CN112391273A - 单细胞分离器及其在分离单细胞过程中的应用和单克隆细胞制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种单细胞分离器及其在分离单细胞过程中的应用和单克隆细胞制备方法，涉及单细胞分离技术领域。所述单细胞分离器包括移液针头和吸液装置，所述移液针头与吸液装置紧密且无泄漏连通，所述移液针头包括距离针口0.5～1cm处呈75～90°弯曲的静脉注射针头。使用本发明提供的单细胞分离器可以快速的从细胞液中对单细胞进行分离提取，有效缓解了现有单细胞分离方法中有限稀释法操作繁复以及流式细胞仪方法对设备要求高的问题。
Description
技术领域
本发明涉及单细胞分离技术领域，尤其是涉及一种单细胞分离器及其在分离单细胞过程中的应用和单克隆细胞制备方法。
背景技术
群体细胞中，由于细胞与细胞之间存在异质性，即使不同代次的同一细胞系或相同代次的不同细胞株之间的细胞对于病毒的敏感性、病毒粒子包装的完整性或病毒制备的有效性均会出现差异性。因此，单细胞分离对克服细胞异质性有着十分重要的意义。另外，对于细胞转染、感染等试验来说，选取单个细胞对于建立特定基因或表达特定蛋白的克隆来说更是十分必要的。因为只有单一基因的细胞群才能最大限度的保持种群稳定性。为了将高产优质的细胞从细胞群体中筛选出来，通常会进行细胞的单克隆筛选，将高产优质的单个细胞从细胞群体中筛选出来，进行扩繁，建立细胞库，从事生物制品生产使用。
目前，主要通过有限稀释法或流式细胞仪等方法从群体细胞中实现单细胞的分离。有限稀释法是最为常用的单细胞克隆方法，其操作步骤是将细胞悬液计数后进行梯度稀释接种至96孔板。实际操作中，该方法效率不高，一般单细胞收获效率在20％左右，大量存在空白孔和多细胞孔，需要进行2-3次克隆才能确保细胞的单克隆性。因此，有限稀释法工作量大、消耗时间长。而流式细胞仪虽可自动进行单细胞筛选，但仪器设备价格昂贵，难以普及，且在筛选细胞过程中加入一些化学物质，对分离后的细胞生长可能会造成一些化学性影响。
因此，研究开发出一种简单、高效的单细胞分离器，提高单细胞分离的成功率和分离效率，以缓解现有单细胞分离方法存在的问题，变得十分必要和迫切。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种单细胞分离器，所述单细胞分离器可以快速的从细胞液中对单细胞进行分离提取，有效缓解了现有单细胞分离方法中有限稀释法操作复杂以及流式细胞仪方法对设备要求高的问题。
本发明的第二目的在于提供一种上述单细胞分离器在分离单细胞过程中的应用。
本发明的第三目的在于提供一种单克隆细胞制备方法。
本发明提供的一种单细胞分离器，所述单细胞分离器包括移液针头和吸液装置。
所述移液针头与吸液装置紧密且无泄漏连通，所述移液针头包括距离针口0.5～1cm处呈75～90°弯曲的静脉注射针头。
进一步的，所述吸液装置包括10ul、20ul、30ul、100ul或200ul中的一种，优选为20ul的移液器。优选地，所述吸液装置为20ul的移液器。
进一步的，所述移液针头包括距离针口0.8～1cm处呈85～90°弯曲的静脉注射针头。
更进一步的，所述移液针头为距离针口0.8cm处呈90°弯曲的静脉注射针头。
进一步的，所述移液针头的针口为平口。
本发明提供的一种上述单细胞分离器在分离单细胞过程中的应用。
进一步的，所述单细胞包括贴壁细胞和/或悬浮细胞。
本发明提供的一种单克隆细胞制备方法，所述方法包括以下步骤：
提供含悬浮细胞的细胞液，随后在显微镜下，利用上述单细胞分离器对细胞液中的单细胞进行吸取，随后对单细胞进行培养，得到单克隆细胞；
或，提供含贴壁细胞的细胞液，随后在显微镜下，利用上述单细胞分离器对细胞液中的单细胞进行吸取，随后对单细胞进行培养，得到单克隆细胞。
进一步的，所述含悬浮细胞或贴壁细胞的细胞液中的细胞密度为200～250×104cells/ml。
