CN114621973A - 一种制备转基因玉米花粉的方法及其使用的试剂盒 - Google Patents

一种制备转基因玉米花粉的方法及其使用的试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN114621973A
CN114621973A CN202210532986.1A CN202210532986A CN114621973A CN 114621973 A CN114621973 A CN 114621973A CN 202210532986 A CN202210532986 A CN 202210532986A CN 114621973 A CN114621973 A CN 114621973A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pollen
corn
transgenic
peg
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210532986.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114621973B (zh
Inventor
吴忠义
张中保
王作平
郑登俞
张春
李向龙
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Original Assignee
Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences filed Critical Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences
Priority to CN202210532986.1A priority Critical patent/CN114621973B/zh
Publication of CN114621973A publication Critical patent/CN114621973A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114621973B publication Critical patent/CN114621973B/zh
Priority to PCT/CN2022/127515 priority patent/WO2023221402A1/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明公开了一种制备转基因玉米花粉的方法及其使用的试剂盒。该方法包括如下步骤：向玉米花粉中加入8℃预冷的玉米花粉培养液，混匀，之后8℃处理10min，得到开孔预处理液；之后加入携带目的基因的质粒和PEG转化液，混匀，之后8℃处理20min；收集沉淀并干燥，获得转基因玉米花粉；转基因玉米花粉中含有目的基因。玉米花粉培养液由蔗糖、H3BO3、KNO3、Ca(NO3)2·4H2O、MnSO4·H2O、MgSO4·7H2O、GA3和水组成。本发明提供的方法价格低廉，既能通过低温环境保持大部分的玉米花粉活力，又能提高外源DNA的导入效率，且不受玉米基因型限制。本发明具有重要的应用价值。

Description

一种制备转基因玉米花粉的方法及其使用的试剂盒
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种制备转基因玉米花粉的方法及其使用的试剂盒。
背景技术
玉米（Zea mays L.）的种植面积及产量在世界粮食作物中占据前列。玉米为食品、饲料、生物燃料和工业加工提供了丰富原料，其种业市场规模巨大，是国际种业巨头激烈竞争的主战场。随着人口数量的增加和玉米深加工技术的不断发展，玉米市场需求不断增大，且面临着来自各种生物和非生物胁迫的严峻挑战，因而玉米产量和品质的提升迫在眉睫。为了应对这一供需不平衡的现状，生物技术在玉米提升产量和品质方面发挥着举足轻重的作用，其中转基因和基因编辑技术已经被证实是开发植物新品种的高效工具。自1988年第一个基于原生质体电穿孔的玉米转化成功以来，科学家们已经开发了多种DNA导入植物细胞的方法，如基因枪法、农杆菌介导法、PEG介导法、脂质体介导法、碳化硅介导法、显微注射法等。目前外源DNA导入玉米的方法主要依赖于成熟的组织培养技术，生产和应用成本高，周期长，且容易受基因型限制，仅适用于少数几种玉米，无法直接应用于商品化品种的大规模的生产实践，特别是近年兴起的基因编辑分子育种在玉米中的应用受到极大限制。目前已有采用不受基因型限制的纳米磁珠介导的玉米花粉转化方法，虽然操作简便，但仍需采购价格昂贵的进口磁珠和磁板才能保证较好的转化效果，平均转化每穗玉米的成本在20-30元左右，而假如单纯依赖进口，货源和货期都难保证，很容易被“卡脖子”，进而影响玉米转化的研究进程。因此，在所有玉米品种（即玉米品种不受基因型限制）中建立一种高效、便捷、低成本的DNA导入方法具有重要的现实意义和广阔的市场应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种在所有玉米品种（即玉米品种不受基因型限制）中获得转基因玉米花粉的方法。
本发明首先保护一种制备转基因玉米花粉的方法，可包括如下步骤：
（1）向玉米花粉中加入4-10℃（如4-6℃、6-8℃、8-10℃、4℃、6℃、8℃或10℃）预冷的玉米花粉培养液，混匀，之后4-10℃（如4-6℃、6-8℃、8-10℃、4℃、6℃、8℃或10℃）处理5-15min（如5-10min、10-15min、5min、10min或15min），得到开孔预处理液；
