CN100451122C

CN100451122C - 油菜转基因的方法

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Publication number: CN100451122C
Application number: CNB2006100184886A
Authority: CN
Inventors: 刘胜毅; 郭学兰; 董彩华; 刘越英
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2006-03-07
Filing date: 2006-03-07
Publication date: 2009-01-14
Anticipated expiration: 2026-03-07
Also published as: CN1821415A

Abstract

本发明公开了一种油菜转基因的方法。本方法以原位生殖器官(包含花粉管，受精前后的配子和合子)为转基因受体。在对油菜授粉后的花柱和子房进行细胞学观察的基础上，确定了该方法的转化时间。在该时间内，削去柱头，滴加外源DNA溶液，使携带外源基因和草胺膦抗性标记基因的DNA转化生殖细胞，通过生长发育，获得转基因的T1代合子(种子)，在T1代幼苗早期用低浓度的除草剂草胺膦进行喷洒筛选，获得转基因阳性油菜植株。本发明的转基因效率为2～10%，转化通量高，而且成本低廉，工作量小，不存在基因型依赖，不存在转基因植株种子繁殖中的春化和越夏问题，筛选简便，结实率高。

Description

油菜转基因的方法

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种油菜转基因的方法，该方法适用于所有的油菜品种、品系或种质资源材料。

背景技术

植物基因转化技术通过各种不同的转化系统，把从动物、微生物或植物中分离到的目的基因(外源基因)，通过各种方法转移到受体植物的基因组上，使得外源基因在受体植物中稳定遗传，并赋予植物新的农艺性状，如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。

油菜(籽用油菜)是重要的油源植物和饲用蛋白源，是我国主要的油料作物。利用生物工程和转基因的手段进行品种改良和遗传学研究是油菜基因工程的重要内容。自1985年获得第一例转基因甘蓝型油菜以来(Ooms G，Bains A，BurrellM，et al.Genetic manipulation in cultivars of oilseed rape(Brassicanapus)using Agrobacterium.Theor Appl Genet，1985，71：325-329)，油菜的遗传转化方法得到很多改进(潘刚，周永明。2003.甘蓝型油菜遗传转化的研究进展。中国油料作物学报，25(3)：90-98)。

油菜的转化方法可以分为基于组织培养的遗传转化和非组织培养的遗传转化。

基于组织培养的遗传转化是以外植体为转基因受体。这些外植体包括下胚轴、子叶柄、茎段、原生质体、小孢子等。这些受体接受外源DNA后都要经过组织培养和植株再生过程，受到植物种类、基因型、外植体类型、培养条件等很多因素的影响。再生过程需要无菌环境、人工光照和控制温/湿度等培养条件，实验重复性差。遗传转化的成本高、周期长、工作量大、效率低。

最早Ooms等(Ooms G，Bains A，Burrell M，et al.Genetic manipulationin cultivars of oilseed rape(Brassica napus)using Agrobacterium.TheorAppl Genet，1985，71：325-329)和Fry(Fry J，Brarnason A，Horsh R B.Transformation of Brassica napus with Agrobacterium tumefaciens basedvectors.Plant Cell Rep，1987，6：321-325)分别用无菌苗的茎段和花茎建立了根癌农杆菌介导转化体系，但转化率不高。1989年Moloney等首次利用甘蓝型春油菜品种“westar”的子叶柄建立了高效的根癌农杆菌介导转化体系，转化效率达至55％(Moloney，M.M.，J.M.Walker and K.K.Sharma.1989.Highefficiency transformation of Brassica napus using Agrobacterium vectors.Plant Cell Rep.8：238-242)。随后各国科研工作者都以这个体系为标准，但都没能重复出相同的高频转化率。实践证明“westar”的确易于转化，但Moloney等的转化体系的重复性低(郭学兰，王汉中。甘蓝型油菜细胞质雄性不育恢复系转基因体系的研究，中国油料作物学报，1999，21(3)：1-5)。

下胚轴也是常用的甘蓝型油菜转化受体。目前被广泛使用的下胚轴转化程序主要根据De Block等人(De Block M，De Brouwer D，Tenning P.Transformationof Brassica napus and Brassica oleracea using Agrobacterium tumefaciensand the expression of the bar and neo genes in the transgenic plants.PlantPhysiol，1989，91：694-701)建立的方法。但是这类方法也存在一定的缺限：下胚轴一般很难从切口处直接再生出不定芽，必须经过愈伤组织阶段的诱导。冬油菜的遗传转化还存在外植体褐化的问题，严重影响再生和转化。

原生质体的转化是针对单个的植物细胞，而不是多细胞的组织和器官，可以避免产生嵌合体。1994年程振东等利用PEG的方法将GUS基因导入甘蓝型油菜栽培品种“云北二号”的原生质体中(程振东，卫志明，许智宏。1994.用PEG法把外源基因导入甘蓝型油菜原生质体再生转基因植株。实验生物学报，37(3)：341-351)。但是这种转化方法受到诸多因素的影响，如PEG的pH值、原生质体的悬浮液组份、外源DNA加入的时间、抗生素筛选的时间以及转化品种基因型和原生质体再生能力等。转化处理会使原生质体受到伤害，因而大大降低细胞分裂的速度。实验的重复性较差，效率低。

分离的小孢子也可以用来作为外源DNA的导入受体(陈军，王兰岚，刘澄清，方荣祥，宋桂英，徐正平，刘贵珍，张丽华，陈正华。用激光微束穿刺法转化甘蓝型油菜小孢子的研究。激光生物学报1998，7(2)：103-107)。实验发现，微束激光穿刺过程中蔗糖浓度降低后影响小孢子的活力，且从微束激光穿刺到进入32℃培养需要时间超过2小时，对培养造成不利影响。微束激光处理已经分裂的小孢子胚，转化率也只有1％.这种转化体系不仅要求油菜品种的小孢子有高的胚状体成胚率，即存在严重的基因型依赖，而且还有其它诸多不利因素会导致再生频率及转化频率降低。根癌农杆菌介导的小孢子转化(王新发，王汉中，刘贵华，胡赞民，郑元本。2005.导入双价基因的转基因杂交油菜亲本及其对菌核病抗性的研究。植物学通报，22(3)：292-301)无需高精设备，但是农杆菌与小孢子的共培时间难以掌握，小孢子容易发生聚集，不利于成胚，转化效率低。胚诱导的培养和筛选过程中需要使用抗生素，也对小孢子胚的生长不利。况且小孢子培养只有在花期才能进行，周期长，当年无法得到转基因种子。转基因植株小苗的移栽、春化、越夏和结实都需要人工控制温/湿度，消耗大量电力和人力。

综上所述，基于组织培养的甘蓝型油菜遗传转化，主要是以根癌农杆菌作为生物媒介介导外源DNA的转化。这类转化方法利用萌发4～12天的子叶柄和下胚轴，或者幼嫩组织的原生质体，或游离小孢子，与带有双元载体的根癌农杆菌共培，然后筛选能够表达报告基因(多为抗生素抗性基因)的再生器官或者胚状体。在共培后的再生过程中需要不断抑制农杆菌的生长，结果使得再生效率大大下降。另外，外植体的基因型、发育时期、对农杆菌的敏感程度、再生的条件和频率都会影响转基因效率。从收集外植体到获得转化植株需要的周期很长，而且要求根癌农杆菌有较高的活力，要求严格的无菌操作、适合转化和再生的培养基、在培养基中添加抗生素、合适的人工气候室与培养条件，需要不断地更换新鲜的培养基等等，实验过程繁琐复杂，对操作人员的熟练程度有很高的要求，周期也非常长。实践中还会遇到组织培养苗难以越夏、需要先满足春化过程才能开花结实等问题。

除此之外也有物理化学媒介介导的遗传转化，如微束激光法(陈军，王兰岚，刘澄清，方荣祥，宋桂英，徐正平，刘贵珍，张丽华，陈正华。用激光微束穿刺法转化甘蓝型油菜小孢子的研究。激光生物学报1998，7(2)：103-107)、PEG法、电激法(Jardinaud M F，Sourvre A，Alibert G.Transient GUS geneexpression in Brassica napus electroporated microspores.Plant Sci，1993，93：177-184)、基因枪法(Nehlin L，Mollers C，Bergman P，et al.Transient beta-gus and gfp gene expression and viability analysis ofmicroptojectile bombarded microsprose of Brassicanapus L.Plant Physiol.，2000，156(2)：175-183)和显微注射法(Nehaus G，Spangeberg G，Scheid O M，et al.Transgenic rapeseed plants obtained by the microinjection of DNAinto microspore-derived embryoids.Theor Appl Genet，1987，75(1)：30-36)等方法。这一类方法共同的特点是，要求实现建立起一套高效的外植体(尤其是原生质体)再生系统；各种介质对外植体的再生率有严重的不利影响，转化频率低，不易重复、周期比较长。从原生质体再生的无性系植株变异比较大。实验还要求有相应的设备条件，如人工生长室，基因枪、显微注射仪、激光器和倒置显微镜(激光微束系统)、电转化仪等。

