CN1823579A - 一种转基因作物花粉竞争剂及其用于棉花制种的方法 - Google Patents
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Abstract
一种转基因作物花粉竞争剂及其用于棉花制种的方法。属于农业杂交制种技术领域。主要解决现行棉花制种方法中存在的工序繁杂、种子混杂、田间去杂问题。其步骤为：(1)以非抗棉花作为母本，以转基因棉花作为父本，配成杂交组合；(2)棉花开花期，用花粉竞争剂对非抗母本花朵的柱头、花药喷雾后，用抗性父本花粉授粉；或者，(3)搜集父本的花粉于花粉竞争剂的液体中配成花粉液，将其点涂或喷雾到母本棉花柱头上杂交授粉；(4)用种、苗纯度选择剂，对所产种子包衣或喷雾选择，完成杂交种子生产。此发明的花粉竞争剂、种苗纯度选择剂及制种方法主要适用于父本转基因抗虫、抗除草剂作物杂交组合(如棉花)制种、种子加工。
Description
技术领域
本发明涉及转基因作物杂交制种的转基因花粉竞争剂及用该竞争剂对转基因作物进行杂交制种的方法。特别是一种用于杂交制种的转基因花粉竞争剂和种、苗纯度选择剂，以及用该花粉竞争剂和种、苗纯度选择剂对转基因棉花进行杂交制种的方法。属于农业杂交制种技术领域。
背景技术
我国目前转基因作物(如棉花)杂交种子生产方法主要靠人工去雄、人工授粉。该生产方法的不足之处是用工多，种子杂，价格高，限制了杂交一代种子大面积利用。在高产、优质优势组合确定以后，生产杂交种子既要制种产量高，又要减少用工时间和劳动强度，还要保证杂交种纯度，这是简化制种的重点和难点，也是科技工作者亟待解决的重大技术难题。
如，在棉花制种中，如果采用不去雄直接授粉就可以减轻70％以上制种的工作量。但，因同时自花授粉产生的假杂种比例高达50％以上，不能保证杂交种纯度，所以，此方法一直不能在制种生产中应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能不去雄授粉的转基因作物花粉竞争剂和种苗纯度选择剂。
本发明进一步的目的在于提供一种采用转基因花粉竞争剂和种苗纯度选择剂对抗虫、抗除草剂棉花杂交组合进行棉花杂交制种的方法。
本发明杂交制种的转基因作物花粉竞争剂由卡那霉素或者新霉素、蔗糖为溶质、以蒸馏水为溶剂配制而成。
本发明杂交制种的转基因作物花粉竞争剂所述的卡那霉素或者新霉素、蔗糖在竞争剂溶液中含有：卡那霉素或者新霉素0.02--1g·L-1、蔗糖50-480g·L-1。
本发明所述的杂交制种的转基因作物花粉竞争剂中可以含有草甘膦。
本发明所述的杂交制种的转基因作物花粉竞争剂中草甘膦在竞争剂溶液中含有：草甘膦0.01-0.1g·L-1。
本发明所述的杂交制种的转基因作物花粉竞争剂中还可以含有促进父本花粉萌发、花粉管生长营养剂及杀虫剂。
本发明所述的杂交制种的转基因作物花粉竞争剂中的促进父本花粉萌发、花粉管生长营养剂、杀虫剂可以为赤霉素、硼酸、硝酸钙、硫酸镁、敌杀死之一种或多种。
本发明所述的赤霉素、硼酸、硝酸钙、硫酸镁、敌杀死可以在竞争剂溶液中含有：GA30.01-0.2g·L-1、H3BO30.01-0.2g·L-1、Ca(NO3)2·4H2O 0.1-3g·L-1、MgSO4·7H2O 0.1---3g·L-1、敌杀死0.01---0.05％，其中之一种或多种。
本发明的花粉竞争剂在使用中可以加入少量土温80做展布剂，增加对柱头的覆盖效果。