所述玉米花粉培养液的溶质及其浓度可为蔗糖0.4-0.6mol/L（如0.4-0.5mol/L、0.5-0.6mol/L、0.4mol/L、0.5mol/L或0.6mol/L）、H3BO3 0.8-1.2mmol/L（如0.8-1.0mmol/L、1.0-1.2mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L或1.2mmol/L）、KNO3 0.8-1.2mmol/L（如0.8-1.0mmol/L、1.0-1.2mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L或1.2mmol/L）、Ca(NO3)2·4H2O 0.8-1.2mmol/L（如0.8-1.0mmol/L、1.0-1.2mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L或1.2mmol/L）、MnSO4·H2O 0.8-1.2mmol/L（如0.8-1.0mmol/L、1.0-1.2mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L或1.2mmol/L）、MgSO4·7H2O 0.8-1.2mmol/L（如0.8-1.0mmol/L、1.0-1.2mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L或1.2mmol/L）和GA3 0.08-0.12mmol/L（如0.08-0.10mmol/L、0.10-0.12mmol/L、0.08mmol/L、0.10mmol/L或0.12mmol/L），溶剂为水；
（2）向步骤（1）得到的开孔预处理液中加入携带目的基因的质粒和PEG转化液，混匀，之后4-10℃（如4-6℃、6-8℃、8-10℃、4℃、6℃、8℃或10℃）处理15-25min（如15-20min、20-25min、15min、20min或25min）；
所述PEG转化液的溶质及其浓度可为PEG 3350或PEG 4000 300-500g/L（如300-400g/L、400-500g/L、300g/L、400g/L或500g/L）、Ca(NO3)2 0.08-0.12mol/L（如0.08-0.10mol/L、0.10-0.12mol/L、0.08mol/L、0.10mol/L或0.12mol/L）和甘露醇0.18-0.22mol/L（如0.18-0.20mol/L、0.20-0.22mol/L、0.18mol/L、0.20mol/L或0.22mol/L），溶剂为水；
（3）完成步骤（2）后，收集沉淀并干燥，获得转基因玉米花粉；
转基因玉米花粉中含有目的基因。
上述方法中，所述玉米花粉培养液的溶质及其浓度具体可为蔗糖0.5mol/L、H3BO31mmol/L、KNO3 1mmol/L、Ca(NO3)2·4H2O 1mmol/L、MnSO4·H2O 1mmol/L、MgSO4·7H2O1mmol/L和GA3 0.1mmol/L，溶剂为水。
上述方法中，所述PEG转化液的溶质及其浓度具体可为PEG 3350或PEG 4000400g/L、Ca(NO3)2 0.1mol/L和甘露醇 0.2 mol/L，溶剂为水。
上述方法中，所述4-10℃预冷的玉米花粉培养液可为8℃预冷的玉米花粉培养液。
上述方法中，所述步骤（1）中，4-10℃处理5-15min具体可为8℃处理10min；
上述方法中，所述步骤（2）中，4-10℃处理15-25min具体可为4-10℃处理20min。
上述方法中，玉米花粉、玉米花粉培养液、质粒和PEG转化液的比例可为2g：（3-5）mL：（100-1000）μg：（4-6）mL（如2g：3mL：100μg：4mL、2g：4mL：500μg：5mL或2g：5mL：1000μg：6mL）。
上述方法中，所述步骤（3）中，收集沉淀并干燥的步骤依次包括：
（3-1）弃上清，用所述玉米花粉培养液洗涤；
（3-2）收集花粉沉淀，吸干表水；
（3-3）加入淀粉再次干燥。
所述步骤（3-3）中，淀粉可为玉米淀粉。
本发明还保护一种培育转基因玉米的方法，可包括如下步骤：
（1）采用上述任一所述的方法制备转基因玉米花粉；转基因玉米花粉中含有目的基因；
（2）将步骤（1）制备的转基因玉米花粉对玉米雌穗进行授粉，得到转基因玉米；所述转基因玉米含有所述目的基因。
本发明还保护一种试剂盒，由上述任一所述玉米花粉培养液和上述任一所述PEG转化液组成；
所述试剂盒用于制备转基因玉米花粉或培育转基因玉米；所述转基因玉米由转基因玉米花粉对玉米雌穗进行授粉获得。
本发明还保护上述试剂盒在制备转基因玉米花粉或培育转基因玉米中的应用；
所述转基因玉米由转基因玉米花粉对玉米雌穗进行授粉获得。
本发明还保护上述任一所述的方法在培育转基因玉米中的应用；所述转基因玉米由上述任一所述的方法制备的转基因玉米花粉对玉米雌穗进行授粉获得。
上述任一所述玉米不受玉米基因型限制，即可为任一玉米品种。
在本发明的实施例中，上述任一所述玉米具体可为玉米自交系京92、玉米自交系郑58、玉米自交系HZ178或玉米自交系178。