进一步的，所述培养包括在35～40℃下培养2～4h，优选为在37℃下培养3h；
优选地，所述培养的气体环境，按体积百分比计，二氧化碳占5％，空气占95％。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的一种单细胞分离器，所述单细胞分离器包括移液针头和吸液装置，所述移液针头与吸液装置紧密且无泄漏连通，所述移液针头包括距离针口0.5～1cm处呈75～90°弯曲的静脉注射针头。使用本发明提供的单细胞分离器可以快速的从细胞液中对单细胞进行分离提取，该分离单细胞装置具有取材容易、制作简单、操作直观可靠、分离成功率高、易于推广普及的特点不仅仅适合于贴壁细胞，也适用于悬浮细胞，进而有效缓解了现有单细胞分离方法中有限稀释法操作繁复以及对流式细胞仪方法对设备要求高的问题。
本申请提供的上述单细胞分离器可以广泛应用于单细胞分离的过程中。
本发明提供的单克隆细胞制备方法，该方法首先提供含贴壁细胞或悬浮细胞的细胞液，随后在显微镜下，利用上述单细胞分离器对细胞液中的单细胞进行吸取，随后对单细胞进行培养，得到单克隆细胞。上述方法通过单细胞分离器和显微镜的结合，从而实现了单细胞的可视化分离，具有目标明确、分离效率高的优势，有效提高了单克隆细胞的制备效率；同时，也有效避免了现有单细胞分离过程中细胞计数及反复稀释等繁杂操作，具有节约实验时间的优势。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的单细胞分离器的结构示意图。
图标：1-吸液装置；2-移液针头。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面，一种单细胞分离器，所述单细胞分离器包括移液针头2和吸液装置1。
所述移液针头2与吸液装置1紧密且无泄漏连通，所述移液针头2包括距离针口0.5～1cm处呈75～90°弯曲的静脉注射针头。
本发明提供的一种单细胞分离器，所述单细胞分离器包括移液针头2和吸液装置1，所述移液针头2与吸液装置1紧密且无泄漏连通，所述移液针头2包括距离针口0.5～1cm处呈75～90°弯曲的静脉注射针头。使用本发明提供的单细胞分离器可以快速的从细胞液中对单细胞进行分离提取，该分离单细胞装置具有取材容易、制作简单、操作直观可靠、分离成功率高、易于推广普及的特点不仅仅适合于贴壁细胞，也适用于悬浮细胞，进而有效缓解了现有单细胞分离方法中有限稀释法操作繁复以及对流式细胞仪方法对设备要求高的问题。
在本发明的一种优选实施方式中，所述吸液装置1包括10ul、20ul、30ul、100ul或200ul中的一种，优选为20ul的移液器。
作为一种优选的实施方式，上述吸液装置1为20ul的移液器，20ul的移液器可以与最小号注射器针头进行无缝隙连接不仅操作简便，而且移液内置滤芯，避免细胞污染。
在本发明的一种优选实施方式中，所述移液针头2包括距离针口0.8～1cm处呈85～90°弯曲的静脉注射针头。
作为一种优选的实施方式，上述移液针头2为利用小号的静脉注射针的针头在距离针口0.8～1cm处弯折85～90°制得，上述静脉注射针的针头纤细柔软，具有一定韧性，可以一定的角度范围内弯曲有利于进入微量或异性容器进行取液、加液等操作；同时，20ul的移液器具有良好的控制液体的速度和力度的优势，将两者进行组合，从而制成了一种简单高效的单细胞分离的装置。
在上述优选实施方式中，本发明使用小号的静脉注射针是因为注射针头纤细柔软，具有一定韧性，可以以一定的角度范围内弯曲有利于进入微量或异性容器进行取液、加液等操作；同时，弯曲位置是可以根据后面用到的无菌培养平皿的深度来订的，因为后面的单细胞筛选是用的70mm的无菌培养平皿，它的深度是15mm，但一般加入5-6mm深度的细胞悬液即可，所以移液针头2为距离针口0.8cm处弯曲。弯曲的角度应该为90°，首先在此角度下可避免吸入的单细胞悬液倒吸入移液器造成细胞污染；其次是因为90°弯曲易于在显微镜下对细胞悬液进行单细胞的分选，如果弯曲角度大于或者小于90°的话，移液针头2为倾斜的，不利于在显微镜下对细胞悬液中的单细胞进行分选。
