CN114085866A - 一种改良的玉米花粉磁转染方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种改良的玉米花粉磁转染方法，包括如下步骤：(1)制备转染用质粒DNA；(2)纳米磁珠MNP与质粒DNA在室温条件下结合，形成MNP‑DNA复合物；(3)收集玉米盛花期的新鲜花粉，隔水在冰盒保存条件下，迅速带回室内；(4)将玉米花粉转化液与过筛的玉米花粉混匀，低温条件下进行开孔预处理；(5)将MNP‑DNA复合物加入到开孔预处理液中，轻柔混匀，置于低温预冷的磁板上进行转染；(6)转染结束后，将花粉悬液用冰盒带至田间，直接对玉米雌穗进行授粉。本发明方法直接利用大田种植的玉米进行转化，仅需常规制冷设备，操作简便，成本低廉，适用于所有玉米品种。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种改良的既能维持花粉活力又能提高转化效率的玉米花粉磁转染方法。
背景技术
玉米是在全球范围内广泛种植的作物，以满足人们日益增长的粮食、饲料和燃料需求。尽管在过去两百年中，人们通过传统育种显著提高了玉米产量和品质，但仍然面临来自各种生物和非生物胁迫的严峻挑战。为了应对这些挑战，人们开发了转基因玉米，以引入所需的性状，如抗虫、抗除草剂、耐旱、耐寒和提高营养品质等。高效的遗传转化是转基因玉米开发的关键。自1988年第一个基于原生质体电穿孔的玉米转化成功以来，科学家们已经开发了多种获得转基因玉米植株的方法，如基因枪法、农杆菌介导法、PEG介导法、脂质体介导法、碳化硅介导法、显微注射法等。但是这些方法主要依赖于组织培养体系，成本高、劳动强度大、耗时长，特别是依赖于基因型。只有少数玉米品种具有相对较高的基因转化效率，如Hi II、B104和A188。大多数优良玉米自交系都存在技术障碍，从而限制了它们的商业应用，特别是在开发先进的育种技术方面，如直接在优良作物种质中进行精确的基因组编辑。因此，在所有玉米品种中建立一个能够直接、精确地进行分子改良的高效基因传递系统是非常重要的。
发明内容
本发明的目的在于开发出一种改良的既能维持花粉活力又能提高转化效率的玉米花粉磁转染方法，该方法直接利用大田种植的玉米进行转化，仅需常规制冷设备，操作简便，成本低廉，适用于所有玉米品种。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种改良的玉米花粉磁转染方法，在取粉后至授粉前的整个过程，始终将玉米花粉置在低温环境中，最大限度的保持玉米花粉的活力；且经过转化溶液的低温预处理，使原本带盖的玉米花粉孔打开，更有利于外源DNA的导入。目的基因导入到玉米花粉中，可实现目的基因在花粉中的瞬时表达。授粉后，可获得更多的转化种子，以供后续筛选鉴定。
本发明方法包括如下步骤：
(1)制备转染用质粒DNA；
(2)纳米磁珠MNP与质粒DNA在室温条件下结合，形成MNP-DNA复合物；
(3)收集玉米盛花期的新鲜花粉，隔水在冰盒保存条件下，迅速带回室内；
(4)将玉米花粉转化液与过筛的玉米花粉混匀，低温条件下进行开孔预处理；
(5)将步骤(2)获得的所述MNP-DNA复合物加入到步骤(4)的开孔预处理液(即玉米花粉转化液与过筛的玉米花粉的混合液)中，轻柔混匀，置于低温预冷的磁板上进行转染；
(6)转染结束后，将花粉悬液用冰盒带至田间，直接对玉米雌穗进行授粉。
本发明所述的改良的玉米花粉磁转染方法，其中，所述步骤(4)和步骤(5)中，所述低温为6-10℃。
本发明所述的改良的玉米花粉磁转染方法，其中，所述低温为8℃
本发明所述的改良的玉米花粉磁转染方法，其中，步骤(1)具体包括如下步骤：大量提取转染用的高纯度质粒DNA，并用ddH2O调整浓度至1000±50ng/μL，小管分装，-20℃冻存，避免反复冻融，磁转染前将质粒DNA取出融化至室温。
