。GFPを発現する細胞を、蛍光標示式細胞分取器(FACS)にて分離した。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)を行い、分離した細胞にてhTERTが転写されていることを確認した。Trap aasayによるテロメア長の測定により、hTERTが発現され、機能していることを確認した。hTERTの発現が確認された細胞群をクローン化した。
クローニングした不死化ヒト間葉系幹細胞クローンの幾つかをそれぞれ、インシュリン、デキサメサゾン、インドメタシンを含めた脂肪細胞誘導培地にて約3週間培養した。培養細胞をオイルレッド染色し、脂肪細胞に分化可能なクローンを特定した。脂肪細胞に分化可能な不死化ヒト間葉系幹細胞クローンの幾つかをそれぞれ、デキサメサゾン、アスコルビン酸、TGF-β3を含めた軟骨誘導培地にて約3週間培養した。培養細胞をアルシアンブルー染色し、軟骨細胞に分化可能なクローンを特定した。脂肪細胞、および軟骨細胞に分化可能であった不死化ヒト間葉系幹細胞クローンの幾つかをそれぞれ、デキサメサゾン、アスコルビン酸、β-グリセロリン酸を含めた骨誘導培地にて約2週間培養した。培養細胞をアルカリホスファターゼ染色し、骨芽細胞にも分化可能な不死化ヒト間葉系幹細胞クローンを特定した。
上記で得られた多分化能を有する不死化ヒト間葉系幹細胞クローンの細胞内に、エピソーマルベクターHuman iPS Cell Generation(商標)Episomal Vector Mix(タカラバイオ3673)を用いて初期化遺伝子を導入した。初期化遺伝子は、核初期化因子(OCT3/4、KLF4、SOX2、L-MYC、LIN28)、およびp53機能阻害因子(mouse p53DD)を含んだ。遺伝子導入は、上記ベクターミックス3μlを3×105個の細胞に電圧1650V、時間10m秒で電気的導入法により導入した。遺伝子導入した細胞を組織培養用プレートで約1週間、10%ウシ胎児血清含有DMEM培地中で培養した。前記培養細胞103~104個を、組織培養用シャーレ中、マイトマイシンC処理したSNLフィーダー細胞上に播種し、ES/iPS細胞用培地(リプロセル社)を用いて約2週間培養した。SNLフィーダー細胞として、ネオマイシン耐性遺伝子とマウスLIF遺伝子を形質転換したマウス線維芽細胞を用いた。培養後の細胞集団には、形態的にiPS細胞コロニーはほとんど見られなかった。得られた細胞集団についてクローニングを行った。クローニングの間、細胞はリプロセル社培地を用いて培養した。得られたクローンの1つをX4N細胞と称し、以下の実施例に用いた。
<遺伝子発現解析>
アフィメトリクス社のGeneChip(登録商標)Human Gene2.0 ST Arrayを用いて、約10万種におよぶ転写産物に関する遺伝子発現情報を、ヒトiPS細胞、ヒト間葉系幹細胞、X4N細胞、神経分化させたX4N細胞(後述する)について階層型クラスタリング解析を行った。解析結果の一部を図1に示す。X4N細胞(図1c)は、ヒトiPS細胞(図1a)やヒト間葉系幹細胞(図1b)の遺伝子発現パターンとは、遺伝子発現パターンが異なっていた。iPS細胞とは形態的に異なるコロニーを形成したX4N細胞は、遺伝子発現パターンもiPS細胞とは異なっていた。これらの結果は、X4N細胞はiPS細胞とは異なる細胞株であることを示唆した。
X4N細胞は、0.1%ゼラチンを被覆した組織培養用シャーレにて、リプロセル社培地を用いて継代培養が可能であった(図2a)。X4N細胞は12~24時間で2倍に増殖した。一般的に24~30時間で2倍に増殖するiPS細胞と比べて、X4N細胞は増殖効率に優れていることが示唆された。また、リプロセル社培地の交換はX4N細胞の場合、2、3日に1回の交換で充分であった(データは示さず)。一般に1日に1回のリプロセル社培地の交換が必要とされるiPS細胞の培養と比べて、経済的にも優れていることが示唆された。
X4N細胞は、ゼラチン被覆(足場)なしの組織培養用シャーレにてリプロセル社培地を用いて培養すると、突起を出しはじめ、球状の細胞塊(スフェア)を形成して浮遊した(図2b)。浮遊した球状の細胞塊は、神経幹細胞をin vitroで培養した際に観られる非接着球体クラスター(「神経球」とも呼ばれる)に形態的に似ていた。そこで、X4N細胞を、ゼラチン被覆なしの組織培養用シャーレにて、リプロセル社培地で1日培養した後に、培地をリプロセル社培地から神経誘導培地(RHB-A タカラ)に交換して約1週間培養した。培養後の細胞は突起を伸ばし神経細胞様に分化した(図2c)。神経誘導培地に20~50ngのBDNF(脳由来神経栄養因子)を添加した場合、X4N細胞はほとんどが増殖を停止し、突起を伸ばしてネットワーク状の形状を呈した(図2d)。
