CN112391335A - 单克隆细胞培养基、应用及培养单克隆细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种单克隆细胞培养基、应用及培养单克隆细胞的方法，涉及细胞培养技术领域，本发明提供的单克隆细胞培养基，包括基础培养基和条件培养基，对贴壁细胞和悬浮细胞均适用。通过基础培养基和条件培养基的配合使用，使得本发明提供的单克隆细胞培养基具有丰富的营养物质，在单克隆细胞生长期间不需要反复换液直至单细胞克隆集落形成，一方面避免了因换液带来的污染风险，另一方面也缩短了单克隆细胞集落的时间，同时提高了单克隆细胞的成活率。

Description

单克隆细胞培养基、应用及培养单克隆细胞的方法

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其是涉及一种单克隆细胞培养基、应用及培养单克隆细胞的方法。

背景技术

群体细胞中，由于细胞与细胞之间存在异质性，即使不同代次的同一细胞系或相同代次的不同细胞株之间的细胞对于病毒的敏感性、病毒粒子包装的完整性或病毒制备的有效性均会出现差异性。为了将高产优质的细胞从细胞群体中筛选出来，通常会进行群体细胞的单克隆筛选，将高产优质的单细胞从细胞群体中筛选出来，进行扩繁，建立细胞库，从事生物制品生产使用。但分离出的单个细胞因密度极低，缺乏群体细胞释放的代谢产物、调控因子和可扩散性信号，所以存活性很低，多数研究也表明，悬浮细胞单克隆培养比贴壁细胞单克隆培养效率更低，有些细胞能低2－3个数量级。

目前，对分离出的单个细胞多采用一周换一次液的做法，来弥补丢失掉的不稳定营养物质(如谷氨酰胺)，以及补充降解的生长因子。但换液的同时不仅增加了污染的风险，同时形成的单克隆细胞集落时间极长(一般需要2周左右)，单克隆细胞成活率也极低(40％左右)。

对于长期从事生物制品研发者来说，如果能找到一种操作简便且能使单细胞成活率高的试验方法，将对今后开展实验室研究工作十分有利。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种单克隆细胞培养基，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。

本发明的第二个目的在于提供上述单克隆细胞培养基的应用。

本发明的第三个目的在于提供一种培养单克隆细胞的方法。

本发明提供了一种单克隆细胞培养基，所述单克隆细胞培养基包括基础培养基和条件培养基；

所述条件培养基包括经冻融及离心处理的同源细胞系的培养基。

进一步的，所述冻融包括在-25～-15℃温度下反复冻融；

优选地，所述冻融包括在-20℃温度下反复冻融2次；

优选地，所述离心的条件包括在800～1200r/min条件下离心8～12min；

优选地，所述离心的条件包括在1000r/min条件下离心10min。

进一步的，所述同源细胞系的培养基包括处于对数生长晚期的同源细胞系的培养基。

进一步的，在冻融和离心处理后还包括除菌的步骤；

优选地，采用过滤的方式进行除菌。

进一步的，所述基础培养基包括基本培养基、白蛋白、生长因子和激素。

进一步的，所述基本培养基包括DMEM或MEM；

优选地，所述白蛋白包括胎牛血清白蛋白或转铁蛋白；

优选地，所述生长因子包括碱性成纤维细胞生长因子和/或表皮生长因子；

优选地，所述激素包括地塞米松、氢化可的松或胰岛素中的一种或多种；

优选地，所述基础培养基包括含有8％～12％(w/w)胎牛血清白蛋白、10-20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子和3-10μg/ml地塞米松的DMEM；