本发明所述的改良的玉米花粉磁转染方法，其中，步骤(2)具体包括如下步骤：根据玉米自交系开花情况和质粒转化需求，预估当天需要进行的转化试验；纳米磁珠MNP一起在室温静置10min，取200μL PCR管，管盖上写好转化编号，加入160μL ddH2O、1μg/μL的纳米磁珠7.5μL和1μg/μL的DNA 30μL，轻柔吸打混匀，室温静置结合20min以上，得到MNP-DNA复合物。
本发明所述的改良的玉米花粉磁转染方法，其中，步骤(3)具体包括如下步骤：用纸袋收集在田间生长的盛花期玉米自交系的新鲜花粉，取粉纸袋装入塑料自封袋内，放在冰上，用冰盒迅速带回室内进行磁转染。
本发明所述的改良的玉米花粉磁转染方法，其中，步骤(4)具体包括如下步骤：用100目网筛去除步骤(3)获得的花粉中的花药，称取过筛花粉2g转移至15mL圆底离心管，管壁标好转化编号，再加入8mL 8℃预冷的玉米花粉转化液，盖紧后充分颠倒混匀，在8℃培养箱中，水平静置开孔10min；所述玉米花粉转化液中各成分含量为：蔗糖0.5mol/L、H3BO31mmol/L、KNO3 1mmol/L、Ca(NO3)2·4H2O 1mmol/L、MnSO4·H2O 1mmol/L、MgSO4·7H2O1mmol/L、GA3 0.1mmol/L。
本发明所述的改良的玉米花粉磁转染方法，其中，步骤(5)具体包括如下步骤：将步骤(2)获得的MNP-DNA全部加入到步骤(4)的开孔预处理液中，总体积约为10mL，轻柔颠倒混匀，置于8℃培养箱中预冷的MagnetoFACTOR-96磁板上(每块磁板上至多可放4根15mL圆底离心管)，水平静置转染10min后轻柔颠倒混匀一次，再水平静置转染10min，合计转染20min。
本发明所述的改良的玉米花粉磁转染方法，其中，步骤(6)具体包括如下步骤：磁转染结束后，将花粉离心管夹在8℃预冷的冰袋中，用冰盒迅速带至田间；轻柔颠倒晃匀花粉，对提前套袋的正在吐丝的玉米自交系雌穗10穗进行授粉；用去尖的1mL枪头吸取花粉悬液滴加在截短至2cm长的玉米花丝上，1mL/穗，戴手套将花粉悬液涂抹均匀，授完转染一个质粒的花粉后，换新的手套再授下一个质粒的花粉，授粉20天后可见结实籽粒。
本发明改良的玉米花粉磁转染方法与现有技术不同之处在于：
本发明对玉米花粉磁转染方法进行了改良，通过在低温环境中对玉米花粉进行磁转染，降低了花粉内降解酶的活力，更有利于保持花粉活力状态和完整度；其次，花粉在低温条件下利用转化夜进行10分钟的预处理以便诱导花粉孔的盖子打开，破除了细胞壁的障碍，有利于磁转染法外源DNA通过花粉孔进入花粉细胞，提高转化效率，该转染方法操作更加快捷，从收集玉米花粉到完成转染并授粉的整个过程可在0.5-1h完成，最大限度的保持了玉米花粉的活力，提高了授粉雌穗的结实率，可获得更多的转化种子，以供后续筛选鉴定；再次，该方法简便高效，仅需提供常规制冷设备和既定磁场即可完成转化，无需昂贵的仪器设备，可在田间和基地实现大规模玉米转化。
下面结合附图对本发明的改良的玉米花粉磁转染方法作进一步说明。
附图说明
图1为本发明中改良的玉米花粉磁转染的流程示意图；其中，A为收集盛花期的新鲜玉米花粉，B为筛除花药，C为低温磁转染，D为在玉米花丝上涂抹花粉悬液；E为授磁转染花粉20天后玉米的结实情况；
图2为本发明中玉米花粉在不同温度的转染液中处理30分钟后的活力对比图；A为新鲜玉米花粉直接进行萌发的情况；B为4℃处理30分钟后再进行萌发的情况；C为8℃处理30分钟后再进行萌发的情况；D为12℃处理30分钟后再进行萌发的情况；E为16℃处理30分钟后再进行萌发的情况；F为室温处理30分钟后再进行萌发的情况；G为上述各处理萌发率的统计情况；
图3为本发明中低温和室温磁转染玉米的结实情况对比图；A所示为玉米自交系HZ178；B所示为玉米自交系京92；左侧所示为低温(8℃)磁转染玉米的结实情况；右侧所示为室温磁转染玉米的结实情况；
图4为本发明中玉米花粉开孔及荧光表达图；A为室温下的花粉孔，B为在8℃下用转化液预处理10分钟，一些玉米花粉的孔盖被诱导打开。C-E在8℃条件下，先用转化液预处理10分钟，再进行磁转染；C为仅转染纳米磁珠(MNP)的花粉，D为仅转染RFP质粒DNA的花粉，E为同时转染MNP和RFP质粒DNA的花粉；F为在8℃条件下，未用转化液预处理10分钟，直接用MNP和RFP质粒DNA磁转染30分钟的玉米花粉；