传统的玉米转基因技术如基因枪法、农杆菌介导法等，大多依赖于组织培养，生产和应用成本高，周期长，且容易受基因型限制，无法直接应用于大规模的生产实践，特别是基因编辑的应用存在瓶颈问题。本发明建立了一种可以高效、便捷、低成本的向玉米导入DNA的方法，其具有如下优点：（1）采用PEG介导的制备转基因玉米花粉的方法，试剂价格非常低廉，平均转化每穗玉米使用PEG成本在1元左右，具有更广泛的适用性。（2）在低温环境中对玉米花粉进行转化，降低了花粉内降解酶的活力，更有利于保持花粉活力状态和完整度。（3）花粉在低温条件下用玉米花粉培养液进行预处理，可以诱导花粉孔的盖子打开，破除了细胞壁的障碍，有利于PEG介导外源DNA通过花粉孔进入花粉细胞，提高转化效率（玉米的花粉孔通常是带盖的，直接进行PEG转化，PEG将外源DNA导入花粉的效率仅为2.6%。而在能维持玉米花粉活力的8℃低温条件下，用玉米花粉培养液预处理10min，40-56%的玉米花粉孔盖打开，此时PEG将外源DNA导入花粉的效率可提高至10%，玉米幼胚的检测GUS基因的表达效率达38%）。（4）本发明提供的方法操作快捷，从收集玉米花粉到完成转化并授粉的整个过程可在0.5-1h完成，最大限度的保持了玉米花粉的活力，提高了授粉雌穗的结实率，获得更多的转基因种子，以供后续筛选鉴定。（5）本发明提供的方法简便高效，仅需提供常规制冷设备即可完成转化，无需昂贵的仪器设备，不受玉米基因型限制，可在田间和基地实现大规模玉米转化。综上所述，本发明提供的方法价格低廉，不受导入方向限制，既能通过低温环境保持大部分的玉米花粉活力，又能提高外源DNA的导入效率，不受玉米基因型限制。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为PEG介导的制备转基因玉米花粉的流程示意图。
图2为转基因玉米花粉授粉后玉米的结实情况。
图3为天然玉米花粉孔以及用培养液I和培养液Ⅱ在8℃下处理后玉米花粉孔的表面结构比较。
图4为重组质粒pUbi-RFP的结构示意图。
图5为实施例4步骤二中空白组、实验组一、实验组二和实验组三的部分检测荧光检测结果。
图6为重组质粒pE35S-GUS的结构示意图。
图7为实施例5步骤二中空白组、实验组一、实验组二和实验组三的GUS蛋白在部分玉米乳熟胚中的表达结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
PEG 3350、PEG 4000和甘露醇均为Sigma公司的产品。
蔗糖、H3BO3、KNO3、Ca(NO3)2·4H2O、MnSO4·H2O、MgSO4·7H2O和GA3均为国药试剂有限公司的产品。
实施例1、PEG介导的制备转基因玉米花粉的方法的建立
本发明的发明人经过大量实验，建立了PEG介导的制备转基因玉米花粉的方法。具体步骤如下：
1、取粉
用纸袋收集盛花期玉米自交系的新鲜花粉（见图1中A），之后装入塑料自封袋；将塑料自封袋夹在8℃预冷的冰袋之间，共同置于冰盒，迅速带回室内。
2、过筛去杂
取步骤1获得的新鲜花粉，过筛（100目），获得花粉（见图1中B）。
3、低温开孔预处理
将步骤2获得的花粉2g转移至圆形塑料培养皿（直径为7cm）中，加入4mL 8℃预冷的玉米花粉培养液，搅拌均匀；之后8℃静置10min（目的为低温开孔），得到开孔预处理液。
玉米花粉培养液的溶质及其浓度为蔗糖0.5mol/L、H3BO3 1mmol/L、KNO3 1mmol/L、Ca(NO3)2·4H2O 1mmol/L、MnSO4·H2O 1mmol/L、MgSO4·7H2O 1mmol/L和GA3 0.1mmol/L，溶剂为ddH2O。
4、转化
（1）提取获得质粒，并用ddH2O稀释，得到浓度为1μg/μL的质粒溶液，-20℃冻存。质粒溶液需避免反复冻融，转化前，将质粒溶液取出，室温融化。
质粒上携带目的基因。
（2）向完成步骤3的开孔预处理液中加入0.5mL步骤（1）得到的质粒溶液，轻柔搅匀；之后加入5mL PEG转化液，轻柔搅匀；最后8℃静置转化20min（期间轻柔晃匀一次；见图1中C）。
PEG转化液的溶质及其浓度为PEG 3350 400g/L、Ca(NO3)2 0.1mol/L和甘露醇0.2mol/L，溶剂为ddH2O。
5、吸干加淀粉
（1）完成步骤4后，小心吸尽上清，加入10mL玉米花粉培养液，轻柔搅匀，洗涤花粉1次。
（2）完成步骤（1）后，待花粉沉降至皿底，小心吸去7mL上清，晃匀，之后转移至300目尼龙布上，用滤纸吸干表水。
（3）完成步骤（2）后，加入3g玉米淀粉，用干净牙刷刷成细末，得到干燥花粉（见图1中D）。该干燥花粉即为制备的转基因玉米花粉。
用制备的转基因玉米花粉对提前套袋的正在吐丝的10个玉米自交系雌穗（提取1-2天修剪花丝）进行授粉，自然成熟。
授粉18天后玉米的结实情况见图1中E。
平均每穗结玉米籽粒约60-70粒（见图2）。
按照上述步骤，将PEG 3350替换为PEG 4000，其它步骤均不变。结果表明，替换为PEG 4000的结果与PEG 3350均无显著差异。
实施例2、玉米花粉培养液中蔗糖浓度对玉米花粉的影响
1、配制玉米花粉培养液1—玉米花粉培养液5。具体如下：
玉米花粉培养液1的溶质及其浓度为蔗糖0.3mol/L、H3BO3 1mmol/L、KNO3 1mmol/L、Ca(NO3)2·4H2O 1mmol/L、MnSO4·H2O 1mmol/L、MgSO4·7H2O 1mmol/L和GA3 0.1mmol/L，溶剂为ddH2O。
玉米花粉培养液2的溶质及其浓度为蔗糖0.4mol/L、H3BO3 1mmol/L、KNO3 1mmol/L、Ca(NO3)2·4H2O 1mmol/L、MnSO4·H2O 1mmol/L、MgSO4·7H2O 1mmol/L和GA3 0.1mmol/L，溶剂为ddH2O。