非组织培养的遗传转化方法，例如种质系统转化法，则无需建立外植体再生系统。这一类方法以生殖器官或细胞为受体，直接利用植物受体本身的有性生殖过程或者种子发育过程，既免除了离体再生的组织培养，又缩短了获得可遗传转基因种子的时间(王关林，方宏筠主编。2002。植物基因工程，北京，科学出版社：350)。近年来这类方法发展很快，其特点可以概括为：

1、由于具有全能性的生殖细胞能直接为受体细胞，因此具有更强的接收外源DNA的潜能，一旦将外源基因导入这些细胞，犹如正常的受精过程会很容易地遗传给后代；

2、避免了外植体再生系统中存在的基因型依赖问题；

3、利用植物自身的授粉过程操作方便、简单，将现代的分子育种与常规育种紧密结合，因此应用潜力大；

4、利用该受体系统进行转化，只需要在植物本身的生长季节里开展转化，无需一年四季地投入工作精力，非常适合于对光温条件较为敏感的当地优良作物品种。

种质系统转化法主要包括花粉管通道法、子房和幼胚注射法、种子浸泡、花粉粒浸泡法等(王关林，方宏筠主编。2002。植物基因工程，北京，科学出版社：481-496)。但从目前研究进展来看，这些方法都有转化率低、结实率低等缺点。

在授精和胚胎发育初期是植物接受远缘遗传物质的敏感时期，在植物授粉后通过花粉管通道法或子房注射法将外源DNA(目的基因)引入胚囊，外源DNA(目的基因)就会进入尚不具备正常细胞壁的配子、合子或早期胚胎细胞，并整合到基因组中(周光宇，龚蓁蓁，王自芬。远缘杂交的分子基础-DNA片段假说的一个论证。遗传学报，1979，6(4)：405-413)。运用这个原理和技术，邓德旺等(邓德旺，郭三堆，杨志民。棉花花粉管通道法转基因的分子细胞学机理研究，云南大学学报，1999，s3，124-125)，采用激光共聚焦显微技术验证了棉花花粉管通道的可行性：外源DNA经过棉花胎座上部传输组织进入胚囊，直接转化处于融合期的无壁生殖细胞。但是转化操作对幼铃的大小有很高的要求，对子房的注射严重影响幼铃的生长，落铃率在一半以上(林栖凤主编。2004.植物分子育种。北京，科学出版社：189-192)。

花粉管通道法在大豆中也有成功报道(崔岩等，2003，提高大豆花粉管通道技术的转化率研究。大豆科学，22(3)：75-77)和相应专利(99123707，刘德璞，等，大豆花粉管通道转基因及其品种改良技术)。但是这种转基因方法不易掌握最佳的转化时机，转化操作对子房造成伤害，减少结实率。在其它作物中，如小麦(令利军，倪建福，张正英。花粉管通道转基因技术及其在小麦分子育种中的作用。分子植物育种，2004，2(3)：407-412)、水稻(王才林，赵凌，宗寿余，龚蓁蓁等。2005.生物技术通报，2：58)、玉米(专利01113922，授权日2004年12月15日)、番茄(专利98121507，授权日2003年7月23日)，也有花粉管通道法转基因成功的报道。

甘蓝型油菜的种质系统转化法也是运用花粉管作为外源DNA的通道。梁明山等(梁明山，吴书惠，潘骏玲。1994.外源DNA导入油菜的研究。西南农业学报，7(4)：37-42)用消毒刀片切去授粉后24小时柱头的三分之一，然后在花柱中央显微注射外源DNA溶液10微升。处理花朵100朵，得到250粒种子，相当于平均每朵花(角果)仅得到2粒种子。转化操作显然极大地影响了结实率。这是这种方法体系的缺点之一。

子房注射法也被用于油菜基因转化。林良斌等以甘蓝型油菜湘油13号为试验材料，将Bt杀虫蛋白基因导入油菜，在授粉后第20～30小时注射子房中部(林良斌，官春云，李恂，周小云，何业华。2000.子房注射法与农杆菌介导法转化甘蓝型油菜的比较研究。生命科学研究，4(3)：231-236)。处理25个子房，得到86粒转基因种子。子房注射对油菜这样的小花植物伤害很大，而且由于子房小，操作非常不方便。

原位(in planta)转化和农杆菌浸泡侵染也被用于油菜的转化(徐光硕，饶勇强，陈雁，张椿雨，孟金陵。用in planta方法转化甘蓝型油菜。作物学报，2004，30(1)：1-5)。在一定条件下，用根癌农杆菌菌液浸染甘蓝型油菜花序，共收获约100,000粒受处理的种子，平均转化效率0.1％左右。实验获得大量的种子，因而筛选工作量非常大。由于存留卡那霉素在植株体内而使许多转基因植株在经卡那霉素筛选移植后死亡，同时由于需要在培养基上用抗生素筛选转基因植株，然后移栽到田间或者花盆里，存在操作难度，造成植株死亡。由此可见，合适的筛选标记也是建立高通量转化体系的关键。另外以抗生素为标记的转基因筛选体系容易产生假阳性的问题(程振东，卫志明。1994.根癌农杆菌对甘蓝型油菜的转化及转基因植的再生。Acta Botanica Sinica(植物学报：英文版)，36(9)：657-663)。

以除草剂抗性为筛选标记则不存在这样的问题。模式植物拟南芥的大规模转基因方法-Floral-dip法(Clough S and Bent A.Floral dip：asimplifiedmetjjodforAgrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana 1998)和Floral-spray(Chung M，chen M，Pan S.，Floralspray transformation can efficiently generate Arabidopsis transgenicplants 2000)就是利用了除草剂抗性基因bar作为筛选基因，通过对生长2～3周的幼苗喷施除草剂，获得大量转基因幼苗，假阳性的植株出现率极低。

综上所述，不管是基于组织培养的遗传转化法，还是非组织培养的转化法，不管是否需要农杆菌的介导，都存在着转化效率低、基因型依赖严重、从转化到收获转基因种子的周期长、受生长季节的限制、工作量大、操作复杂等缺点中的一项或几项。长期以来，油菜转化主要依赖根癌农杆菌介导的转化方法，该方法依赖于组织培养和抗生素筛选，同样存在着基因型依赖强，工作量大，转化效率低的问题，而现有的其它物种中采用的花粉管通道法又存在结实率、抗生素筛选标记、工作量大、容易造成植株死亡等问题。目前还没有一种油菜转基因方法实现了高通量、高效率、低成本转化并解决基因型依赖问题。随着拟南芥和水稻模式植物基因组序列测定，多种作物的功能基因组研究陆续展开，快速得到大量转基因插入油菜突变体群体成为一项迫切的任务。本发明提供的转化体系有望解决限制油菜突变体库建立的技术瓶颈，并且这种转化技术也是高通量、高效率转基因育种的必备条件。发明人为了实现高通量、高效率的油菜基因转化，发明了油菜转基因技术。本发明采用柱头点滴的方法进行油菜的基因转化，将带有除草剂抗性基因的外源DNA直接导入油菜配子或合子中。该方法组合了生殖细胞为受体的种质转化系统的优点和油菜授粉特点，获得抗除草剂的转基因种子，平均转化率2.7％.

