CN114501985B - 通过液体介导将花粉递送到来自受体植物的花的封闭柱头上进行异花授粉 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了通过液体介导将花粉粒递送到受体雌花中的封闭柱头上的新方法。例如，提供了液体介导的授粉的方法。所提供的方法包括从供体植物收集花粉，将收集的花粉悬浮在液体溶液中，并将所述溶液引入到受体植物上的受体花芽的封闭柱头上，从而用来自所述供体植物的花粉给花授粉。
Description
技术领域
本公开涉及农业生物技术领域，并且更具体地涉及通过经液体介导将供体植物花粉粒递送到受体植物花的封闭柱头上来改善异花授粉效率的方法。
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背景技术
杂种培殖(hybridization)是驯化植物育种的重要方面，因为它能够引入瞬时杂种活力、不同种质之间的期望变异、转基因性状整合，并产生新的表型(Goulet等人，2017)。植物育种者使用杂种培殖或受控异花授粉作为不同作物中育种周期的起点。对许多作物物种(诸如大豆)进行异花授粉的常规方法通常涉及常规授粉，其需要用镊子小心地手动去除萼片和花瓣以暴露花的柱头。由于花的解剖结构和大小，这个过程是复杂的、耗时的且劳动密集的(Walker等人，1979；Talukdar等人，2012)。典型的商业育种计划需要在工作流程中进行数千甚至数百万次杂交，诸如开发杂交、回交和性状整合。由于育种者希望加快作物品种开发并减少劳动力需求，因此开发促进更高产量并且提高效率的改良杂交方法至关重要。
发明内容
在一个方面，本发明提供了通过液体介导将花粉递送到植物的封闭柱头上的方法，其包括以下步骤：a)从供体植物获得花粉；b)产生包含所述花粉的液体溶液；以及c)将所述溶液引入到受体花的封闭柱头中，从而用来自供体植物的花粉给该花授粉。在一些实施方案中，花粉粒是从来自供体植物的多朵花获得的。在其他实施方案中，将所述溶液引入到受体植物上的封闭柱头上的步骤包括将溶液注入到花芽中。在一些实施方案中，本文提供的方法进一步包括选择由所述授粉产生的后代种子或植物的步骤。在进一步的实施方案中，供体植物包含有助于选择所述后代植物或种子的等位基因。
在另一个方面，本发明提供了通过液体介导将花粉递送到植物的封闭柱头上的方法，其包括以下步骤：a)从供体植物获得花粉；b)产生包含所述花粉的液体溶液；以及c)将所述溶液引入到受体花的封闭柱头上，从而用来自供体植物的花粉给该花芽授粉，并且其中受体花芽在所述授粉时是雄性不育的。在一些实施方案中，受体植物是遗传上雄性不育的。在一些实施方案中，花芽或受体植物用导致雄性不育的杀配子剂进行了处理。在一些实施方案中，受体植物是大豆植物。
在又一个方面，本发明提供通过液体介导将花粉递送到植物的封闭柱头上的方法，其包括以下步骤：a)从供体植物获得花粉；b)产生包含所述花粉的液体溶液；c)将所述溶液引入到受体花的封闭柱头上，从而用来自供体植物的花粉给花芽授粉；其中所述溶液包含选自由果胶酶、增稠剂、表面活性剂、蔗糖、矿物离子、植物生长调节剂、载体蛋白和核酸分子组成的组的至少第一组分。在一些实施方案中，所述至少第一组分是果胶酶。在进一步的实施方案中，所述果胶酶是果胶甲酯酶。在又进一步的实施方案中，所述溶液包含浓度为约1.5单位/L至约1500单位/L的果胶甲酯酶。在一些实施方案中，所述至少第一组分是增稠剂。在进一步的实施方案中，所述增稠剂是黄原胶。在更进一步的实施方案中，所述溶液包含约0.04重量％至约0.08重量％的黄原胶。在一些实施方案中，所述至少第一组分是表面活性剂。在进一步的实施方案中，所述表面活性剂是吐温20。在又进一步的实施方案中，所述溶液包含约0.001重量％至约0.01重量％的吐温20。在一些实施方案中，所述至少第一组分是蔗糖。在进一步的实施方案中，所述溶液包含约10重量％至约20重量％的蔗糖。在其他实施方案中，所述至少第一组分是矿物离子。在进一步的实施方案中，所述矿物离子选自由MgSO4、ZnSO4和硼酸组成的组。在又进一步的实施方案中，所述溶液包含约0.01重量％至约0.05重量％的MgSO4。在其他实施方案中，所述溶液包含约0.01重量％至约0.05重量％的ZnSO4。在又进一步的实施方案中，所述溶液包含约0.005重量％至约0.02重量％的的硼酸。在一些实施方案中，所述至少第一组分是载体蛋白。在其他实施方案中，所述载体蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)。在进一步的实施方案中，所述溶液包含约0.01重量％至约0.1重量％的牛血清白蛋白(BSA)。
在又一个方面，本发明提供了通过液体介导将花粉递送到植物的封闭柱头上的方法，其包括以下步骤：a)从供体植物获得花粉；b)产生包含所述花粉的液体溶液；以及c)将所述溶液引入到受体花芽的封闭柱头上，从而用来自供体植物的花粉给该花芽授粉；其中所述方法进一步包括收集从所述授粉产生的种子。在一些实施方案中，使从所述种子生长的后代植物与其自身或第二植物杂交。