优选地，所述基础培养基包括含有10％(w/w)胎牛血清白蛋白、15ng/ml碱性成纤维细胞生长因子和5μg/ml地塞米松的DMEM。

进一步的，所述基础培养基与所述条件培养基的体积比为1～3:1，优选为2:1。

本发明还提供了上述的单克隆细胞培养基在培养单克隆细胞中的应用。

此外，本发明改还提供了一种培养单克隆细胞的方法，所述方法包括使用上述的单克隆细胞培养基进行培养。

进一步的，所述方法包括在96孔平底细胞培养板中进行培养，所述96孔平底细胞培养板中每孔含有至少200μl的单克隆细胞培养基。

与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：

本发明提供的单克隆细胞培养基，包括基础培养基和条件培养基，对贴壁细胞和悬浮细胞均适用。其中，基础培养基能够提供细胞生长的营养成分，有效保证细胞的正常生长；以经冻融及离心处理的同源细胞系的培养基作为条件培养基，能够在有效获得同源细胞的代谢产物、生长因子和基质产物等物质的基础上，避免从原培养基中携带细胞，造成污染。通过基础培养基和条件培养基的配合使用，使得本发明提供的单克隆细胞培养基具有丰富的营养物质，在单克隆细胞生长期间不需要反复换液直至单细胞克隆集落形成，一方面避免了因换液带来的污染风险，另一方面也缩短了单克隆细胞集落的时间，同时提高了单克隆细胞的成活率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1A为本发明实验例提供的单个BHK21悬浮细胞的显微结果图；

图1B为本发明实验例提供的单个BHK21悬浮细胞形成的细胞集落的显微结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。

一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。

因单个细胞密度极低，缺乏群体细胞释放的代谢产物、调控因子和可扩散性信号，所以存活性很低，鉴于此，本发明通过改变单克隆细胞培养基质成分，实现了单细胞克隆形成率的极大提高，具体地，本发明提供了一种单克隆细胞培养基，所述单克隆细胞培养基包括基础培养基和条件培养基；

所述条件培养基包括经冻融及离心处理的同源细胞系的培养基。

本发明提供的单克隆细胞培养基中，基础培养基能够提供细胞生长的营养成分，有效保证细胞的正常生长；以经冻融及离心处理的同源细胞系的培养基作为条件培养基，能够在有效获得同源细胞的代谢产物、生长因子和基质产物等物质的基础上，避免从原培养基中携带细胞，造成污染。通过基础培养基和条件培养基的配合使用，使得本发明提供的单克隆细胞培养基具有丰富的营养物质，在单克隆细胞生长期间不需要反复换液直至单细胞克隆集落形成，一方面避免了因换液带来的污染风险，另一方面也缩短了单克隆细胞集落的时间，同时提高了单克隆细胞的成活率。

在一些优选的实施方式中，所述冻融包括在-25～-15℃温度下反复冻融，冻融温度例如可以为，但不限于-25℃、-22℃、-20℃、-18℃或-15℃。为了在保证冻融效果的基础上进一步节约成本，本实施方式优选在-20℃温度下反复冻融2次。

在一些优选的实施方式中，所述离心的条件包括在800～1200r/min条件下离心8～12min，其中离心转速例如可以为，但不限于800r/min、900r/min、1000r/min、1100r/min或1200r/min；离心时间例如可以为，但不限于8min、9min、10min、11min或12min。同样地，为了在保证离心效果的基础上进一步节约成本，本实施方式优选在1000r/min条件下离心10min。

在一些优选的实施方式中，在冻融和离心处理后还包括除菌的步骤。

在冻融和离心处理的基础上，辅以除菌的操作，能够进一步避免污染的发生。在本实施方式中，对除菌的方式不做限定，本领域技术人员通常使用的除菌方法均可。

为了能够在除菌的基础上进一步避免从原培养瓶中携带细胞，优选使用无菌过滤器过滤实现除菌，优选地，使用0.22μm的无菌过滤器过滤。

在一些优选的实施方式中，所述基础培养基包括基本培养基、白蛋白、生长因子和激素。

通过在基本培养基的基础上增加营养成分和激素成分，能够进一步刺激单克隆细胞的分化和增殖，缩短单克隆细胞形成集落的时间，提高实验效率。

其中，基本培养基能够提供细胞生存所需的最基本的营养物质，本实施方式对基本培养基的具体选择不做限定，本领域常规使用的细胞基本培养基均可。优选地，使用DMEM或MEM作为本发明中的基本培养基。DMEM不仅含有高浓度葡萄糖、氨基酸和维生素等多种营养成分，还是一种应用广泛的基础培养基，用于促进许多不同哺乳动物细胞的生长，尤其对促进极低密度细胞的生长非常有利。MEM培养基是哺乳动物细胞的理想培养基，通常用于贴壁细胞的培养，通过对配方进行修正，可以用于其他类型细胞的培养，如无钙MEM培养基可以用于悬浮细胞的培养，含有Hank’s盐的MEM培养基可以用于二倍体细胞的培养。