图5为本发明中载体pUbi-RFP结构示意图；
图6为本发明中载体pYBA1132-bar结构示意图；
图7为本发明中花粉磁转染玉米自交系郑58中bar基因的筛选与整合。
具体实施方式
一种改良的玉米花粉磁转染方法：
纳米磁珠(MNP，货号9006)和磁板(货号9008-96)购自德国Chemicell公司。
玉米骨干自交系为178、HZ178、京92和郑58。
具体的玉米花粉磁转染过程如图1所示。
(1)大量提取转染用的高纯度质粒DNA，并用ddH2O调整浓度至1000±50ng/μL，小管分装，-20℃冻存，避免反复冻融，磁转染前将质粒DNA取出融化至室温。
(2)根据玉米自交系开花情况和质粒转化需求，预估当天需要进行的转化试验；纳米磁珠MNP一起在室温静置10min，取200μL PCR管，管盖上写好转化编号，加入160μLddH2O、1μg/μL的纳米磁珠7.5μL和1μg/μL的DNA 30μL，轻柔吸打混匀，室温静置结合20min以上，得到MNP-DNA复合物。
(3)用纸袋收集盛花期玉米自交系的新鲜花粉(图1(A))，取粉纸袋装入塑料自封袋内，夹在8℃预冷的冰袋中，用冰盒迅速带回室内进行磁转染。
(4)用100目网筛去除步骤(3)获得的花粉中的花药(图1(B))，称取过筛花粉约2g转移至15mL圆底离心管(管壁标好转化编号)，再加入8mL 8℃预冷的玉米花粉转化液，盖紧后充分颠倒混匀，在8℃培养箱中，水平静置开孔10min；所述玉米花粉转化液中各成分含量为：蔗糖0.5mol/L、H3BO3 1mmol/L、KNO3 1mmol/L、Ca(NO3)2·4H2O 1mmol/L、MnSO4·H2O1mmol/L、MgSO4·7H2O 1mmol/L、GA3 0.1mmol/L。
(5)将步骤(2)获得的MNP-DNA全部加入到步骤(4)的开孔预处理液中(总体积约为10mL)，轻柔颠倒混匀，置于8℃培养箱中预冷的MagnetoFACTOR-96磁板上(每块磁板上至多可放4根15mL圆底离心管)，水平静置转染10min后轻柔颠倒混匀一次，再水平静置转染10min，合计转染20min(图1(C))。
(6)磁转染结束后，将花粉离心管夹在8℃预冷的冰袋中，用冰盒迅速带至田间；轻柔颠倒晃匀花粉，对正在吐丝的玉米自交系雌穗(提前套袋)10穗进行授粉；用去尖的1mL枪头吸取花粉悬液滴加在截短至约2cm长的玉米花丝上，1mL/穗，戴手套将花粉悬液涂抹均匀(图1(D))。授完转染一个质粒的花粉后，换新的手套再授下一个质粒的花粉。授粉20天后可见结实籽粒(图1(E))。
低温可更好的维持玉米花粉活力。
1)转化液处理和温度对玉米花粉活力的影响。通过在直径15mm的玻底皿中进行玉米花粉的萌发来观测花粉活力，以新鲜玉米花粉为对照(-)。在200μL花粉萌发培养液(15％PEG4000、150g/L蔗糖、300mg/L Ca(N03)2·4H2O、100mg/L H3BO3、200mg/L MgSO4·7H20、100mg/L KNO3和0.1mM GA3)中，加入约5mg新鲜玉米花粉(-)；同时在180μL花粉萌发培养液中加入20μL花粉悬液(在4℃、8℃、12℃、16℃和室温条件下在转化液中预处理30分钟，相当于2×104粒花粉)中；轻柔搅匀，25℃静置暗培养3小时后，在显微镜下观察花粉的萌发情况并拍照计数。玉米自交系京92的花粉萌发结果如图2所示。在4℃、8℃、12℃、16℃和室温条件下，转化液预处理30分钟的花粉萌发率分别为48％(153/318)、54％(579/1077)、21％(130/623)、25％(136/552)和12％(113/935)。在8℃下，在转化液中预处理30分钟的花粉具有最高的萌发率，可维持未经转化液预处理花粉75％的活力(64％，719/1121)。在京92、HZ178、郑58和178四个玉米品种中观察到类似的效应，即在8℃下转化液中预处理30分钟的花粉比室温预处理的萌发率更高(表1)。