玉米花粉培养液3的溶质及其浓度为蔗糖0.5mol/L、H3BO3 1mmol/L、KNO3 1mmol/L、Ca(NO3)2·4H2O 1mmol/L、MnSO4·H2O 1mmol/L、MgSO4·7H2O 1mmol/L和GA3 0.1mmol/L，溶剂为ddH2O。
玉米花粉培养液4的溶质及其浓度为蔗糖0.6mol/L、H3BO3 1mmol/L、KNO3 1mmol/L、Ca(NO3)2·4H2O 1mmol/L、MnSO4·H2O 1mmol/L、MgSO4·7H2O 1mmol/L和GA3 0.1mmol/L，溶剂为ddH2O。
玉米花粉培养液5的溶质及其浓度为蔗糖0.7mol/L、H3BO3 1mmol/L、KNO3 1mmol/L、Ca(NO3)2·4H2O 1mmol/L、MnSO4·H2O 1mmol/L、MgSO4·7H2O 1mmol/L和GA3 0.1mmol/L，溶剂为ddH2O。
2、用纸袋收集盛花期玉米自交系京92的新鲜花粉，之后装入塑料自封袋；将塑料自封袋夹在8℃预冷的冰袋之间，共同置于冰盒，迅速带回室内。
3、取步骤2获得的新鲜花粉，过筛（100目），获得花粉。
4、在玻底皿（直径3cm，凹面直径2cm）中精确称取5mg花粉（约2×104粒花粉），之后加入200μL玉米花粉培养液1、玉米花粉培养液2、玉米花粉培养液3、玉米花粉培养液4或玉米花粉培养液5，分散搅匀，加盖8℃静置30min（模拟玉米花粉转化过程），最后在光学显微镜下观察玉米花粉形态并拍照，统计花粉总数、完整花粉数（扣除破裂花粉数）和花粉完整度。
统计结果见表1。结果表明，玉米花粉在玉米花粉培养液2、玉米花粉培养液3和玉米花粉培养液4中浸泡30min后，仍能保持88-92%的完整度；而用玉米花粉培养液1（蔗糖浓度为0.3mol/L）或玉米花粉培养液5（蔗糖浓度为0.7mol/L）浸泡玉米花粉30min后，部分玉米花粉破裂，花粉完整度降低至63-65%，不利于花粉转化。故玉米花粉培养液中蔗糖浓度为0.4-0.6mol/L时为合适的渗透压。
Figure 665868DEST_PATH_IMAGE001
实施例3、低温开孔预处理有效诱导玉米花粉开孔
一、为了研究玉米花粉孔对DNA导入玉米花粉的影响，本发明的发明人首先在扫描电镜下观察玉米花粉孔的表面结构。
结果见图3中A。结果表明，玉米花粉通常只有一个带盖的花粉孔，阻碍了外部物质的进入，这在谷物花粉中很常见。
二、实验一
（1）用纸袋收集盛花期玉米自交系（玉米自交系京92、玉米自交系郑58、玉米自交系HZ178或玉米自交系178）的新鲜花粉，之后装入塑料自封袋；将塑料自封袋夹在8℃预冷的冰袋之间，共同置于冰盒，迅速带回室内。
（2）取步骤（1）获得的新鲜花粉，过筛（100目），获得花粉。
（3）开孔
8℃低温开孔：将步骤（2）获得的花粉2g转移至圆形塑料培养皿（直径为7cm）中，加入4mL 8℃预冷的玉米花粉培养液3（命名为“培养液I”），搅拌均匀；之后8℃静置10min（目的为开孔），取适量花粉涂布于导电胶布上，小心迅速吸干表水，喷金后在扫描电镜下观察拍照，统计可见花粉孔总数、开孔花粉数和花粉开孔率。
25℃室温开孔：将步骤（2）获得的花粉2g转移至圆形塑料培养皿（直径为7cm）中，加入4mL 放置于25℃的玉米花粉培养液3，搅拌均匀；之后25℃静置10min（目的为开孔），取适量花粉涂布于导电胶布上，小心迅速吸干表水，喷金后在扫描电镜下观察拍照，统计可见花粉孔总数、开孔花粉数和花粉开孔率。
统计结果见表2。结果表明，8℃处理的玉米花粉的孔盖被诱导打开（见图3中B），消除了外源DNA进入花粉的障碍；8℃处理的玉米花粉的花粉开孔率为40-56%，与25℃处理的玉米花粉无显著差异。发明人先前的研究表明，低温（8℃）可维持玉米花粉较高的活力，25℃处理玉米花粉后活力大大下降（Zuo-Ping Wang, et al. Efficient and genotypeindependent maize transformation using pollen transfected by DNA-coatedmagnetic nanoparticles[J]. J Integr Plant Biol., DOI: 10.1111/jipb.13263.）。因此，在保持玉米花粉高活力的前提下，低温（8℃）开孔预处理能有效诱导玉米花粉开孔，进而用于玉米花粉的PEG转化。
Figure 998760DEST_PATH_IMAGE002
三、实验二
（1）用纸袋收集盛花期玉米自交系（玉米自交系郑58或玉米自交系HZ178）的新鲜花粉，之后装入塑料自封袋；将塑料自封袋夹在8℃预冷的冰袋之间，共同置于冰盒，迅速带回室内。
（2）取步骤（1）获得的新鲜花粉，过筛（100目），获得花粉。
（3）开孔
培养液I开孔：将步骤（2）获得的花粉2g转移至圆形塑料培养皿（直径为7cm）中，加入4mL 8℃预冷的玉米花粉培养液3（命名为“培养液I”），搅拌均匀；之后8℃静置10min（目的为开孔），取适量花粉涂布于导电胶布上，小心迅速吸干表水，喷金后在扫描电镜下观察拍照，统计可见花粉孔总数、开孔花粉数和花粉开孔率。
培养液Ⅱ开孔：将步骤（2）获得的花粉2g转移至圆形塑料培养皿（直径为7cm）中，加入4mL 8℃预冷的磁珠花粉转化液（记载于中国专利文献，申请号为201910623296.5；命名为“培养液Ⅱ”），搅拌均匀；之后8℃静置10min（目的为开孔），取适量花粉涂布于导电胶布上，小心迅速吸干表水，喷金后在扫描电镜下观察拍照，统计可见花粉孔总数、开孔花粉数和花粉开孔率。