本发明的种子纯度选择剂包括抗病虫种衣剂，在该抗病虫种衣剂中含有草甘膦；草甘膦、抗病虫种衣剂在选择剂中按重量百分比计含有：草甘膦30-40％；抗病虫种衣剂60-70％。
本发明转基因棉花杂交制种的方法有：
(一)、对抗除草剂杂交组合的步骤如下：
(1)、以非抗除草剂棉花B作为母本，以抗除草剂的转基因棉花A作为父本，配成杂交组合；
(2)、棉花开花期的每天上午，用装有上述技术方案含草甘膦的花粉竞争剂的液体C的微型喷雾器，对棉花B的花朵柱头、花药喷雾后，即用转基因棉花A的花粉对B柱头杂交授粉；或者，
(3)、搜集父本转基因棉花A的抗性花粉于上述技术方案中含草甘膦的花粉竞争剂的液体C中配成花粉液，将花粉液点涂或喷雾到母本棉花B柱头上杂交授粉；
(4)、用上述技术方案中的种子纯度选择剂，对该收获的种子进行包衣处理选择，完成杂交种子生产。
(二)、对抗虫杂交组合的步骤如下：
(1)、以非转基因棉花B作为母本，转基因抗虫棉花A作为父本，配成杂交组合；
(2)、棉花开花期的每天上午，用装有上述技术方案中不含草甘膦的花粉竞争剂的液体C的微型喷雾器，对非转基因棉花B的花朵柱头、花药喷雾后，即用转基因棉花A的花粉对B柱头杂交授粉；或者，
(3)、搜集父本转基因棉花A的花粉于上述技术方案中不含草甘膦的花粉竞争剂的液体C中配成花粉液，将花粉液点涂或喷雾到母本非转基因棉花B柱头上杂交授粉；
(4)、杂交种子在苗床播种出苗后，用5g·L-1的卡那霉素液喷苗，7天后选择拔除有黄斑的假杂种苗。
本发明的关键技术设计是：对转基因作物(如棉花，下同)杂交组合制种时对花粉和种、苗进行“两次选择”的制种理论及方法，即：以保证非抗性植物母本柱头正常生活能力，提高制种产量为前提；以植物抗性基因(抗除草剂草甘膦，抗卡那霉素等)为选择基础；以“花粉竞争”提高真杂种比例为手段；以“种子选择”去除假杂种为种子纯度保证。在不具抗性的母本花器柱头体细胞、母本花粉配子体细胞和具有抗性的父本花粉配子体细胞之间，利用三者对某些化学药剂在生理、生化反应上的抗性差异，在母本柱头上创造出一种能促进父本花粉、抑制母本花粉萌发和花粉管生长的竞争微环境，形成并加大父、母本花粉竞争差异。在花粉萌发和花粉管生长的约20个小时内，通过提高具有抗性的父本花粉在柱头上萌发率和花粉管的生长速度，使其精细胞比受抑制的母本花粉精细胞能够更早、更快地到达子房，更多地占据有限的胚囊卵细胞位置，完成受精过程，达到父、母本花粉竞争和选择、提高杂种率的目的。再对其生产的种子进行抗性药剂包衣处理选择，去掉可能产生的假杂种，以确保杂交种子纯度，从而实现不去雄直接授粉简化制种。
通过在棉花柱头上创造竞争的微环境，对父、母本进行“花粉竞争选择”提高杂种率，并对所产种子采用‘种子包衣选择’保证种子纯度的“两次选择”的制种理论及其方法设计，可以用于棉花、小麦、水稻、油菜、蔬菜等转基因作物的简化杂交制种。
本发明提出使用花粉竞争剂授粉，改变常规的授粉方法。
本发明的转基因作物花粉竞争药剂是利用转基因抗虫植物常具有的编码氨基糖苷3’--磷酸转移酶II〔APH(3’)-II〕抗卡那霉素、新霉素标记基因，以及抗除草剂草甘膦等转基因特性，与非抗性株系配成杂交组合；根据父、母本花粉的物理、生化特性，保持和增加花粉活性，扩大父母本花粉的竞争差异，使其达到能够竞争选择的目的。本人在棉花花粉离体萌发试验中，加入0.05g·L-1的卡那霉素后，非抗性花粉比对照萌发率下降84.5％，花粉管长度短45.6％，差异极显著；而抗性花粉与对照比差异不显著；采用花粉竞争剂授粉制种的真杂种比例，比不用竞争剂但同样采取不去雄授粉制种增加27％，达到76％。同时，加入抗虫剂可以保花、保铃；且花粉萌发、保铃又与激素、硼、钙等物质关系密切；不同植物花粉的等渗浓度差异很大，必须加入不同浓度的蔗糖等。故，花粉竞争剂配方由花粉等渗剂、父本花粉促进剂、母本花粉抑制剂、花粉生长营养剂、杀虫剂等组成。