发明内容

本发明的目的是在于提供一种油菜转基因的方法，解决目前常用的油菜遗传转化方法中转化效率低，通量小，依赖组织培养和基因型等问题，该方法不仅转化效率高、成本低、不存在基因型依赖，而且避免了转化操作过程中的组培工作，避免了转基因植株繁殖中的春化和越夏问题。

本发明的技术解决方案是以原位生殖器官(包含花粉管，受精前后的配子和合子)为转基因受体，先对油菜授粉后的花柱和子房进行细胞学观察，确定遗传转化的操作时间；在该时间内对油菜进行遗传转化操作，即在油菜授粉后的2～12小时，削去部分柱头并滴加外源DNA溶液，使外源目标基因和草胺膦抗性基因(bar)为标记基因的DNA对生殖细胞进行转化，进而通过自然生长发育，获得转基因的T1代种子。这一转基因方法，可以适用于所有开花结实的油菜品种或品系或种质资源材料。在T1代幼苗早期用低浓度(0.01％~0.5％)的除草剂草胺膦进行喷洒筛选，直接得到转基因阳性油菜植株。对于不同的油菜品种转基因的效率在2％～10％。下面分四个步骤对本发明的内容进行详细说明。

一、观察受精后花粉管伸长过程以确定最佳外源DNA导入时间

在田间或在人工生长室播种油菜，按照正常的栽培管理措施培育油菜。在花期套袋，每隔一小时取授粉后的油菜子房用显微镜观察花粉管伸长和伸长进程，以确定最佳的外源DNA导入时间。

其步骤如下：

1.花蕾选择：开花期选择油菜主花序或发育良好的侧枝花序，摘除顶部未开放的小花蕾和下部角果及已经开放的花，留下大小适当和即将开放的花蕾用作去雄和转化。

2.花粉的准备：选择上述处理的单株的一个分枝花序或在同一品种不同单株上(或雄性不育系的保持系)选择花序，从花序上端向下套上硫酸纸袋或其它油菜自交用的袋子。袋子下端用回形针别住或其它方法封住。防止蜜蜂传粉，也防止被风吹开或者吹掉。

3.人工去雄：用浓度为70％的酒精(乙醇)擦拭尖嘴钳和手指尖，小心拨开步骤1中花序的花萼和花瓣露出雄蕊和雌蕊，不要伤及雌蕊，去除雄蕊。再套上硫酸纸袋，下端用回形针别住。在花序的下部挂上标牌，注明品种和去雄的日期。雄性不育材料则不用去雄。

4.人工授粉：人工去雄的第二天上午，打开步骤2(“花粉的准备”)中所套袋子，用镊子夹取处于散粉状态的花药，之后套上原先的袋子。将取下的花朵中花药点在步骤3(“人工去雄”)的柱头上，进行授粉，之后套上原先的袋子。

5.采样：从人工授粉后的0.5小时开始，每隔1小时摘取授粉后的子房10枚。一直到授粉后48小时。

6.子房样品的固定：取授粉后不同时期的子房，投入FAA固定液中，在1.5毫升的带盖小离心管中室温(20～25℃)下固定12～48小时。

7.复水：取出固定后的样品依次投入0.8毫升体积的浓度为60％酒精、45％酒精、20％酒精和蒸馏水四种溶液中各浸泡15分钟。

8.软化：倒掉步骤7的蒸馏水，加0.8毫升的软化剂即浓度为6摩尔/升(mol/L)的氢氧化钠(NaOH)溶液淹没样品，处理36小时。

9.染色：倒掉6mol/L的NaOH溶液，在离心管中加入1毫升蒸馏水漂洗5分钟，倒掉蒸馏水；再加1毫升蒸馏水漂洗5分钟，倒掉并吸干所有水分，在浓度为0.1％苯胺蓝染色液中染色1～6小时。

10.压片：用镊子轻轻的将染色后的子房样品取出，放在已经事先滴加1滴0.1％苯胺蓝染色液的载玻片上。从一侧小心盖上盖玻片，用拇指轻压盖玻片，压扁子房和柱头。

11.荧光显微镜观察：将压片好的玻片放在荧光显微镜的载物台上，在可见光下进行聚焦，直到在显微镜中能清晰的看到柱头和子房。用紫外光激发样品，观察发亮蓝色荧光的花粉管(以没有授粉的子房作为对照)。萌发的花粉粒和花粉管产生大量胼胝质，在紫外光激发下，能够发出亮蓝色的荧光，很容易与灰蓝色的雌性器官组织(柱头、花柱、子房)区分开来。没有授粉的柱头和花柱不会有亮蓝色荧光。

所用试剂配方如下：

FAA固定液(100毫升)：取90毫升浓度为50％或70％的酒精，加入5毫升甲醛和5毫升冰醋酸混合均匀。

60％酒精(100毫升)：取40毫升蒸馏水加入60毫升无水酒精混匀。

45％酒精(100毫升)：取55毫升蒸馏水加入45毫升无水酒精混匀。

20％酒精(100毫升)：取80毫升蒸馏水加入20毫升无水酒精混匀。

软化剂6mol/L的氢氧化钠(NaOH)：称取24克氢氧化钠固体颗粒，溶解在80毫升蒸馏水中，待完全溶解后，将溶液定容在100毫升。

0.1％苯胺蓝染色液：称取0.1克苯胺蓝粉末，溶于100毫升0.14mol/L的K₂HPO₄(pH8.2)中，搅拌使之完全溶解；其中0.14mol/L(摩尔每升)K₂HPO₄(磷酸氢二钾)(pH8.2)配制方法为：在100毫升水中加入2.44克K₂HPO₄，完全溶解后用浓NaOH调节pH值到8.2.

二、外源DNA(质粒pGreen0229)的抽提和酶切

待转化的外源DNA或基因需构建在一个适当的植物表达载体上。在本发明陈述的程序中，待转化的外源DNA是除草剂草胺膦抗性基因(bar)，构建在质粒pGreen0229植物表达载体上(带有质粒pGreen0229的大肠杆菌菌株DH5α已经商业化)。质粒pGreen0229的核苷酸序列和限制性内切酶酶切图谱参见附图1和http://www.pgreen.ac.uk/jit/pG0229.htm。

待转化的外源DNA可以为其它基因，如各种植物病原菌抗性基因、作物优良品质和产量相关基因等。这些基因需要与筛选标记基因如bar基因连一起，然后通过基因工程手段构建到适当的质粒载体中。本发明陈述的程序中，bar基因插入在质粒pGreen0229的多克隆位点上(附图1)。

(一)、外源DNA质粒的抽提步骤如下：

1.吸取500微升带有质粒pGreen0229的大肠杆菌DH5α菌液，接入盛有500毫升LB培养基的三角瓶中，37℃恒温摇床上培养，转速200转/分钟。培养16小时，培养基变得浑浊。

2.质粒pGreen0229的抽提：

(1)将步骤1中变浑浊的培养基分装到4支50毫升带盖离心管中，4℃下8000转/分钟离心5分钟，倒掉上清液收集菌体。

(2)将收集的菌体用STE溶液重悬，并转入2毫升离心管，每支离心管装1.5～1.8毫升重悬菌液。4℃下8000转/分钟离心5分钟，倒掉上清液收集菌体。

(3)用SDS-碱裂解法抽提菌液中的质粒DNA。在离心管中加入200微升溶液I，室温(20～25℃)下在涡旋仪上涡旋直到菌体充分散开；接着在室温(20～25度)加入新配置的400微升溶液II，颠倒离心管混匀，待溶液变得清亮后加入预冷的300微升溶液III，颠倒混匀；放在碎冰中，0℃放置3～5分钟。

(4)将离心管在4℃下10,000转/分钟离心10分钟，小心吸取上清液于新的2毫升离心管中，加入与上清液体积相等的氯仿-异戊醇溶液，氯仿-异戊醇溶液中氯仿和异戊醇的体积比为24∶1，颠倒离心管混匀溶液，室温(20～25度)放置5分钟，然后室温(20～25度)离心15分钟，转速10,000转/分钟，小心吸取上清液于新的2毫升离心管中。

(5)加入600微升异丙醇，颠倒混匀溶液，室温(20～25度)离心15分钟，转速10,000转/分钟，倒掉上清液。用250微升50TE溶液(含有RNA酶即牛胰核糖核酸酶A，浓度为20毫克/升)溶解质粒沉淀并在水浴锅中37℃水浴1小时。

(6)加入625微升无水乙醇和25微升3mol/L乙酸钠溶液，颠倒混匀溶液，室温(20～25度)放置5分钟，将质粒再沉淀。室温(20～25℃)下离心5分钟，转速10,000转/分钟，倒掉上清液。加入1毫升浓度为70％的酒精，上下颠倒10～15次，室温(20～25度)离心2分钟，转速10,000转/分钟，倒掉上清液，室温(20～25度)放置15分钟使酒精完全挥发。将再沉淀的质粒溶解于250微升0.1～1倍的SSC溶液中。