白蛋白优选包括胎牛血清白蛋白和/或转铁蛋白，通过添加胎牛血清白蛋白和/或转铁蛋白能够提高单克隆细胞培养基中的营养成分，利于细胞生长。需要说明的是，“和/或”表达的含义是可以单独选用胎牛血清白蛋白作为本发明中的白蛋白，也可以单独选用转铁蛋白作为本发明中的白蛋白，或者可以同时选用胎牛血清白蛋白和转铁蛋白作为本发明中的白蛋白。其添加量例如可以为，但不限于8％(w/w)、9％(w/w)、10％(w/w)、11％(w/w)或12％(w/w)。

生长因子优选包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和/或表皮生长因子，激素优选包括地塞米松、氢化可的松或胰岛素中的一种或多种。优选使用碱性成纤维细胞生长因子和地塞米松作为本发明中的生长因子和激素。碱性成纤维细胞生长因子和地塞米松一起可起相互协同作用或加成作用利于促进单克隆细胞的分化和增殖。其中，碱性成纤维细胞生长因子的添加量例如可以为，但不限于10ng/ml、12ng/ml、15ng/ml、18ng/ml或20ng/ml；地塞米松的添加量例如可以为，但不限于3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、6μg/ml、7μg/ml、8μg/ml、9μg/ml或10μg/ml。

优选地，所述基础培养基包括含有10％(w/w)胎牛血清白蛋白、15ng/ml碱性成纤维细胞生长因子和5μg/ml地塞米松的DMEM。

通过对基础培养基中各组分的添加量进行进一步的调整和优化，能够在有效控制成本的基础上，提高本发明提供的单克隆细胞培养基的营养成分，更利于单克隆细胞的分化和增值。

在一些优选的实施方式中，所述基础培养基与所述条件培养基的体积比为1～3:1，例如可以为，但不限于1:1、2:1或3:1，优选为2:1。当基础培养基与条件培养基的体积比为2:1时，各组分的配合效果更好，更有利于细胞生长。

基于本发明提供的单克隆细胞培养基的有益效果，本发明还提供了上述的单克隆细胞培养基在培养单克隆细胞中的应用。

应用本发明提供的单克隆培养基培养单克隆细胞，能够简化实验流程，避免多次换液带来细胞污染的风险，同时缩短了单克隆细胞形成集落的时间，提高了实验效率，此外，极大地提高了单克隆细胞的成活率。

根据本发明的第三个方面，还提供了一种培养单克隆细胞的方法，所述方法包括使用上述的单克隆细胞培养基进行培养。

本发明提供的单克隆细胞的培养方法，在单克隆细胞培养阶段采用本发明提供的单克隆细胞培养基，所以在单克隆细胞生长期间不需要反复换液直至单细胞克隆集落形成，避免了因换液带来的污染风险，操作简单，适于实验室推广应用。

在一些优选的实施方式中，所述方法包括在96孔平底细胞培养板中进行培养，所述96孔平底细胞培养板中每孔含有至少200μl的单克隆细胞培养基。

在单克隆细胞培养阶段于96孔细胞培养板中每孔加入200μl的单克隆细胞培养基，比现有技术增加了一倍的量，可以避免植入单克隆细胞的96孔板因长时间放置37℃、5％CO₂培养箱中因培养基质的损耗而影响细胞的生长，同时，双倍的培养基质也利于单克隆细胞的快速增殖。

此外，在单克隆细胞制备及培养阶段采用96孔平底细胞培养板，避免使用96孔U型细胞培养板，这样不仅便于镜下观察，有明确的底面积，还可以扩大单细胞克隆群的选择空间。实验发现，使用96孔平底细胞培养板更有利于保持细胞的活力，提高单克隆细胞的成活率；此外，因96孔平底细胞培养板底部面积较大，可以更加方便的对多余1个细胞的孔进行剔除，或者在多个细胞中选择生长最佳的细胞，这样做可以明显提高单细胞的分选率。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本发明实施例中用到的主要试剂信息如下：

实验选用的BHK21细胞及PK贴壁细胞由甘肃健顺生物科技有限公司赠予；DMEM培养基为甘肃兰州建顺公司生产，货号：1903006BLM；胎牛血清为Gibco公司生产，货号：1932594C；0.25％胰蛋白酶为Hyclone公司生产，货号：J170048；台盼蓝为BiologicalIndustries公司生产，货号：1847042；碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)为Cyagen公司生产，货号：HEGFP-0602；地塞米松为Solarbio公司生产，货号：No.320E053