在上述优选实施方式中，所述移液针头2为距离针口0.8cm处呈90°弯曲的静脉注射针头。
在本发明的一种优选实施方式中，所述移液针头2的针口为平口。
作为一种优选的实施方式，上述移液针头2的针口为平口可以增加针头与细胞的接触面积，提高对细胞悬液中单细胞的分选效率；同时减小针头对细胞膜的损伤，增加细胞的成活率。
根据本发明的一个方面，一种上述单细胞分离器在分离单细胞过程中的应用。
本申请提供的上述单细胞分离器可以广泛应用于单细胞分离的过程中。
在本发明的一种优选实施方式中，所述单细胞包括贴壁细胞和/或悬浮细胞。
作为一种优选的实施方式，上述单细胞不仅包括贴壁细胞，还包括悬浮细胞，因此，本申请单细胞分离器具有应用范围更广的优势。
根据本发明的一个方面，一种单克隆细胞制备方法，所述方法包括以下步骤：
提供含悬浮细胞的细胞液，随后在显微镜下，利用上述单细胞分离器对细胞液中的单细胞进行吸取，随后对单细胞进行培养，得到单克隆细胞；
或，提供含贴壁细胞的细胞液，随后在显微镜下，利用上述单细胞分离器对细胞液中的单细胞进行吸取，随后对单细胞进行培养，得到单克隆细胞。
本发明提供的单克隆细胞制备方法，该方法首先提供含贴壁细胞或悬浮细胞的细胞液，随后在显微镜下，利用上述单细胞分离器对细胞液中的单细胞进行吸取，随后对单细胞进行培养，得到单克隆细胞。上述方法通过单细胞分离器和显微镜的结合，从而实现了单细胞的可视化分离，具有目标明确、分离效率高的优势，有效提高了单克隆细胞的制备效率；同时，也有效避免了现有单细胞分离过程中细胞计数及反复稀释等繁杂操作，具有节约实验时间的优势。
在本发明的一种优选实施方式中，所述含悬浮细胞或贴壁细胞的细胞液中的细胞密度为200～250×104cells/ml。
在本发明的一种优选实施方式中，所述培养为在37℃下培养3h；
作为一种优选的实施方式，上述培养条件在37℃下培养3h，一方面使细胞适应培养基环境，另一方面有助于细胞的稳定与贴附，利于后期对含有单个细胞的孔进行筛选。
在本发明的一种优选实施方式中，所述培养的气体环境，按体积百分比计，二氧化碳占5％，空气占95％。
作为一种优选的实施方式，上述5％二氧化碳气体环境中，CO2的作用是维持细胞培养液中pH的相对稳定，模拟形成一个类似细胞/组织在生物体内的生长环境，利于细胞的生长。
下面发明人将结合实施例和对比例对本发明的技术方案进行进一步地说明。
实施例1
图1为实施例1提供的单细胞分离器的结构示意图；其中：吸液装置1，即20ul的移液器；移液针头2，即距离针口约0.8cm处折成约90°的注射器针头。
如图1所示，一种单细胞分离器，所述单细胞分离器的制备方法，包括以下步骤：
首先，取一枚注射器针头，用剪刀将针尖部分剪去，并将其磨平；随后用止血钳将针头距离针口约0.8cm处折成约90°；然后，将折成约90°的注射器针头的尾部与20ul的移液器连接，制得单细胞分离装置。
实施例2
一种单细胞分离器，所述单细胞分离器的制备方法，包括以下步骤：
首先，取一枚注射器针头，用剪刀将针尖部分剪去，并将其磨平；随后用止血钳将针头距离针口约0.5cm处折成约75°；然后，将折成约75°的注射器针头的尾部与20ul的移液器连接，制得单细胞分离装置。
实施例3
一种单细胞分离器，所述单细胞分离器的制备方法，包括以下步骤：
首先，取一枚注射器针头，用剪刀将针尖部分剪去，并将其磨平；随后用止血钳将针头距离针口约1cm处折成约90°；然后，将折成约90°的注射器针头的尾部与20ul的移液器连接，制得单细胞分离装置。
实施例4
一种单克隆细胞制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)取一个直径为70mm，深度为15cm的无菌培养平皿，预先加入深约0.5cm的37℃预热的细胞培养基；用3ml吸管吸取吹匀的BHK21悬浮细胞悬液1～2滴，滴入培养平皿中，轻轻晃动平血，使细胞分散均匀，必要时，可将细胞先进行一定量的稀释，以提高单细胞的挑选机率；