(二)、质粒溶液的电泳检测和定量：

在浓度为0.8％的琼脂糖胶(即1×TAE缓冲液)中电泳，测定质粒浓度。单酶切(Bgl II)和双酶切(Bgl II和BspHI)的质粒片段在浓度为1％的琼脂糖胶(1×TAE缓冲液)中电泳。其方法如下：

1.琼脂糖凝胶的制备：0.8％或者1％的琼脂糖(1×TAE缓冲液为溶剂)置于三角瓶中，瓶口倒扣一个小烧杯，将该三角瓶置于微波炉中以中火加热5分钟至琼脂糖溶解。

2.胶板的制备：取有机玻璃内槽，洗净、晾干；取纸胶条，将有机玻璃内槽置于一水平放置的模具上，放好梳子。倒入冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液，使胶液缓慢地展开直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温(20～25度)静置30分钟左右，待胶凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有1×TAE缓冲液的电泳槽中使用。

3.加样：用微量加样器将质粒溶液或其酶切产物样品(各2微升，事先与1微升6×上样缓冲液混匀)分别加入至胶板的样品孔内。每加完一个样品，换一个吸头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部，本实验样品孔容量约15～20微升。在第一个上样孔或最后一个上样孔内加入5微升的分子量标记(如DL2000DNA，浓度为50ng/ul)。

4.电泳：加完样后的凝胶板即可通电进行电泳；建议在80～100V的电压下电泳；当上样缓冲液中的溴酚兰移动到距离胶板下沿约1厘米处停止电泳；将凝胶放入溴化乙锭工作液(0.5ug/ml左右)中染色约20分钟。为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm(伏特/厘米)(两电极间的距离)。

5.观察与拍照：在紫外灯(310nm波长)下观察染色后的凝胶。DNA存在处显示出红色的荧光条带。在紫外灯下观察时，应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免眼睛遭受强紫外光损伤。采用快速凝胶成像系统拍照电泳图谱。

6.用0.1～1×SSC溶液调整外源DNA质粒浓度达到50～500ng/μL.4℃冷藏质粒溶液备用。

所用试剂配方如下：

(1)LB培养基：

分别称取10克胰蛋白胨，5克酵母提取物和10克氯化钠依次溶解于蒸馏水中，定容于1000毫升。分装于500毫升三角瓶中，121℃，6.859×104Pa下高压消毒15分钟。加入无菌的卡那霉素溶液，使得终浓度为50毫克每升。4℃冷藏备用。

(2)STE溶液：

用移液器分别吸取下列溶液：

1mol/L Tris-HCl溶液(pH8.0) 1毫升

3mol/L 氯化钠(NaCl)溶液 3.3毫升

0.5mol/L 乙二酸四乙胺二钠盐(EDTA，pH8.0) 200微升

混匀并加蒸馏水至100毫升。

1mol/L Tris-Cl(pH8.0)配制方法为：用800毫升蒸馏水溶解121.1克Tris碱，加浓盐酸42毫升，使溶液冷却至室温后，调整pH值到8.0，加水定容至1升。分装后，在6.859×104Pa的高压下(121℃下)蒸汽灭菌15分钟，4℃冰箱贮存。

0.5mol/L EDTA(pH8.0)配制方法为：用800毫升蒸馏水剧烈搅拌溶解186.1克二水乙二酸四乙胺二钠(EDTA-Na·2H2O)。用NaOH调解溶液的pH值(约需要20克固体NaOH)，当pH值接近8.0时才会完全溶解。定容于1升。分装后，在6.859×104Pa的高压下(121℃下)蒸汽灭菌15分钟，4℃冰箱贮存。

3mol/L氯化钠(NaCl)溶液配制方法为：用800毫升蒸馏水剧烈搅拌溶解292克NaCl，定容于1升。分装后，在6.859×104Pa的高压下(121℃下)蒸汽灭菌15分钟，室温贮存。

(3)50TE溶液：

用移液器分别吸取下列溶液：

1mol/L Tris-HCl溶液(pH8.0) 5毫升

0.5mol/L 乙二酸四乙胺二钠盐(EDTA，pH8.0)： 2毫升

加蒸馏水至100毫升。

其中1mol/L Tris-Cl(pH8.0)和0.5mol/L EDTA(乙二酸四乙胺二钠盐)(pH8.0)的配制方法与所用试剂配方(2)中描述的相同。

(4)溶液I：

50mmol/L 葡萄糖

10mmol/L EDTA，20mmol/L

20mmol/L Tris-HCl pH8.0

溶液I可成批配制，每瓶约100毫升，分装后，在6.859×104Pa的高压下(121℃下)蒸汽灭菌15分钟，4℃冰箱贮存。

(5)溶液II：

0.2mol/L NaOH(临用前吸取10mol/L NaOH贮存液20微升。10mol/L NaOH贮存液的配制方法为：称取40克固体NaOH(氢氧化钠)溶于100毫升蒸馏水中。)

1％SDS(临用前吸取20％SDS贮存液50微升)

定容于1毫升。

(6)溶液III：

60毫升5mol/L 醋酸钾，5毫升冰醋酸，28.5毫升蒸馏水。

(7)氯仿/异戊醇(24∶1)：

在24毫升氯仿中加入1毫升异戊醇，混匀后棕色瓶4℃冰箱贮存。

(8)RNA酶(牛胰核糖核酸酶A)：

称取25mg的RNase A，在25毫升的缓冲液中(1mmol/L Tris-HCl 250微升，1.5mmol/L NaCl 75微升，双蒸水25ml)溶解，然后用100度煮沸15分钟，缓慢冷却至室温并分装为100ul/管，-20度冻存。

(9)SSC溶液：

在800毫升蒸馏水中溶解175.3克Nacl和88.2克柠檬酸钠，加入数滴10mol/LNaOH调pH至7.0，加水至1000毫升，配制成20×SSC溶液。分装后，在6.859×104Pa的高压下(121℃下)蒸汽灭菌15分钟，4℃冰箱贮存。使用前用高压灭菌的蒸馏水稀释成0.1～1×SSC溶液。

(10)1×TAE缓冲液：

2mol/L Tris碱，1mol/L乙酸，100mmol/L EDTA

先配制成5×TAE缓冲液：称取242克Tris碱溶于500毫升蒸馏水中，加入57.1毫升冰乙酸(17.4mol/L)及200毫升0.5mol/L EDTA(pH 8.0)混匀，补加蒸馏水至1000毫升，4℃冰箱贮存；使用时用蒸馏水稀释5倍，配成1×TAE缓冲液。

其中0.5mol/L EDTA(乙二酸四乙胺二钠盐)(pH8.0)的配制方法与所用试剂配方(2)中描述的相同。

(11)0.8％琼脂糖胶：

称取0.4克琼脂糖，置于三角瓶中，加入50毫升1×TAE缓冲液。

(12)1％琼脂糖胶：

称取0.5克琼脂糖，置于三角瓶中，加入50毫升1×TAE缓冲液。

(13)6×上样缓冲液：

0.25％溴酚兰，40％(w/v)蔗糖

即：称取0.25克溴酚兰，40克蔗糖，分别溶解，定容于100毫升蒸馏水中。分装后，在6.859×104Pa的高压下(121℃下)蒸汽灭菌15分钟，4℃冰箱贮存。

三、油菜的转化

油菜播种于田间(隔离的)或人工生长室中，按照正常的栽培管理措施，在开花期，选择晴朗的天气(生长室内则不受此限制)，人工剥蕾去雄。选择已有几朵开花的花序，打掉花序的顶端的小花蕾，去掉角果和已经开放的花朵，留下未开放花蕾，每花序留10～15个，人工剥蕾去雄，雄性不育系则不需人工去雄。之后套上大小合适的杂交用袋子(如硫酸纸袋)。同时选取另外的花序，打掉已开放的花朵，套袋，为次日授粉提供开放的花朵和散粉的雄蕊。在花序下方的花序轴上挂牌，注明剥蕾的日期和材料代号。其中花蕾选择、花粉准备、人工去雄的方法与发明内容一相同。

次日上午，从套袋后新开放的花朵上取花粉，授在人工剥蕾后的柱头上，油菜授粉后套袋。人工授粉的方法与发明内容一相同。同日下午，油菜授粉后2～12小时进行遗传转化操作，用锋利的手术刀切掉授过粉的柱头，立即用微量移液器在切口上滴加1～3微升外源DNA溶液(发明内容二中抽提出的质粒溶液)，套袋，花序的牌子上附加注明所转化的外源DNA代号等信息。如果遇到雨天则不滴加外源DNA溶液，但要挂牌注明已授粉。在转化和套袋5～14天后取下袋子，待角果自然成熟后收获种子。

四、转基因后代的筛选和种植

1.转基因植株筛选

在本发明陈述中使用除草剂抗性基因，以筛选转基因植株，但本发明不限于用除草剂抗性基因。

将发明内容三中收获的种子倒在干净的干平皿上，选取未破裂完整的种子并计数。每1000颗种子为一份。同时选取来自拜尔公司的抗除草剂油菜种子为阳性对照种子，未转基因的油菜种子为阴性对照种子。取干净的大平皿(直径15cm)，铺上洁净的滤纸，并用双蒸水湿润滤纸，将一份种子均匀分散在滤纸上，在生长箱中以18～25℃，光照16小时，黑暗8小时的条件催芽。出芽后将其点种在装有中性花土的塑料盒中。大约在催芽后的3～4天、绝大部分苗的子叶展开，真叶开始显露时，喷除草剂。除草剂草胺膦的浓度为0.01％～0.5％。用喷雾瓶将除草剂均匀喷洒到叶子上，除草剂第一次喷洒后5～12天再喷洒一次。每次喷施之后用剪刀剪除已经变黄枯萎的幼苗，和转基因阳性对照一样仍能够保持子叶绿色并继续生长的幼苗是转基因植株。待绿苗长到3～5片叶后小心地移栽到温室或带土营养钵中。

2.PCR检测的快速DNA抽提方法如下：

在抗除草剂的转基因油菜植株上采集叶片一小片，放入1.5毫升离心管中，加入400微升DNA抽提缓冲液(200mM Tris-Hcl(pH8.0)，250mM NaCl，25mMEDTA(pH8.0)，0.5％SDS)，用电动匀浆器匀浆20～30秒。随后在台式离心机上4℃以13000转/分钟的转速离心15分钟，将上清液转入到干净的1.5毫升离心管中。在此离心管中加入等体积预冷的异丙醇并轻轻颠倒混匀，在室温(20～25度)下静置2～3分钟。最后在台式离心机上，室温下以12000转/分钟的速度离心5分钟。弃去上清，20～25度开盖放置15分钟左右使异丙醇挥发，加30微升无菌双蒸水溶解DNA沉淀，-20℃保存待用。

DNA抽提缓冲液的配制(100毫升)：称取2.42克Tris碱，0.093克EDTA-Na₂·H₂O，1克NaCl和0.5克SDS粉末加双蒸水混匀，用浓HCl调整pH至8.0，最后用蒸馏水定容至100毫升。

3.外源DNA插入片段的PCR检测

本发明以除草剂抗性基因bar为例，但不限于除草剂抗性基因。

(1)根据除草剂抗性基因bar核苷酸序列，设计PCR引物，从植物总DNA中扩增bar基因片段。PCR扩增的阳性对照为发明内容二中抽提的质粒pGreen0229溶液。

(2)引物序列：

Bar1：5’GAA，GTC，CAG，CTG，CCA，GAA，AC；

Bar2：5’AGT，CGA，CCG，TGT，ACG，TCT，CC。

在20微升(μl)PCR体系中分别加入：

去离子水 13.3μl，

10×Buffer 2μl

2.5mmol/L dNTP 0.5μl

25mmol/L MgCl₂ 1.5μl

Taq酶 0.2μl(1单位)

植物总DNA 1μl(50～100ng)

(3)在PCR仪上采用下列程序进行反应：

94℃5分钟(min)1个循环→94℃30秒(sec)→55℃30sec→72℃1min，35个循环→72℃7min 1个循环→4～10℃维持数小时。

得到的产物在1.2％琼脂糖电泳检测(电泳方法如内容二中所述)，大小为284bp，结果如附图4。

(4)1.2％琼脂糖配制：

称取0.6克琼脂糖，置于三角瓶中，加入50毫升1×TAE缓冲液，加热溶解。

本发明的特点是：通量高，而且成本低廉、工作量小、易操作、周期短、直接获得转基因种子、没有基因型效应、避免了转基因油菜种子繁殖中的春化和越夏问题、结实率高、筛选简便。

本发明的优点主要体现在以下几个方面：

1.本发明提供的油菜授粉后花粉管和子房的细胞学观察方法，可以对不同的油菜品种的受精过程进行分析，确定油菜不同品种所特有的最佳处理时期以达到提高转化效率的目的。

2.本发明提供的转化方法效率高(在油菜花期每个工人可以处理数万朵花、得到数千粒转基因种子)、实现高通量基因转化。

3.在本发明提供的油菜转化方法中转化不依赖于油菜基因型，即适合任何品种、品系或种质资源材料，克服了农杆菌介导转化法中基因型依赖问题，也避免了目前普遍使用的转化方法中存在的大量组织培养工作，成本低廉，工作量小。

4.本发明中的大田油菜转化是在油菜生长季节，可直接获得转基因种子，避免了目前普遍使用的转化方法中转基因油菜种子繁殖需春化和越夏等问题。

5.本发明方法中的转化操作对结实率和种子萌发率影响小。

6.本发明中的遗传转化操作不使用任何细菌菌株，因此避免了细菌带来的环境风险。

附图说明

图1质粒pGreen0229的限制性内切酶酶切图谱以及主要基因排列顺序

pGreen II质粒载体是pGreen0229的基本骨架，限制性内切酶Bgl II将骨架切开，连接T-DNA.T-DNA片段上带有抗除草剂草胺膦的bar基因，该基因连接在nos启动子后面。LacZ基因中部有多克隆位点。LB：T-DNA左边界；RB：T-DNA右边界

图2.油菜品种“中双九号”自交授粉后不同时间花粉管在柱头和子房中伸长的荧光显微观察

A图：未授粉的雌蕊、柱头和花柱

B图：授粉后7小时雌蕊、柱头和花柱

C图：授粉后12小时雌蕊、柱头和花柱

用0.1％苯胺蓝染色后观察到的中双九号自交授粉的柱头、花柱、子房。图中箭头所示发亮蓝色荧光的是已萌发花粉管，图中的标尺所代表实际大小为5微米。图A显示的未授粉柱头上没有亮蓝色荧光。授粉后7小时至少十多条花粉管已经进入花柱(图B)而授粉后12小时进入花柱的花粉管更多(图C)，而且不少花粉管已经到达子房和胚珠。

图3.质粒pGreen0229限制性内切酶酶切鉴定

泳道1为质粒溶液，分子量大小在4.5kb；经过单酶切(Bgl II)之后，产生两个片段，分别是1959bp和2495bp(泳道2)；经过双酶切(Bgl II和BspH

I)之后产生4个片段，从大到小依次为：1959bp、961bp、809bp、725bp(泳道3)。泳道DL和泳道M分别是分子量标记DL2000和λHindIII+EcoR I双酶切产物。鉴定结果表明所抽提出来的质粒是pGreen0229

图4.经两次除草剂喷施之后抗性苗的PCR检测结果

泳道M为分子量标记DL2000，泳道C是阳性对照(质粒pGreen0229)的PCR扩增产物。从这一结果可以看出经过两次除草剂筛选后的抗性苗基本上呈现PCR阳性结果，说明本发明的除草剂筛选体系有效、可靠。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做进一步的说明。

实施例1：甘蓝型油菜品种“中双九号”授粉后花粉管伸长过程的观察

甘蓝型油菜品种“中双九号”(中国农业科学院油料作物研究所培育，又名“全能628”)。该品种是双低(低芥酸低硫甙)优质油菜品种，抗病毒病、耐菌核病，是长江流域主要栽培品种之一。于秋季(9月26日～9月30日)播种“中双九号”，厢宽2米，行距0.3米。按照正常栽培管理和肥水措施，次年春季开花。开花后对自交授粉后的“中双九号”子房每隔1小时进行取样，用于确定花粉管伸长显微观察，以确定最佳的质粒导入时间。

花粉管萌发及伸长的染色及荧光观察参考并改进魏琴(魏琴，周黎军，陈东林，李旭峰，陈放。十字花科10属种与油菜萝卜胞质不育系杂交的花粉萌发情况观察，植物学通报，2000，17(3)：260-265)方法，主要步骤如下：

1.花蕾选择：3月下旬，选择“中双九号”主花序或者第一次分枝的花序，摘除顶部未开放的小花蕾和下部角果及已经开放的花，留下12个花蕾。

2.花粉的准备：选择“中双九号”另一枝花序，摘除下部角果和已经开放的花，套上硫酸纸袋，下端用回形针别住，防止蜜蜂传粉，也防止被风吹开或者吹掉。在花序的下部挂上标牌，注明品种和套袋自交的日期。

3.人工去雄：用浓度为70％的酒精(乙醇)擦拭尖嘴钳和手指尖，小心拨开花萼和花瓣露出雄蕊和雌蕊，不要伤及雌蕊，去除雄蕊。套上硫酸纸袋，下端用回形针别住。在花序的下部挂上标牌，注明品种和去雄的日期。

4.人工授粉：人工去雄的第二天上午10～11点，打开以上第2步(“花粉的准备”)中所套硫酸纸袋子夹取已经散粉的油菜成熟花药，套上硫酸纸袋。事先用浓度为70％的酒精(乙醇)擦拭尖嘴钳。将取下的花药点在第3步(“人工去雄”)的柱头上授粉。然后套上硫酸纸袋。

5.采样：从人工授粉后的0.5小时开始，每隔1小时摘取授粉后的子房10枚。一直到授粉后24小时。

6.子房样品的固定：田间采取授粉后不同时期(按照“采样”步骤)的子房，立即投入FAA固定液中，在1.5毫升的带盖小离心管中20～25度固定24小时。

7.复水：20～25度，取出固定后的样品依次投入0.8毫升体积的浓度为60％酒精、45％酒精、20％酒精和蒸馏水四种溶液中各浸泡15分钟。

8.软化：倒掉蒸馏水，加0.8毫升体积浓度为6mol/L(摩尔每升)的氢氧化钠(NaOH)淹没样品，在20～25度处理12小时。

9.染色：倒掉6mol/L的NaOH溶液，在离心管中加入1毫升蒸馏漂洗5分钟，倒掉；再加1毫升蒸馏漂洗5分钟，倒掉并吸干所有水分，在浓度为0.1％苯胺蓝染色液中染色3～5小时。

11.荧光显微镜观察：将压片好的玻片放在荧光显微镜的载物台上，在可见光下进行聚焦，使得显微镜中清晰的看到柱头和子房。用356nm左右波长的紫外光激发样品，观察发亮蓝色荧光的花粉管(以没有授粉的子房作为对照)。在356nm左右的紫外光激发下，萌发的花粉粒和花粉管产生大量胼胝质，能够发出亮蓝色的荧光，很容易与灰蓝色的雌性器官组织(柱头、花柱、子房)区分开来。没有授粉的柱头和花柱不会有亮蓝色荧光。

通过观察发现“中双九号”授粉后，能够很快在柱头上萌发。授粉后大约7小时花粉管进入花柱，少数可以到达子房(附图2)。随着时间的延长，在花柱中的花粉管更多，并逐渐延伸到子房、开始进入胚珠(附图2)。由此确定“中双9号”最佳基因转化处理时期。

所用试剂配方如下：

1％苯胺蓝染色液：称取0.1克苯胺蓝粉末，溶于100毫升0.14mol/L的K₂HPO₄(pH8.2)中，搅拌使之完全溶解；其中0.14mol/L(摩尔每升)K₂HPO₄(磷酸氢二钾)(pH8.2)配制方法为：在100毫升水中加入2.44克K₂HPO₄，完全溶解后用浓NaOH调节pH值到8.2.

实施例2：外源DNA质粒的抽提准备和酶切鉴定

待转化的外源DNA是带有除草剂草胺膦抗性(bar基因)的质粒pGreen0229植物表达载体(带有质粒pGreen0229的大肠杆菌菌株DH5α由中国农业科学院生物技术研究所刘昱辉惠赠)。质粒pGreen0229的核苷酸序列和限制性内切酶酶切图谱参见附图1和http://www.pgreen.ac.uk/jit/pG0229.htm。

(一)、外源DNA质粒的抽提步骤如下：

1.吸取50微升带有质粒pGreen0229的大肠杆菌DH5α菌种，接入盛有500毫升LB培养基的三角瓶中，37℃恒温摇床上培养，转速200转每分钟。培养16小时，培养基变得浑浊。

2.质粒pGreen0229的抽提：

(1)将步骤1中变浑浊的培养基分装到4支有盖50毫升离心管中，4℃下8000转每分钟离心5分钟，倒掉上清液收集菌体。

(2)用STE溶液重悬收集的菌体，并转入2毫升离心管，每支离心管装有1.5～1.8毫升重悬菌液。4℃下8000转每分钟离心5分钟，倒掉上清液收集菌体。

(3)用SDS-碱裂解法抽提菌液中的质粒DNA。在离心管中加入200微升溶液I，室温(20～25℃)下在涡旋仪上涡旋直到菌体充分散开；接着在室温(20～25度)加入新配置的400微升溶液II，颠倒离心管混匀，待溶液变得清亮后加入预先冰冷的300微升溶液III，颠倒混匀；放在碎冰中，0℃放置3～5分钟。

(4)将离心管在4℃下10,000转每分钟离心10分钟，小心吸取上清液于新的2毫升离心管中，加入与上清液体积相等的氯仿-异戊醇溶液，氯仿-异戊醇溶液中氯仿和异戊醇的体积比为24∶1，颠倒离心管混匀溶液，室温(20～25度)放置5分钟，然后室温(20～25度)离心，转速10,000转每分钟离心15分钟，小心吸取上清液于新的2毫升离心管中。

(5)加入600微升异丙醇，颠倒混匀溶液，室温(20～25度)离心，转速10,000转每分钟离心15分钟，倒掉上清液。用250微升50TE溶液(含有RNA酶即牛胰核糖核酸酶A，浓度为20毫克每升)溶解质粒沉淀并在水浴锅中37℃水浴1小时。

(6)加入625微升无水乙醇和25微升3mol/L乙酸钠溶液，颠倒混匀溶液，室温(20～25度)放置5分钟，将质粒再沉淀。室温(20～25℃)下离心，转速10,000转每分钟离心5分钟，倒掉上清液。加入1毫升浓度为70％的酒精，上下颠倒10~15次，室温(20～25度)离心，转速10,000转每分钟离心2分钟，倒掉上清液，室温(20～25度)放置15分钟使酒精完全挥发。将再沉淀的质粒溶解于250微升0.1～1倍的SSC溶液中。

(二)、质粒溶液的电泳检测和定量：

1.脂糖凝胶的制备：0.8％或者1％的琼脂糖(1×TAE缓冲液为溶剂)置于三角瓶中，瓶口倒扣一个小烧杯，将该三角瓶置于微波炉中以中火加热5分钟至琼脂糖溶解。

2.胶板的制备：取有机玻璃内槽，洗净、晾干；取纸胶条，将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，放好梳子。倒入冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液，使胶液缓慢地展开直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温(20～25度)静置30分钟左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有1×TAE缓冲液的电泳槽中使用。

3.加样：用微量加样器将质粒溶液或其酶切产物样品(各2微升，事先与1微升6×上样缓冲液混溶)分别加入胶板的样品孔内。每加完一个样品，换一个吸头。加样时应防止碰坏样品孔周围的凝胶面以及穿透凝胶底部，本实验样品孔容量约15～20微升。在第一个上样孔或最后一个上样孔内加入5微升的DL2000DNA分子量标记(浓度为50ng/ul)。

4.电泳：加完样后的凝胶板即可通电进行电泳；建议在80～100V的电压下电泳；当上样缓冲液中的溴酚兰移动到距离胶板下沿约1厘米处停止电泳；将凝胶放入溴化乙锭工作液(0.5ug/ml左右)中染色约20分钟。为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm(伏特每厘米)(两电极间的距离)。

(三)、质粒溶液的限制性内切酶消化鉴定：

质粒溶液分别在单酶切(Bgl II)缓冲液和双酶切(Bgl IIBspHI)缓冲液中处理，处理后的溶液各吸取4微升在浓度为1％的琼脂糖胶(溶剂为1×TAE缓冲液)中电泳测定，测定结果见附图3。电泳方法与(二)相同。

所用试剂配方如下：

(1)LB培养基：

(2)STE溶液：

用移液器分别吸取下列溶液：

1mol/L Tris-HCl溶液(pH8.0) 1毫升

3mol/L 氯化钠(NaCl)溶液 3.3毫升

0.5mol/L 乙二酸四乙胺二钠盐(EDTA，pH8.0)：200微升

混匀并加蒸馏水至100毫升。

(3)50TE溶液：

用移液器分别吸取下列溶液：

1mol/L Tris-HCl溶液(pH8.0) 5毫升

0.5mol/L 乙二酸四乙胺二钠盐(EDTA，pH8.0)：2毫升

加蒸馏水至100毫升。

(4)溶液I：

50mmol/L葡萄糖

10mmol/L EDTA，20mmol/L

20mmol/L Tris-HCl pH8.0

(5)溶液II：

1％SDS(临用前吸取20％SDS贮存液50微升)

定容于1毫升。

(6)溶液III：

60毫升5mol/L 醋酸钾，5毫升冰醋酸，28.5毫升蒸馏水。

(7)氯仿/异戊醇(24∶1)：

(8)RNA酶(牛胰核糖核酸酶A)：

(9)SSC溶液：

(10)单酶切(Bgl II)缓冲液和体系：

限制性内切酶购自NEB(New England Biolabs)公司。

10×buffer3： 2微升

质粒溶液： 5微升

内切酶Bgl II： 0.5微升

无菌蒸馏水： 12.5微升

酶切处理方法：37℃水浴，过夜或者16小时。

(11)双酶切(Bgl II+BspH I)缓冲液和体系：

限制性内切酶购自NEB(New England Biolabs)公司。

10×buffer3： 2微升

质粒溶液： 5微升

内切酶Bgl II： 0.5微升

内切酶BspHI： 1微升

无菌蒸馏水： 11.5微升

酶切处理方法：37℃水浴，过夜或者16小时。

(12)1×TAE缓冲液：

2mol/L Tris碱，1mol/L乙酸，100mmol/L EDTA

(13)0.8％琼脂糖胶：

称取0.4克琼脂糖，置于三角瓶中，加入50毫升1×TAE缓冲液。

(14)1％琼脂糖胶：

称取0.5克琼脂糖，置于三角瓶中，加入50毫升1×TAE缓冲液。

(15)6×上样缓冲液：

0.25％溴酚兰，40％(w/v)蔗糖

即：称取0.25克溴酚兰，40克蔗糖，分别溶解，定容于100毫升蒸馏水中。

分装后，在6.859×104Pa的高压下(121℃下)蒸汽灭菌15分钟，4℃冰箱贮存。

实施例3：甘蓝型油菜品种“中双九号”的转化及结实率分析

于秋季(9月26日～9月30日)播种“中双九号”，厢宽2米，行距0.3米。按照正常栽培管理和肥水措施，下一年春季开花。

盛花期选择晴朗的天气，选择未开放花蕾，每花序留10～15个，转化前人工去雄。打掉花序的顶端没有去雄的小花蕾，去掉角果和已经开放的花朵，套上大小合适的硫酸纸袋。同时选取另外的花序，打掉已开放的花朵，套袋，准备花粉，为次日授粉提供新开放的花朵和散粉的雄蕊。在花序下方的花序轴上挂牌，注明日期和材料代号。其中花蕾选择、花粉的准备、人工去雄按照“实施例1：甘蓝型油菜品种“中双九号”授粉后花粉管伸长过程的观察”中的步骤1、2和3进行。

次日上午10:00，从套袋后新开放的花朵上取花粉，人工授粉(按照“实施例1：甘蓝型油菜品种“中双九号”授粉后花粉管伸长过程的观察”中的步骤4进行)。下午，用锋利的手术刀切掉部分授过粉的柱头，立即用微量移液器将质粒溶液(实施例2抽提出的质粒溶液)2微升滴加在切口上，套袋。花序的牌子上附加注明质粒代号等信息。如果遇到雨天则不滴加外源DNA溶液，但要挂牌注明。在套袋5～7天后取下袋子，待角果自然成熟，然后收获种子。

比较自交授粉以及授粉后进行转化处理的油菜花序的结实率，分析本发明对油菜结实率的影响(表1)。

表1“中双九号”转化后的结实情况

经过转化处理的花序一共61个，每个花序可以得到6～7个有效角果，每个角果可以得到17粒种子。与同样人工去雄、授粉但不作转化处理的角果相比，转化操作后每果粒数平均减少2粒，表明新方法的转化处理对结实率影响较小。

本发明的转化操作对雌蕊的影响降到最低，保证转化处理后的植株保持较高的结实率。解决了在其它农作物种上采用类似方法引起的结荚数下降(大豆只有31％，雷勃钧，尹光初。1991。外源DNA导入大豆的适宜时期与相应方法。中国油料，1：88-89)和落铃问题(棉花成铃率最高只有31.3％，李保成，蒙峰丽，赵红梅，杨玲。1998.石河子科技，外源DNA导入法提高棉花抗病性效果初报和体会3：4-5；林栖凤主编。2004.植物分子育种。北京，科学出版社：189-192)。

实施例4：转基因后代的筛选

1.用除草剂筛选转基因种子和幼苗

将实施案例3中收获的种子倒在干净的干平皿上，选取未破裂完整的种子并计数。每1000颗种子为一份。同时选取来自拜尔公司的抗除草剂油菜种子为阳性对照种子，未转基因的油菜种子为阴性对照种子。取一个干净的大平皿(直径15cm)，铺上洁净的滤纸，并用双蒸水润湿，将一份种子分散均匀在滤纸上，在生长箱中以18～28℃，光照16小时，黑暗8小时的条件催芽。出芽后将其点种在装有中性花土塑料盒中。大约在催芽后的3～4天，绝大部分苗的子叶展开，真叶开始显露时，准备喷除草剂。除草剂草胺膦的浓度为0.01％～0.5％.用喷雾瓶将除草剂均匀喷洒到叶子上，5～12天后再喷洒一次。每次喷施之后用剪刀剪除已经变黄枯萎的幼苗，和转基因阳性对照一样仍能够保持子叶绿色并继续生长的幼苗是转基因植株。待绿苗长到3～5片叶后小心地移栽到土中生长，分单株留取约100mg叶片用于DNA抽提和PCR检测。

2.PCR检测的快速DNA抽提方法如下：

采集新鲜的油菜嫩叶一小片，放入1.5毫升离心管中，加入400微升DNA抽提缓冲液(200mM Tris-Hcl(pH8.0)，250mM NaCl，25mM EDTA(pH8.0)，0.5％SDS)，用电动匀浆器匀浆20～30秒。随后在台式离心机上4℃以13000转/分钟的转速离心15分钟，将上清液转入到干净的1.5毫升离心管中。在此离心管中加入等体积预冷的异丙醇并轻轻颠倒混匀，在室温(20～25度)下静置2～3分钟。最后在台式离心机上室温以12000转每分钟的速度离心5分钟。弃去上清，20～25度开盖放置15分钟左右使异丙醇挥发，加30微升无菌双蒸水溶解DNA沉淀，-20℃保存待用。

3.转基因植株的PCR检测

(1)根据除草剂抗性基因bar核苷酸序列设计PCR引物，从植物总DNA中扩增bar基因片段。PCR扩增的阳性对照为发明内容二中抽提的质粒pGreen0229溶液。

(2)引物序列：

Bar1：5’GAA，GTC，CAG，CTG，CCA，GAA，AC；

Bar2：5’AGT，CGA，CCG，TGT，ACG，TCT，CC。

在20微升(μl)PCR体系中分别加入：

去离子水 13.3μl，

10×Buffer 2μl

2.5mmol/L dNTP 0.5μl

25mmol/L MgCl₂ 1.5μl

Taq酶 0.2μl(1单位)

植物总DNA 1μl(50～100ng)

(3)在PCR仪上采用下列程序进行反应：

(4)1.2％琼脂糖：

称取0.6克琼脂糖，置于三角瓶中，加入50毫升1×TAE缓冲液。

表2“中双九号”转化后代幼苗的除草剂筛选结果

本次实验收获的转化种子共萌发出8809株幼苗，经两次除草剂筛选后获得绿苗252株，PCR鉴定结果表明，假阳性率为5％，转化效率为2.7％.种子的萌发率很高，用除草剂筛选的效率高。