实施例1

本实施例提供了一种单克隆细胞培养基，包括基础培养基和条件培养基，所述基础培养基和条件培养基的体积比为2:1。

所述基础培养基包括含有10％(w/w)胎牛血清白蛋白、15ng/ml碱性成纤维细胞生长因子和5μg/ml地塞米松的DMEM；

所述条件培养基的配制为：

①收集处于对数生长晚期的同源细胞系的培养基；

②将培养基于-20℃反复冻融两次；

③将培养基于1000r/min，离心10min；

④将离心后的培养基用0.22μm无菌过滤器过滤。

实施例2

本实施例提供了一种单克隆细胞培养基，与实施例1的区别仅在于，所述基础培养基包括含有8％(w/w)胎牛血清白蛋白、20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子和3μg/ml地塞米松的DMEM。

实施例3

本实施例提供了一种单克隆细胞培养基，与实施例1的区别仅在于，所述基础培养基包括含有12％(w/w)胎牛血清白蛋白、10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子和10μg/ml地塞米松的DMEM。

实施例4

本实施例提供了一种单克隆细胞培养基，与实施例1的区别仅在于，基础培养基为DMEM。

实施例5

本实施例提供了一种单克隆细胞培养基，与实施例1的区别仅在于，基础培养基中不含有碱性成纤维细胞生长因子。

实施例6

本实施例提供了一种单克隆细胞培养基，与实施例1的区别仅在于，基础培养基中不含有地塞米松。

实施例7

本实施例提供了一种单克隆细胞培养基，与实施例1的区别仅在于，所述条件培养基的配制不包括步骤④。

实施例8

本实施例提供了一种单克隆细胞培养基，与实施例1的区别仅在于，所述基础培养基和条件培养基的体积比为3:1。

实施例9

本实施例提供了一种单克隆细胞培养基，与实施例1的区别仅在于，所述基础培养基和条件培养基的体积比为1:1。

对比例1

本对比例提供了一种单克隆细胞培养基，与实施例1的区别仅在于，不含有基础培养基。

对比例2

本对比例提供了一种单克隆细胞培养基，与实施例1的区别仅在于，不含有条件培养基。

对比例3

本对比例提供了一种单克隆细胞培养基，与实施例1的区别仅在于，所述条件培养基的配制不包含步骤②。

对比例4

本对比例提供了一种单克隆细胞培养基，与实施例1的区别仅在于，所述条件培养基的配制不包含步骤③。

为了进一步验证本发明提供的单克隆细胞培养基的效果，进行如下实验：

实验例

1、单克隆细胞的制备与培养

本发明方法：

(1)取处于对数生长期的BHK21悬浮细胞/PK贴壁细胞(需先用0.25％胰蛋白酶进行消化)，进行计数；

(2)用细胞基本培养基DMEM先将细胞悬液稀释至1×10⁵个细胞/ml；

(3)取1×10⁵个细胞/ml 200μl，加至20ml(1:100)DMEM，成为1×10³个细胞/ml；

(4)取1×10³个细胞/ml 200μl，分别用实施例1-9及对比例1-4提供的单克隆细胞培养基加至20ml(1:100)，成为1×10个细胞/ml；

(5)将浓度为10个细胞/ml的悬液按每孔100μl的量分别接种到提前加有100μl实施例1-9及对比例1-4提供单克隆细胞培养基的96孔平底细胞培养板中；

(6)将96孔平底细胞培养板放入37℃、5％CO₂培养箱中培养；

(7)培养2h-4h后，取出96孔平底细胞培养板，于显微镜下观察，将只有单个细胞的孔用记号笔标出；

(8)将只有单个细胞的孔进行跟踪观察，pH下降表示细胞生长，通过显微镜观察确认，待细胞扩增出集落时继续进行逐级放大培养。

传统方法：

(1)取处于对数生长期的BHK21悬浮细胞或PK贴壁细胞，进行计数；

(2)用细胞培养基先将细胞悬液稀释至1×10⁵个细胞/ml；

(3)取1×10⁵个细胞/ml 200μl，加至20ml(1:100)细胞培养基，成为1×10³个细胞/ml；

(4)取1×10³个细胞/ml 200μl，加至20ml(1:100)细胞培养基，成为1×10个细胞/ml；

(5)将浓度为10个细胞/ml的悬液按每孔100μl的量接种到96孔细胞培养板；

(6)将96孔U型细胞培养板放入37℃、5％CO₂培养箱中培养；

(7)培养2h～4h后，取出96孔U型细胞培养板，于显微镜下观察，将只有单个细胞的孔、多于2个细胞的孔及空白孔用不同颜色的记号笔标出；