過剰のグルタミン酸(Glu)を細胞に添加することで細胞死が誘導されるかを調べた。神経誘導培地で約1週間培養して神経分化誘導したX4N細胞に、最終濃度10mMのグルタミン酸を添加した。数日間の培養後に顕微鏡(対物40倍)にて細胞を撮像した。計測エリア(mm2)あたりの細胞塊のサイズ(mm2)と数(個)に減少が観察され(図3)、細胞塊の数とサイズとを計測した(表3)。
<定量PCR法によるX4N細胞の遺伝子マーカー探索>
実施例1記載のヒト間葉系幹細胞(hMSC)、実施例1記載のX4N細胞、実施例2記載の神経分化誘導したX4N細胞、およびヒトiPS細胞を用いて、CCN1、CCN2、CCN3、Myc、Sox2、Klf4、Oct3/4、Lin28、Nanog、およびhTERTについて定量PCRを行い、GAPDHおよびβ-Actin等の内在性対照遺伝子のシグナル値に対する相対値を算出した(データは示さず)。
<定量PCR法によるX4N細胞を製造するための幹細胞の遺伝子マーカー探索>
実施例1記載のヒト間葉系幹細胞(hMSC)、実施例1記載のX4N細胞、実施例2記載の神経分化誘導したX4N細胞、およびヒトiPS細胞に加えて、実施例1記載の不死化ヒト間葉系幹細胞について、実施例4で遺伝子マーカーとして特定したCCN1及びCCN2について定量PCRを行った(図4)。内在性対照遺伝子としてCAPDHを用いた。
<ハイブリドーマ法によるX4Nタンパク質マーカー探索>
免疫:マウスをX4N細胞で免疫した。1匹あたり1×107個の細胞をアジュバントと混合して腹腔に免疫し、最終免疫は、1匹あたり1×106個の細胞を尾静脈から注入した。
<ラット脊髄損傷モデルを用いた後肢運動機能改善評価>
10週齢のSD系雌ラット18匹を(体重:197.4~229.2g)、室温22±2℃、相対湿度30~70%、明暗各12時間の環境下で1週間馴化飼育した(体重:233.1~261.5g)。飼育中、ラットは、水、および固型飼料CE-2(フィードワン株式会社)を自由摂取した。馴化飼育後のSD系雌ラット14匹を、各群の平均体重が均一になるように、体重層別無作為法にて3群(試験群6匹、対照群6匹、健常群2匹)に分けた。
<損傷個所周辺の脊髄組織の染色>
実施例6で採取した損傷個所周辺の脊髄切片を調製し、組織切片をヘマトキシリン・エオジン染色した(図6)。試験群の損傷個所周辺の脊髄組織(図6a)は、対照群の損傷個所周辺の脊髄組織(図6b)に比べて、脊髄の損傷個所(空隙)が神経細胞で補修されている。補修された脊髄では、異形腫、炎症反応は認められなかった(図6a)。実施例6で用いた神経分化X4N細胞は、セルソーターなどで神経に分化した細胞を選別し、濃縮する工程を経ることなく、高効率に神経細胞に分化し得る安全な神経細胞に分化可能な前駆細胞、同様に骨細胞、軟骨細胞、または脂肪細胞に分化可能な前駆細胞であることが示唆された。
Claims (6)
- 間葉系幹細胞にテロメラーゼ(TERT)を導入して、CCN1およびCCN2の両方を発現する幹細胞を調製する工程、および
前記幹細胞に1つ又はそれ以上のリプログラミング因子を導入する工程を含む、
神経細胞に分化可能な前駆細胞の作製方法であって、
前記1つ又はそれ以上のリプログラミング因子が、OCT3/4、SOX2、KLF4およびL-Mycの組合せである、方法。 - 間葉系幹細胞にテロメラーゼ(TERT)を導入して調製されたCCN1およびCCN2の両方を発現する幹細胞に1つ又はそれ以上のリプログラミング因子を導入することによって作製された、神経細胞に分化可能な前駆細胞であって、
前記1つ又はそれ以上のリプログラミング因子が、OCT3/4、SOX2、KLF4およびL-Mycの組合せである、細胞。 - 請求項1に記載の方法に従って作製された、細胞。
- 受託番号P-02505で寄託された細胞。
- 請求項2~4のいずれか一項に記載の細胞を、神経細胞培養培地もしくは神経分化培地、または神経細胞誘導因子を含む神経細胞培養培地もしくは神経分化培地中で培養する工程を含む、神経細胞を製造する方法。
- 請求項2~4のいずれか一項に記載の細胞、および請求項5に記載の方法で製造された神経細胞のいずれか一方またはその両方を含む、脊髄損傷、重症筋無力症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、または統合失調症を処置するための組成物。
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Biochem. Biophys. Res. Commun.,2013年,Vol.439,pp.552-558 |
Cytotherapy,2017年,Vol.19,pp.808-820,Published: April 25, 2017 |
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