表1四个玉米自交系在8℃和室温条件下进行/不进行转化液预处理和的花粉萌发率
2)低温磁转染玉米结实率更高。磁转染结束后，将转染花粉对玉米雌穗进行授粉，在种子成熟后，进行收获、拍照和结实率统计。结果如图3和下表所示，经8℃下磁转染花粉授粉的玉米，其结实率为40-68粒/穗，明显高于室温磁转染花粉授粉的玉米(9-10粒/穗)，说明低温磁转染更有利于维持花粉活力，提高结实率，获得更多可供筛选鉴定的玉米种子。
玉米花粉的开孔对外源基因的导入和表达至关重要。
为了研究花粉孔对DNA导入玉米花粉的影响，我们首先在扫描电镜下观察了玉米花粉孔的表面结构。玉米花粉通常只有一个带盖的花粉孔(图4A)，阻碍了外部物质的进入。这在谷物花粉中很常见。其次，我们研究了在8℃条件下花粉孔的开放与否。在8℃下用转化液预处理10分钟，一些玉米花粉的孔盖被诱导打开(图4B)，消除了外源DNA进入花粉的障碍。随后，我们研究了四个玉米自交系京92、HZ178、郑58和178在室温或8℃下用转化液处理10分钟后的花粉开孔率。如下表所示，8℃下处理的花粉，其开孔率保持在40-50％，尽管略低于室温处理，但足以进行玉米花粉磁转染了。
我们使用红色荧光蛋白(RFP)作为报告基因(由玉米泛素(Ubi)启动子驱动，图5)，研究了外源基因在玉米花粉中的瞬时表达。经转化液预处理10min以及磁场转染20min后，将玉米花粉转入表达培养液(20％PEG4000，150g/L蔗糖，300mg/L Ca(N03)2·4H2O，100mg/LH3BO3，200mg/L MgSO4·7H20，100mg/L KNO3)中，在25℃下培养20h。在仅转染纳米磁珠(MNP)(图4C)或仅转染RFP质粒DNA(图4D)的花粉中未检测到红色荧光，但在同时22％(129/590)转染MNP和RFP质粒DNA的花粉中可检测到红色荧光(图4E)。另一方面，在8℃条件下，未用转化液预处理10分钟，直接用MNP和RFP质粒DNA磁转染30分钟的玉米花粉中，约有3％(6/208)可检测到红色荧光(图4F)。这些结果表明，与直接转染相比，用转化液预处理10min诱导花粉开孔对外源基因的进入和瞬时表达更有效。除草剂筛选标记基因bar可通过花粉磁转染高效导入玉米基因组中并稳定遗传。
为了筛选稳定的转化后代，我们将除草剂选择标记基因bar(载体如图6所示)通过花粉磁转染方法导入到玉米自交系郑58中。在三叶期经200mg/L草铵膦筛选后，1.41％(5/355)的T1代幼苗表现出除草剂抗性(图7A)。这5株抗草铵膦转基因玉米经bar/PAT快速转基因试纸条检测(图7B)为阳性(同时具有检出线和控制线)，表明通过花粉磁转染成功地将bar基因导入到玉米中并正常表达。此外，Southern杂交结果显示，这些T1代玉米植株的基因组中整合了约2-5个拷贝(图7C)，5个转基因系都将bar基因遗传到T2代，Southern杂交检测发现其T2代出现了遗传分离(图7D)。上述研究结果表明，通过我们的玉米花粉磁转染，外源基因被有效整合到玉米基因组中，并在后代中正常表达和稳定遗传。
现有的玉米花粉转染方法是在室温条件下进行转染，但玉米花粉在室温条件下极易萌发、失活和破裂。我们研究发现，室温磁转染后的玉米花粉仅能维持10％左右的活力，其授粉的玉米雌穗结实率仅为10粒/穗。而在8℃低温磁转染后的玉米花粉可75％左右的活力，其授粉的玉米雌穗结实率可提高至60粒/穗。如此，玉米花粉的低温磁转染可大幅提高结实率，获得更多的转化种子，以供后续筛选鉴定。此外，现有的玉米花粉转染方法未进行开孔预处理。因玉米的花粉孔通常是带盖的，直接进行磁转染，纳米磁珠将外源DNA导入花粉的效率仅为2％。而在能维持玉米花粉活力的8℃低温条件下，用转化液预处理10min，40-50％的玉米花粉孔盖打开，此时纳米磁珠将外源DNA导入花粉的效率可提高至22％。综合以上两方面，本申请中改良的玉米花粉磁转染方法，既能通过低温环境保持大部分的玉米花粉活力，又能通过开孔预处理提高外源DNA的导入效率，具有广泛的应用前景。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (9)