磁珠花粉转化液的溶质及其浓度为蔗糖200g/L、H3BO3 103mg/L、KNO3 53mg/L、Ca(NO3)2·4H2O 148mg/L、MnSO4·H2O 578.7mg/L、MgSO4·7H2O 103mg/L和GA3 30 mg/L，，溶剂为ddH2O。
统计结果见表3。结果表明，8℃下开孔预处理10min后，经培养液Ⅰ处理的玉米花粉约48-53%的孔盖被诱导打开，而经培养液2处理的玉米花粉仅少数孔盖被诱导打开（见图3中C），其花粉开孔率仅为15-17%。说明本发明所用的玉米花粉培养液3（培养液Ⅰ）具有更高的开孔效率，更有利于PEG介导的玉米花粉转化。
Figure 83DEST_PATH_IMAGE003
按照上述步骤，将玉米花粉培养液3中PEG 3350替换为PEG 4000，其它步骤均不变。结果表明，替换为PEG 4000的结果与PEG 3350均无显著差异。
实施例4、低温开孔预处理提高外源基因在花粉中的表达
一、重组质粒pUbi-RFP的构建
将pUbiquitin驱动EGFP表达载体中的报告基因EGFP片段替换为红色荧光蛋白基因（mRFP1），得到重组质粒pUbi-RFP。重组质粒pUbi-RFP中，由Ubi启动子驱动红色荧光蛋白基因（mRFP1）的表达。
pUbiquitin驱动EGFP表达载体记载于如下文献中：王莉等.玉米早期籽粒中强表达启动子的筛选.作物杂志.2020（4）：114-120
mRFP1记载于如下文献中：Campbell, et al. A monomeric red fluorescentprotein. PNAS，2002(99)7877-7882.
重组质粒pUbi-RFP的结构示意图见图4。
采用重组质粒pUbi-RFP研究PEG介导的外源基因在玉米花粉中的瞬时表达。
二、低温开孔预处理对外源基因在花粉中的表达的影响
实验组一：
（1）用纸袋收集盛花期玉米自交系京92的新鲜花粉，之后装入塑料自封袋；将塑料自封袋夹在8℃预冷的冰袋之间，共同置于冰盒，迅速带回室内。
（2）取新鲜花粉，过筛（100目），获得花粉。
（3）低温开孔预处理
将花粉2g转移至圆形塑料培养皿（直径为7cm）中，加入4mL 8℃预冷的玉米花粉培养液3，搅拌均匀；之后8℃静置10min（目的为开孔），得到开孔预处理液。
（4）向开孔预处理液中加入0.5mL 浓度为1μg/μL的重组质粒pUbi-RFP溶液（溶剂为ddH2O），轻柔搅匀；之后加入5mL PEG转化液，轻柔搅匀；最后8℃静置转化20min（期间轻柔晃匀一次）。
（5）小心吸尽上清，加入10mL玉米花粉培养液3，轻柔搅匀，洗涤花粉1次；待花粉沉降至皿底，小心吸去8mL上清，晃匀，之后转移至300目尼龙布上，用滤纸吸干表水，得到玉米花粉。
（6）将玉米花粉转入表达培养液，25℃培养20h；之后用激光共聚焦显微镜Confocal观察红色荧光，统计总花粉数、可见RFP花粉数，进一步计算RFP检出率。
表达培养液的溶质及其浓度为20% PEG4000、150g/L蔗糖、300mg/L Ca(N03)2·4H2O、100mg/L H3BO3、200mg/L MgSO4·7H20和100mg/L KNO3，溶剂为ddH2O。
实验组二（不进行开孔处理）：按照上述步骤，将步骤（3）和步骤（4）替换为步骤（a），其它步骤均不变。步骤（a）为：将花粉2g转移至圆形塑料培养皿（直径为7cm）中，加入4mL 8℃预冷的水和0.5mL 浓度为1μg/μL的重组质粒pUbi-RFP溶液（溶剂为ddH2O），轻柔搅匀；之后加入5mL PEG转化液，轻柔搅匀；最后8℃静置转化30min（期间轻柔晃匀一次）。
实验组三：按照上述步骤，将步骤（4）替换为步骤（b），其它步骤均不变。步骤（b）为：向开孔预处理液中加入0.5mL 浓度为1μg/μL的重组质粒pUbi-RFP溶液（溶剂为ddH2O），轻柔搅匀；之后再加入5mL 8℃预冷的玉米花粉培养液3，轻柔搅匀；最后8℃静置转化20min（期间轻柔晃匀一次）。
空白组：按照上述步骤，将步骤（4）替换为步骤（b），其它步骤均不变。步骤（b）为：向开孔预处理液中加入0.5mL水，轻柔搅匀；之后加入5mL PEG转化液，轻柔搅匀；最后8℃静置转化20min（期间轻柔晃匀一次）。
部分检测结果见图5（A为空白组，B为实验组一，C为实验组二，D为实验组三）。统计结果见表4。结果表明，空白组没有红色荧光；与直接转染（实验组二）相比，低温开孔预处理（实验组一）对外源基因的进入和在花粉中的瞬时表达更有效。低温开孔预处理可以显著提高PEG介导的外源基因（如mRFP1）在花粉中的表达。只加DNA不加PEG（实验组三）也观察不到红色荧光，说明PEG转化液在介导外源基因mRFP1进入花粉表达的过程中发挥了关键作用。
Figure 88125DEST_PATH_IMAGE004
按照上述步骤，将玉米花粉培养液3中PEG 3350替换为PEG 4000，其它步骤均不变。结果表明，替换为PEG 4000的结果与PEG 3350均无显著差异。
实施例5、低温开孔预处理提高外源基因在玉米乳熟胚中的表达
一、重组质粒pE35S-GUS的构建
将pBI121质粒（记载于如下文献中：Jefferson，et al.GUS fusions:β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higherplants.The EMBO Journal.1987(6):3901-3907）的35S启动子和GUS之间插入草铵膦抗性基因bar、NOS终止子以及E35S增强型启动子片段，得到重组质粒pE35S-GUS。重组质粒pE35S-GUS中，由E35S启动子驱动β-葡糖苷酸酶（GUS）的表达。