本发明的花粉竞争剂，适用于具有抗除草剂草甘膦、抗卡那霉素与抗虫连锁等显性标记性状的转基因植物作父本，与非抗植物作母本的杂交组合。显性性状包括：抗卡那霉素、草甘膦、等除草剂、抗生素中一种或一种以上化学药剂的作物杂交组合。
本发明的制种方法与现有制种技术相比具有如下优点(以抗草甘膦兼抗虫棉花杂交组合为例)：
①、本发明实现了棉花简化、省工制种，解决了不去雄直接授粉难题。省去目前大面积采用的手工去雄程序，在与原人工授粉用工相同或减少的情况下，一次性完成了授粉、花粉竞争选择等两道工序；且花朵的可视性远比去雄后的柱头要好，又省去标记程序，加快授粉速度。可节约70％以上的人工制种成本。因此，减轻了劳动强度，可以大幅度降低制种成本。
②、本发明保证了杂交种子的纯度。由于采用了抗除草剂等显性标记棉花做父本，经过‘花粉竞争’，在保证了父本抗性基因纯度，抑制了母本中非抗性花粉萌发后，又通过‘种子选择’机械包衣处理，直观、安全、自动清除并杜绝了假杂种，确保杂交一代种子纯度。这是包括人工去雄等现有各种制种方法所不可能达到的纯度比例。而且此工艺便于工厂化生产，把田间农民人工去杂前移到工厂化自动处理。也减轻制种者、管理者的市场风险。
③、本发明保证了制种产量。由于采用花粉竞争杂交法授粉，提高了真杂交种子产量，不用人工去雄，避免了人工去雄对子房的手工损伤，而且授粉量大，所以单株成铃率高，因此，保证了制种田产量。
④、本发明提出的液体花粉授粉法，与目前采用的干粉授粉相比较，用液体花粉授粉具有可以加入激素、杀虫剂、促进剂等药剂，便于合并多项作业的优点，且花粉授粉均匀、利用率高，花粉萌发率高，棉铃脱落少，还可以实现小型机械喷雾授粉。
⑤、本发明提出用加有除草剂的包衣剂处理种子，具有保证了种子质量和纯度、可以工厂化生产、在出苗期早识别、安全自动清除假杂种、杜绝假冒、伪劣种子等多种优点，使种苗具有可识别性，使农民用上放心种子。
⑥、本发明在棉花柱头上涂抹或喷雾花粉竞争药剂，只针对最关键部位施药，采用‘外科手术’的办法处理柱头；只在柱头上创造一种微竞争环境，抑制而不杀死花粉。比化学杀雄方法的整株喷雾杀死花粉，更直接、安全和有效，解决了多年来棉花化学杀雄不能成功的难题，减少用药量和药害，减少环境污染，降低药剂成本和工时。
⑦、此种方法生产的抗草甘膦杂交种子，可以在田间使用灭生性除草剂，比较彻底地解决棉田草害，减轻锄草劳动强度，降低生产成本，提高棉花产量，实现规模化生产。
⑧、本发明有利于高产组合的自由选配。因为不需要不育系，只要求父、母本一方是转基因品系即可。因此，容易筛选到大批高产优质组合，特别是对于棉花、小麦等在三系制种应用上尚存在问题的作物，更有应用价值；对杂交种子的育种方向提出一条途径。
⑨、使用转基因花粉竞争剂的不去雄授粉制种方法的杂交种子比例，要比对照提高25％，达到75％以上。提高了制种效率，减少假杂种数量。
具体实施方式
实施例1
对抗草甘膦、抗虫的棉花杂交组合，用卡那霉素、草甘膦和蔗糖在蒸馏水中(以下各实施例同)配成花粉竞争剂，其中：
卡那霉素0.08g·L-1，蔗糖460g·L-1，
草甘膦0.042g·L-1。
用卡那霉素0.08克，蔗糖460克，草甘膦0.042克，加入到1000毫升蒸馏水中，再加入0.1克土温80做展布剂。