在又进一步的方面，本发明提供了通过液体介导将花粉递送到植物的封闭柱头上的方法，其包括以下步骤：a)从供体植物获得花粉；b)产生包含所述花粉的液体溶液；以及c)将所述溶液引入到受体花芽的封闭柱头上，从而用来自供体植物的花粉给该花芽授粉；其中所述方法包括在引入所述溶液之前在所述花芽中制造开口。在一些实施方案中，所述制造开口包括去除所述花芽的上部或者使所述花芽的上部破裂。
在另一个方面，本发明提供了生产包含用于异花授粉的期望花粉浓度的花粉悬浮溶液的方法，其包括以下步骤：a)从父本收集花粉脱落的花；b)匀质化所述花以使花粉释放；c)通过去除花碎屑纯化来自所述经匀质化的花的花粉；d)量化所述经纯化的花粉；以及e)将所述经纯化的花粉悬浮在溶液中以产生包含期望花粉浓度的花粉悬浮溶液。在一些实施方案中，所述匀质化包括在珠磨均质器中研磨所述花。在进一步的实施方案中，所述匀质化是在有或没有液体的情况下执行。在一些实施方案中，所述经纯化的花粉被悬浮在80％蔗糖溶液中或被悬浮在玉米油中。
在又一个方面，本发明提供了生产杂种种子的方法，其包括以下步骤：a)从供体植物获得花粉；b)生产包含所述花粉的液体溶液；c)将所述溶液引入到具有与供体植物的基因型不同的基因型的雌性受体亲本的花芽的封闭柱头上，从而用来自供体植物的花粉给雌性受体花授粉；d)收获由所述授粉产生的种子；以及e)鉴定杂种种子。在一些实施方案中，供体植物是大豆植物。
在另一个方面，本发明提供了生产F1杂种大豆种子的方法，其包括以下步骤：a)由供体大豆植物制备包含期望花粉浓度的花粉悬浮溶液；b)将所述花粉悬浮溶液引入到具有与供体植物的基因型不同的基因型的母本的花芽的封闭柱头上，其中所述花粉悬浮溶液是通过将所述溶液注入到封闭花芽中或者通过在花芽中制造开口并将所述溶液施加到所述开口中来引入到柱头上的，从而用来自供体植物的花粉给该花授粉；以及c)收获由所述授粉产生的F1种子。在一些实施方案中，所述溶液包含选自由果胶酶、增稠剂、表面活性剂、蔗糖、植物生长调节剂、矿物离子、载体蛋白和核酸分子组成的组的至少第一组分。在其他实施方案中，所述母本的花芽是雄性不育的。在进一步的实施方案中，所述F1种子是使用表型或基因型标记物进行鉴定的。
附图说明
图1A、1B、1C和1D：示出了成熟大豆花和示例性受体大豆花芽的解剖结构的图像。图1A示出了成熟大豆花的解剖结构，其中五片花瓣封闭雌蕊和十个雄蕊。图1B显示出花粉脱落的成熟的雄蕊群和雌蕊群，九个雄蕊在雌蕊周围形成管，而第十个雄蕊保持自由。图1C示出了适合在异花授粉中充当受体花的代表性花芽。图1D示出了合适的受体花芽的解剖结构的细节：柱头变得可接受花粉，而花药尚未脱落花粉。
图2：示出了花粉溶液制备步骤图，包括花粉粒收集、纯化和储存。不同的储存缓冲液可根据所使用的相应提取缓冲液来使用。例如，如果20％蔗糖被用作提取缓冲液，则经纯化的花粉将被储存在4℃的80％蔗糖中。如果油被用作提取缓冲液，则经纯化的花粉将被储存在-20℃的油中。
图3：示出了表面活性剂对体外花粉萌发率的影响。将花粉粒添加到含有如所指示的浓度的不同表面活性剂的花粉萌发培养基(GM：20％蔗糖、0.03％硝酸钙、0.01％硼酸)中。对照是在不存在表面活性剂的情况下进行的花粉萌发。在25℃下孵育2小时后，记录萌发率(平均SE；n＝3个平行样，每个平行样100-150个花粉粒)。当花粉管的长度大于花粉粒的直径时，花粉粒被认为已萌发。
图4：示出了对含有不同浓度的黄原胶的悬浮液中的花粉均匀度的测量。收集时间点被显示在x轴上(以分钟表示)，花粉悬浮率(从溶液顶部收集/从溶液底部收集)被显示在y轴上(平均SE；n＝3)。
图5A、5B、5C和5D：示出了通过液体介导将花粉递送到花的封闭柱头上的示例性方法的图像。图5A显示出了将花粉溶液注入到花芽上。图5B显示出了将一滴花粉溶液施加到已去除芽尖的芽上。图5C示出了用于从芽上去除尖端的柱头上方的切割线。图5D示出了如红色染料所指示的液体成功递送到柱头。红色染料被纳入花粉溶液中作为花粉溶液递送到柱头的指示剂。将含有红色染料(Allura Red AC 0.01％)的液体花粉溶液(20％蔗糖、0.04％黄原胶、15U/L PME、0.001％吐温20和花粉)注入到花芽中。5分钟后，解剖花芽以检查柱头上的红色染色(如箭头所示)。
图6A、6B、6C和6D：示出了来自不同授粉技术的代表性种子组(seed set)的图像。图6A示出了用常规授粉技术异花授粉的ms6雄性不育植物中的对照种子组的图像。图6B示出了用通过注射在液体溶液中递送的供体花粉进行异花授粉的ms6雄性不育植物中的种子组的图像。图6C示出了用标准对照授粉技术授粉的雄性能育受体植物中的对照种子组的图像。图6D示出了用通过注射在液体溶液中递送的供体花粉进行异花授粉的雄性能育植物中的种子组的图像。在图6C和6D中，基于标记物的基因分型被用来确认来自异花授粉的种子组的“杂种”性质。
图7A、7B和7C：示出了当杀配子剂被用来诱导雄性不育时的种子组的图像。图7A示出了携带完整种子组荚的能育植物的代表性图像。图7B示出了经受了为诱导雄性不育(其导致不杂交就不能结出种子)而用250ppm马来酰肼进行的处理的能育植物的代表性图像。图7C示出了由经马来酰肼处理而变得雄性不育并随后经受异花授粉的花产生的种子荚的代表性图像。
具体实施方式