Claims

1、一种油菜转基因的方法，它包括下列步骤：

A、外源DNA导入时间，首先是花蕾选择，选择油菜花序，摘除顶部未开放的小花蕾和下部角果及已经开放的花；其次是花粉的准备，选择上述处理的单株的一个分枝花序或在同一品种不同单株上选择花序，从花序上端向下套上硫酸纸袋或油菜自交用的袋子；第三是人工去雄，用浓度为70％的酒精擦拭尖嘴钳和手指尖，剥开第一步中花序的花萼和花瓣露出雄蕊和雌蕊，去除雄蕊，套上硫酸纸袋，下端用回形针别住；第四是人工授粉，打开第二步中所套袋子夹取已处于散粉状态的花药，套上原先的袋子，将取下的花药点在第三步的柱头上授粉；第五是采样，从人工授粉后的0.5小时开始，每隔1小时摘取授粉后的子房，一直到授粉后48小时；第六是子房样品的固定：将不同时期的子房投入FAA固定液中，在1.5毫升的带盖小离心管中室温下固定12～48小时；第七是复水，取出固定后的样品依次投入0.8毫升体积的浓度为60％酒精、45％酒精、20％酒精和蒸馏水四种溶液中各浸泡15分钟；第八是软化，倒掉第七步的蒸馏水，加0.8毫升体积浓度为6mol/L的氢氧化钠淹没样品，处理12小时；第九是染色，倒掉6mol/L的NaOH溶液，在离心管中加入1毫升蒸馏水漂洗5分钟，倒掉蒸馏水，再加1毫升蒸馏水漂洗5分钟，倒掉蒸馏水并吸干水分，在浓度为0.1％苯胺蓝染色液中染色1～6小时；第十是压片，将染色后的子房样品取出，放在已经事先滴加1滴0.1％苯胺蓝染色液的载玻片上，从一侧盖上盖玻片，压盖玻片，压扁柱头、花柱和子房；第十一是荧光显微镜观察，将压片好的玻片放在荧光显微镜的载物台上，在可见光下进行聚焦，直到显微镜中能清晰的看到柱头、花柱和子房；

B、外源DNA质粒的抽提和酶切：首先是吸取500微升带有质粒pGreen0229的大肠杆菌DH5α菌液，接入盛有500毫升LB培养基的三角瓶中，37℃恒温摇床上培养，转速200转每分钟，培养16小时，培养基变得浑浊；其次是质粒pGreen0229的抽提，将上一步中变浑浊的培养基分装到离心管中，4℃下8000转/分钟离心5分钟，倒掉上清液收集菌体；然后用SDS-碱裂解法抽提菌液中的质粒DNA在离心管中加入200微升溶液I，室温下在涡旋仪上涡旋直到菌体散开，接着在室温下加入400微升溶液II，颠倒离心管混匀，待溶液变得清亮后加入预先冰冷的300微升溶液III，颠倒混匀，放在碎冰中，0℃放置3～5分钟，再将离心管在4℃下10,000转/分钟离心10分钟，吸取上清液于离心管中，加入与上清液体积相等的氯仿-异戊醇溶液，氯仿-异戊醇溶液中氯仿和异戊醇的体积比为24∶1，颠倒离心管混匀溶液，室温下放置5分钟，然后室温下离心15分钟，转速10,000转/分钟，吸取上清液于离心管中，加入600微升异丙醇，颠倒混匀溶液，室温下离心15分钟，转速10,000转/分钟，倒掉上清液，用250微升50TE溶液溶解质粒沉淀并在水浴锅中37℃水浴1小时，最后加入625微升无水乙醇和25微升3mol/L乙酸钠溶液，颠倒混匀溶液，室温放置5分钟，将质粒再沉淀，室温下离心5分钟，转速10,000转/分钟，倒掉上清液，加入1毫升浓度为70％的酒精，上下颠倒10～15次，室温下离心2分钟，转速10,000转/分钟，倒掉上清液，室温下放置15分钟使酒精挥发，将再沉淀的质粒溶解于250微升SSC溶液中；第三是质粒溶液的电泳检测和定量：在浓度为0.8％的琼脂糖胶和1×TAE缓冲液中电泳测定质粒浓度，经过Bgl II的单酶切和Bgl II和BspHI的双酶切的质粒片段在浓度为1％的琼脂糖胶和1×TAE缓冲液中电泳测定，其步骤是：

a.琼脂糖凝胶的制备：0.8％或1％的琼脂糖和1×TAE缓冲液置于三角瓶中，瓶口倒扣一个烧杯，将三角瓶置于微波炉加热5分钟至琼脂糖溶解；

b.胶板的制备：取有机玻璃内槽，洗净、晾干，取纸胶条，将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，倒入冷却至65℃的琼脂糖凝胶液，使胶液展开直到在有机玻璃板表面形成均匀的胶层，室温下静置30分钟，待凝固完全后，拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔；

c.加样：用微量加样器将质粒溶液或其酶切产物样品各2微升，事先与1微升6×上样缓冲液混溶分别加入胶板的样品孔内，每加完一个样品，换一个吸头，样品孔容量15～20微升，在第一个上样孔或最后一个上样孔内加入5微升的分子量标记，其浓度为50ng/μl；

d.电泳：加完样后的凝胶板即可通电进行电泳；在80～100V的电压下电泳；当上样缓冲液中的溴酚兰移动到距离胶板下沿1厘米处停止电泳，将凝胶放入溴化乙锭工作液0.5μg/ml中染色20分钟，电场强度不高于5V/cm；

e.观察与拍照：在紫外灯下，波长为310nm，观察染色后的凝胶；

f.用SSC溶液调整质粒浓度，4℃冷藏质粒溶液备用；

所述的溶液I、溶液II、溶液III、TAE缓冲液、SSC溶液组成分别如下：

溶液I：

50mmol/L葡萄糖

10mmol/L EDTA，20mmol/L

20mmol/L Tris-HCl pH8.0；

溶液II：

0.2mol/L NaOH

1％SDS

定容于1毫升；

溶液III：

60毫升5mol/L醋酸钾，5毫升冰醋酸，28.5毫升蒸馏水；

TAE缓冲液：

先配制成5倍TAE缓冲液：称取242克Tris碱溶于500毫升蒸馏水中，加入浓度为17.4mol/L的57.1毫升冰乙酸和200毫升0.5mol/LpH8.0的EDTA，混匀，补加蒸馏水至1000毫升，4℃冰箱贮存；使用时用蒸馏水稀释5倍，配成1倍TAE缓冲液；即1×TAE缓冲液；

SSC溶液：

在800毫升蒸馏水中溶解175.3克NaCl和88.2克柠檬酸钠，加入数滴10mol/LNaOH调pH至7.0，加水至1000毫升，配制成20倍SSC溶液；分装后，在6.859×104Pa的高压下121℃下灭菌15分钟，4℃冰箱贮存；使用前用高压灭菌的蒸馏水稀释成0.1～1倍SSC溶液；

C、油菜的转化：油菜播种于田间或人工生长室中，按照正常的栽培管理措施，在开花期，选择晴朗天气，人工剥蕾去雄，打掉花序的顶端小花蕾，去掉角果和已经开放的花朵，留下待开放花蕾，每花序留10～15个，套上纸袋，同时选取另外的花序，打掉已开放的花朵，套袋，为次日授粉提供开放的花朵和散粉的雄蕊，次日，从套袋后开放的花朵上取花粉，授在人工剥蕾后的柱头上，油菜授粉后2～12小时进行遗传转化操作，用刀片切掉授过粉的柱头，在切口上滴加1～3微升的外源DNA质粒溶液，套袋5～14天后取下袋子，待角果成熟后收获种子；

D、转基因植株筛选：将收获的种子倒在干净的干平皿上，选取未破裂完整的种子并计数，每1000颗种子为一份，同时选取抗除草剂油菜种子为阳性对照种子，未转基因的油菜种子为阴性对照种子；取干净的大平皿，铺上洁净的滤纸，并用双蒸水湿润滤纸，将一份种子均匀分散在滤纸上，在生长箱中以18～25℃，光照16小时，黑暗8小时的条件催芽，出芽后将其点种在装有中性花土的塑料盒中，在催芽后的3～4天

苗的子叶展开，将除草剂均匀喷洒到叶子上，喷施之后用剪刀剪除已经变黄枯萎的幼苗，待绿苗长到3～5片叶后移栽到温室或带土营养钵中。

2、根据权利要求1所述的一种油菜转基因的方法，其特征在于：所使用的外源DNA质粒溶液的溶剂为0.1倍到1倍浓度的SSC溶液。

3、根据权利要求1所述的一种油菜转基因的方法，其特征在于：SSC溶液中外源DNA质粒的浓度为50～500ng/μl。

4、根据权利要求1所述的一种油菜转基因的方法，其特征在于：除草剂的浓度范围为0.01％～0.5％。

5、根据权利要求1所述的一种油菜转基因的方法，其特征在于：除草剂第一次喷洒5～12天后再喷洒一次。