重组质粒pE35S-GUS的结构示意图见图6。
采用重组质粒pE35S-GUS研究外源基因在玉米乳熟胚中的表达。
二、低温开孔预处理对外源基因在玉米乳熟胚中的表达的影响
实验组一：
（1）用纸袋收集盛花期玉米自交系HZ178的新鲜花粉，之后装入塑料自封袋；将塑料自封袋夹在8℃预冷的冰袋之间，共同置于冰盒，迅速带回室内。
（2）取新鲜花粉，过筛（100目），获得花粉。
（3）将花粉2g转移至圆形塑料培养皿（直径为7cm）中，加入4mL 8℃预冷的玉米花粉培养液3，搅拌均匀；之后8℃静置10min（目的为开孔），得到开孔预处理液。
（4）向开孔预处理液中加入0.5mL 浓度为1μg/μL的重组质粒pE35S-GUS溶液（溶剂为ddH2O），轻柔搅匀；之后加入5mL PEG转化液，轻柔搅匀；最后8℃静置转化20min（期间轻柔晃匀一次）。
（5）小心吸尽上清，加入10mL玉米花粉培养液3，轻柔搅匀，洗涤花粉1次；待花粉沉降至皿底，小心吸去8mL上清，晃匀，之后转移至300目尼龙布上，用滤纸吸干表水，得到玉米花粉；向玉米花粉中加入3g玉米淀粉，用干净牙刷刷成细末，得到干燥花粉，即转基因玉米花粉。
（6）将转基因玉米花粉对提前套袋的正在吐丝的10个玉米自交系HZ178雌穗（提取1-2天修剪花丝）进行授粉，授粉后第18天，取乳熟胚进行GUS染色。
实验组二（不进行开孔预处理）：按照上述步骤，将步骤（3）和步骤（4）替换为步骤（a），其它步骤均不变。步骤（a）为：将花粉2g转移至圆形塑料培养皿（直径为7cm）中，加入4mL 8℃预冷的水和0.5mL 浓度为1μg/μL的重组质粒pE35S-GUS溶液（溶剂为ddH2O），轻柔搅匀；之后加入5mL PEG转化液，轻柔搅匀；最后8℃静置直接转化30min（期间轻柔晃匀一次）。
实验组三：按照上述步骤，将步骤（4）替换为步骤（b），其它步骤均不变。步骤（b）为：向开孔预处理液中加入0.5mL 浓度为1μg/μL的重组质粒pE35S-GUS溶液（溶剂为ddH2O），轻柔搅匀；之后再加入5mL 8℃预冷的玉米花粉培养液3，轻柔搅匀；最后8℃静置转化20min（期间轻柔晃匀一次）。
空白组：按照上述步骤，将步骤（4）替换为步骤（b），其它步骤均不变。步骤（b）为：向开孔预处理液中加入0.5mL水，轻柔搅匀；之后加入5mL PEG转化液，轻柔搅匀；最后8℃静置转化20min（期间轻柔晃匀一次）。
部分检测结果见图7（A为空白组，B为实验组一，C为实验组二，D为实验组三）。统计结果见表5。结果表明，空白组没有GUS阳性胚；与直接转染（实验组二）相比，低温开孔预处理（实验组一）对外源基因的进入和在玉米乳熟胚中的表达更有效。低温开孔预处理可以显著提高PEG介导的外源基因（如GUS）在玉米乳熟胚中的表达。只加DNA不加PEG（实验组三）也没有GUS阳性胚，说明PEG转化液在介导外源基因GUS进入玉米花粉并传递到玉米胚表达的过程中发挥了关键作用。
Figure 292841DEST_PATH_IMAGE005
按照上述步骤，将玉米花粉培养液3中PEG 3350替换为PEG 4000，其它步骤均不变。结果表明，替换为PEG 4000的结果与PEG 3350均无显著差异。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.一种制备转基因玉米花粉的方法，包括如下步骤：
（1）向玉米花粉中加入4-10℃预冷的玉米花粉培养液，混匀，之后4-10℃处理5-15min，得到开孔预处理液；
所述玉米花粉培养液的溶质及其浓度为蔗糖0.4-0.6mol/L、H3BO3 0.8-1.2mmol/L、KNO3 0.8-1.2mmol/L、Ca(NO3)2·4H2O 0.8-1.2mmol/L、MnSO4·H2O 0.8-1.2mmol/L、MgSO4·7H2O 0.8-1.2mmol/L和GA3 0.08-0.12mmol/L，溶剂为水；
（2）向步骤（1）得到的开孔预处理液中加入携带目的基因的质粒和PEG转化液，混匀，之后4-10℃处理15-25min；
所述PEG转化液的溶质及其浓度为PEG 3350或PEG 4000 300-500g/L、Ca(NO3)2 0.08-0.12mol/L和甘露醇0.18-0.22mol/L，溶剂为水；
（3）完成步骤（2）后，收集沉淀并干燥，获得转基因玉米花粉；
转基因玉米花粉中含有目的基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述玉米花粉培养液的溶质及其浓度为蔗糖0.5mol/L、H3BO3 1mmol/L、KNO3 1mmol/L、Ca(NO3)2·4H2O 1mmol/L、MnSO4·H2O 1mmol/L、MgSO4·7H2O 1mmol/L和GA3 0.1mmol/L，溶剂为水；
所述PEG转化液的溶质及其浓度为PEG 3350或PEG 4000 400g/L、Ca(NO3)2 0.1mol/L和甘露醇 0.2 mol/L，溶剂为水。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述4-10℃预冷的玉米花粉培养液为8℃预冷的玉米花粉培养液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述步骤（1）中，4-10℃处理5-15min为8℃处理10min；