所述细胞培养基由基础培养基与条件培养基以2:1的比例混匀后制得，其中：所述基础培养基为添加了10％FBS、10-20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和3-10ug/ml地塞米松的DMEM/F12培养基，该培养基中，碱性成纤维细胞生长因子和地塞米松一起可起相互协同作用或加成作用利于促进单克隆细胞的分化和增殖；此外，添加了10％FBS，提高了培养基中的营养成分，利于细胞生长；
所述条件培养基，为收集处于对数生长晚期的同源细胞系的培养基后，将培养基于-20℃反复冻融两次，随后1000r/min离心10min，并用0.22um无菌过滤器过滤后，制得的条件培养基。
(2)、将平皿置于显微镜的载物台上，将实施例1制得的单细胞分离器调至10ul，用手按压使其处于负压状态，寻找圆且透亮的单个BHK21悬浮细胞，进行吸取；
(3)、将吸取的单个细胞放入预先加有细胞培养基的96孔细胞培养板中；将装有单个细胞的96孔细胞培养板放入37℃、5％CO2培养箱中培养2h～4h后，取出96孔细胞培养板，于显微镜下观察，将只有单个细胞的孔、多于2个细胞的孔及空白孔用不同颜色的记号笔标出；
(4)、将只有单个细胞的孔进行跟踪观察，pH下降表示细胞生长，通过显微镜观察确认，待细胞扩增出集落时继续进行逐级放大培养，得到单克隆细胞。
实施例5
本实施例处将实施例4步骤(2)中实施例1制得的单细胞分离器替换为实施例2制得的单细胞分离器外，其余同实施例4。
实施例6
本实施例处将实施例4步骤(2)中实施例1制得的单细胞分离器替换为实施例3制得的单细胞分离器外，其余同实施例4。
对比例1
一种BHK21悬浮培养细胞单细胞分离培养的常规方法(有限稀释法)，包括以下步骤：
(1)、取处于对数生长期的BHK21悬浮细胞，进行计数；
(2)、用细胞培养基先将细胞悬液稀释至1×105个细胞/ml；
(3)、取1×105个细胞/ml200ul，加至20ml(1:100)细胞培养基，成为1×103个细胞/ml；
(4)、取1×103个细胞/ml200ul，加至20ml(1:100)细胞培养基，成为1×10个细胞/ml；
(5)、将浓度为10个细胞/ml的悬液按每孔100ul的量接种到96孔细胞培养板；
(6)、将96孔细胞培养板放入37℃、5％CO2培养箱中培养；
(7)、培养2h～4h后，取出96孔细胞培养板，于显微镜下观察，将只有单个细胞的孔、多于2个细胞的孔及空白孔用不同颜色的记号笔标出；
(8)、将只有单个细胞的孔进行跟踪观察，pH下降表示细胞生长，通过显微镜观察确认，待细胞扩增出集落时继续进行逐级放大培养。
效果例1
为表明本申请单克隆细胞制备方法相对于现有常规的有限稀释法具有分离效率高的优势，现特利用96孔细胞培养板，使用实施例4以及对比例1的单克隆细胞制备方法对BHK21悬浮细胞悬液进行分离实验，其结果如下表所示：
由上表可知，使用本发明实施例4方法从BHK21悬浮细胞悬液中分离单细胞，在不同日期的4次检测中，其克隆率均在93.8％以上，平均单细胞克隆率为95.8％，而使用对比例1常规稀释方法分离的单细胞克隆率4次均在20％左右，平均单细胞克隆率为20.3％。由此可以得出，使用本发明方法分离单细胞的克隆率是使用常规稀释方法分离单细胞的克隆率的4.7倍，使用本发明方法极大地提高了筛选单细胞的工作效率。另外，使用本发明方法分离单细胞省去了繁琐的细胞计数与倍比稀释步骤，简化了实验流程，缩短了实验时间。
实施例7
本实施例处将实施例4步骤(1)中的BHK21悬浮细胞悬液替换为PK贴壁细胞悬液外，其余同实施例4。
对比例2
一种PK贴壁细胞单细胞分离培养的常规方法(有限稀释法)，包括以下步骤：
(1)将长满单层底面的PK贴壁细胞用0.25％的胰蛋白酶进行消化，形成细胞悬液后计数；
(2)用细胞培养基先将细胞悬液稀释至1×105个细胞/ml；
(3)取1×105个细胞/ml200ul，加至20ml(1:100)细胞培养基，成为1×103个细胞/ml；
(4)取1×103个细胞/ml200ul，加至20ml(1:100)细胞培养基，成为1×10个细胞/ml；
(5)将浓度为10个细胞/ml的悬液按每孔100ul的量接种到96孔细胞培养板；
(6)将96孔细胞培养板放入37℃、5％CO2培养箱中培养；
(7)培养2h～4h后，取出96孔细胞培养板，于显微镜下观察，将只有单个细胞的孔、多于2个细胞的孔及空白孔用不同颜色的记号笔标出；
(8)将只有单个细胞的孔进行跟踪观察，pH下降表示细胞生长，通过显微镜观察确认，待细胞扩增出集落时继续进行逐级放大培养。
效果例2
为表明本申请单克隆细胞制备方法同样可以从贴壁细胞中分离单细胞，且相对于现有常规的有限稀释法具有分离效率高的优势，现特利用96孔细胞培养板，使用实施例7以及对比例2的单克隆细胞制备方法对PK贴壁细胞悬液进行分离实验，其结果如下表所示：
由上表可知，使用本发明实施例7方法从PK贴壁细胞悬液中分离单细胞，在不同日期的4次检测中，其克隆率均在93.8％以上，平均单细胞克隆率为96.4％，而使用对比例2常规稀释方法分离的单细胞克隆率4次均在20％左右，平均单细胞克隆率为20.1％。结果得出，使用本发明方法分离单细胞的克隆率是使用常规稀释方法分离单细胞的克隆率的4.8倍，使用本发明方法极大地提高了筛选单细胞的工作效率。另外，使用本发明方法分离单细胞省去了繁琐的细胞计数与倍比稀释步骤，简化了实验流程，缩短了实验时间。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种单细胞分离器，其特征在于，所述单细胞分离器包括移液针头和吸液装置，
所述移液针头与吸液装置紧密且无泄漏连通，所述移液针头包括距离针口0.5～1cm处呈75～90°弯曲的静脉注射针头。
2.根据权利要求1所述的单细胞分离器，其特征在于，所述吸液装置包括10ul、20ul、30ul、100ul或200ul中的一种，优选为20ul的移液器。
3.根据权利要求1所述的单细胞分离器，其特征在于，所述移液针头包括距离针口0.8～1cm处呈85～90°弯曲的静脉注射针头。
4.根据权利要求3所述的单细胞分离器，其特征在于，所述移液针头为距离针口0.8cm处呈90°弯曲的静脉注射针头。
5.根据权利要求1～4任一项所述的单细胞分离器，其特征在于，所述移液针头的针口为平口。
6.一种根据权利要求1～5任一项所述的单细胞分离器在分离单细胞过程中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述单细胞包括贴壁细胞和/或悬浮细胞。
8.一种单克隆细胞制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
提供含悬浮细胞的细胞液，随后在显微镜下，利用权利要求1～5任一项所述的单细胞分离器对细胞液中的单细胞进行吸取，随后对单细胞进行培养，得到单克隆细胞；
或，提供含贴壁细胞的细胞液，随后在显微镜下，利用权利要求1～5任一项所述的单细胞分离器对细胞液中的单细胞进行吸取，随后对单细胞进行培养，得到单克隆细胞。
9.根据权利要求8所述的单克隆细胞制备方法，其特征在于，所述含悬浮细胞或贴壁细胞的细胞液中的细胞密度为200～250×104cells/ml。
10.根据权利要求8所述的单克隆细胞制备方法，其特征在于，所述培养包括在35～40℃下培养2～4h，优选为在37℃下培养3h；
优选地，所述培养的气体环境，按体积百分比计，二氧化碳占5％，空气占95％。
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