1.一种改良的玉米花粉磁转染方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)制备转染用质粒DNA；
(2)纳米磁珠MNP与质粒DNA在室温条件下结合，形成MNP-DNA复合物；
(3)收集玉米盛花期的新鲜花粉，隔水在冰盒保存条件下，迅速带回室内；
(4)将玉米花粉转化液与过筛的玉米花粉混匀，低温条件下进行开孔预处理；
(5)将步骤(2)获得的所述MNP-DNA复合物加入到步骤(4)的开孔预处理液中，轻柔混匀，置于低温预冷的磁板上进行转染；
(6)转染结束后，将花粉悬液用冰盒带至田间，直接对玉米雌穗进行授粉。
2.根据权利要求1所述的改良的玉米花粉磁转染方法，其特征在于：所述步骤(4)和步骤(5)中，所述低温为6-10℃。
3.根据权利要求2所述的改良的玉米花粉磁转染方法，其特征在于：所述低温为8℃。
4.根据权利要求3所述的改良的玉米花粉磁转染方法，其特征在于：步骤(1)具体包括如下步骤：大量提取转染用的高纯度质粒DNA，并用ddH2O调整浓度至1000±50ng/μL，小管分装，-20℃冻存，避免反复冻融，磁转染前将质粒DNA取出融化至室温。
5.根据权利要求4所述的改良的玉米花粉磁转染方法，其特征在于：步骤(2)具体包括如下步骤：根据玉米自交系开花情况和质粒转化需求，预估当天需要进行的转化试验；纳米磁珠MNP一起在室温静置10min，取200μL PCR管，管盖上写好转化编号，加入160μL ddH2O、1μg/μL的纳米磁珠7.5μL和1μg/μL的DNA 30μL，轻柔吸打混匀，室温静置结合20min以上，得到MNP-DNA复合物。
6.根据权利要求5所述的改良的玉米花粉磁转染方法，其特征在于：步骤(3)具体包括如下步骤：用纸袋收集在田间生长的盛花期玉米自交系的新鲜花粉，取粉纸袋装入塑料自封袋内，放在冰上，用冰盒迅速带回室内进行磁转染。
7.根据权利要求6所述的改良的玉米花粉磁转染方法，其特征在于：步骤(4)具体包括如下步骤：用100目网筛去除步骤(3)获得的花粉中的花药，称取过筛花粉2g转移至15mL圆底离心管，管壁标好转化编号，再加入8mL 8℃预冷的玉米花粉转化液，盖紧后充分颠倒混匀，在8℃培养箱中，水平静置开孔10min；所述玉米花粉转化液中各成分含量为：蔗糖0.5mol/L、H3BO3 1mmol/L、KNO3 1mmol/L、Ca(NO3)2·4H2O 1mmol/L、MnSO4·H2O 1mmol/L、MgSO4·7H2O 1mmol/L、GA3 0.1mmol/L。
8.根据权利要求7所述的改良的玉米花粉磁转染方法，其特征在于：步骤(5)具体包括如下步骤：将步骤(2)获得的MNP-DNA全部加入到步骤(4)的开孔预处理液中，总体积约为10mL，轻柔颠倒混匀，置于8℃培养箱中预冷的MagnetoFACTOR-96磁板上，水平静置转染10min后轻柔颠倒混匀一次，再水平静置转染10min，合计转染20min。
9.根据权利要求8所述的改良的玉米花粉磁转染方法，其特征在于：步骤(6)具体包括如下步骤：磁转染结束后，将花粉离心管夹在8℃预冷的冰袋中，用冰盒迅速带至田间；轻柔颠倒晃匀花粉，对提前套袋的正在吐丝的玉米自交系雌穗10穗进行授粉；用去尖的1mL枪头吸取花粉悬液滴加在截短至2cm长的玉米花丝上，1mL/穗，戴手套将花粉悬液涂抹均匀，授完转染一个质粒的花粉后，换新的手套再授下一个质粒的花粉，授粉20天后可见结实籽粒。
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| GR01 | Patent grant | ||
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