所述步骤（2）中，4-10℃处理15-25min为4-10℃处理20min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：玉米花粉、玉米花粉培养液、质粒和PEG转化液的比例为2g：（3-5）mL：（100-1000）μg：（4-6）mL。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）中，收集沉淀并干燥的步骤依次包括：
（3-1）弃上清，用所述玉米花粉培养液洗涤；
（3-2）收集花粉沉淀，吸干表水；
（3-3）加入淀粉再次干燥。
7.一种培育转基因玉米的方法，包括如下步骤：
（1）采用权利要求1至6任一所述的方法制备转基因玉米花粉；转基因玉米花粉中含有目的基因；
（2）将步骤（1）制备的转基因玉米花粉对玉米雌穗进行授粉，得到转基因玉米；所述转基因玉米含有所述目的基因。
8.一种试剂盒，由权利要求1或2中所述玉米花粉培养液和所述PEG转化液组成；
所述试剂盒用于制备转基因玉米花粉或培育转基因玉米；所述转基因玉米由转基因玉米花粉对玉米雌穗进行授粉获得。
9.权利要求8所述试剂盒在制备转基因玉米花粉或培育转基因玉米中的应用；
所述转基因玉米由转基因玉米花粉对玉米雌穗进行授粉获得。
10.权利要求1至6任一所述的方法在培育转基因玉米中的应用；
所述转基因玉米由权利要求1至6任一所述的方法制备的转基因玉米花粉对玉米雌穗进行授粉获得。
CN202210532986.1A 2022-05-17 2022-05-17 一种制备转基因玉米花粉的方法及其使用的试剂盒 Active CN114621973B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210532986.1A CN114621973B (zh) 2022-05-17 2022-05-17 一种制备转基因玉米花粉的方法及其使用的试剂盒
PCT/CN2022/127515 WO2023221402A1 (zh) 2022-05-17 2022-10-26 一种制备转基因玉米花粉的方法及其使用的试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210532986.1A CN114621973B (zh) 2022-05-17 2022-05-17 一种制备转基因玉米花粉的方法及其使用的试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114621973A true CN114621973A (zh) 2022-06-14
CN114621973B CN114621973B (zh) 2022-07-19

Family

ID=81907213

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210532986.1A Active CN114621973B (zh) 2022-05-17 2022-05-17 一种制备转基因玉米花粉的方法及其使用的试剂盒

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN114621973B (zh)
WO (1) WO2023221402A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114085866A (zh) * 2021-11-26 2022-02-25 北京市农林科学院 一种改良的玉米花粉磁转染方法
WO2023221402A1 (zh) * 2022-05-17 2023-11-23 北京市农林科学院 一种制备转基因玉米花粉的方法及其使用的试剂盒

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2351120C1 (ru) * 2007-09-17 2009-04-10 Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской Академии наук Способ получения трансгенных растений кукурузы
CN102031273A (zh) * 2010-08-26 2011-04-27 北京农业生物技术研究中心 一种提高玉米转基因效率的花粉管通道转化体系及方法
CN102174568A (zh) * 2011-03-04 2011-09-07 天津大学 一种玉米成熟胚原位转基因的方法
CN110331167A (zh) * 2019-07-11 2019-10-15 北京农业生物技术研究中心 一种不依赖于玉米基因型的dna导入方法
CN114085866A (zh) * 2021-11-26 2022-02-25 北京市农林科学院 一种改良的玉米花粉磁转染方法
CN114480477A (zh) * 2022-02-23 2022-05-13 吉林农业科技学院 一种通过花粉介导转基因提高玉米抗旱性的方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114621973B (zh) * 2022-05-17 2022-07-19 北京市农林科学院 一种制备转基因玉米花粉的方法及其使用的试剂盒

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2351120C1 (ru) * 2007-09-17 2009-04-10 Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской Академии наук Способ получения трансгенных растений кукурузы