现代植物育种依靠异型杂交或异花授粉来产生具有从每个亲本系获得的特定可遗传性状的后代植物。因此，通量和效率在F1种群发展和性状整合工作流程效率中发挥了至关重要的作用。大豆(Glycine max)是经济上重要的农作物，但其育种已受到受控异花授粉的低效率过程的阻碍。大豆属于开花植物豆科的蝶形亚科。大豆花由五片封闭雌蕊和十个雄蕊的花瓣(一片旗瓣、两片翼花瓣和两片龙骨瓣)组成。在十个雄蕊中，九个雄蕊在雌蕊周围形成管，而第十个雄蕊则保持自由。这种结构导致来自花药的花粉直接脱落到柱头上(图1A和1B)。通常，花粉在花开放(开花期)前不久或开花后立即脱落，导致高程度的自花授粉，并且自然异型杂交率通常低于1％(Vollmann等人，1992)。最初，大豆育种者通过人工去雄并随后授粉来进行杂种培殖。大约50年前，通过绕过去雄步骤的技术进一步提高了授粉途径的效率。从那时起，这种改良的途径依然是大豆异花授粉的金标准(Walker等人，1979；Talukdar等人，2012)。然而，这种传统的授粉方法仍然非常费力且耗时，通常包括以下步骤：(1)去除母本的被选定花芽上的萼片；(2)将花瓣逐一去除以暴露柱头；(3)在父本上寻找鲜艳的开放的花朵；(4)将花瓣逐一去除，直至看到花药；以及(5)将雄性供体亲本的花药擦在雌性亲本的柱头上。当前发明代表本领域的显著进步，因为它令人惊讶地允许通过液体介导将花粉递送到来自受体植物的花的封闭柱头上来进行异花授粉，从而绕过了像传常规杂交技术那样需要手动去除萼片和花瓣。如本文所用，“封闭柱头”是指在杂交时仍被诸如花瓣和萼片的花结构封闭的花上的柱头。为了确保使用本文描述的液体介导的花粉递送系统进行成功的异花授粉，必须使用处于最佳发育阶段的受体雌花。在这个阶段，柱头可以接受花粉粒，并且花药还没有脱落花粉。
因此，本公开允许执行用于将供体花粉递送到受体花的封闭柱头上的高通量方法。本文提供的方法显著减少了以前促进大豆的异花授粉所需的时间和劳动。这是特别重要的，因为现代植物育种计划可能需要每年进行数千或者甚至数百万次的个体杂交，以产生具有改良性状的新植物品种。
液体授粉溶液配方
在一方面，本发明提供了从供体植物获得花粉并产生包含所述花粉的液体溶液以进一步用于授粉的方法。如本文所用，“花粉”是指至少一个花粉粒并且可以包含多个花粉粒。一般而言，将期望使用含有允许花粉均匀分散并保持溶液中花粉粒的高活力的成分的溶液。本文提供了可在此类溶液的生产中使用的组分的非限制性实例，其在某些实施方案中可包括果胶酶、增稠剂、表面活性剂、蔗糖、矿物离子、植物生长调节剂和核酸分子。在一些实施方案中，增稠剂可以是黄原胶，其用来将花粉均匀地分散在溶液中，并且可以举例来说以约0.04重量％至约0.08重量％黄原胶的浓度存在于溶液中。在一些实施方案中，所述溶液可以是水溶液或者可被包含在其他溶剂中。在进一步的实施方案中，所述溶液可以包含充当渗透应力调节剂的蔗糖，并且可以以例如约10重量％至约20重量％蔗糖的浓度存在于溶液中。在一些实施方案中，果胶酶是果胶甲酯酶(PME)，其充当花粉-柱头相互作用的促进剂，并且可以以例如约1.5单位/升至约1500单位/升的浓度存在于溶液中。在一些实施方案中，表面活性剂是吐温20，其用于改善液体渗透，并且可以以例如约0.001重量％至约0.01重量％吐温20的浓度存在于溶液中。在某些实施方案中，所述溶液包含多个大豆花粉粒，并且包括但不限于以下组分：约0.04％至约0.08％(w/v)的黄原胶；约10％至约20％(w/v)的蔗糖；约0.01mg/L至约10mg/L的PME；以及约0.001％至约0.01％(v/v)的吐温20。所述溶液还可以包含用于稳定果胶酶的载体蛋白，诸如处于约0.1mg/ml浓度的牛血清白蛋白(BSA)。还可以存在植物生长调节剂，诸如处于约10-5M至约10-8M浓度的赤霉酸(GA)，以调节花粉萌发和花粉管生长；处于约0.01％至约0.05％浓度的MgSO4以支持Ca2+吸收或结合；以及处于约0.01％至约0.05％浓度的ZnSO4以促进花粉萌发和花粉管生长；处于约0.005％至约0.02％浓度的硼酸以调节花粉萌发和花粉管生长。
本发明还提供用于供体花粉的收集和纯化的方法，所述供体花粉用于本文提供的方法中。在一些实施方案中，供体花粉是通过加工含有花粉的花，从而使花粉释放而获得的。在优选的实施方案中，通过使用珠磨均质器轻轻研磨花来使花粉从花中释放。花可使用液体研磨或者在不存在液体的情况下研磨。将释放的花粉纯化以去除花碎屑并离心以收集经纯化的花粉粒。一旦花粉粒被纯化，就可将它们重新悬浮在如本文所描述的授粉溶液中。替代地，可将经纯化的花粉粒重新悬浮在80％蔗糖溶液中或者重新悬浮在油中，并分别被储存在4℃或-20℃，或者被储存在保持花粉活力的类似条件下。在优选的实施方案中，收集的大豆花粉粒被重新悬浮在玉米油中并被储存在玉米油中。玉米油在花粉保存方面似乎与低温保存一样有效，低温保存是更昂贵、更麻烦的替代方案。据报道，矿物油、大豆油和橄榄油可被用于储存吊裙草(Crotalaria retusa L.)的花粉粒(Jain和Shivanna，1990)。此外，一些有机溶剂不会提取膜磷脂，且非常适合于花粉的储存，诸如苯、石油、乙醚、环己烷、丁醇、丙醇(Mishra和Shivanna，1982；Diaz等人，2007)。在一些实施方案中，经纯化的花粉是使用例如血细胞计数器量化的。这允许将预定量的花粉粒添加到授粉溶液中，从而获得所需的花粉粒密度。鉴于本公开，本领域的技术人员将理解，可以使用本文公开的方法基于植物品种和环境条件为任何特定受体植物优化所需的花粉密度水平。
花粉溶液的递送以进行植物授粉
本发明令人惊讶地允许潜在地任何植物的异花授粉。在一个实施方案中，所述方法包括从供体植物获得花粉，产生包含所述花粉的液体溶液，以及将该溶液引入到受体植物上的花芽中，从而用来自供体植物的花粉为该花授粉。在某些方面，可以确定将授粉溶液递送至花芽的最佳发育阶段。这可以使用本文描述的方法经验性地确定。为了促进异花授粉，优选在柱头变得可接受花粉并且花药尚未脱落花粉的特定时间段内将含有花粉粒的液体溶液递送至受体花。在大豆中，发现在花芽发育的B1期前后对异花授粉是有效的(Peterson等人，1992)。在这个阶段，花冠是可见的，但没有完全延伸到花芽中的萼裂片之外，并且柱头被花瓣和萼片封闭(图1C和1D)。
在特定的实施方案中，可通过将花粉溶液注入到花芽中以使得溶液与柱头接触来将花粉溶液引入到受体植物的花芽中。所述注入可使用任何能够在花芽中注入期望量的溶液而不破坏柱头和胚珠的仪器来执行。非限制性的实例是注射器(图5A)。
在一些实施方案中，可以对花芽进行修饰以促进使用含供体花粉的溶液进行异花授粉。在某些方面，花芽的尖端的一部分可通过切割被除去，从而在保持花芽几乎完整的同时为花粉溶液与柱头接触制造一个开口(图5B和5C)。
在进一步的实施方案中，本发明的方法可以包括选择由所述用花粉溶液授粉产生的后代种子或植物。这可以通过使用包含在花粉供体中的用来鉴定该供体的后代植物或种子的多态性标记等位基因来促进。形态标记物或生化/蛋白质标记物在育种中通常被用作选择具有期望性状的植物的工具。已被广泛使用并且特别有希望应用于植物育种的分子标记技术包括：限制片段长度多态性(RFLP)、扩增片段长度多态性(AFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、微卫星或简单序列重复(SSR)和单核苷酸多态性(SNP)(Al-Khayri等人，2016)。
在另一些其他实施方案中，本文所描述的方法可包括对在授粉时雄性不育的花进行授粉。鉴于柱头在大豆花中未被暴露并且取决于花的发育阶段，例如，被用于异花授粉的供体花粉可能与受体植物产生的花粉竞争。为了提高异花授粉的功效，在某些情况下，受体植物上的花为雄性不育的以减少与自交的竞争可能是有利的。因此，可将雄性不育系统与特定杂交中的雌性(花)亲本植物一起使用。许多此类雄性不育系统是众所周知的，包括细胞质雄性不育(CMS)和基因雄性不育(GMS)。CMS和GMS促进了许多作物的杂种种子生产，从而允许育种者利用与杂种优势(杂交优势)相关的产量增益。已在大豆中鉴定出11种雄性不育的雌性能育突变体(ms1、ms2、ms3、ms4、ms5、ms6、ms7、ms8、ms9、msMOS和msp)(Graybosch和Palmer，1988)。杀配子剂的使用提供了产生雄性不育的替代方法。几种杀配子剂已被报道为在诱导各种作物的花粉不育方面是有效的，并且在本领域中是众所周知的。此类杀配子剂包括甲基砷酸钠、2,3-二氯异丁酸盐、2,2-二氯丙酸钠、赤霉酸、马来酰肼(1,2-二氢哒嗪、3,6-二酮)、2,4-二氯苯氧基乙酸、4-氟草酰苯胺乙酯(ethyl 4-fluorooxanilate)、三卤代甲基磺酰胺、砷酸乙酯和砷酸甲酯(Ali等人，1999)。
在一些实施方案中，将花粉溶液引入到受体植物花芽的封闭柱头上的步骤可以以每个花芽约10秒的速率执行。在其他实施方案中，授粉被定义为平均每朵花耗时少于约20秒、30秒、40秒或60秒。这比传统授粉方法明显更快，传统授粉方法每朵花可能耗时最长5分钟。因此，所公开的方法可比传统方法快约20-30倍。因此，本发明的高度有效的方法可在高通量系统中实施。因此，本发明的一个方面包括对多个植物同时执行本发明的方法。在某些方面，所述多个植物包含至少约10、50、100、250、500、1,000、5,000、10,000、50,000或100,000或更多个植物。所述方法可在田间或受控生长环境诸如温室或生长室中进行。
本文所公开的方法可被执行用于改善潜在地任何具有这样的雌性受体花的植物的异花授粉，所述受体花中的柱头在杂交时仍被诸如花瓣和萼片的花结构封闭。此类植物可包括但不限于大豆、大麦、小麦、稻米、莴苣、鹰嘴豆、花生、茄子、胡椒和番茄。
经修饰的植物和种子
本发明的一个方面提供了由本文所描述的方法产生的后代植物和种子的选择。在一些实施方案中，后代植物和种子可被定义为包含相对于花亲本植物的可检测修饰。产生此类植物和种子的一种方法是通过使用由植物遗传转化产生的等位基因。用于转化用于与本发明一起使用的宿主植物细胞的合适方法是本领域众所周知的，并且包括任何可以将DNA引入到细胞(例如，其中重组DNA构建体被稳定地整合到植物染色体中的细胞)中的方法并且在本领域中是众所周知的。一些被广泛使用的细胞转化的方法是农杆菌属(Agrobacterium)介导的转化、微粒轰击介导的转化以及细胞穿透肽介导的DNA修饰剂递送。
另一种生产经修饰植物和种子的方法是通过基因组编辑。如本文所用，术语“基因组编辑”是指使用基因组编辑方法和位点特异性基因组修饰酶来修饰核苷酸序列。在一些实施方案中，通过本文提供的方法纯化的供体花粉可使用本领域已知的技术转化成包含一种或多种介导植物的基因组特异性修饰的试剂。可根据本发明使用这样的花粉粒，其包括在任何当前或先前代中使用此类试剂产生的基因座的任何此类试剂。
用于在预先确定的染色体位点处改变野生型DNA序列的合适方法包括本领域已知的任何方法。通过使用基因组编辑方法和试剂进行的植物基因组靶向修饰可被用于通过修饰植物基因组DNA来创建改良的植物系。此外，基因组编辑方法和试剂可以促进将一种或多种感兴趣的核酸靶向插入到植物基因组中。用于将供体多核苷酸引入到植物基因组中或修饰植物的基因组DNA的示例性方法包括诸如以下基因组编辑试剂的使用：序列特异性重组酶、内切核酸酶、锌指核酸酶、工程化的或天然大范围核酸酶、TALE-内切核酸酶、RNA引导的内切核酸酶(例如，成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas9系统、CRISPR/Cpf1系统、CRISPR/CasX系统、CRISPR/CasY系统、CRISPR/Cascade系统)和CRISPR相关转座酶((Strecker等人，2019)和(Klompe等人，2019)。几个实施方案涉及使用单链寡核苷酸在植物基因组中引入精确碱基对修饰的基因组编辑方法，如Sauer等人所描述(PlantPhysiol.170(4):1917–1928；2016)。
如本文所用，术语“位点特异性基因组修饰酶”是指可以以序列特异性的方式修饰核苷酸序列的任何酶。在一些实施方案中，位点特异性基因组修饰酶通过诱导单链断裂对基因组进行修饰。在一些实施方案中，位点特异性基因组修饰酶通过诱导双链断裂对基因组进行修饰。在一些实施方案中，位点特异性基因组修饰酶包含胞苷脱氨酶。在一些实施方案中，位点特异性基因组修饰酶包含腺嘌呤脱氨酶。在本公开中，位点特异性基因组修饰酶包括内切核酸酶、重组酶、转座酶、脱氨酶、解旋酶以及其任何组合。在一些实施方案中，位点特异性基因组修饰酶是序列特异性核酸酶。
实施例
实施例1.用于花粉收集、纯化和储存的改良方法
在一些植物中，尤其在大豆中，由于花的大小和结构，难以收集花粉。此外，大豆花粉粒在尺寸上相对较小(约26μm)，并且在单朵花中以相对较少的量存在(约3000至7000个花粉粒/朵花)(Palmer等人，1978)。为了满足使用本文所描述的方法进行大规模授粉的需要，可以开发基于液体的平台来优化供体花粉的收集、纯化和储存。这包括以下步骤：使所收集的花破碎(例如，通过研磨或通过使用珠磨均质器在有或没有液体的情况下均质化)以使花粉释放，过滤经破碎的花以纯化释放的花粉，通过离心收集经纯化的花粉，以及将经纯化的花粉重新悬浮成适合于储存或适合用于液体授粉的溶液(图2)。经纯化的花粉可被储存在4℃的80％蔗糖溶液、-20℃的玉米油中或任何其他合适的储存溶液中以备后用。
经纯化的花粉可使用血细胞计数器量化以确定从纯化过程中获得的花粉粒数。花粉的量化使得能够生产含有期望花粉密度的花粉溶液，并确保始终施用固定的量，这降低了从测试不同花粉溶液的效率测定获得的结果中出现大量变化的可能性，并进一步降低碎片对授粉效率的影响。这种简单且快速的方法可被用于任何其他物种以收集和储存经纯化的花粉。
实施例2.用于花粉递送的溶液的开发
对于植物的液体授粉，可将从供体植物获得的花粉粒混合到液体溶液中以促进向花芽中的递送。花粉液体溶液中的组分及其浓度对溶液的功效是重要的，因为它们不仅影响花粉活力本身，而且影响被授粉植物产生杂种种子组的成功率。然而，虽然可通过优化给定花粉溶液中的组分和浓度来提高功效，但在仍实现授粉的同时，还可以进行许多替代和修改，如以下表1中所示。
表1.使用各种花粉溶液授粉时结荚成功率的测量
为了降低花粉液体溶液和植物组织之间的表面张力，进行了测试以鉴定不会干扰花粉管生长并且有助于将花粉液体溶液递送到柱头的合适的表面活性剂。通过剂量滴定测试了不同的表面活性剂，包括吐温20、Pluronic、Silwet L-77和Triton X-100。含有0.001％吐温20的萌发缓冲液显示出与对照相当的花粉萌发率(图3)。吐温20、Pluronic和Silwet L-77被选择用于初始液体授粉测试，并以0.001％的浓度使用(上表1)。
还在液体溶液中测试了黄原胶的使用，以改善花粉在溶液中的分散。该测试是通过将花粉添加到装有含0.01％至0.08％黄原胶的溶液的管中来执行，并且使每种花粉溶液在混合后不受扰动。在混合后0、30、60和90分钟的时间点从管的顶部和底部取出20μl的花粉悬浮液样品，并将其放在载玻片上。对花粉粒的数目进行计数，并重复该过程三次以得出花粉悬浮率(从管顶部收集的溶液的花粉数与从管底部收集的溶液的花粉数的比率)，其指示花粉在悬浮液中的分布水平(图4)。以0.4％-0.8％的浓度使用的黄原胶在本研究中似乎是花粉悬浮液的最佳范围。
蔗糖被用作渗透压的主要调节剂。如果浓度太高或太低，它都将破坏渗透平衡，并且导致溶液中的花粉活力损失。测试了蔗糖浓度对液体授粉的影响(上表1)。观察到被测试的花粉液体溶液中10％-20％蔗糖产生了积极的结果。
果胶酶可被用于帮助提高液体溶液中花粉的授粉成功率。此类果胶酶可包括果胶甲酯酶(PME)或聚半乳糖醛酸酶(PG)。进行了实验以确定在含有不同浓度的PG或PME的液体溶液中使用花粉时的结荚成功率。在三个独立试验中对每种花粉溶液进行测试，每次试验使用15-20个样品。当将花粉粒悬浮在含有范围从0.005U/L-5U/L的浓度的PG的培养基中时，结荚成功率与对照的结荚成功率没有显著差异。补充有1.5U/L、150U/L和1500U/L浓度的PME的培养基也没有表现出对授粉的显著影响，但补充有15U/L浓度的PME的培养基导致结荚成功率高于对照(0U/L PME在20％蔗糖、0.04％黄原胶溶液中)。结果示于上表1中。15U/L PME的添加增加了结荚率，使成功率与常规异花授粉技术相当。
额外的组分可被用于本文所描述的花粉液体溶液中。BSA(0.1mg/ml)可在包含果胶酶的溶液中用作载体蛋白以防止酶活性损失。MgSO4(0.01％-0.05％)被认为支持Ca2+的吸收或结合。ZnSO4被认为在花粉管生长过程中保护花粉管免受自由基影响。硼被认为直接参与与花粉管生长有关的膜果胶合成。观察到花粉液体溶液中硼酸以及MgSO4和ZnSO4的添加提高了液体授粉的成功率。当在液体授粉溶液中添加MgSO4和ZnSO4二者以及PME时，成功率达到64％，这与使用常规异花授粉技术的成功率相当(上表1)。
实施例3.液体介导的在大豆植物中进行的花粉递送
合适的液体介导的花粉递送方法是使用大豆花芽通过染料检查方法评估的。通过在最长萼片的弯曲点插入注射器针头并注入注射缓冲液(20％蔗糖、0.04％黄原胶、15U/LPME、0.001％吐温20和Allura Red AC 0.01％)直至过量液体渗出来将注射缓冲液递送到带帽花芽中。注入后五分钟，解剖花芽以检查柱头上的红色染色。柱头上的红色染色指示施用的液体成功地与柱头接触(图5D)。
基于从测试单个组分的实验获得的结果，确定用于大豆中花粉递送的溶液的有益组分包括但不限于以下组分：黄原胶：0.04％-0.08％(w/v)；蔗糖：10-20％(w/v)；PME：0.01-10mg/L；和吐温20：0.001％-0.01％(v/v)。液体溶液还可以包含用来稳定PME的BSA(0.1mg/ml)；以及用来支持Ca2+吸收或结合的矿物离子，诸如MgSO4(0.01％-0.05％)；用来促进花粉萌发和花粉管生长的ZnSO4(0.01％-0.05％)；以及用来调节花粉萌发和花粉管生长的硼酸(0.005％-0.02％)。这些组分和其他组分可以针对给定的应用进行优化。
为了分析此情况，制备了包含各种浓度的组分的组合的花粉溶液用于液体授粉。选择来自雄性供体植物的鲜艳的开放的花用于花粉收集。按照上述实施例1中描述的方法收集花粉。将经纯化的花粉重新悬浮在不同的液体授粉溶液(上表1中)。选择雄性不育母本上未开放的芽用于授粉。通过将2-5μl体积的花粉溶液注入到每个未开放的花芽中来将花粉溶液递送到受体花的封闭柱头中。比较液体介导的授粉组和对照组(常规授粉)的产生荚的授粉的百分比(成功百分比)。授粉后15天，测量结荚。液体介导的授粉处理的结荚率在7％到64％间变化(上表1)。而对照为60％。代表性的结荚图像示于图6A和图6B中。
实施例4.杂种植物的生产和杂种性的确认
进行了研究以确定异型杂交后代的生产是否可以通过在不影响雌性生育力的情况下使用杀配子剂使植物雄性不育来优化。在这项研究中，一旦花原基开始，就将马来酰肼(以50、150和250ppm)或蒸馏水喷雾在雄性能育系的植物的茎上。注意确保所有植物都被均匀喷雾。产生了雄性不育植物，其具有与源自大豆品种01046197的ms6雄性不育系的植物非常相似的表型(产生无种子的荚)(图7B)。大豆品种01046197被公开于美国专利第9,232,755号中，该专利的全部内容都通过引用方式并入本文。雌性生育力不受马来酰肼处理影响，并且当被异花授粉时花芽发育成带有种子的荚(图7C)，其似乎与未经处理的对照产生的带有种子的荚相似(图7A)。因此，杀配子剂诱导的雄性不育可被用于提高在液体溶液中使用花粉时的异花授粉效率。
还进行了研究以确定通过液体介导递送来自供体植物的花粉粒是否可以与受体植物中的自花授粉竞争。如本文所用，“自体能育的”植物是在自花授粉(即通过其自身的花粉)时成功地结种子的植物。将含有来自包含显性表型标记物(紫色下胚轴)的供体系的花粉的液体溶液，施加到带有隐性表型标记物(浅绿色下胚轴)的自体能育的雌性受体品系上。将含有来自包含显性表型标记物(紫色下胚轴)的供体系的花粉的液体溶液施加到带有隐性表型标记物(浅绿色下胚轴)的自体能育的雌性受体系上。如果异花授粉是成功的，人们会期望看到后代具有紫色下胚轴，因为该颜色性状是由父本贡献的。观察到具有紫色下胚轴的后代植物(未示出)，这表明液体介导的自体能育的受体亲本的授粉能够由在液体溶液中递送的供体花粉产生杂种后代。代表性种子组在图6C和6D中示出。
此外，基于在多个染色体上使用分子标记进行基因分型来测试所得后代植物的杂种性。基因组中各种多态性的存在可被广泛用作遗传标记物。许多DNA基因分型方法利用这些遗传标记物来区分各种植物系并研究它们之间的进化关系。SNP基因分型测定为任何基因组内多态性的检测提供了一种高度灵活的技术。
TaqMan SNP基因分型测定与八种选定的标记物(SEQ ID NO：1-8)一起被用于杂种后代植物的基因分型。基因分型结果示于下表2中。七种后代植物中的四种是由于通过液体介导将花粉递送到自体能育受体系而产生的杂种。
用于扩增示例性分子标记基因座的引物序列和用于对相应分子标记序列进行基因分型的探针在下表3中给出。
表3.用于对代表性分子标记进行基因分型的示例性引物和探针
在说明性实施例中，标记物SEQ ID NO:1可使用如表3中所给出的引物SEQ ID NO:9(正向引物)和SEQ ID NO:17(反向引物)来扩增。分子标记物SEQ ID NO:1的核苷酸位置201处的SNP可使用TaqMan测定用如SEQ ID NO:25(探针1)和SEQ ID NO:33(探针2)所指示的探针来检测。本领域的技术人员将认识到，给定引物的任一侧的序列都可被用来替代给定引物，只要引物可以扩增包括待检测等位基因的区域。用于检测的精确探针可以变化，例如，可鉴定出待检测的标记扩增子的区域的任何探针都可以代替本文所示例的那些探针。扩增引物和检测探针的构型(Configuration)也可以改变。因此，本发明不限于本文所具体列举的引物、探针或标记序列。
本文提供了用于大豆授粉的基于液体的花粉收集、纯化和花粉粒递送的新方法以及适合于在大豆中进行液体介导的授粉的优化的液体溶液。如上所描述，成功地产生了杂种植物并且使用表型和基因型测定证实了杂种性。这些结果表明，可以将在液体溶液中的供体花粉递送到受体花的封闭柱头上，并且以此类方式递送的花粉可以与自花授粉竞争以使大豆产生种子。本文所描述的方法旨在实现通过液体介导将花粉粒递送到受体花的封闭柱头上，并旨在获得大豆的低成本且高效率的授粉系统。本文所描述的方法可通过开发用于自动施用花粉溶液的装置并且/或者利用图像识别技术来选择最佳花芽来进一步增强。
在一些实施方案中，成像系统可被用于确定花期和注入角度。在其他实施方案中，数字移液管可被用于施用期望体积的液体授粉溶液。在一些实施方案中，机器人系统诸如机器人手臂或机器人蜜蜂(Wood等人，2013)可被用于使液体介导的花粉递送过程自动化。例如，机器人蜜蜂可配备有图像识别系统以检测用于异花授粉的合适的受体花。机器人蜜蜂也可被配备成携带载有液体花粉溶液的筒。一旦合适的受体花被鉴定出，机器人蜜蜂就可以将合适体积的液体花粉溶液注入到受体花中以实现异花授粉。
实施例5.新型液体介导的授粉平台的进一步应用
可通过液体介导的用外源性DNA转化的花粉进行的授粉来直接产生受体植物的转基因种子或经基因编辑的种子。收集的花粉可通过诸如电穿孔、轰击和声处理、农杆菌感染、花粉管介导的转染或磁转染等物理方法来转化(Zhao等人，2017)。例如，可使用电穿孔或磁转染将CRISPR/Cpf1试剂递送到经纯化的花粉粒中。然后挑选经转化的花粉并将其放入到本文提供的液体溶液中。然后可将花粉溶液注入到花芽中以产生经基因组编辑的种子。利用本文提供的液体介导的授粉系统和基于CRISPR/Cpf1的基因编辑来发现和改良植物的性状是可行的。该组合消除了对组织培养的费力步骤的需要，同时在短时间内由经转化的种子产生转基因或经基因编辑的植物。
本发明提供了不依赖组织培养物的植物转化方法，其可被用于将含有0.05％表面活性剂Silwet L-77和包含性状改良基因的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的花粉溶液递送到花芽中进行大豆的转化。将通过在不同日子重复接种来瞄准花发育的最佳阶段，以确保农杆菌能被最大程度地获取，从而提高转化率。
本文提供的方法也可被用于将外源性DNA递送至受体植物中以进行植物的无病原体转化-基因编辑。先前的研究已经报道，外源性DNA可通过花粉管途径或子房滴灌转化引入到植物中(Yang等人，2009)。这些方法已被用于多种作物，包括棉花、稻米和大豆。本发明提供了将液体授粉与外源性DNA结合的手段，其是通过将包含期望外源性DNA的DNA溶液与如本文所描述的花粉溶液一起施用以转化没有正常细胞壁的合子细胞来实现。通过组合这些溶液，外源性DNA可以通过沿着花粉管向下流动到达子房，并整合到已受精但仍未分裂的合子细胞中。经转化的种子可在无需原生质体制备、细胞培养和植物再生的情况下直接获得。
Claims (33)
1.一种通过液体介导将花粉递送到来自受体大豆植物的花的封闭柱头上的方法，所述方法包括以下步骤：
a)获得来自供体大豆植物的花粉；
b)生产包含所述花粉的液体溶液；以及
c)将所述溶液引入到受体大豆植物上未开放的花芽的封闭柱头上，其中封闭柱头被花结构包围，从而用来自所述供体植物的所述花粉给所述花芽授粉。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述花粉是从来自所述供体植物的多朵花获得的。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述引入步骤包括将所述溶液注入到所述花芽中。
4.如权利要求1所述的方法，其进一步包括选择由所述授粉产生的后代种子或植物的步骤。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述供体植物包含有助于选择所述后代植物或种子的等位基因。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述花芽在所述授粉时是雄性不育的。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述受体植物是遗传上雄性不育的。
8.如权利要求6所述的方法，其中所述花芽或受体植物用杀配子剂进行了处理。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述溶液包含至少第一组分，所述至少第一组分选自由果胶酶、增稠剂、表面活性剂、蔗糖、植物生长调节剂、矿物离子、载体蛋白以及核酸分子组成的组。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述果胶酶是果胶甲酯酶。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述溶液包含约1.5单位/升至约1500单位/升浓度的果胶甲酯酶。
12.如权利要求9所述的方法，其中所述增稠剂包含黄原胶。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述溶液包含约0.04重量％至约0.08重量％的黄原胶。
14.如权利要求9所述的方法，其中所述表面活性剂包括吐温20。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述溶液包含约0.001重量％至约0.01重量％的吐温20。
16.如权利要求9所述的方法，其中所述溶液包含约10重量％至约20重量％的蔗糖。
17.如权利要求9所述的方法，其中所述矿物离子选自由MgSO4、ZnSO4和硼酸组成的组。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述溶液包含约0.01重量％至约0.05重量％的MgSO4。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述溶液包含约0.01重量％至约0.05重量％的ZnSO4。
20.如权利要求17所述的方法，其中所述溶液包含约0.005重量％至约0.02重量％的硼酸。
21.如权利要求9所述的方法，其中所述载体蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)。
22.如权利要求20所述的方法，其中所述溶液包含约0.01重量％至约0.1重量％的牛血清白蛋白(BSA)。
23.如权利要求1所述的方法，其进一步包括收集由所述授粉产生的种子。
24.如权利要求23所述的方法，其包括将由所述种子生长的后代植物与其自身或第二植物杂交。
25.如权利要求1所述的方法，其包括在引入所述溶液之前在所述花芽中制造开口。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述制造开口包括去除所述花芽的上部或者使所述花芽的上部破裂。
27.如权利要求1所述的方法，
其中获得所述花粉的步骤包括收集来自所述供体大豆植物的脱落花粉的花；且
其中生产包含所述花粉的液体溶液的步骤包括
(i)均质化所述花以使所述花粉释放；
(ii)通过去除花碎屑纯化来自所述经均质化的花的所述花粉；
(iii)量化所述经纯化的花粉；以及
(iv)将所述经纯化的花粉悬浮在溶液中以产生包含期望花粉浓度的所述花粉的液体溶液。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述经纯化的花粉被悬浮在80％蔗糖溶液中或被悬浮在玉米油中。
29.一种生产杂种种子的方法，所述方法包括以下步骤：
a)获得来自供体大豆植物的花粉；
b)生产包含所述花粉的液体溶液；
c)将所述溶液引入到具有与所述供体大豆植物的基因型不同的基因型的母本的花芽中，其中所述花芽包含封闭柱头，从而用来自所述供体的花粉对所述花授粉；
d)收获由所述授粉产生的种子；以及
e)鉴定杂种后代。
30.一种生产F1杂种大豆种子的方法，所述方法包括以下步骤：
a)由供体大豆植物制备包含期望花粉浓度的花粉悬浮溶液；
b)将所述花粉悬浮溶液引入到具有与所述供体大豆植物的基因型不同的基因型的母本的花芽的封闭柱头中，其中所述花粉悬浮溶液是通过将所述溶液注入到所述封闭花芽中或者通过在所述花芽中制造开口并将所述溶液施加到所述开口中来引入到所述柱头上的，从而用来自所述供体植物的花粉给所述花授粉；以及
c)收获由所述授粉产生的F1种子。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述溶液包含至少第一组分，所述至少第一组分选自由果胶酶、增稠剂、表面活性剂、蔗糖、植物生长调节剂、矿物离子、载体蛋白以及核酸分子组成的组。
32.如权利要求30所述的方法，其中所述母本的所述花芽是雄性不育的。
33.如权利要求30所述的方法，其进一步包括使用表型或基因型标记物鉴定所述F1杂种种子。
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