以非转基因棉花鄂抗病棉B为母本，以抗草甘瞵棉花A为父本，配成杂交组合。开花期每天上午，制种人员一手持装有花粉竞争剂的小喷雾器，对准母本B的柱头和花药喷雾后，另一手随即拿一父本A的开放花朵，在父本B柱头上授粉杂交；一朵父本花可为5朵母本花授粉。
花粉选择的效果检查方法：用1g·L-1的草甘膦溶液浸泡棉种直到种子分层，在30℃条件下保湿萌发，72小时后检查，有气生根毛、颈叶绿者为真杂种，黑根斑、无气生根毛为假杂种。统计比例后，真杂交种高于65％为有效。
棉花收获后，对生产的杂交种子用硫酸脱绒，用杂交种子纯度选择剂进行种子包衣处理。播种后，只有抗草甘瞵的杂交种可以出苗正常生长，假杂种不能出苗或出苗后很快死亡.达到种子选择的目的。杂交种子纯度达到97％。
也可以不用除草剂包衣，棉苗出齐后，结合苗床化除，用1g·L-1草甘膦喷雾，杀死假杂种。
实施例2，
对抗卡那霉素的抗虫棉花杂交组合，卡那霉素和蔗糖用蒸馏水配成花粉竞争剂，其中：
卡那霉素0、1g·L-1，蔗糖420g·L-1。
喷雾时加入0.01％土温80作展布剂。
以非转基因棉花鄂抗病棉B为母本，以转基因抗虫棉花A为父本，配成高产组合。早上取30克父本花粉放入100毫升花粉竞争液中，用毛笔蘸取花粉液，涂在母本花的柱头上，或用喷雾器对柱头喷雾，完成了一朵花的杂交授粉工作。
杂交种子播种出苗后，用5g·L-1卡那霉素液喷苗，10天后选择拔除黄斑不抗的假杂种苗，完成种苗选择。杂交种子的纯度达到95％以上。
实施例3
对抗虫且有鸡脚叶、无腺体等显性标记性状抗虫棉花组合，新霉素、蔗糖、赤霉素、硼酸、硝酸钙和硫酸镁在花粉竞争剂溶液中含有：
新霉素0、07g·L-1，蔗糖450g·L-1，赤霉素0、1g·L-1，
硼酸0、1g·L-1，硝酸钙0、3g·L-1，硫酸镁0、2g·L-1。
花粉竞争剂的使用方法同实施例2。其真假杂种选择方法与实施例2相同，只是还可以进一步拔除非鸡脚叶、无腺体标记的假杂种。杂交种子的纯度达到98％。
实施例4
对父本抗除草剂草甘膦兼抗虫的棉花杂交组合，卡那霉素、草甘膦、蔗糖、赤霉素和硼酸在花粉竞争剂溶液中含有：
卡那霉素0.05g·L-1，蔗糖380g·L-1，草甘膦0.042g·L-1，
赤霉素0、08g·L-1，硼酸0、15g·L-1。
花粉选择及种子包衣选择方法同实施例1。杂交种子的纯度达到97％。
实施例5
对虫害重的棉田，在上述实施例1、2、3、4的花粉竞争剂中，加入杀虫剂敌杀死0.03％，其他组分和方法相同。
实施例6
对母本抗虫的转基因棉花，需父本抗除草剂。在花粉竞争剂溶液中含有：
草甘膦0、04g·L-1，蔗糖400g·L-1。
其制种和种子选择方法同实施例1。杂交种子的纯度达到98％。
实施例7
对于杂交小麦制种，用抗草甘膦小麦作父本；在花粉竞争剂溶液中含有：
草甘膦0.03g·L-1，蔗糖100g·L-1。
开花期，每天对母本开颖麦穗喷雾后，用抗草甘膦小麦授粉，其种子用含草甘膦的种衣剂处理。
对于棉花杂交制种的转基因作物花粉竞争剂，蔗糖在溶液中含有350-480g·L-1，而其它的农作物花粉等渗浓度一般需蔗糖50-480g·L-1。
Claims (10)
1、一种杂交制种的转基因作物花粉竞争剂，其特征是：该花粉竞争剂由以卡那霉素或者新霉素、蔗糖为溶质、以蒸馏水为溶剂配制而成，专用于转基因作物抗性花粉和非抗性花粉的竞争选择，结合种、苗选择剂，实现不去雄授粉杂交制种。
2、根据权利要求1所述的一种杂交制种的转基因作物花粉竞争剂，其特征是：所述的卡那霉素或者新霉素、蔗糖，在竞争剂溶液中含有：卡那霉素或者新霉素0.02--1g·L-1，蔗糖50-480g·L-1。
3、根据权利要求1或2所述的一种杂交制种的转基因作物花粉竞争剂，其特征是：所述的花粉竞争剂中含有草甘膦。
4、根据权利要求3所述的一种杂交制种的转基因作物花粉竞争剂，其特征是：所述的草甘膦在竞争剂溶液中含有：草甘膦0.010.1g·L-1。
5、根据权利要求1或2所述的一种杂交制种的转基因作物花粉竞争剂，其特征是：所述的花粉竞争剂中含有促进父本花粉萌发、花粉管生长营养剂、杀虫剂。
6、根据权利要求5所述的一种杂交制种的转基因作物花粉竞争剂，其特征是：所述的促进父本花粉萌发、花粉管生长的营养剂、杀虫剂在竞争剂溶液中含有：GA3 0.010.2g·L-1、H3BO3 0.01-0.2g·L-1、Ca(NO3)2·4H2O 0.1-3g·L-1、MgSO4·7H2O 0.1---3g·L-1、敌杀死0.01---0.05％，其中之一种或多种。
7、一种杂交制种的种苗纯度选择剂，包括抗病虫种衣剂，其特征是：在该抗病虫种衣剂中含有草甘膦；草甘膦、抗病虫种衣剂在选择剂中按重量百分比计含有：草甘膦30-40％；抗病虫种衣剂60-70％。
8、一种杂交制种的种苗纯度选择剂的快速检验方法，其特征是：把权利要求7所述的种苗纯度选择剂与水按1∶300比例配制成液体，将种子浸泡在该液体中至种子分层，在保湿、照光、30℃条件下发芽，72小时后，有气生根毛、颈叶绿色、根无黑斑者为抗草甘膦种子。
9、一种转基因抗除草剂棉花杂交制种的方法，其特征是：该制种的步骤如下：
(1)、以非抗除草剂棉花B作为母本，以抗除草剂草甘膦的转基因棉花A作为父本，配成杂交组合；
(2)、棉花开花期的每天上午，用装有上述权利要求中含草甘膦的花粉竞争剂C的微型喷雾器，对B花朵的柱头、花药喷雾后，即用A的花粉对B柱头杂交授粉；或者，
(3)、搜集父本A的花粉于上述权利要求中含草甘膦的花粉竞争剂的液体C中配成花粉液，将花粉液点涂或喷雾到母本棉花B柱头上杂交授粉；
(4)、用上述权利要求7中的种子纯度选择剂，对该收获的种子进行包衣处理，完成杂交种子生产。
10、一种转基因抗虫棉花杂交制种的方法，其特征是：该制种的步骤如下：
(1)、以非转基因棉花B作为母本，转基因抗虫棉花A作为父本，配成杂交组合；
(2)、棉花开花期的每天上午，用装有上述权利要求中不含草甘膦的花粉竞争剂微型喷雾器对棉花B的花朵柱头、花药喷雾后，即用棉花A的花粉对B柱头杂交授粉；或者，
(3)、搜集父本棉花A的花粉于上述权利要求中不含草甘膦的花粉竞争剂中配成花粉液，将花粉液点涂或喷雾到母本棉花B柱头上杂交授粉；
(4)、杂交种子在苗床播种出苗后，用0、5--1g·L-1的卡那霉素液喷苗，7天后选择拔除有黄斑的假杂种苗，完成杂交种子生产。
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| CN102893855A (zh) * | 2012-10-14 | 2013-01-30 | 中国农业科学院棉花研究所 | 一种生产环保经济型棉花杂交品种的方法 |
| CN114501985A (zh) * | 2019-10-01 | 2022-05-13 | 孟山都技术公司 | 通过液体介导将花粉递送到来自受体植物的花的封闭柱头上进行异花授粉 |
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