(8)将只有单个细胞的孔跟踪观察，pH下降表示细胞生长，通过显微镜观察确认，待细胞扩增出集落时继续进行逐级放大培养。

2、实验结果

(1)选用BHK21悬浮细胞，使用传统方法和使用本发明方法分别进行四批次实验，计算每批次实验中单克隆细胞的成活率及单克隆细胞形成集落的时间。由结果可以看出，使用本发明方法获得的单克隆细胞的平均成活率为88.9％，远远高于使用传统常规方法获得的单克隆细胞的平均成活率40.8％，且单克隆细胞集落形成的时间与传统方法相比也明显缩短。结果见表1、表2。对分选出的单个BHK21悬浮细胞及其形成的细胞集落进行镜检，结果如图1A和图1B所示。

表1 BHK21悬浮细胞单克隆细胞的成活率

表2 BHK21悬浮细胞单克隆细胞形成集落的时间

(2)选用PK贴壁细胞，使用传统方法和使用本发明方法分别进行四批次实验，计算每批次实验中单克隆细胞的成活率及单克隆细胞形成集落的时间。由结果可以看出，使用本发明方法获得的单克隆细胞的平均成活率为89.0％，远远高于使用传统常规方法获得的单克隆细胞的平均成活率40.4％，且单克隆细胞集落形成的时间与传统方法相比也明显缩短。结果见表3、表4。

表3 PK贴壁细胞单克隆细胞的成活率

表4 PK贴壁细胞单克隆细胞形成集落的时间

由结果1和结果2可以看出，与传统方法相比，悬浮细胞与贴壁细胞使用本发明方法获得的单克隆细胞的成活率约是使用传统方法的2.2倍，说明使用本发明提供的单克隆细胞培养基不仅可以大大提高悬浮细胞单克隆细胞的成活率也可以提高贴壁细胞单克隆细胞的成活率；此外，使用本发明提供的单克隆细胞培养基也缩短了单克隆细胞形成集落的时间，提高了实验效率。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种单克隆细胞培养基，其特征在于，所述单克隆细胞培养基包括基础培养基和条件培养基；

所述条件培养基包括经冻融及离心处理的同源细胞系的培养基。

2.根据权利要求1所述的单克隆细胞培养基，其特征在于，所述冻融包括在-25～-15℃温度下反复冻融；

优选地，所述冻融包括在-20℃温度下反复冻融2次；

优选地，所述离心的条件包括在800～1200r/min条件下离心8～12min；

优选地，所述离心的条件包括在1000r/min条件下离心10min。

3.根据权利要求1所述的单克隆细胞培养基，其特征在于，所述同源细胞系的培养基包括处于对数生长晚期的同源细胞系的培养基。

4.根据权利要求1所述的单克隆细胞培养基，其特征在于，在冻融和离心处理后还包括除菌的步骤；

优选地，采用过滤的方式进行除菌。

5.根据权利要求1所述的单克隆细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基包括基本培养基、白蛋白、生长因子和激素。

6.根据权利要求5所述的单克隆细胞培养基，其特征在于，所述基本培养基包括DMEM或MEM；

优选地，所述白蛋白包括胎牛血清白蛋白和/或转铁蛋白；

优选地，所述生长因子包括碱性成纤维细胞生长因子和/或表皮生长因子，优选为碱性成纤维细胞生长因子；

优选地，所述激素包括地塞米松、氢化可的松或胰岛素中的一种或多种，优选为地塞米松；

优选地，所述基础培养基包括含有8％～12％(w/w)胎牛血清白蛋白、10-20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子和3-10μg/ml地塞米松的DMEM；

优选地，所述基础培养基包括含有10％(w/w)胎牛血清白蛋白、15ng/ml碱性成纤维细胞生长因子和5μg/ml地塞米松的DMEM。

7.根据权利要求1-6任一项所述的单克隆细胞培养基，其特征在于，所述基础培养基与所述条件培养基的体积比为1～3:1，优选为2:1。

8.权利要求1-7任一项所述的单克隆细胞培养基在培养单克隆细胞中的应用。

9.一种培养单克隆细胞的方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1-7任一项所述的单克隆细胞培养基进行培养。

10.根据权利要求9所述的培养单克隆细胞的方法，其特征在于，所述方法包括在96孔平底细胞培养板中进行培养，所述96孔平底细胞培养板中每孔含有至少200μl的单克隆细胞培养基。

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