CN102031273A (zh) * 2010-08-26 2011-04-27 北京农业生物技术研究中心 一种提高玉米转基因效率的花粉管通道转化体系及方法
CN102174568A (zh) * 2011-03-04 2011-09-07 天津大学 一种玉米成熟胚原位转基因的方法
CN110331167A (zh) * 2019-07-11 2019-10-15 北京农业生物技术研究中心 一种不依赖于玉米基因型的dna导入方法
CN114085866A (zh) * 2021-11-26 2022-02-25 北京市农林科学院 一种改良的玉米花粉磁转染方法
CN114480477A (zh) * 2022-02-23 2022-05-13 吉林农业科技学院 一种通过花粉介导转基因提高玉米抗旱性的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIYAN YANG 等: "Expression of Foreign Genes Demonstrates the Effectiveness of Pollen-Mediated Transformation in Zea mays", 《FRONT PLANT SCI》 *
崔贵梅 等: "玉米花粉体外萌发方法改进及其对花粉介导转基因的作用", 《植物学报》 *
张婷婷 等: "花粉介导法将水稻OsSIK1基因导入玉米自交系的研究", 《山西农业科学》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114085866A (zh) * 2021-11-26 2022-02-25 北京市农林科学院 一种改良的玉米花粉磁转染方法
CN114085866B (zh) * 2021-11-26 2022-09-23 北京市农林科学院 一种改良的玉米花粉磁转染方法
WO2023221402A1 (zh) * 2022-05-17 2023-11-23 北京市农林科学院 一种制备转基因玉米花粉的方法及其使用的试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
CN114621973B (zh) 2022-07-19
WO2023221402A1 (zh) 2023-11-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114621973B (zh) 一种制备转基因玉米花粉的方法及其使用的试剂盒
CN109652455B (zh) 一种磁性纳米载体介导的不结球白菜高效遗传转化方法及其应用
WO2023093348A1 (zh) 一种改良的玉米花粉磁转染方法
CN102925488B (zh) 磁性纳米载体介导的植物转基因方法
Abdul-Baki et al. DNA uptake during electroporation of germinating pollen grains
CN111893133A (zh) 一种农杆菌介导的菜心遗传转化方法
CN109971710A (zh) 建鲤脑细胞系及其建立方法与应用
CN108338073A (zh) 一种辣椒的组织培养方法
CN108504625A (zh) 一种小鼠成纤维细胞及其用途
CN108546670A (zh) 一种高粱原生质体的制备方法及制备的原生质体的转化方法
CN110295183A (zh) 一种基于CsPrx25超量表达提高柑橘对溃疡病抗性的方法
CN108707624A (zh) 一种利用发根农杆菌诱导培养博落回毛状根的方法及应用
CN110331167B (zh) 一种不依赖于玉米基因型的dna导入方法
CN117070557A (zh) 一种快速高效的农杆菌介导的鸢尾种子遗传转化方法
CN109370922A (zh) 一对成功实现茭白正常茭人工选育的菰黑粉菌及其应用
CN108949822A (zh) Hrvvp7转基因红花种子的培育方法
CN108118068A (zh) 一种高效快速的菊花转基因方法
CN108865899A (zh) 一种双孢蘑菇菌株及其选育方法
CN101401550A (zh) 诱导茄子小孢子形成胚状体的方法及其专用培养基
JP2005514952A6 (ja) 葉外殖片を用いた遺伝子銃法によるトランスジェニック・チャ
Wenzler et al. Persistent changes in the proliferative capacity of maize leaf tissues induced by Ustilago infection
CN112391273A (zh) 单细胞分离器及其在分离单细胞过程中的应用和单克隆细胞制备方法
Zhan et al. In vitro plantlet formation in Linum marginale from cotyledons, hypocotyls, leaves, roots and protoplasts
CN101451149B (zh) 农杆菌介导的高效玉米遗传转化方法
CN105123495A (zh) 一种偏籼型水稻显性矮秆突变体的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant